DE3851265T2

DE3851265T2 - Hydrolysierbare Verbindungen, die elektronübertragende Mittel freigeben und ihre analytische Verwendung.

Info

Publication number: DE3851265T2
Application number: DE3851265T
Authority: DE
Inventors: Robert Troconis Belly; Chung-Yuan Chen; Patricia Marie Scensny; Annie Liu Wu
Original assignee: Eastman Kodak Co
Current assignee: Ortho Clinical Diagnostics Inc
Priority date: 1987-06-08
Filing date: 1988-06-07
Publication date: 1995-04-13
Anticipated expiration: 2008-06-08
Also published as: JPS6456669A; EP0295034A3; DE3851265D1; US4952495A; EP0295034A2; EP0295034B1

Description

Diese Erfindung ist für das Gebiet der klinischen Chemie geeignet. Sie betrifft hydrolysierbare Verbindungen und analytische Zusammensetzungen und Elemente, die diese enthalten. Sie betrifft ferner ein Verfahren zur Bestimmung von hydrolytischen Analyten unter Verwendung der hydrolysierbaren Substrate.
Chemische Analysen von Flüssigkeiten, beispielsweise Wasser, Milch und biologischen Flüssigkeiten, sind oftmals erwünscht oder aus Gesundheitsgründen und für Diagnosezwecke sowie zur Behandlung von Krankheiten erforderlich. Es sind verschiedene Zusammensetzungen und Elemente zur Erleichterung derartiger Analysen bekannt. Derartige Materialien umfassen im allgemeinen eine Reagenszusammensetzung für die Bestimmung der zu analysierenden Substanz, die hier als Analyt bezeichnet wird. Der Analyt kann bestehend aus lebenden Zellen, wie zum Beispiel Hefe-Zellen, weißen Blutkörperchen, Bakterien oder anderen lebenden Organismen oder einer nicht lebenden chemischen Substanz, wie zum Beispiel einem Enzym. Die Reagenszusammensetzung liefert bei Kontakt mit dem Analyten eine feststellbare Veränderung (zum Beispiel eine Farbstoffbildung), die in bestimmter Weise quantifiziert werden kann.
Die Bestimmung von spezifischen hydrolytischen Enzymen in biologischen Flüssigkeiten kann für die Diagnose und Behandlung von Krankheiten nützlich sein. Sie kann ferner für die Bestimmung des Vorhandenseins von bestimmten Mikroorganismen nützlich sein, da der Metabolismus der Mikroorganismen von dem Vorhandensein von bestimmten hydrolytischen Enzymen anhängt.
Es ist eine Anzahl von analytischen Verfahren entwickelt worden, wobei ein Substrat für ein Enzym, das von Interesse ist, hydrolysiert wird unter Freisetzung eines bestimmbaren Restes. Diese Verfahren verwenden sowohl kolorimetrische wie auch fluorometrische Farbstoffe. Fluorometrische Bestimmungsverfahren sind im allgemeinen vorzuziehen, im Hinblick auf ihre im allgemeinen größere Empfindlichkeit. Andere bekannte Bestimmungsverfahren verwenden Diazoniumverbindungen, um bestimmbare Reste bei Vorhandensein von hydrolytischen Analyten zu bilden.
Die kanadische Patentschrift 670 378 beschreibt Phosphate von 2,3-Dimethoxy-5-methylhydrochinonen, die als Emulgatoren in pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet werden können. Es wird keine analytische Verwendung von derartigen Verbindungen beschrieben.
Weiterhin werden bestimmte ortho-Benzochinone als geeignete Fungizide in der US-A-3 504 054 beschrieben, doch wird keine analytische Anwendung derartiger Verbindungen erwähnt.
Ein beträchtlicher Fortschritt im Stande der Technik wird in der EP-Publikation 211 898 beschrieben. Diese Literaturstelle beschreibt geeignete reduzierbare Verbindungen, die, wenn sie durch ein Reduktionsmittel (wie zum Beispiel NADH) in einer Testprobe reduziert werden, eine bestimmbare Spezies liefern, wie zum Beispiel ein Chromogen oder Fluorogen. Viele der bestimmbaren Spezies, die auf diese Weise freigesetzt werden, weisen hohe Extinktions-Koeffizienten auf und zeigen somit eine hohe Empfindlichkeit gegenüber niedrigen Analyt-Konzentrationen. Wünschenswert wäre es, wenn derartige Verbindungen zur Bestimmung von hydrolytischen Analyten, wie zum Beispiel hydrolytischen Enzymen, die in verschiedenen Organismen gefunden werden, eingesetzt werden könnten. Hydrolytische Enzyme und ihre Substrate sind jedoch nicht immer Reduktionsmittel für derartige reduzierbare Verbindungen.
Es hat sich gezeigt, daß die Reduktion von einigen reduzierbaren Verbindungen unerwünscht langsam verlaufen kann. In solchen Fällen kann-ein Elektronenübertragungsmittel zur Erleichterung der Reduktion der Verbindung eingesetzt werden. Selbst im Falle dieser Reaktionen jedoch wird nur ein Äquivalent der bestimmbaren Spezies für jedes Äquivalent von verwendetem Elektronenübertragungsmittel freigesetzt. Infolgedessen wäre es wünschenswert, wenn eine empfindlichere Bestimmungsmethode entwickelt werden könnte, d. h. eine Bestimmungsmethode, bei der mehr als ein Äquivalent der bestimmbaren Spezies von nur einem Äquivalent des Elektronenübertragungsmittels freigesetzt wird.
Die im vorstehenden beschriebenen Probleme wurden durch diese Erfindung gelöst durch Verwendung einer hydrolysierbaren Verbindung, die durch die folgende Formel gekennzeichnet ist:
BLOCK-ETA
worin bedeuten:
BLOCK steht für -CO-R*, Thioxophosphono oder ein Salz hiervon oder einen monovalenten Rest, der sich ableitet von einer Aminosäure, einem Peptid, Mono-, Oligo- oder Polysaccharid, worin R* steht für Wasserstoff, substituiertes oder unsubstituiertes Alkyl, substituiertes oder unsubstituiertes Alkenyl, substituiertes oder unsubstituiertes Aryl, substituiertes oder unsubstituiertes Cycloalkyl oder eine substituierte oder unsubstituierte heterocyclische Gruppe, und
ETA eine Gruppe, die sich ableitet von einem Elektronenübertragungsmittel, das, wenn es freigesetzt wird, ein Phenazin, Naphthazin, Phenothiazin oder eine Phenazoniumverbindung oder ein substituiertes para-Benzochinon oder Naphthochinon in entweder seiner oxidierten oder reduzierten Form liefert, wobei
BLOCK und ETA durch den aktiven Redoxteil des Elektronenübertragungsmittels miteinander verbunden sind.
Durch diese Erfindung wird ferner eine analytische Zusammensetzung bereitgestellt, die umfaßt:
a) entweder eine reduzierbare Verbindung, die ein bestimmbares Signal als Folge einer Reduktion durch ein Elektronenübertragungsmittel in seiner reduzierten Form liefert, oder eine oxidierbare Verbindung, die ein bestimmbares Signal als Folge der Oxidation durch ein Elektronenübertragungsmittel in seiner oxidierten Form liefert, und
b) eine hydrolysierbare Verbindung, wobei die Zusammensetzung gekennzeichnet ist dadurch, daß die hydrolysierbare Verbindung der folgenden Formel entspricht:
BLOCK-ETA
worin bedeuten:
BLOCK eine Gruppe der Formel -CO-R*, Phosphono oder Thioxophosphono oder ein Salz hiervon, oder einen monovalenten Rest, der sich ableitet von einer Aminosäure, einem Peptid, einem Mono-, Oligo- oder Polysaccharid, worin R* steht für Wasserstoff, substituiertes oder unsubstituiertes Alkyl, substituiertes oder unsubstituiertes Alkenyl, substituiertes oder unsubstituiertes Aryl, substituiertes oder unsubstituiertes Cycloalkyl oder eine substituierte oder unsubstituierte heterocyclische Gruppe, und
ETA eine Gruppe, die sich ableitet von einem Phenazin, Naphthazin, Phenothiazin oder einer Phenazoniumverbindung, oder einem substituierten oder unsubstituierten Benzochinon oder Naphthochinon in entweder seiner oxidierten oder reduzierten Form, wobei
BLOCK und ETA miteinander durch den aktiven Redoxteil des Elektronenübertragungsmittels miteinander verbunden sind.
Weiterhin umfaßt ein trockenes analytisches Element dieser Erfindung zur Bestimmung eines hydrolytischen Analyten ein absorbierendes Trägermaterial, wobei das Element dadurch gekennzeichnet ist, daß es eine hydrolysierbare Verbindung, wie oben beschrieben, für die analytische Zusammensetzung enthält.
Weiterhin umfaßt ein Verfahren zur Bestimmung eines hydrolytischen Analyten die folgenden Stufen:
A. Kontaktieren einer Probe einer Flüssigkeit, von der erwartet wird, daß sie einen hydrolytischen Analyten enthält, unter hydrolysierenden Bedingungen mit der hydrolysierbaren Verbindung, die oben für die analytische Zusammensetzung beschrieben wurde, wobei das Kontaktieren in Gegenwart von entweder einer reduzierbaren Verbindung durchgeführt wird, die ein bestimmbares Signal als Folge einer Reduktion durch ein Elektronenübertragungsmittel in seiner reduzierten Form liefert oder in Gegenwart einer oxidierbaren Verbindung, die ein bestimmbares Signal als Folge einer Oxidation durch ein Elektronenübertragungsmittel in seiner oxidierten Form liefert, unter Erzeugung einer bestimmbaren Spezies, und
B. Bestimmung der bestimmbaren Spezies, die erzeugt wird entweder aufgrund der Reduktion oder Oxidation der reduzierbaren bzw. oxidierbaren Verbindung.
Die vorliegende Erfindung stellt neue Substrate bereit, die Elektronenübertragungsmittel durch Hydrolyse durch hydrolytische Analyte freisetzen. Diese freigesetzten Elektronenübertragungsmittel können entweder in einer reduzierten oder oxidierten Form vorliegen und erleichtern entweder die Reduktion von reduzierbaren Verbindungen oder die Oxidation von oxidierbaren Verbindungen unter Erzeugung einer bestimmbaren Spezies. Dies bedeutet, daß die Substrate in einem Bestimmungsverfahren für hydrolytische Analyte eingesetzt werden können, unter Gewinnung einer empfindlicheren und rascheren Bestimmung.
Im Falle einer Ausführungsform ist ferner ein stöchiometrischer Überschuß an einem Reduktionsmittel vorhanden, das dazu befähigt ist, das oxidierte Elektronenübertragungsmittel zu reduzieren. Dieses Reduktionsmittel reduziert das Elektronenübertragungsmittel mit einer viel größeren Geschwindigkeit als die reduzierbare Verbindung. Alternativ ist im Falle einer anderen Ausführungsform auch ein stöchiometrischer Überschuß eines Oxidationsmittels vorhanden, das dazu befähigt ist, das reduzierte Elektronenübertragungsmittel zu oxidieren. Dieses Oxidationsmittel oxidiert das Elektronenübertragungsmittel mit einer viel größeren Geschwindigkeit als die oxidierbare Verbindung. Als Folge hiervon kann ein Äquivalent des freigesetzten Elektronenübertragungsmittels recyclisiert werden unter Erzeugung von mehr als einem Äquivalent der bestimmbaren Spezies, wodurch ein verstärktes, hoch empfindliches Bestimmungsverfahren möglich wird.
Die Reaktion der reduzierbaren Verbindung mit dem Reduktionsmittel oder die Reaktion der oxidierbaren Verbindung mit dem Oxidationsmittel muß in Abwesenheit des Elektronenübertragungsmittels langsam verlaufen. Dies kann auf verschiedene Weise erreicht werden, einschließlich auf elektrochemischem Wege durch Einstellung der Redoxpotentiale, oder durch Einstellung der physikalischen oder chemischen Reaktionsbedingungen (zum Beispiel Temperatur, pH-Wert, Konzentration der Reaktionskomponenten oder Immobilisierung von Reaktionskomponenten innerhalb von Mizellen).
Die vorliegende Erfindung kann dazu verwendet werden, um qualitativ oder quantitativ einen hydrolytischen Analyten zu bestimmen (einen lebenden oder nicht lebenden Analyten). Der hier gebrauchte Ausdruck "hydrolytischer Analyt" bezieht sich auf eine Substanz (chemische Substanz, Enzym oder Organismus), die das Substrat dieser Erfindung zu hydrolysieren vermag, und zwar durch Abspaltung der BLOCK-Gruppe von dem Rest des Moleküls. Diese Erfindung eignet sich insbesondere zur Bestimmung von hydrolytischen Enzymen, wie zum Beispiel Acylasen, Esterasen, Amidasen, Glykosidasen, Phosphatasen und Mikroorganismen, die diese Enzyme enthalten, wie beispielsweise Mitglieder der Familie der Enterobacteriaceaen oder Neisseriaceaen, einschließlich solchen Enzymen und Mikroorganismen, die aufgeführt sind in der PCT- Patentanmeldung 80/02433 (WO-A-8002433) . Das Substrat kann bestimmt sein, um mit der geeigneten BLOCK-Gruppe und Bindung einen speziellen Analyten zu bestimmen.
Die Substrate dieser Erfindung können im Rahmen analytischer Bestimmungen von verschiedenen wäßrigen Flüssigkeiten verwendet werden, wie beispielsweise biologischen Flüssigkeiten (zum Beispiel Urin, cerebralen spinalen Flüssigkeiten, Blut, Lymphflüssigkeiten, einem Gewebe-Homogenat, Schleim, Speichel oder Stuhl-Sekretionen), Herstellungsverfahren, Abwässern oder Nahrungsmitteln. Die Bestimmungen können durchgeführt werden unter Anwendung einer einzelnen Reaktion oder einer Reaktionsfolge, bei der eine Hydrolyse des Substrates erfolgt und eine Freisetzung des Elektronenübertragungsmittels.
Die Substrate dieser Erfindung sind gekennzeichnet durch die Formel:
BLOCK-ETA.
In dieser Formel steht BLOCK für jede geeignete hydrolysierbare Gruppe, die von dem Rest des Moleküls durch Hydrolyse abgespalten werden kann. Im Kontext dieser Anmeldung blockiert oder inhibiert die BLOCK-Gruppe die dem Elektronenübertragungsmittel (identifiziert als ETA) eigene Fähigkeit zur Elektronenübertragung durch eine Redox-Blockierung. Dies bedeutet, daß BLOCK an ETA durch den aktiven Redoxteil des Elektronenübertragungsmittelmoleküls gebunden ist, so daß ETA inaktiv ist, wenn es an BLOCK gebunden ist und aktiv ist, wenn es freigesetzt worden ist. Der spezielle aktive Redoxteil eines jeden Elektronenübertragungsmittels ist einem fachkundigen Chemiker bekannt. Die Blockierungsgruppe kann ausgewählt werden aufgrund der gewünschten Analyt-Spezifität. Zu repräsentativen Blockierungsgruppen gehören zum Beispiel -CO-R*, Phosphono oder Thioxophosphono oder ein Salz hiervon, oder ein Rest, der sich ableitet von einer Aminosäure, einem Peptid oder einem Mono-, Oligo- oder Polysaccharid.
R* kann stehen für Wasserstoff, substituiertes oder unsubstituiertes Alkyl (vorzugsweise von 1 bis 20 Kohlenstoffatomen, zum Beispiel Methyl, Ethyl, Chloroethyl, Isopropyl, Benzyl oder Chlorobenzyl), substituiertes oder unsubstituiertes Alkenyl (vorzugsweise von 2 bis 20 Kohlenstoffatomen, zum Beispiel Ethenyl, 2-Propenyl oder 4-Hexenyl), substituiertes oder unsubstituiertes Aryl (vorzugsweise mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen, zum Beispiel Phenyl oder Methoxyphenyl), substituiertes oder unsubstituiertes Cycloalkyl (vorzugsweise mit 5 bis 12 Kohlenstoffatomen, zum Beispiel Cyclopentyl oder Cyclohexyl), oder eine substituierte oder unsubstituierte heterocyclische Gruppe (vorzugsweise mit 6 bis 12 Kohlenstoff-, Schwefel-, Stickstoff- und Sauerstoffatomen, zum Beispiel Pyridyl oder Thienyl).
ETA ist eine Gruppe, die sich von einem Elektronenübertragungsmittel ableitet, die, wenn sie freigesetzt ist, eine Phenazin-, Naphthazin-, Phenothiazin-, Phenazoniumverbindung oder ein substituiertes Benzo- oder Naphthochinon in entweder oxidierter oder reduzierter Form liefert. Unter einem Elektronenübertragungsmittel ist hier eine Verbindung zu verstehen, die ein Redox-Potential aufweist, derart, daß sie dazu befähigt ist, sowohl ein oder mehrere Elektronen in Gegenwart von entweder reduzierbaren oder oxidierbaren Verbindungen aufzunehmen und abzugeben.
ETA ist an BLOCK durch eine einzelne Bindung gebunden oder durch eine verbindende Gruppe, die Teil des ETA-Restes ist. Zu derartigen verbindenden Gruppen gehören Oxy, Thio oder Imino [-NR-, worin R steht für Wasserstoff oder substituiertes oder unsubstituiertes Alkyl mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen (zum Beispiel Methyl, Chloromethyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Decyl oder Benzyl), substituiertes oder unsubstituiertes Cyclohexyl (zum Beispiel Cyclohexyl oder 4-Methylcyclohexyl), substituiertes oder unsubstituiertes Phenyl (Phenyl, Chlorophenyl oder p-Methoxyphenyl), Sulfonyl (-SO&sub2;R', worin R' steht für Alkyl oder Phenyl, wie für R angegeben), oder eine substituierte oder unsubstituierte heterocyclische Gruppe, wie oben definiert, beispielsweise Pyridyl oder Thienyl]. Vorzugsweise ist ETA an BLOCK durch eine Oxy- oder Iminogruppe gebunden, in der R steht für Wasserstoff oder ein kurzkettiges substituiertes oder unsubstituiertes Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen.
Zu repräsentativen Elektronenübertragungsmitteln, von denen sich ETA ableitet, gehören die Phenazine, wie zum Beispiel Phenazinmethosulfat und Phenazinethosulfat, die Naphthazine, wie zum Beispiel Roseinduline 2G, die Phenothiazine, wie zum Beispiel Thionin, die Phenazoniumverbindungen, wie zum Beispiel Cresyl blue (und andere, die beschrieben werden von Furst & Mitarbeitern in Anal. Chim. Acta, 140, S. 1-18, 1982, Tabelle 2), und substituierte o- oder p-Benzo- und Naphthochinone, von denen einige ganz allgemein beschrieben werden in der EP-Publikation 190 740 und in EP-A-0 255 679. Zu besonders geeigneten Verbindungen für die Praxis dieser Erfindung gehören Phenazinmethosulfat, Phenazinethosulfat und die oben erwähnten o- oder p-Benzo- und Naphthochinone.
Ganz allgemein sind die geeignetsten Elektronenübertragungsmittel jene, die der Struktur (I) entsprechen:
Im Falle dieser Struktur stehen R&sup7; und R&sup8; unabhängig voneinander für Wasserstoff, Hydroxy, Halogen (zum Beispiel Fluoro, Chloro, Bromo oder Jodo), Cyano, Nitro, Carboxy, Carboxyalkyl, worin die Alkylgruppe 1 bis 10 Kohlenstoffatome aufweist (zum Beispiel Carboxymethyl oder Carboxyethyl), Carboxamido (d. h. -CONR'R'', worin R' und R'' unabhängig voneinander stehen für Wasserstoff, Alkyl oder Aryl, wie unten definiert), Sulfonamido (d. h. -SO&sub2;NR'R'', worin R' und R'' die oben angegebene Bedeutung haben), Trihaloalkyl, worin die Alkylgruppe 1 bis 10 Kohlenstoffatome aufweist (wie beispielsweise Trichloromethyl, Tribromomethyl oder Trifluoromethyl), Sulfonyl (d. h. -SO&sub2;R''', worin R''' steht für Alkyl oder Aryl, wie unten definiert), Carboxaldehyd, Carbonylalkyl, worin die Alkylgruppe 1 bis 10 Kohlenstoffatome aufweist (wie zum Beispiel Acetyl), substituiertes oder unsubstituiertes Alkyl oder Alkenyl (im allgemeinen mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, wie zum Beispiel Methyl, Ethyl, Chloromethyl, 2-Propenyl, n-Hexyl oder Decyl und vorzugsweise mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen), substituiertes oder unsubstituiertes Alkoxy (definiert entsprechend Alkyl), substituiertes oder unsubstituiertes Hydroxyalkyl (im allgemeinen mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, wie zum Beispiel Hydroxymethyl, Hydroxyethyl, 2-Hydroxypropyl oder 2- Hydroxyisopropyl, worin der Alkylanteil weiter substituiert sein kann und vorzugsweise 1 bis 5 Kohlenstoffatome aufweist), substituiertes oder unsubstituiertes Hydroxyalkoxy (definiert entsprechend Hydroxyalkyl), substituiertes oder unsubstituiertes Acetoxyalkyl (im allgemeinen mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen im Alkylteil des Moleküls, der definiert werden kann, wie für Alkyl oben angegeben, zum Beispiel Acetoxymethyl oder Acetoxyethyl und vorzugsweise mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen), substituiertes oder unsubstituiertes Acetoxyalkoxy (im allgemeinen mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen im Alkoxyteil des Moleküls und definiert ähnlich wie oben für Acetoxyalkyl angegeben, und vorzugsweise mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen), substituiertes oder unsubstituiertes Alkoxyalkyl oder Oxyalkylenalkoxy (jeweils im allgemeinen mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen, wobei die Alkoxy- und Alkylanteile des Moleküls wie oben beschrieben definiert sind und der Alkylenrest 1 bis 5 Kohlenstoffatome aufweist), substituiertes oder unsubstituiertes Aryl (im allgemeinen mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen, wie zum Beispiel Phenyl, Naphthyl, Xylyl, Methylnaphthyl oder p-Methoxyphenyl), substituiertes oder unsubstituiertes Alkaryl (im allgemeinen mit 7 bis 10 Kohlenstoffatomen, wobei die Alkyl- und Arylanteile der Moleküle definiert sind entsprechend wie oben für Alkyl und Aryl angegeben, zum Beispiel Benzyl, Phenylethyl oder p-Methoxyphenylethyl), heterocyclische oder alkyl-heterocyclische Gruppen (im allgemeinen mit 5 bis 12 Kohlenstoff-, Stickstoff-, Sauerstoff- oder Schwefelatomen im Ring, mit, falls erwünscht, einem oder mehreren Substituenten, wie zum Beispiel Morpholino, Piperidino oder Methylpiperidino).
In der Struktur I stehen ferner R&sup9; und R¹&sup0; unabhängig voneinander für Gruppen, wie für R&sup7; und R&sup8; beschrieben, oder sie stehen gemeinsam für die Kohlenstoff-, Stickstoff-, Sauerstoff- oder Schwefelatome, die erforderlich sind zur Vervollständigung eines 4- bis 8-gliedrigen kondensierten substituierten oder unsubstituierten carbocyclischen oder heterocyclischen Ringes, der an den Chinonkern gebunden ist (zum Beispiel unter Vervollständigung eines Cyclopentan-, Dihydrofuran- oder bicyclischen Ringes, wie beispielsweise eines Bicyclo[2.2.2]octan-, Benzo- oder eines Bicyclo[2.2.1]heptanringes).
Mindestens einer der Substituenten R&sup7;, R&sup8;, R&sup9; und R¹&sup0; hat nicht die Bedeutung von Wasserstoff, sondern steht für eine der oben definierten Gruppen oder bildet gemeinsam mit einem anderen Substituenten einen der angegebenen definierten ankondensierten Ringe.
Die hydrolysierbaren Substrate dieser Erfindung werden nach dem folgenden allgemeinen Verfahren hergestellt: Herstellung oder Kauf des Elektronenübertragungsmittels mit anschließender Umsetzung mit einem geeigneten Blockierungsrest. Der Blockierungsrest oder blockierende Rest kann erworben oder hergestellt werden unter Anwendung üblicher chemischer Methoden. Vor Umsetzung mit einem Elektronenübertragungsmittel werden die reaktiven Gruppen am blockierenden Rest mit schützenden Gruppen geschützt, so daß eine Reaktion mit dem Elektronenübertragungsmittel nur an einer Position erfolgt. Hat die Umsetzung stattgefunden, so werden die schützenden Gruppen entfernt.
Ein hydrolytischer Analyt wird gemäß dieser Erfindung bestimmt durch Kontaktieren einer Probe einer Flüssigkeit, von der angenommen wird, daß sie den Analyten enthält, mit sowohl dem oben beschriebenen hydrolytischen Substrat sowie entweder einer reduzierbaren Verbindung oder einer oxidierbaren Verbindung. Das Substrat und die reduzierbare oder oxidierbare Verbindung können separat oder gemeinsam in einer analytischen Zusammensetzung geliefert werden.
Im Falle einer bevorzugten Ausführungsform wird ein hydrolytischer Analyt bestimmt durch Kontaktieren einer Flüssigkeitsprobe, von der angenommen wird, daß den Analyten enthält, mit dem hydrolytischen Substrat, einer reduzierbaren Verbindung und überschüssigem Reduktionsmittel oder einer oxidierbaren Verbindung und überschüssigem Oxidationsmittel. Das Substrat und die reduzierbare oder oxidierbare Zusammensetzung können separat oder gemeinsam als analytische Zusammensetzung bereitgestellt werden.
Im Falle der Reduktions-Ausführungsform werden reduzierbare Verbindungen, die für die Praxis dieser Erfindung geeignet sind, breit definiert als organische Verbindungen, die ein bestimmbares Signal als Folge einer Reduktion durch ein Elektronenübertragungsmittel in seiner reduzierten Form liefern. Ein derartiges Signal kann erzeugt werden durch die Verbindung selbst oder einen Teil hiervon, der in geeigneter Weise freigesetzt wird. Zu repräsentativen reduzierbaren Verbindungen gehören Tetrazoliumsalze, Leucofarbstoffe, 2,6-Dichloroindophenol und andere bekannte Verbindungen, die dem Fachmann bekannt sind.
Besonders geeignete reduzierbare Verbindungen sind die reduzierbaren Verbindungen, die in der EP-Publikation 0 211 898 beschrieben werden. Diese Verbindungen enthalten eine verschiebbare bestimmbare Spezies, die bei einem physiologischen pH-Wert (d. h. bei 9 oder weniger) reduziert werden kann, unter Freisetzung der verschiebbaren bestimmbaren Spezies. Die Bezeichnung "verschiebbare bestimmbare Spezies" ist wie folgt definiert: (1) einen Chromogenrest, der eine erste spektrale Absorptionsbande aufweist, während er an die reduzierbare Verbindung gebunden ist, und eine zweite spektrale Absorptionsbande, wenn er freigesetzt wird, oder einen Fluorogenrest, der erste spektrale Absorptions- und Emissionsbanden aufweist, während er gebunden ist und zweite spektrale Absorptions- und Emissionsbanden, wenn er freigesetzt ist, (2) einen chemisch oder biologisch geeigneten Rest, der inaktiv ist, blockiert oder in anderer Weise nicht zugänglich, wenn er an die reduzierbare Verbindung gebunden ist, jedoch aktiv, entblockiert oder zugänglich ist, wenn er freigesetzt ist, oder (3) einen chemisch oder biologisch geeigneten Rest, der aktiv oder zugänglich ist, wenn er an die reduzierbare Verbindung gebunden ist, jedoch inaktiv oder in anderer Weise unzugänglich ist, wenn er freigesetzt wird.
Infolgedessen kann eine verschiebbare bestimmbare Spezies ein Rest sein, der eine erste spektrale Absorptionsbande aufweist, wenn er an die reduzierbare Verbindung gebunden ist, vor einer Reduktion und Freisetzung, der jedoch eine zweite spektrale Absorptionsbande während der analytischen Bestimmung aufweist. Die bestimmbare Spezies ist chemisch modifiziert, wenn sie an den Kern der reduzierbaren Verbindung gebunden ist, derart, daß die spektrale Absorptionsbande der reduzierbaren Verbindung "verschoben wird" von der Bande, die die Spezies aufweist, wenn sie freigesetzt wird. Im allgemeinen, jedoch nicht notwendigerweise, wird die Bande zu wesentlich kürzeren Wellenlängen relokalisiert, wenn die Spezies ein Teil der reduzierbaren Verbindung ist. In sämtlichen Fällen überlappen sich die zwei Banden nicht in einem ins Gewicht fallenden Ausmaß. Der Wechsel von einer spektralen Absorptionsbande zu einer anderen kann die Folge sein der bloßen Freisetzung des Restes von der reduzierbaren Verbindung, oder alternativ er kann verursacht werden durch eine solche Freisetzung, gekoppelt mit entweder eine Reaktion des freigesetzten Restes mit Metallionen oder einem Beizmittel, oder gekoppelt mit einer Veränderung in der Bestimmungsumgebung (zum Beispiel einer Veränderung des pH-Wertes).
Wie oben beschrieben, können verschiebbare bestimmbare Spezies auch chemisch oder biologisch geeignete Reste sein, die, wenn sie an die reduzierbare Verbindung gebunden sind, inaktiv oder blockiert sind oder in anderer Weise unzugänglich sind, die jedoch, wenn sie bei einem physiologischen pH-Wert freigesetzt werden, biologisch oder chemisch aktiv sind oder für eine weitere Reaktion zugänglich sind. Die freigesetzten aktiven Spezies können selbst bestimmt werden oder sind für eine oder mehrere nachfolgende chemische, physikalische oder biologische Reaktionen geeignet unter Bildung einer bestimmbaren Spezies. Die Praxis dieser Erfindung liefert ein Mittel für die Freisetzung solcher Reste, wie beispielsweise von Enzymen, Enzymsubstraten, Enzyminhibitoren, Ko-Faktoren, Katalysatoren oder Reaktionskomponenten durch Reduktion der reduzierbaren Verbindung, vorzugsweise bei einem physiologischen pH-Wert, für eine Vielzahl von chemischen oder biologischen Zwecken.
Ferner kann eine verschiebbare bestimmbare Spezies ein chemisch oder biologisch geeigneter Rest sein, der, wenn er an die reduzierbare Verbindung gebunden ist, aktiv oder in anderer Weise zugänglich ist für eine oder mehrere nach folgenden chemischen, physikalischen oder biologischen Reaktionen, der jedoch, wenn er bei einem physiologischen pH-Wert freigesetzt wird, inaktiv oder in anderer Weise unzugänglich für solche Reaktionen wird.
Die reduzierbaren Verbindungen, die für diese Erfindung besonders geeignet sind, entsprechen der Struktur
worin CAR- steht für einen substituierten oder unsubstituierten aromatischen Kern oder Chinonkern, worin R¹ steht für einen Rest, umfassend eine verschiebbare bestimmbare Spezies, wie oben definiert, und worin n steht für 1 oder 2. Beispiele für derartige Kerne werden unten angegeben. Wird ferner R¹ ersetzt durch H, so hat
ein Reduktionspotential (E1/2) von entweder mindestens +100 mV, gemessen in Wasser, oder von mindestens -650 mV, gemessen in Acetonitril. Dieser E1/2-Wert erleichtert die Reduktion und die nachfolgende Freisetzung der verschiebbaren bestimmbaren Spezies von der Verbindung. Derartige Messungen erfolgen nach üblichen elektrochemischen Methoden unter Anwendung von entweder einer Differential-Impuls-Polarographie oder einer cyclischen Voltametrie.
Die oxidierbaren Verbindungen, die für die Praxis dieser Erfindung geeignet sind, lassen sich breit definieren als organische Verbindungen, die ein bestimmbares Signal als Folge einer Oxidation durch ein Elektronenübertragungsmittel in seiner oxidierten Form liefern. Ein solches Signal kann erzeugt werden durch die Verbindung selbst oder einen Teil hiervon, der in bestimmter Weise freigesetzt wird. Zu repräsentativen oxidierbaren Verbindungen gehören substituierte und unsubstituierte Hydrochinone, Aminophenole, Phenylendiamine und andere, die dem Fachmann bekannt sind. Diese Materialien sind entweder im Handel erhältlich oder leicht herstellbar unter Anwendung bekannter Verfahren und Ausgangsmaterialien.
Im Falle einer Ausführungsform wird die vorliegende Erfindung durchgeführt mit einem stöchiometrischen Überschuß an einem Reduktionsmittel, das dazu befähigt ist, die oxidierte Form des Elektronenübertragungsmittels nach seiner Reaktion mit der reduzierbaren Verbindung zu reduzieren. Alternativ wird die Erfindung im Falle einer anderen Ausführungsform mit einem stöchiometrischen Überschuß an einem Oxidationsmittel durchgeführt, das dazu befähigt ist, die reduzierte Form des Elektronenübertragungsmittels zu oxidieren, nach seiner Reaktion mit der oxidierbaren Verbindung. In Gegenwart von überschüssigem Reduktionsmittel oder Oxidationsmittel wird das freigesetzte Elektronenübertragungsmittel somit recyclisiert, bis sämtliche reduzierbare oder oxidierbare Verbindung umgesetzt worden ist.
Infolgedessen wird jede Verbindung, die ein oxidiertes Elektronenübertragungsmittel reduziert, als Reduktionsmittel betrachtet und kann in der Praxis dieser Erfindung verwendet werden. Ein besonders geeignetes Reduktionsmittel ist Nicotinamidadenindinukleotid in der reduzierten Form (NADH). Ebenfalls geeignete Reduktionsmittel sind Nicotinamidadenindinukleotidphosphat, in reduzierter Form (NADPH), Flavinadenindinukleotid in reduzierter Form (FADH), Ascorbinsäure oder Salze hiervon, Cytochrome und Ubichinol.
Umgekehrt wird jede Verbindung, die ein reduziertes Elektronenübertragungsmittel oxidiert, als Oxidationsmittel betrachtet und kann im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden. Zu repräsentativen geeigneten Oxidationsmitteln gehören Wasserstoffperoxid, Ferricyanid, Persulfat, Ferrichlorid und Bleidioxid.
In Abhängigkeit von ihren Wasserlöslichkeiten können die hydrolytischen Substrate und anderen Komponenten der Zusammensetzungen dieser Erfindung entweder direkt in Puffern gelöst werden oder in einer Kombination eines Puffers und mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln, oder es können Lösungen hergestellt werden, die ein Substrat, Puffer, ein mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel und ein oberflächenaktives Mittel enthalten.
Bei Verwendung zur Bestimmung von Enzymen oder Organismen wird die Zusammensetzung dieser Erfindung abgepuffert auf den besonderen pH-Wert, der für ein bestimmtes Bestimmungsverfahren erforderlich ist. Geeignete Puffer lassen sich von einem Fachmann leicht bestimmen und zu ihnen gehören Phosphate, Borate und organische Puffer, wie sie beschrieben werden von Good & Mitarbeitern in Biochem., 5, 467 (1966) und in Anal. Biochem. 104, 300 (1980). Zu oberflächenaktiven Mitteln, die für die Praxis dieser Erfindung geeignet sind, gehören beliebige oberflächenaktive Mittel, die die Hydrolyse der Verbindung nicht inhibieren. Im allgemeinen sind für die Bestimmung von lebenden Zellen die geeigneten oberflächenaktiven Mittel nicht ionogene oberflächenaktive Mittel.
Eine Zusammensetzung kann in der folgenden allgemeinen Weise hergestellt werden, wobei die besonderen Details einer solchen Herstellungsweise in dem folgenden Beispiel 4 beschrieben werden. Das hydrolytische Substrat wird in dem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel in einer Konzentration gelöst, die abhängt von seinem Molekulargewicht, die jedoch im allgemeinen bei 0,1 bis 20, und vorzugsweise bei 1 bis 10 mg/ml Lösungsmittel liegt. Bei Bestimmungsverfahren in Lösung ist die Menge an hydrolytischem Substrat, das vorliegt, mindestens 0,01 und vorzugsweise 10 bis 100 millimolar. Eine reduzierbare oder oxidierbare Verbindung kann in einer mindestens 0,001 und vorzugsweise 0,01 bis 1 millimolaren Menge vorliegen. Die Menge an Reduktionsmittel oder Oxidationsmittel, die in der Zusammensetzung vorliegt oder zugegeben wird zum Zeitpunkt der Bestimmung, kann von einem Fachmann leicht bestimmt werden, solange ein stöchiometrischer Überschuß in Beziehung zu der reduzierbaren bzw. oxidierbaren Verbindung vorliegt.
Die Bestimmung von lebenden Zellen, und insbesondere von bakteriellen Zellen erfolgt oftmals in Gegenwart eines Nährstoffes für diese Zellen, obgleich seine Gegenwart nicht wesentlich ist. Jedes beliebige Nährmedium kann eingesetzt werden, das nützliche Kohlenstoff- und gegebenenfalls Stickstofflieferanten enthält. Geeignete Nährmedien mit geeigneten Bestandteilen und pH-Werten sind dem Fachmann bekannt.
Einige Enzymanalyte erfordern einen Inducer, d. h. ein Material oder eine Kombination von Materialien, die die Bildung des Enzymes in der Zelle fördern. Der Typ des Inducers oder des Induktionsmediums, das angewandt wird, hängt von dem Enzym ab, das gebildet und bestimmt wird. In einigen Fällen können sowohl ein Inducer als auch ein Nährmittel oder ein Nährmedium benötigt werden, um die Bildung zu fördern.
Die vorliegende Erfindung ist anwendbar auf Bestimmungen in Lösung wie auch auf Trockenbestimmungen. Im Falle von Bestimmungsverfahren in Lösung wird eine Zusammensetzung, die in hydrolytisches Substrat enthält, durch Vermischen mit einer flüssigen Testprobe, die lebende Zellen oder einen hydrolytischen Analyten enthält, der bestimmt werden soll, in Kontakt gebracht. Im allgemeinen wird das Substrat mit der Testprobe in einem geeigneten Behälter vermischt. Die erhaltene Lösung wird vorsichtig vermischt und kann, falls erwünscht, für eine relativ kurze Zeitspanne bei einer Temperatur, die für den speziellen Analyten optimal ist, inkubiert werden. Die Testprobe wird dann untersucht durch Messung der erhaltenen bestimmbaren Spezies mittels einer geeigneten Bestimmungsvorrichtung.
Die Bestimmung in Lösung kann ferner durchgeführt werden durch Kontaktieren eines porösen absorbierenden Materials, wie beispielsweise eines Papierstreifens, der die Testprobe enthält, mit einer Dispersion des Substrates. Der Analyt in der Testprobe kann aus dem porösen Material in die Dispersion wandern und die analytischen Reaktionen auslösen, die für die Bestimmung benötigt werden.
Alternativ kann das Verfahren dieser Erfindung unter Verwendung eines trockenen analytischen Elementes durchgeführt werden. Ein solches Element kann ein absorbierendes Trägermaterial sein, d. h. ein dünnes Blatt oder ein dünner Streifen eines selbsttragenden absorbierenden oder aufsaugenden Materials, wie beispielsweise eines Filterpapieres oder Streifens, das das hydrolysierbare Substrat enthält, oder einen getrockneten Rest einer Zusammensetzung mit demselben.
Bei Verwendung in trockenen analytischen Elementen kann das Substrat in ein geeignetes absorbierendes Trägermaterial eingeführt werden durch Aufsaugen oder durch Imprägnieren oder es kann auf ein geeignetes absorbierendes Trägermaterial aufgeschichtet werden. Alternativ kann das Substrat dem Element während einer Bestimmung zugeführt werden. Geeignete Trägermaterialien sind unlöslich und behalten ihre strukturelle Integrität bei, wenn sie Wasser oder physiologischen Flüssigkeiten, wie beispielsweise Urin oder Serum, exponiert werden. Geeignete Trägermaterialien können hergestellt werden aus Papier, porösen teilchenförmigen Strukturen, Cellulose, porösen Polymerfilmen, Glasfasern oder gewebten und nicht gewebten Textilien (synthetischer oder nicht synthetischer Art).
Ein trockenes Bestimmungsverfahren kann in besonders vorteilhafter Weise unter Verwendung eines analytischen Elementes durchgeführt werden, das aufweist einen Träger, auf dem sich mindestens eine poröse Ausbreitzone, wie dem absorbierenden Trägermaterial, befindet. Das Substrat kann sich in der Ausbreitzone befinden oder in einer hiervon verschiedenen Zone (zum Beispiel einer Reagens-, Registrier- oder hydrophilen Zone). Die Ausbreitzone kann aus beliebigen geeigneten fasrigen oder nicht-fasrigen Materialien oder Mischungen von beiden hergestellt werden.
Das trockene analytische Element dieser Erfindung weist vorzugsweise einen geeigneten nicht porösen Träger auf, der das absorbierende Trägermaterial trägt. Ein solcher Träger kann aus einer beliebigen geeigneten, dimensionsstabilen und vorzugsweise transparenten (d. h. für Strahlung durchlässigen) Folie oder blattförmigem Material bestehen, die bzw. das elektromagnetische Strahlung einer Wellenlänge zwischen 200 und 900 nm durchläßt. Zu geeigneten Trägermaterialien gehören Polystyrol, Polyester, Polycarbonate, Celluloseester und andere aus dem Stande der Technik bekannte Materialien.
In den Elementen dieser Erfindung kann die Menge an dem hydrolytischen Substrat weitestgehend variiert werden, liegt jedoch im allgemeinen bei einer Beschichtungsstärke von mindestens 0,001 und vorzugsweise von 0,05 bis 1 g/m². Die reduzierbare oder oxidierbare Verbindung kann in das Element eingeführt werden während der Herstellung oder während des Bestimmungsverfahrens in einer Beschichtungsstärke von mindestens 0,01, und vorzugsweise von 0,05 bis 0,5 g/m². Weiterhin können das Reduktionsmittel oder Oxidationsmittel in entsprechender Weise zugegeben werden, um einen stöchiometrischen Überschuß bezüglich der reduzierbaren bzw. oxidierbaren Verbindung zu liefern. Eine Vielzahl von unterschiedlichen Elementen, abhängig von dem Bestimmungsverfahren, kann gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt werden. Die Elemente können in einer Vielzahl von Formen hergestellt werden, einschließlich in Form länglicher Bänder jeder gewünschten Breite, in Form von blattförmigen Materialien, Slides oder Chips.
Das Bestimmungsverfahren dieser Erfindung kann manuell oder in automatisierter Form durchgeführt werden. Im allgemeinen erfolgt bei Verwendung der trockenen Elemente eine Bestimmung eines Analyten oder von lebenden Zellen dadurch, daß das Element von einer Vorratsrolle, einem Chippaket oder einem anderen Vorratsbehälter entnommen wird und physikalisch in Kontakt gebracht wird mit einer Probe (zum Beispiel bis zu 200 ul) der zu testenden Flüssigkeit, derart, daß die Probe mit den Reagentien in dem Element vermischt wird. Ein solcher Kontakt kann in jeder beliebigen geeigneten Weise erfolgen, beispielsweise durch Eintauchen des Elementes in die Probe oder vorzugsweise durch Auftröpfeln von einem oder mehreren Tropfen der Probe mit der Hand oder maschinell mittels einer geeigneten Abgabevorrichtung. Praktisch gleichzeitig können alle anderen benötigten Reagentien, wie reduzierbare Verbindung, Reduktionsmittel, oxidierbare Verbindung oder Oxidationsmittel zu dem Element oder der Testprobe zugegeben werden, wenn sie nicht bereits in dem Element enthalten sind.
Im allgemeinen erfolgt die Bestimmung (in Lösung oder im Trockenen) unter Bedingungen derart, daß eine Hydrolyse des hydrolytischen Substrates durch das hydrolytische Enzym gefördert wird. Zu solchen hydrolysierenden Bedingungen gehören die Bedingungen des pH-Wertes, die ionische Stärke und Temperatur, welche für die Hydrolyse zweckdienlich sind. Im allgemeinen variiert der pH-Wert von einem Analyten zum anderen, liegt jedoch im Falle der meisten biologischen Analyte bei weniger als 9 und vorzugsweise weniger als 8. Die Temperatur ist nicht kritisch, liegt jedoch im allgemeinen bei weniger als 50ºC.
Die Bestimmung eines Analyten oder einer lebenden Zelle wird erreicht, wenn das hydrolytische Substrat hydrolysiert wird, unter Freisetzung eines Elektronenübertragungsmittels, das mit der reduzierbaren oder oxidierbaren Verbindung reagiert unter Freisetzung einer bestimmbaren Spezies oder eines Restes, der an einer oder mehreren zusätzlichen Reaktionen teilnimmt, unter Lieferung einer bestimmbaren Spezies. Diese bestimmbare Spezies kann in geeigneter Weise unter Verwendung einer geeigneten Vorrichtung bestimmt werden. Im Falle einer bevorzugten Ausführungsform wird das oxidierte (oder reduzierte) Elektronenübertragungsmittel reduziert (oxidiert) durch das Reduktionsmittel (Oxidationsmittel), wodurch es für die Reaktion mit zusätzlicher reduzierbarer (oder oxidierbarer) Verbindung zur Verfügung steht. Dieser Recyclinprozeß setzt sich fort, bis sämtliche reduzierbare (oder oxidierbare) Verbindung erschöpft ist. Die Bestimmung kann entweder aus einer Geschwindigkeits(rate)-Bestimmung bestehen oder einer Endpunkt-Bestimmung.
Die hier und in den Ansprüchen gebrauchte Abkürzung I.E. steht für Internationale Einheiten der Enzymaktivität, wobei eine I.E. die Menge an Enzymaktivität ist, die erforderlich ist, um die Umwandlung von einem Mikromol Substrat pro Minute unter Standard-pH- und Temperaturbedingungen für das Enzym zu katalysieren. Beispiel 1: Herstellung des hydrolytischen Substrates I Substrat I

Stufe 1: Herstellung von 4-Hydroxy-2,3,5-trimethylphenyl- 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosid

Eine Mischung von Pentaacetyl-β-D-galactopyranose, 15 g, 38 mMol 2,3,5-Trimethylhydrochinon, umkristallisiert aus Toluol, 17,5 g, 115 mMol sowie frisch destilliertes Phosphoroxychlorid (1,5 g, 9 mMol) wurden 24 Stunden lang in 150 ml Toluol in einer Vorrichtung auf Rückflußtemperatur erhitzt, um das anfallende Wasser und Essigsäure abzudestillieren. Nach Abkühlung auf Raumtemperatur wurde die Reaktionsmischung in 200 ml Wasser gegossen und die organische Phase wurde abgetrennt. Die wäßrige Phase wurde zweimal mit Toluol (100 ml) gewaschen und die organischen Extrakte wurden miteinander vereinigt und getrocknet. Das Lösungsmittel wurde entfernt und der Rest wurde durch Kolonnenchromatographie gereinigt (Kieselsäure, 80 : 20, Toluol:Ethylacetat) unter Gewinnung von 7,1 g Produkt. Nach zweimaliger Umkristallisation aus einem Gemisch aus Methanol:Wasser im Verhältnis 1 : 1 wurde das reine β-Anomer erhalten, Fp. 160-161ºC. Kohlenstoff- und Wasserstoff- NMR-Analysen bestätigten die Struktur.

Stufe 2: Herstellung des hydrolytischen Substrates I

Eine Mischung von 4-Hydroxy-2,3,5-trimethylphenyl-2,3,4,6- tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosid (2,9 g, 6 mMol) in 50 ml Wasser freiem Methanol und 6 ml einer frisch zubereiteten 1 molaren Natriummethoxidlösung wurde 2 Stunden lang bei 20ºC gerührt, worauf 750 mg eines AMBERLYST 15 (H&spplus;)-Ionenaustauschharzes zugegeben und die Mischung zusätzliche 1,5 Stunden lang gerührt wurde. Die Mischung wurde filtriert, das Harz wurde abgetrennt und mit Methanol gewaschen und das Filtrat wurde im Vakuum konzentriert, unter Gewinnung von 1,9 g Produkt. Das Material wurde aus einer Mischung von Methanol:Wasser im Verhältnis 1 : 1 umkristallisiert, unter Gewinnung des reinen Produktes, Fp. 217-219ºC. Massen-spektroskopische Analysen und Kohlenstoff- und Wasserstoff-NMR-Analysen bestätigten die Struktur. Berechnet für C &sub1;&sub5;H&sub2;&sub2;O&sub7;:
C: 57,3, H: 7,1, O: 35,6. Gefunden: C: 57,3; H: 6,9, O: 35,2. Beispiel 2: Herstellung des hydrolytischen Substrates II Substrat II

Stufe 1: Herstellung von 4-Hydroxy-2,3,5-trimethylphenyl- 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosid

Eine Mischung von Pentaacetyl-β-D-glucopyranose, 15 g, 38 mMol, 2,3 ,5-Trimethylhydrochinon (umkristallisiert aus Toluol, 17,5 g, 115 mMol) sowie frisch destilliertes Phosphoroxychlorid (1,5 g, 9 mMol) wurde in 150 ml Toluol in einer Vorrichtung 24 Stunden lang auf Rückflußtemperatur erhitzt, um das anfallende Wasser und Essigsäure abzudestillieren. Nach Abkühlung auf Raumtemperatur wurde die Reaktionsmischung in 200 ml Wasser gegossen und die organische Schicht wurde abgetrennt. Die wäßrige Phase wurde zweimal mit Toluol (100 ml) gewaschen, worauf die organischen Extrakte miteinander vereinigt und getrocknet wurden. Das Lösungsmittel wurde entfernt und der Rückstand wurde durch Kolonnenchromatographie gereinigt (Kieselsäure, 80 : 20, Toluol:Ethylacetat) unter Gewinnung eines Öles. Nach Kristallisation und Umkristallisation (4 ·) aus einem Gemisch aus Methanol:Wasser im Verhältnis 1 : 1 wurde das reine β-Anomer erhalten, Fp. 96-97,5ºC. Kohlenstoff- und Wasserstoff-NMR-Analysen bestätigten die Struktur.

Stufe 2: Herstellung des hydrolytischen Substrates II

Eine Mischung von 4-Hydroxy-2,3,5-trimethylphenyl-2,3,4,6- tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosid (1,53 g, 3,2 mMol) in 50 ml wasserfreiem Methanol und 3,2 ml frisch zubereiteter 1 molarer Natriummethoxidlösung wurde 1,5 Stunden lang bei 20ºC gerührt. Dann wurden 500 mg AMBERLYST 15(H&spplus;)-Ionenaustauschharz zugegeben und die Mischung wurde für weitere 1,5 Stunden gerührt. Die Mischung wurde dann filtriert, das Harz wurde abgetrennt und mit Methanol gewaschen und das Filtrat wurde im Vakuum konzentriert unter Gewinnung des Produktes. Dieses Material wurde aus 50 ml eines Methanol:Wasser-Gemisches im Verhältnis 1 : 1 umkristallisiert, unter Gewinnung von 500 mg weißer Nadeln, Fp. 222-223ºC. Massen-spektroskopische Analysen sowie Kohlenstoff- und Wasserstoff-NMR-Analysen bestätigten die Struktur. Beispiel 3: Herstellung des hydrolytischen Substrates III Substrat III
Eine Lösung von 10 g Phenazinmethosulfat in 20 ml Essigsäureanhydrid und 20 ml Eisessig wurde geschüttelt mit einem 10% Palladium-Kohle-Katalysator unter Wasserstoff in einer Hydriervorrichtung 1,5 Stunden lang bei 25ºC. Das Schütteln wurde dann eingestellt und die Mischung wurde 18 Stunden lang bei 25ºC stehengelassen. Der Katalysator wurde durch Filtration entfernt und das Filtrat wurde in 1 l Eis und Wasser gegossen, worauf 5 g Natriumbicarbonat zugegeben und die Mischung eine Stunde lang gerührt wurde. Die ausgefallene feste Masse wurde durch Filtration abgetrennt und gründlich mit Wasser gewaschen. Nach Trocknen an der Luft wog das Produkt 2,14 g, Fp. 139-141ºC. Das Material wurde durch Chromatographie auf Kieselsäure gereinigt (die Probe wurde in Methylenchlorid gelöst und mit Methylenchlorid und 10% Diethylether eluiert) und nach Umkristallisation aus Diethylether/ Ligroin wurde das reine Produkt erhalten, 1,57 g, Fp. 141-142ºC. IR- und NMR-Analysen bestätigten die Struktur.

Beispiel 4: Hydrolytisches Substrat und Zusammensetzung zur Bestimmung von β-Galactosidase

Eine analytische Zusammensetzung gemäß dieser Erfindung wurde hergestellt mit 20 ml hydrolytischem Substrat I, 10 mmolar in Methanol, wobei das Elektronenübertragungsmittel, das freigesetzt wurde, bestand aus 2,3,5-Trimethylhydrochinon, 1,5 ml einer Dispersion von reduzierbarer Verbindung I (hergestellt durch Lösen von 14,6 mg der reduzierbaren Verbindung I in 500 ml N,N-Dimethylformamid, Zusatz von 1 ml TRITON X-100® als oberflächenaktivem Mittel und Zugabe der erhaltenen Lösung zu 50 ml von 0,1 molarem Kaliumphosphatpuffer, pH-Wert 7,5), 30 ul NADH, 10 mmolar in Wasser, 10 ml Diaphorase, 1 mg/ml Wasser, enthaltend 2% Rinderserumalbumin; und 30 ml Magnesiumchlorid (0,1 molar in Wasser). Der pH-Wert der Zusammensetzung wurde auf 7,5 mit 1,4 ml eines 0,1 molaren Kaliumphosphatpuffers eingestellt. Die reduzierbare Verbindung I hatte die folgende Struktur:
worin DYE steht für
Diese Zusammensetzung wurde dazu verwendet, um zwei verschiedene Konzentrationen von β-Galactosidase (von Escherichia coli, Grade VI) zu bestimmen, durch Messung der Menge an bestimmbarem Farbstoff, der aus der reduzierbaren Verbindung freigesetzt wurde. Die Farbstoffdichte wurde bei 635 nm nach 30 Minuten bei 37ºC gemessen.
Der gleiche Analyt wurde ferner unter Anwendung eines standardisierten colorimetrischen Bestimmungsverfahrens als Vergleich bestimmt. Im Falle dieses Bestimmungsverfahrens wurde o-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid (2,3 · 10&supmin;³ molar, unten als ONPG identifiziert) als Substrat verwendet. Die Reaktion enthielt ferner Magnesiumchlorid (10&supmin;³ molar) sowie Kaliumphosphatpuffer (0,1 molar, pH 7,5). Die freigesetzte Farbstoffdichte wurde bei 410 nm nach 30 Minuten bei 37ºC gemessen. Tabelle I zeigt die Verbesserung (erhöhte optische Dichte), die erhalten wurde bei Verwendung einer Zusammensetzung gemäß dieser Erfindung. Die Daten für die optische Dichte ("Test Absorbance") sind die Daten nach Abzug des Hintergrundes. TABELLE I Analyt-Konzentration optische Dichte (20 Min.) Vergleich Test

Beispiel 5: Hydrolytisches Substrat und Zusammensetzung zur Bestimmung von β-Glucosidase

Es wurde eine analytische Zusammensetzung hergestellt mit 100 ul des hydrolytischen Substrates II (10 mmolar) in einem 0,1 molaren Natriumphosphatpuffer, 1,5 ml einer Dispersion von reduzierbarer Verbindung II (hergestellt wie in Beispiel 4 beschrieben), NADH (30 ul, 10 mmolar in Wasser), 10 ul Diaphorase (1 mg/ml Wasser), enthaltend 2% Rinderserumalbumin, und 0,1 molarem Natriumphosphatpuffer (1,3 ml, pH 6,5). Die reduzierbare Verbindung II hatte die folgende Struktur:
Diese Zusammensetzung wurde verwendet zur Bestimmung des Vorhandenseins von verschiedenen Mengen des hydrolytischen Substrates β-Glucosidase durch Messung des freigesetzten Farbstoffes bei 635 nm, wie in Beispiel 4 oben beschrieben. In Tabelle II unten sind die Analyt-Konzentrationen und der erhaltene Farbstoff, freigesetzt nach 30 Minuten Reaktionsdauer (identifiziert als Veränderung der optischen Dichte, ΔOD) bei 37ºC angegeben.

TABELLE II

β-Glucosidase-Konzentration (I.E./ml) ΔOD (bei 635 nm)
0 0,035
33 0,365
66 0,418
90 0,454

Beispiel 6: Vergleichsbeispiel unter Verwendung von hydrolytischem Substrat und einer Zusammensetzung für die Bestimmung von Esterase

Dieses Beispiel vergleicht die vorliegende Erfindung mit einem Standard-Bestimmungsverfahren für Schweineleberesterase.
Eine analytische Zusammensetzung gemäß dieser Erfindung wurde hergestellt mit dem hydrolytischen Substrat 111 (100 ul von einer 3 mg/ml methanolischen Lösung), 1,5 ml einer Dispersion einer reduzierbaren Verbindung II (4 mg reduzierbare Verbindung, 500 ul TRITON X-100® als nicht ionogenem oberflächenaktivem Mittel, 25 ul eines 0,05 molaren Phosphatpuffers, pH 7,5 und 250 ul angesäuertem N,N-Dimethylformamid), 1,4 ml zusätzlichem Phosphatpuffer und 24 ul NADH (4 mg/ml wäßriger Lösung).
Die Zusammensetzung wurde in einer Küvette mit 10 ul einer Esteraselösung, wie in Tabelle III unten angegeben, vermischt und der erhaltene Farbstoff wurde bei 635 nm gemessen unter Verwendung eines Standard-Spektrophotometers bei 28ºC in Zwei- Minuten-Intervallen.
Eine titrimetrische Vergleichsbestimmung wurde unter Verwendung von Ethylbutyrat als Substrat durchgeführt nach dem Verfahren, das beschrieben wird von Stotz in Methods in Enzymology, Band 1, S. 657, beruhend auf einer Methode von Harrier & Mitarbeitern, beschrieben in J. Biol. Chem., 138, S. 111 (1941). Natriumhydroxid (0,1 normal) wurde als Titrierlösung und Bromothymolblau als Indikator verwendet. Tabelle III zeigt ferner die Ergebnisse an, die im Falle dieser Vergleichsbestimmung erhalten wurden. Offensichtlich ist, daß das Verfahren der vorliegenden Erfindung eine mindestens 100-fache Steigerung der Bestimmung im Vergleich zum Vergleichsverfahren ermöglicht. TABELLE III Vergleichsbestimmung Enzym-Konzentration Ausgangs-Lösung Verdünnung Beispiel 3 ΔOD bei 365 nm nach 30 Minuten)
* Ausgangs-Lösung wurde hergestellt durch Zugabe von 10 ul Esterase zu 1 ml destilliertem Wasser.
NA = nicht gemessen.

Beispiel 7: Hydrolytisches Substrat und Zusammensetzung für die Bestimmung von Acylase-Enzym

Im Falle dieses Beispieles wurde eine Zusammensetzung dieser Erfindung zur Bestimmung eines Acylase-Enzymes verwendet.
Es wurde eine analytische Zusammensetzung hergestellt mit einer Dispersion einer reduzierbaren Verbindung II (1,5 ml, hergestellt wie in Beispiel 6 beschrieben), hydrolytischem Substrat 111 (100 ul einer 3 mg/ml methanolischen Lösung), 0,05 molarem Kaliumphosphatpuffer, pH-Wert 7,5 (1,3 ml), NADH (25 ul von 4 mg/ml Pufferlösung), und Enzym (100 ul von 10 mg/ml Pufferlösung von Acylase I, Grade I von Schweinenieren, Sigma Chemical Co.). Eine Vergleichslösung enthielt alle Reagentien mit Ausnahme des Enzyms. Die optischen Dichten wurden bei 635 nm bei 37ºC abgelesen und die Veränderung in der optischen Dichte (ΔA) wurde nach 30 Minuten bestimmt.
Lösung ΔA, 635 nm 30 Minuten, 37ºC
Vergleich (kein Enzym) 0,182
Vergleich (kein Substrat) 0,091
Test 2,208

Beispiel 8: Hydrolytisches Substrat und Zusammensetzung für die Bestimmung von Acylase-Enzym

Dieses Beispiel veranschaulicht ein Substrat und eine Zusammensetzung gemäß dieser Erfindung unter Verwendung von Ascorbat als Reduktionsmittel zur Bestimmung eines Acylase- Enzyms.
Die folgenden Lösungen wurden in 2 Küvetten eingebracht:
Küvette 1 : 1,3 ml eines 0,1 molaren 2-(4-Morpholino)ethansulfonsäurepuffers, 25 ml Acylase I von Schweinenieren, und 200 ul des hydrolytischen Substrates 111 (3 mg/ml methanolische Lösung).
Küvette 2 : 1,3 ml des 2-(4-Morpholino)ethansulfonsäurepuffers und 200 ul des hydrolytischen Substrates III.
Jede Küvette wurde 15 Minuten lang bei 37ºC inkubiert. Dann wurden 1,5 ml einer Dispersion von reduzierbarer Verbindung II bei einem pH-Wert von 6,5, hergestellt wie in Beispiel 6 beschrieben, und 25 ul von 4 mg/ml destillierter Wasserlösung von Natriumascorbat zu jeder Küvette zugegeben. Die optischen Dichten wurden bei 635 nm abgelesen und die Veränderung in der optischen Dichte (ΔA) wurde nach 30 Minuten bestimmt.
Lösung ΔA, 635 nm 30 Minuten, 37ºC
Hintergrund-Vergleich (Küvette 2) 0,250
Beispiel-Test (Küvette 1) 1,223

Claims

1. Hydrolisierbare Verbindung, gekennzeichnet durch die Formel:

BLOCK-ETA

worin bedeuten:

BLOCK gleich -CO-R*, Thioxophosphono oder ein Salz hiervon oder einen monovalenten Rest, der sich ableitet von einer Aminosäure, einem Peptid, einem Mono-, Oligo- oder Polysaccharid, wobei R* steht für Wasserstoff, eine substituierte oder unsubstituierte Alkylgruppe, eine substituierte oder unsubstituierte Alkenylgruppe, eine substituierte oder unsubstituierte Arylgruppe, eine substituierte oder unsubstituierte Cycloalkylgruppe oder eine substituierte oder unsubstituierte heterocyclische Gruppe, und

ETA eine Gruppe, die sich ableitet von einer Phenazin-, Naphthazin-, Phenothiazin- oder Phenazoniumverbindung oder einem substituierten para-Benzochinon oder Naphthochinon in entweder seiner oxidierten oder reduzierten Form,

wobei BLOCK und ETA miteinander durch den Redox-aktiven Teil des Elektronenübertragungsmittels (ETA) verbunden sind.

2. Analytische Zusammensetzung mit:

a) entweder einer reduzierbaren Verbindung, die ein feststellbares Signal als Folge einer Reduktion durch ein Elektronenübertragungsmittel in ihre reduzierte Form liefert, oder mit einer oxidierbaren Verbindung, die ein feststellbares Signal als Folge einer Oxidation durch ein Elektronenübertragungsmittel in ihre oxidierte Form liefert, und

b) einer hydrolisierbaren Verbindung,

wobei die Zusammensetzung dadurch gekennzeichnet ist, daß die hydrolisierbare Verbindung der Formel:

BLOCK-ETA

entspricht, in der bedeuten:

BLOCK gleich -CO-R*, Phosphono oder Thioxophosphono oder ein Salz hiervon oder einen monovalenten Rest, der sich von einer Aminosäure ableitet, eines Peptids, eines Mono-, Oligo- oder Polysaccharides, worin R* steht für Wasserstoff, eine substituierte oder unsubstituierte Alkyl-, substituierte oder unsubstituierte Alkenyl-, substituierte oder unsubstituierte Aryl-, substituierte oder unsubstituierte Cycloalkyl- oder eine substituierte oder unsubstituierte heterocyclische Gruppe, und

ETA eine Gruppe, die sich ableitet von einer Phenazin-, Naphthazin-, Phenothiazin- oder Phenazoniumverbindung oder einem substituierten Benzochinon oder Naphthochinon in entweder der oxidierten oder reduzierten Form,

wobei BLOCK und ETA miteinander durch den Redox-aktiven Teil des Elektronenübertragungsmittels miteinander verbunden sind.

3. Trockenes analytisches Element für die Bestimmung eines hydrolytischen Analyten mit einem absorbierenden Trägermaterial, dadurch gekennzeichnet, daß es eine hydrolisierbare Verbindung enthält, die gekennzeichnet ist durch die Formel:

BLOCK-ETA

worin bedeuten:

4. Verfahren zur Bestimmung eines hydrolytischen Analyten mit den Stufen:

A. Kontaktieren einer Probe einer Flüssigkeit, von der angenommen wird, daß sie einen hydrolytischen Analyten enthält, mit einer hydrolisierbaren Verbindung unter hydrolisierbaren Bedingungen, wobei die hydrolisierbare Verbindung gekennzeichnet ist durch die Formel:

BLOCK-ETA

worin bedeuten:

wobei BLOCK und ETA miteinander durch den Redox-aktiven Teil des Elektronenübertragungsmittels miteinander verbunden sind, wobei das Kontaktieren in Gegenwart von entweder einer reduzierbaren Verbindung durchgeführt wird, die ein feststellbares Signal als Folge einer Reduktion durch ein Elektronenübertragungsmittel in ihre reduzierte Form liefert oder in Gegenwart einer oxidierbaren Verbindung, die ein feststellbares Signal als Folge einer Oxidation durch ein Elektronenübertragungsmittel in ihre oxidierte Form liefert, unter Erzeugung einer bestimmbaren Spezies, und

B. Bestimmung der bestimmbaren Spezies aus der Reduktion oder Oxidation der reduzierbaren bzw. oxidierbaren Verbindung.

5. Verfahren nach Anspruch 4 zur Bestimmung eines hydrolytischen Enzyms.

6. Verfahren nach entweder Anspruch 4 oder 5, das in Gegenwart von entweder-einem Reduktionsmittel oder Oxidationsmittel durchgeführt wird, das zu einer Reduktion bzw. Oxidation befähigt ist, wobei sich das Elektronenübertragungsmittel in entweder seiner oxidierten bzw. seiner reduzierten Form befindet.

7. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem das Reduktionsmittel besteht aus Nicotinamidadenindinucleotid, reduzierte Form.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 4-7, bei dem es sich um ein Immunoassay für eine immunologische Spezies handelt, wobei der hydrolytische Analyt Teil einer markierten immunologischen Spezies ist.

9. Die hydrolisierbare Verbindung nach Anspruch 1, die Zusammensetzung nach Anspruch 2, das trockene analytische Element nach Anspruch 3 und das Verfahren nach einem der Ansprüche 4-8, worin sich ETA ableitet von einem Phenazinmethosulfat, Phenazinethosulfat oder einem substituierten para-Benzochinon oder Naphthochinon.

10. Die hydrolisierbare Verbindung nach Anspruch 1, die Zusammensetzung nach Anspruch 2, das trockene analytische Element nach Anspruch 3 sowie das Verfahren nach einem der Ansprüche 4-8, worin ETA sich ableitet von einem substituierten oder unsubstituierten Benzochinon oder Naphthochinon der folgenden Struktur:

worin R&sup7; und R&sup8; unabhängig voneinander stehen für Wasserstoff, Hydroxy, Halo, Cyano, Nitro, Carboxy, Carboxyalkyl, Carboxamido, Sulfonamido, Trihaloalkyl, Sulfonyl, Carboxaldehyd, Carbonylalkyl, substituiertes oder unsubstituiertes Alkyl, substituiertes oder unsubstituiertes Alkenyl, substituiertes oder unsubstituiertes Alkoxy, substituiertes oder unsubstituiertes Hydroxyalkyl, substituiertes oder unsubstituiertes Hydroxyalkoxy, substituiertes oder unsubstituiertes Alkoxyalkyl, substituiertes oder unsubstituiertes Oxyalkylenalkoxy, substituiertes oder unsubstituiertes Acetoxyalkyl, substituiertes oder unsubstituiertes Acetoxyalkoxy, substituiertes oder unsubstituiertes Aryl, substituiertes oder unsubstituiertes Alkaryl, eine substituierte oder unsubstituierte heterocyclische Gruppe oder eine substituierte oder unsubstituierte alkylheterocyclische Gruppe,

R&sup9; und R¹&sup0; jeweils unabhängig voneinander Gruppen wie für R&sup7; und R&sup8; angegeben, oder gemeinsam die Atome, die zur Vervollständigung eines 4- bis 8-gliedrigen ankondensierten carbocyclischen oder heterocyclischen Ringes erforderlich sind,

wobei gilt, daß mindestens einer der Reste R&sup7;, R&sup8;, R&sup9; und R¹&sup0; nicht für Wasserstoff steht.