DE3851810T2

DE3851810T2 - Polynukleotidentest unter Benutzung von Oligonukleotiden zur Eliminierung von unerwünschten Kreuzreaktionen.

Info

Publication number: DE3851810T2
Application number: DE3851810T
Authority: DE
Inventors: Lyle John Arnold
Original assignee: Gen Probe Inc
Current assignee: Gen Probe Inc
Priority date: 1987-07-31
Filing date: 1988-07-29
Publication date: 1995-02-09
Anticipated expiration: 2008-07-30
Also published as: NO891366L; JP2783568B2; AU623090B2; WO1989001049A1; FI891524L; US5434047A; DK153589D0; KR890701765A; PT88144A; FI891524A7; CA1323552C; AU2266588A; ATE112804T1; KR960002234B1; FI891524A0; JPH02500804A; EP0304184A1; DK153589A; NO891366D0; ES2063038T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Assay für eine gewünschte Nucleotidsequenz (die "Ziel-Nucleotidsequenz") die in Gegenwart anderer Nucleotidsequenzen (den " Nicht-Ziel- Nucleotidsequenzen") vorliegen kann, wobei letztere in das Assay für die erstgenannte Zielsequenz mit dem Resultat potentiell falscher qualitativer oder quantitativer Ergebnisse einzugreifen vermögen.
Es ist seit längerem bekannt, daß einmalige oder falsche bzw. fehlexprimierte Nucleotidsequenzen in einem Polynucleotid durch Hybridisierung mit einer multimeren Nucleotidsonde nachgewiesen werden können. Diese Technik erlaubt den frühen Nachweis von infektiösen Organismen wie Bakterien, Viren etc.; genetisch bedingten Krankheiten wie z. B. Sichelzellanämie; sowie verschiedenen Krebsarten. Die Sonde (die als "Ziel- Sonde" bezeichnet wird) wird gewählt mit einer komplementären Nucleotidsequenz (normalerweise genau komplementär) zu der Nucleotidsequenz, die nachgewiesen werden soll (die "Ziel-Nucleotidsequenz"). Folgend auf die Hybridisierung der Sonde mit dem Ziel-Polynucleotid werden alle gebildeten Ziel-Sonde/Polynucleotid-Hybride typischerweise von der unhybridisierten Sonde getrennt. Die Menge der Sonde in jeder der beiden voneinander getrennten Medien wird dann bestimmt, um ein qualitatives oder quantitatives Maß der Menge des ursprünglich vorhandenen Zieles bereitzustellen.
Bei vielen Assays können jedoch ein oder mehrere Nicht-Ziel-Polynucleotide vorhanden sein, die eine der Zielsequenz eng verwandte Nucleotidsequenz aufweisen (sich beispielsweise in nur 1 bis 5 Nucleotiden unterscheiden). In solchen Fällen kann dann das Nicht-Ziel-Polynucleotid das Assay durch Hybridisierung mit wenigstens einem Anteil der Ziel-Sonde stören und falsche qualitative oder quantitative Ergebnisse produzieren. Dieses Problem wird verschärft, wenn die Sondensequenz zum Assay für je verschiedene Spezies von Organismen einer besonderen Gattung gewählt wird, deren einzelne Spezies die identische oder sehr eng verwandte Ziel-Nucleotidsequenz enthalten (sich z. B. nur in einem Nucleotid unterscheiden).
Eine Lösung der erwähnten Art der Störung wurde beispielsweise von Wallace et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80 278-282 (1983) vorgeschlagen, bei der präzise Kontrolle der Stringenz verwendet wurde, um einzelne Nucleotidunterschiede festzustellen. Durch Verwendung von nur 19 Nucleotide langen Oligonucleotidsonden und durch präzise Kontrolle der Stringenz waren Wallace et al. fähig, an Nitrozellulose gebundene mit Sichelzellanämie assoziierten Hämoglobin-DNA von normaler Hämoglobin-DNA zu unterscheiden, wobei diese sich in nur einer Punktmutation voneinander unterschieden. Eine solches Verfahren bedient sich vorteilhaft der Tatsache, daß die Ziel-Sonde/Ziel-Polynucleotid-Hybride eine höhere Schmelztemperatur aufweisen als die Ziel-Sonde/Nicht-Ziel-Polynucleotid-Hybride, da die Nucleotidsequenz der Ziel-Sonde absichtlich ähnlicher komplementär der Ziel- Nucleotidsequenz als der Nucleotidsequenz jeglicher möglicherweise anwesenden anderen Nicht-Ziel-Polynucleotide gewählt wird. In dieser Art von Assays werden an Nitrozellulose gebundene Polynucleotide mit Polynucleotidsonden bei genau regulierter bzw. kontrollierter Temperatur hybridisiert, welche idealerweise zwischen den Schmelztemperaturen von Sonde/Ziel-Polynucleotid-Hybrid und dem Sonde/Nicht-Ziel-Polynucleotid-Hybrid liegt. Eben angeführte Schmelztemperaturen können sich jedoch manchmal nur um 2-3ºC unterscheiden.
Eine ernsthafte Schwierigkeit besteht somit bei gerade erwähntem Verfahren darin, daß es eine stringente Kontrolle der Temperatur verlangt, und selbst dann noch entweder spezifisch viele Möglichkeiten des Eingreifens durch das Nicht-Ziel-Polynucleotid zuläßt (d. h. relativ große Mengen der Sonde sind mit dem Nicht-Ziel-Polynucleotid hybridisiert), oder in zu geringem Maße Hybridisierung zwischen der Ziel-Sonde und dem Ziel- Polynucleotid bewirkt, und so potentiell zu falschen qualitativen Ergebnissen führt. Darüberhinaus wird für quantitative Ergebnisse ein sogar noch viel höherer Grad an Temperaturkontrolle verlangt, da die Temperatur in jeweils zwei Assays genau gleich gehalten werden muß, welche erforderlich sind zur Bestimmung einer Eichkurve sowie zum Assay für eine unbekannte Probe.

Definitionen

Die in dieser Offenbarung sowie in diesen Ansprüchen benutzten Begriffe sind definiert als:
Nucleotid: eine Untereinheit einer Nucleinsäure, bestehend aus einer Phosphatgruppe, einem Zucker mit 5 Kohlenstoffatomen und einer Stickstoff enthaltenden Base. Bei RNA ist der Zucker mit 5 Kohlenstoffatomen Ribose. In DNA ist er 2- Desoxyribose.
Nucleotidmultimer: eine Kette aus Nucleotiden, verbunden durch Phosphodiesterbindungen oder deren Analoga.
Oligonucleotide: ein in der Regel aus etwa 10 bis etwa 100 Nucleotiden bestehendes Nucleotidmultimer, welches aber auch 200 Nucleotide oder länger sein kann. Sie werden in der Regel aus Nucleotidmonomeren synthetisiert oder mittels enzymatischen Methoden gewonnen.
Polynucleotid: ein in der Regel mehr als etwa 100 Nucleotide langes Nucleotidmultimer.
Ziel-Nucleotidsequenz: eine Nucleotidsequenz, für die ein Assay ausgeführt wird. Sie kann eine Gruppe von eng verwandten Nucleotidsequenzen einschließen (z. B. welche sich nur in einem Nucleotid unterscheiden, wie bei verschiedenen Organismen einer Gattung).
Nicht-Ziel-Nucleotidsequenz: eine oder mehrere Nucleotidsequenzen, die ein Assay für eine Ziel-Nucleotidsequenz unter Verwendung einer gewählten Sonde aufgrund eines hohen Grades an Sequenzhomologie zur Ziel-Nucleotidsequenz stören können. In der Regel, aber nicht notwendigerweise befinden sich die Ziel- sowie Nicht-Ziel- Nucleotidsequenzen auf verschiedenen bzw. distinkten Nucleotidmultimeren. Die Nicht-Ziel-Sonde kann nur zu einem Teil der Nicht-Ziel-Sequenz komplementär sein und kann auch auf Teile sowohl der Nicht-Zielsequenz als auch daran anschließender Nucleotide überlappen. Nur nötig ist, daß die Nicht-Ziel-Sonde mit genügend Nicht-Ziel-Sequenz hybridisiert, um Kreuzreaktion mit der Ziel-Sonde zu verhindern.
Nucleotidmultimer-Sonde: eine Sonde, die selbst ein Nucleotidmultimer ist (für gewöhnlich, aber nicht notwendigerweise, ein Oligonucleotid), welche gewählt wird, um bevorzugt mit einem Ziel- oder Nicht-Ziel-Nucleotidmultimer zu hybridisieren.
Schmelztemperatur: die Temperatur bezüglich eines Nucleotidmultimerhybrids, bei der eine Hälfte des Mybrids denaturiert ist.
Die vorliegende Erfindung stellt für ein Assay für eine Ziel-Nucleotidsequenz unter Verwendung einer gewählten Sonde (der "Ziel-Sonde") ein Mittel bereit, mit Hilfe dessen eine Störung durch eine oder mehrere Nicht-Ziel-Nucleotidsequenzen vermindert werden kann. Dies wird ausgeführt durch Bereitstellen eines Assays für eine Zielnucleotidsequenz in einer Probe mit folgenden Schritten:
(a) Vorsehen einer Ziel-Sonde mit einer Nucleotidsequenz, die in der Lage ist, bei Hybridisierungsbedingungen unter Bildung eines ersten Hybridkomplexes mit der Ziel- Sequenz spezifisch zu hybridisieren, wobei die Nucleotidsequenz der Ziel-Sonde ebenfalls in der Lage ist, mit einer Nicht-Ziel-Nucleotidsequenz, gesondert und verschieden von der Ziel-Sequenz, bei den Bedingungen unter Bildung eines zweiten Hybridkomplexes, gesondert und verschieden von dem ersten Hybridkomplex, spezifisch zu hybridisieren, wobei bei den Bedingungen die Schmelztemperatur des ersten Hybridkomplexes höher als die des zweiten Hybridkomplexes ist.
(b) Vorsehen einer Nicht-Ziel-Sonde mit einer zweiten Nucleotidsequenz, die in der Lage ist, mit einer Nicht-Ziel-Nucleotidsequenz bei den Bedingungen unter Bildung eines dritten Hybridkomplexes spezifisch zu hybridisieren, wobei bei den Bedingungen die Schmelztemperatur des dritten Hybridkomplexes höher als die des zweiten Hybridkomplexes liegt,
(c) Inkontaktbringen der Probe mit der Ziel-Sonde und mindestens einer besagten Nicht- Ziel-Sonde unter den Bedingungen in einem flüssigen Medium in Abwesenheit eines Festphasenträgers, und
(d) Durchführen des Assays zur Hybridisierung der Ziel-Sonde mit der Probe.
Vorzugsweise hiermit stellt die vorliegende Erfindung ein Assay und ein Kit zur Durchführung eines solchen Assays bereit, mit dem eine Ziel-Polynucleotidsequenz auch bei möglicher Anwesenheit einer Nicht-Ziel-Polynucleotidsequenz nachgewiesen wird. Das Medium wird unter Hybridisierungsbedingungen mit verschiedenen Ziel- sowie Nicht-Ziel- Nucleotidsequenz-Sonden versetzt. Dies erlaubt die Hybridisierung der Ziel-Sonde mit dem vorliegenden Ziel (d. h. dem möglicherweise vorliegenden Ziel). Da jedoch die Ziel- sowie Nicht-Ziel-Sequenzen eng verwandt sind, kann die Sonde auch zufällig mit vorhandenen Nicht-Ziel-Polynucleotidsequenzen hybridisieren. Die Nicht-Ziel-Sonde oder -Sonden werden so gewählt, daß sie unter solchen Hybridisierungsbedingungen mit vorliegenden Nicht-Ziel-Polynucleotidsequenzen so hybridisieren, daß der Grad an jeglicher Ziel- Sonde/Nicht-Ziel-Hybridisierung vermindert wird, welcher in Abwesenheit der Nicht-Ziel- Sonde auftreten kann, wobei jegliche Ziel-Sonde/Ziel-Hybridisierung nicht übermäßig vermindert wird (d. h. nicht in einem so hohen Grad vermindert wird, daß das Assay in der praktischen Anwendung undurchführbar wird).
Die Erfindung kann mit jedem beliebigen Standard-Hybridisierungsverfahren eingesetzt werden. In der Regel wird die Ausbildung des Ziel-Sonde/Ziel-Hybrids auf einer Oberfläche oder in Lösung so verwendet, daß der Nachweis des Ziel-Sonde/Ziel-Hybrids ohne den Nachweis übermäßiger Mengen an unhybridisierter Ziel-Sonde ermöglicht wird. Dies wird unter Verwendung folgender Arbeitsvorschrift ausgeführt:
Ausbildung des Ziel-Sonde/Ziel-Hybrids in Lösung, gefolgt von der Absonderung des Hybrids von unhybridisierter Ziel-Sonde.
Um die Menge der vorliegenden Ziel-Nucleotidsequenz entweder quantitativ oder qualitativ durch Anwendung dieses Verfahrens bestimmen zu können, kann die Menge von hybridisierter oder unhybridisierter Ziel-Sonde bestimmt werden und der Menge an gebildetem Hybrid zugeordnet werden. Typischerweise wird die Menge an Ziel-Sonde in hybridisierter Form bestimmt, ausgenommen in solchen Fällen, in denen die Ziel-Sonde eine vorher hybridisierte, markierte Sonde verdrängt (siehe z. B. Clin. Chem. 32, 1696- 1701(1986)).
Die Erfindung kann in verschiedenen Ausführungsarten verwendet werden. Wenn z. B. verbesserte homogene Assay-Verfahren zur Verfügung stehen, wird das hier als Erfindung beschriebene Verfahren auch in homogenen Assayformen nützlich sein. In allen Erscheinungsformen wird in dem Hybridisierungs-Assay an einem Punkt verlangt, daß die Nicht-Ziel-Sonde oder -Sonden zur Hybridisierung mit der (den) Nicht-Ziel-Sequenz(en) fähig sind, ohne signifikant mit der Zielsequenz zu hybridisieren. Dieses "Abdecken" (capping) der Nicht-Ziel-Sequenz(en) kann entweder vor, während, oder nach der Hybridisierung zwischen der Ziel-Sonde und der Zielsequenz stattfinden. Eine bevorzugte Ausführungsform ist, das "Abdecken" während der Hybridisierung zwischen der Ziel- Sonde und der Ziel-Sequenz zu verwenden. Diese Anwendung der Erfindung kann in verschiedenen Formen erfolgen. Diese beinhalten:
1. Isotherm: Hybridisierung findet bei einer gleichbleibenden Temperatur statt.
2. Langsam abkühlend: Die Hybridisierung findet über einen fallenden Temperaturbereich statt, der in der Regel die Schmelztemperatur (Tm) des Ziel- Sonde/Ziel-Nucleotidsequenz-Hybrids einschließt.
Alternativ hierzu kann (können) die Nicht-Ziel-Sonde(n) zum "Abdecken" der Nicht-Ziel- Sequenzen zeitlich vor der Ziel-Sonde zugefügt werden. Ebenfalls geeignet ist es, die Ziel- Sonde/Zielsequenz-Hybridisierung bei hohen Temperaturen und/oder hochstringenten Bedingungen durchzuführen, und dann die Nicht-Ziel-Sonde zuzugeben, um Ziel-Sonde/- Nicht-Zielsequenz-Hybridisierung bei nachlassender Temperatur und/oder Stringenz zu vermeiden.
Hybridisierungsbedingungen werden bevorzugterweise erreicht durch erstmaliges Erhitzen des Mediums, um wenigstens die Sonden sowie jegliche vorhandene Ziel-Sequenz zu denaturieren (und bevorzugterweise bis zu einer Temperatur, welche alle vorliegenden Nucleotidmultimere denaturiert), und anschließendes graduelles Abkühlen des Mediums auf eine Temperatur, bei der die Ziel-Sonde mit der Ziel-Sequenz hybridisieren kann (und bei der bevorzugterweise alle Hybridisierungen abgeschlossen sind). Während der Abkühlung kann Nicht-Ziel-Sonde mit Nicht-Ziel-Sequenz hybridisieren, um eine Kreuzreaktion beim späteren Erreichen der Temperatur, bei der die Ziel-Sonde mit der Nicht-Ziel-Sequenz hybridisiert, zu verhindern. In einem Aspekt der Erfindung werden die Hybridisierungsbedingungen durch gerade beschriebene Maßnahmen festgelegt, wobei sich alle Polynucleotide in einem flüssigen Medium in Abwesenheit jeglichen Festphasenträgers befinden, an welchen das flüssige Medium absorbiert ist. Eine derartige Festphase würde einen festen Träger wie z. B. Nitrozellulose einschließen.
In einem anderen Aspekt der Erfindung wird die Ziel-Sonde mit einem oder mehreren Atomen oder Molekülen, welche sich selbst zum direkten Nachweis eignen, markiert. Solche Markierungen können - sind aber nicht darauf beschränkt - Strahlungsmarkierungen, Enzyme, Chemilumeneszenzmarkierungen, kolorimetrische Markierungen und Fluoreszenzmarkierungen einschließen. Darüberhinaus schließt der Schritt zum Nachweis auf Anwesenheit der Ziel-Sonde, wie schon beschrieben bevorzugterweise ein, jegliche mit Nucleotidmultimeren hybridisierte Ziel-Sonde von nicht in dieser Weise hybridisierter Ziel- Sonde abzusondern (und bevorzugterweise zu trennen). Diese Absonderung (oder Trennung) kann ausgeführt werden durch selektive Absorption der Polynucleotidhybride an einer festen Trägersubstanz wie Hydroxylapatit unter Verwendung des von Kohne, D.E. und Britten, R.J., "Nucleic Acid Research" Vol. 2, S. 500-12 (1971) beschriebenen Verfahrens. Wenn sich jedoch die Ziel-Nucleotidsequenz auf einem Polynucleotid bedeutend größerer Lange als der Ziel-Sonde befindet (was typischerweise für ein Polynucleotid aus einer klinischen Probe ist), kann die Trennung bevorzugterweise ausgeführt werden durch selektive Immobilisierung der längeren Ziel-Sequenz mit ihrer hybridisierten Ziel-Sonde an polykationischen Partikeln durch Ionenbindung.
Ausführungsformen der Erfindung werden im folgenden anhand der Fig. 1 und 2 beschrieben.
Fig. 1 illustriert graphisch die Wärmestabilität der im weiter unten beschriebenen Experiment erzeugten Hybride.
Fig. 2 illustriert in einem Diagramm das Verhältnis verschiedener möglicher Hybride und ihrer Schmelzpunkte zueinander.

BEISPIEL I

Zur Demonstration der vorliegenden Erfindung wurden vier synthetische Oligonucleotide hergestellt, im folgenden als "SONDE", "ZIEL", "MIß-SONDE" und "MIß-ZIEL" bezeichnet. Die Sonde besteht aus einer 35 Basen langen Sequenz, und stellt ein exaktes Komplement zum "ZIEL" dar. Das MIß-ZIEL (MIS-TARGET) enthält die ZIEL-Sequenz mit zwei Austauschen (fehlenden Übereinstimmungen = mismatches): in Position 12 ist A durch T ersetzt, und in Position 24 ist C durch G ersetzt. DIE MIß-SONDE ist das exakte Komplement zum MIß-ZIEL. Die zwei Substitutionen befinden sich im Abstand von 1/3 vom Ende der Sonde. Bei allen Sequenzen ist der Purin- und Pyrimidingehalt sowie der G + C-Gehalt konstant.
Die Sonden wurden unter Verwendung eines Applied Biosystems, Inc. Model 380A DNA- Synthesizers hergestellt und unter Verwendung der Standardverfahren gereinigt (Tetrahedron 39 3-22 (1983)).
Die Sequenzen der angeführten Oligonucleotide sind wie folgt:
SONDE: 5'CAG TCA AAC TCT AGC CAT TAC CTG CTA AAG TCA TT 3'
ZIEL: 3'GTC AGT TTG AGA TCG GTA ATG GAC GAT TTC AGT AA 5'
MIß-SONDE: 5'CAG TCA AAC TCA AGC CAT TAC CTC CTA AAG TCA TT 3'
MIß-ZIEL: 3'GTC AGT TTG AGT TCG GTA ATG GAG GAT TTC AGT AA 5'.
In folgenden Experimenten agieren SONDE und MIß-SONDE als Nucleotidmultimer- Sonden, während ZIEL und MIß-ZIEL jeweils als entweder Ziel- oder Nicht Ziel- Nucleotidmultimer agieren (wobei die gesamte Sequenz jedes der beiden entweder eine Ziel- oder eine Nicht-Ziel-Nucleotidsequenz darstellt).
Zuerst wurde die thermische Stabilität jeder der Sonden mit jeder der Ziel-Multimeren ermittelt. Die SONDE und MIß-SONDE wurden unter Verwendung von T&sub4;-Kinase, ³²P und Gamma-Adenosintriphosphat (ATP) endmarkiert, und anschließend jeweils unabhängig hybridisiert mit je ZIEL sowie MIß-ZIEL (also insgesamt vier unabhängige Hybridisierungen) bei 50ºC in 0,48 M Phosphatpuffer pH 6,8 und 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS). Aliquote (10 ul) der Lösungen wurden dann verdünnt in 3 ml eines "Reakionspuffers", bestehend aus 0,1 M Phosphatpuffer pH 6,8 und 0,1% SDS, und 5 Minuten lang bei verschiedenen Temperaturen erhitzt, wie in Fig. 1 angezeigt. Der Prozentsatz der hybridisierten Sonde wurde durch Bindung an Hydroxylapatit bei 45ºC in 0,08 M Phosphatpuffer pH 6,8 und 0,02% SDS unter Verwendung des Verfahrens von Kohne, oben, ermittelt. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 in Prozent zum verbleibenden Nucleotideinzelstrang angegeben. Die Temperatur, bei der die Hälfte der Sonde hybridisiert bleibt, und die andere Hälfte der Sonde als Einzelstrang vorliegt, ist als die Schmelztemperatur (Tm) bekannt, und wird als das Maß der thermischen Stabilität verwendet. Wurde das exakte Komplement (Zielmultimer) jeweils jeder Sonde ersetzt durch das Nicht-Ziel-Multimere (also Ersetzen des Komplementes jeweils jeder Sonde durch ein von dieser nur in zwei Basen abweichendem Nucleotidmultimeren), ergab sich daraus eine Erniedrigung der Schmelztemperatur um 6-7ºC.
Fig. 2 illustriert die Hybridisierungs-Tm der verschiedenen möglichen Reaktionen und Kreuzreaktionen.
In Bezug auf Fig. 1 wird ersichtlich, daß in einem Assay für entweder ZIEL oder MIß- ZIEL (Jenes, für welches das Assay gewünscht ist, wird als "Ziel-Nucleotid-Multimer" bezeichnet, wobei das andere als das "Nicht-Ziel-Nucleotid-Multimer" bezeichnet wird), wobei beide zusammen anwesend sein können, es schwierig werden könnte, eine Temperatur zu wählen, bei der der größte Anteil des Zielmultimeren mit seiner komplementären Sonde (der Ziel-Sonde) hybridisieren würde, ohne daß gleichzeitig ein nicht unbeträchtlicher Anteil der Ziel-Sonde hybridisiert mit dem Nicht-Ziel-Multimeren vorliegen würde. So würde also das Nicht-Ziel-Nucleotid-Multimer das Assay für das Ziel- Nucleotid-Multimer stören, sofern nicht eine Temperatur gewählt wird, bei der nur ein kleiner Teil des Ziel-Nucleotid-Multimeren hybridisiert vorliegt.
Die vorliegende Erfindung reduziert erheblich die Störung, die durch eine Nicht-Ziel- Nucleotidsequenz auftreten kann, und kann somit die Notwendigkeit stringenter Temperaturkontrolle aufgrund der Anwesenheit von Ziel-Sonde sowie Nicht-Ziel-Sonde während der Hybridisierung überflüssig machen.
Um das Vorhergehende zu illustrieren, wurde ein weiteres Experiment unternommen. SONDE und MIß-SONDE wurden in Reaktionspuffer nach den in unten angeführter Tabelle angegebenen Molverhältnissen vermischt. Im Wasserbad wurden die Reaktionsansätze 5 Minuten auf 70ºC erhitzt und dann über einen Zeitraum von 2 Stunden auf 50ºC abgekühlt. Darauf wurde die Inkubation bei 50ºC 1 Stunde lang fortgesetzt. Das anfängliche Erhitzen der Reaktionsansätze stellte sicher, daß bei Beginn alle Sequenzen einzelsträngig (d. h. "denaturiert") vorlagen; die abschließende Temperatur von 50ºC erlaubte die Hybridisierung aller Kombinationen aus Sonde und Zielsequenz, da sie weit unterhalb aller Tm's lag. Wie später gezeigt wird, bevorzugte eine graduelle Abkühlung die Paarung von exakten Komplementen gegenüber mißgepaarten Komplementen, da die Temperatur langsam ihre jeweiligen Tm's durchschritt. Die Reaktionen wurden mittels Bindung an Hydroxylapatit wie schon vorher beschrieben nachgewiesen.
Um die in TABELLE 1(A) angeführten Ergebnisse zu erhalten, wurde die Ziel-Sonde markiert, und ZIEL sowie MIß-ZIEL stellten das Ziel- sowie das Nicht-Ziel-Nucleotid- Multimer dar, während die MIß-SONDE unmarkiert war. Die Ergebnisse in Tabelle 1(A) zeigen, daß: (1) die Hybridisierung der Ziel-Sonde mit dem Ziel-Multimeren (Reaktionen A-D) nicht übermäßig verhindert wird durch Anwesenheit eines bis zu 4fachen Überschusses an Nicht-Ziel-Sonde; (2) überschüssige unmarkierte Sonde unter den gleichen Bedingungen mit der markierten Sonde einigermaßen wie erwartet werden konnte, konkurriert (in den Grenzen der experimentellen Unsicherheit) (Reaktionen E-G); (3) die Ziel-Sonde signifikant mit Nicht-Ziel hybridisiert (Reaktion H), aber diese Hybridisierung sehr effektiv beseitigt wird durch die Anwesenheit sogar relativ geringer Mengen an Nicht- Ziel-Sonde (1 : 1-Molverhältnis zur Ziel-Sonde) (Reaktionen I-K); und (4) bei Vermischen beider Sonden mit beiden Multimeren die Nicht-Ziel-Sonde offensichtlicherweise mit dem Nicht-Ziel-Multimer hybridisiert und so das Ausmaß an jeglicher Ziel-Sonde/Nicht-Ziel- Multimer-Hybridisierung verringert, die in Abwesenheit der Nicht-Ziel-Sonde stattfinden könnte, wobei die Ziel-Sonde/Ziel-Multimer-Hybridisierung kaum beeinträchtigt (und gewiß auch nicht übermäßig vermindert) wird (Reaktionen L-O).
Die Tabelle 1(B) zeigt die Ergebnisse des selben Experimentes, ausgeführt mit der MIß- ZIEL-SONDE als markierter Sonde, und der ZIEL-SONDE als unmarkierter Sonde. Insofern können hier MIß-ZIEL sowie ZIEL als jeweils Ziel- sowie Nicht-Ziel-Nucleotid- Multimere betrachtet werden. Die Ergebnisse bestätigen ebenso die oben angeführten Schlußfolgerungen (1)-(4). Insbesondere repräsentieren die Reaktionen A und H aus Tabelle 1(B) eine Situation, in der die zwei Ziel-Multimeren nicht durch die einzige markierte Sonde unterschieden werden konnten (82% gegenüber 78% Hybridisierung). Die Anwesenheit der Ziel-Sonde (hier verwendet als eine Nicht-Ziel-"Abdeck"-Sonde) statt dessen fördert einen klaren Unterschied im Ausmaß der Hybridisierung. In diesem Fall betrug der gewünschte Hybridisierungsgrad von markierter MIß-SONDE mit dem MIß- ZIEL 56% im Vergleich zu 0% von markierter MIß-SONDE mit dem ZIEL (Reaktionen D und K).
Ein Experiment wurde ausgeführt, um das Verfahren der graduellen Abkühlung mit dem isothermalen Verfahren zu vergleichen. Die Reaktionen A-D und H-K aus Tabelle 1(A) wurden wiederholt, jedoch mit dem Unterschied, daß nach dem Schritt des Vorheizens auf 70ºC die Temperatur sofort auf die Inkubationstemperatur von 50ºC oder 55ºC gesenkt wurde (durch Hineinstellen der die Reaktionslösungen enthaltenden Gefäße in Wasserbäder mit den eben genannten Temperaturen), wie in TABELLE 2 angegeben. Die Inkubation wurde darauf bei der Inkubationstemperatur für 2 Stunden fortgesetzt, und die Reaktionsansätze wie schon beschrieben mittels Hydroxylapatit untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Aus Tabelle 2 ist ersichtlich, daß bei sofortiger Kühlung die Menge an hybridisiertem Ziel-Sonde/Ziel-Multimer in Gegenwart der "Abdeck"-MIß- ZIEL-SONDE etwas verringert ist (Reaktionen A-D), während die Menge an hybridisiertem ZIEL-SONDE/MIß-ZIEL-Multimer etwas größer ist (Reaktionen H-K). Insofern scheint sich graduelles Abkühlen als Teil des Erreichens der Hybridisierung in dem in der vorliegenden Erfindung angegebenem Verfahren vorteilhaft auszuwirken. TABELLE 1 Effekt von Sondenverhältnissen auf die Verdrängung Markierte Sonde Unmarkierte Sonde Nicht-Ziel-Sonde Ziel Miß-Ziel Hybridisierung Hybridisierung (normiert) Markierte Miß-Sonde Unmarkierte Miß-Sonde Ziel-Sonde Miß-Ziel Ziel Hybridisierung Hybridisierung (normiert)
* Fußnote: Entspricht 0,1 pMol der Sonde in einer 10-ul-Hybridisierungsreaktion TABELLE 2 Temperatureffekt Markierte Sonde "Abdeck"-Miß-Sonde Ziel Miß-Ziel Hybridisierung Langs. Kühlen Hybridisierung (normiert) Hybridisierung Isotherm Hybridisierung (normiert) Isotherm Hybridisierung (normiert)
* Fußnote: Entspricht 0, 1 pMol der Sonde in einer 10-ul-Hybridisierungsreaktion.
Es wurde oben gezeigt, daß für einen Assay für eine Ziel-Nucleotidsequenz unter Verwendung einer Ziel-Sonde die Störung durch eine Nicht-Ziel-Nucleotidsequenz (charakteristischerweise ein anderes Nucleotid-Multimer) verringert werden kann durch Bereitstellen einer Nicht-Ziel-Sonde, die mit dem Nicht-Ziel-Nucleotid-Multimer ein Hybrid bildet, dessen Tm höher liegt, als der Tm vom Ziel-Sonde/Nicht-Ziel-Nucleotid- Multimer, welche mit dem Nicht-Ziel-Nucleotid-Multimer ein Hybrid bildet. Somit kann in einen Assay für jede gegebene Ziel-Nucleotidsequenz die potentielle Störung durch eine nah verwandte Nicht-Ziel-Nucleotidsequenz vermindert werden. Darüberhinaus wird, wie oben gezeigt wurde, wenn die Hybridisierungsbedingungen durch graduelles Abkühlen erreicht werden, der oben angegebene vorteilhafte Effekt weiter verstärkt.
Das Verhältnis von Nicht-Ziel-Sonde zu Ziel-Sonde kann beträchtlich variieren. Bevorzugt wird ein Verhältnis nicht größer als 9 zu 1, und das besonders bevorzugte Verhältnis ist nicht größer als 4 zu 1.
Die Menge der verwendeten Nicht-Ziel-Sonde kann über einen weiten Bereich variieren, und dennoch die oben angegebenen verbesserten Ergebnisse zur Verfügung stellen. Jedoch ist es bevorzugt, daß die Nicht-Ziel-Sonde in ungefähr äquimolarem Verhältnis zur Nicht- Ziel-Sequenz vorliegt, und speziell zu bevorzugen ist ein molares Verhältnis, das einen Überschuß zur in der Probe vorliegenden Nicht-Ziel-Sequenz darstellt. Dies kann erreicht werden durch Verwendung einer größeren Menge der Sonde als der Menge an Ziel- und Nicht-Ziel-RNA-Sequenzen in der Probe.
Obwohl in oben angegebenen Experimenten sich die Ziel- und Nicht-Ziel- Nucleotidsequenzen über die gesamte Lange des Ziel- sowie Nicht-Ziel-Nucleotid- Multimeres erstreckten, wird augenfällig, daß dies nicht unbedingt so sein muß. Tatsächlich stellen bei den meisten klinischen Anwendungen beide Sequenzen nur einen Teil der Länge von wesentlich längeren Ziel- und Nicht-Ziel-Polynucleotiden dar. Das folgende Beispiel illustriert solch einen klinischen Assay.

BEISPIEL II

In diesem Fall wurden die synthetische Ziel-Sonde und die Nicht-Ziel-Sonde an zelluläre RNA hybridisiert, wie es in einem klinischen Assay der Fall sein könnte. Das System bestand aus Neisseria gonorrhoea (gon-RNA als das erwünschte Ziel) und Neisseria meningitidis (men-RNA als das unerwünschte Fehlpaarungs-Ziel). Sonden wurden synthetisiert, die, bis auf zwei angegebene Basenfehlpaarungen, wie in BEISPIEL 1, komplementär zu beiden RNA-Spezies waren. Die Sondensequenzen waren wie folgt:
Gon-Sonde: 5'GAG GAT TCC GCA CAT GTC AAA ACC AGG TAA 3'
Men-Sonde: 5'GAG GAT TCC GTA CAT GTC AAG ACC AGG TAA GG 3'
Die Sonden wurden wie in Beispiel 1 synthetisiert. Die Sondensequenzen wurden durch Sequenzalignment nahe verwandter Organismen und Auswahl der für die gewünschten Organismen spezifischen Bereiche erhalten.
Die Tm's jeder Kombination aus Sonde und Ziel-RNA wurden bestimmt: gon-Sonde mit gon-RNA 59,2ºC, gon-Sonde mit men-RNA 48,2ºC, men-Sonde mit men-RNA 61,5ºC und men-Sonde mit gon-RNA 55ºC. Wie es der Fall in erstem obengenanntem Arbeitsbeispiel war, hatte die exakt gepaarte Hybridisierung eine Tm ungefahr 6-10ºC über der entsprechenden fehlgepaarten Hybridisierung.
Hybridisierungsassays wurden analog zu den isothermalen 550 C-Bedingungen aus Tabelle 2 mit einem zusätzlichen langsamen Kühlschritt von 55ºC auf 40ºC durchgeführt. (In diesem Fall wurden die Hybridisierungen in 0,48 M Phosphatpuffer pH 6,8 und 0,5% SDS vorgenommen und die Hydroxylapatittrennungen in 0,12 M Phosphatpuffer pH 6,8 und 0,02% SDS bei 40ºC durchgeführt.) Die Reaktionsmischungen wurden für 5 Minuten auf 70ºC erhitzt, um komplette Denaturierung aller Komponenten sicherzustellen, sofort auf 55ºC abgekühlt, 15 Stunden inkubiert, langsam über eine Zeitspanne von 4 Stunden auf 40ºC abgekühlt, und dann eine weitere Stunde wiederum bei 40ºC inkubiert. Die Reaktionsansätze wurden länger als im ersten Beispiel inkubiert, und mit einem größeren Überschuß an Sonde versehen, da bekannt war, daß diese Sonden langsamer hybridisieren.
Die Ergebnisse in Tabelle 3 zeigen denselben "Abdeck"-Effekt der Nicht-Ziel-Sonde (men) auf die Nicht-Ziel-RNA, wie schon im ersten Beispiel gesehen. Hybridisierung der Ziel- Sonde an die Ziel-RNA wurde nicht wesentlich vermindert durch die Anwesenheit eines zweifachen Überschusses an Nicht-Ziel-Sonde (Reaktion D), während die unerwünschte Kreuzhybridisierung von Ziel-Sonde an Nicht-Ziel-RNA, obgleich klein, komplett beseitigt wurde bei einem 1 : 1-Verhältnis von Nicht-Ziel-Abdeck-Sonde zu Ziel-Sonde (Reaktion J). Tabelle 3 Gon-Ziel-Sonde Men-Nicht-Ziel-Sonde Gon-Ziel Men-Nicht-Ziel maximal möglicher Hybridisierung maximal möglicher Hybridisierung (normiert)
* Fußnote: Entspricht 0,3 pMol der Sonde in einer 30-ul-Hybridisierungsreaktion

BEISPIEL III

Um die Effizienz des "Abdeckens" zu bestimmen, wurde ein weiteres Experiment unter Verwendung eines hohen Überschusses an Sonde und geringer Konzentrationen an RNA ausgeführt, wie es in einem klinischen Assay typisch sein kann. In diesem Beispiel wurden die Sonden und RNA's in den angegebenen Verhältnissen vermischt (in 0,48 M Phosphatpuffer pH 6,8 , 0,5% SDS, 1 mM EDTA und 1 mM EGTA), 5 Minuten lang auf 70ºC erhitzt, langsam über eine Zeitspanne von 1 1/4 Stunden auf 55ºC abgekühlt, bei 55ºC für 2 Stunden inkubiert, langsam über eine Zeitspanne von 30 Minuten auf 45ºC abgekühlt und dann bei 45ºC 30 Minuten lang inkubiert. Die Hybride wurden wie oben beschrieben an Hydroxylapatit abgetrennt. Dieses Inkubationsschema erlaubte die beste Trennung der exakt gepaarten Hybridisierungen aufgrund der langsamen Abkühlung über der intermediären (stringenten) Temperatur von 55ºC und einer verlängerten Inkubation bei dieser Temperatur.
Wie in Tabelle 4 zu sehen ist, eliminierte die Abdeck-(Nicht-Ziel)Sonde wiederum vollständig die Kreuzreaktion zwischen Ziel-Sonde und Nicht-Ziel-RNA nebst einer Verminderung der spezifischen Hybridisierung (Ziel-Sonde/Ziel-RNA) um nur 26%. Tabelle 4 Gon-Sonde Men-Sonde Gon-RNA Men-RNA maximal möglicher Hybridisierung maximal möglicher Hybridisierung (normiert)
* Fußnote: Entspricht 0,2 pMol der Sonde in einer 100-ul-Hybridisierungsreaktion.
An eben Aufgeführtem ist natürlich auch zu würdigen, daß die Ziel-Sonde mit vielen aus dem Stand der Technik bekannten Markierungen versehen werden kann. Darüberhinaus kann ein Kit zusammengestellt werden, der, entweder getrennt oder in einer Mischung, die Ziel- und Nicht-Ziel-Sonden enthält, und der sich zur Ermittlung der Anwesenheit einer Ziel-Nucleotidsequenz in einem Medium eignet, in welchem auch eine verwandte Nicht- Ziel-Nucleotidsequenz vorliegen kann.

Claims

1. Assay für eine Ziel-Nucleotidsequenz in einer Probe, umfassend die Stufen:

(a) Vorsehen einer Ziel-Sonde mit einer Nucleotidsequenz, die in der Lage ist, bei Hybridisierungsbedingungen unter Bildung eines ersten Hybridkomplexes mit der Ziel- Sequenz spezifisch zu hybridisieren, wobei die Nucleotidsequenz der Ziel-Sonde ebenfalls in der Lage ist, mit einer Nicht-Ziel-Nucleotidsequenz, gesondert und verschieden von der Ziel-Sequenz, bei den Bedingungen unter Bildung eines zweiten Hybridkomplexes, gesondert und verschieden von dem ersten Hybridkomplex, spezifisch zu hybridisieren, wobei bei den Bedingungen die Schmelztemperatur des ersten Hybridkomplexes höher als die des zweiten Hybridkomplexes ist.

(b) Vorsehen einer Nicht-Ziel-Sonde mit einer zweiten Nucleotidsequenz, die in der Lage ist, mit einer Nicht-Ziel-Nucleotidsequenz bei den Bedingungen unter Bildung eines dritten Hybridkomplexes spezifisch zu hybridisieren, wobei bei den Bedingungen die Schmelztemperatur des dritten Hybridkomplexes höher als die des zweiten Hybridkomplexes liegt,

(c) Inkontaktbringen der Probe mit der Ziel-Sonde und mindestens einer besagten Nicht-Zielsonde unter den Bedingungen in einem flüssigen Medium in Abwesenheit eines Festphasenträgers, und

(d) Durchführen des Assays zur Hybridisierung der Ziel-Sonde mit der Probe.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem die Sonden in der Weise ausgewählt werden, daß der dritte Hybridkomplex eine größere Anzahl von komplementären Nucleotiden besitzt als der zweite Hybridkomplex.

3. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 und 2, bei dem die Sonden Oligonucleotide mit einigen übereinstimmenden Regionen sind.

4. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem die Sonden Oligonucleotide sind, welche sich nur in ein bis drei Nucleotiden unterscheiden.

5. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem die Ziel-Sonde markiert ist.

6. Verfahren gemäß Anspruch 5, bei dem die Markierung aus Strahlungsmarkierungen, Enzymen, Chemilumeneszenzmarkierungen, kolorimetrischen Markierungen und Fluoreszenzmarkierungen gewählt ist.

7. Verfahren gemäß Anspruch 5 oder Anspruch 6, bei dem das Molverhältnis der nichtmarkierten Sonde zu der markierten Sonde nicht mehr als 9 zu 1 beträgt.

8. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, bei dem das Molverhältnis der Nicht-Ziel-Sonde zu der Ziel-Sonde nicht mehr als 9 zu 1 beträgt.

9. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8, bei dem das Molverhältnis der Nicht-Ziel-Sonde zu der Ziel-Sonde nicht mehr als 4 zu 1 beträgt.

10. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9, bei dem die Hybridisierungsbedingungen so gestaltet sind, daß zuerst das Medium zur Denaturierung mindestens der Sonden und jeder vorhandenen Ziel-Sequenz erhitzt und dann das Medium mit einem externen Wärmeaustauschmedium gekühlt wird, dessen Temperatur allmählich auf eine Temperatur vermindert wird, bei welcher die Ziel-Sonde mit der Ziel-Sequenz hybridisieren kann.

11. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10, bei dem die Hybridisierung bei einer vorbestimmten Temperatur geschieht.

12. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 11, bei dem die Nucleotidsequenz RNA ist.

13. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 11, bei dem die Nucleotidsequenz DNA ist.

14. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 6 bis 11, bei dem der Schritt des Durchführens des Assays das vorausgehende Abtrennen der Hybride von nicht hybridisierten markierten Sonden und das anschließende Nachweisen der Anwesenheit der Markierung in den Hybriden umfaßt.

15. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 12 bis 14, bei dem die Sonden Oligonucleotide sind und die Ziel- und Nicht-Ziel-Nucleotidsequenzen Polynucleotide mit größerer Länge als die Sonden sind, und bei dem der Schritt der Durchführung des Assays folgendes umfaßt:

(a) Inkontaktbringen des flüssigen Mediums mit einem geeigneten polykationischen Trägermaterial, das in der Lage ist, daraus Polynucleotide und Hybride nicht-kovalent zu binden, ohne signifikante Bindung irgendwelcher Oligonucleotide mit weniger als 100 Nucleotiden in der Länge, so daß mit irgendeinem Polynucleotid hybridisierte Ziel- Sonden von irgendwelchen nicht derart hybridisierten Ziel-Sonden abgetrennt werden,

(b) Trennen des Trägermaterials von dem die nicht derart hybridisierte Ziel-Sonde enthalten flüssigen Medium, und

(c) Detektieren der Anwesenheit jeglicher an dem Trägermaterial gebundenen Markierung.

16. Kit, welches für die Durchführung eines Assays einer Ziel-Nucleotidsequenz in einer Testprobe anwendbar ist, welches ebenfalls eine Nicht-Ziel-Nucleotidsequenz enthalten kann, umfassend:

(a) eine markierte Ziel-Sonde mit einer Nucleotidsequenz, die in der Lage ist, bei Hybridisierungsbedingungen unter Bildung eines ersten Hybridkomplexes mit der Ziel- Sequenz spezifisch zu hybridisieren, wobei die Nucleotidsequenz der Ziel-Sonde ebenfalls in der Lage ist, mit einer Nicht-Ziel-Nucleotidsequenz, gesondert und verschieden von der Ziel-Sequenz, bei den Bedingungen unter Bildung eines zweiten Hybridkomplexes, gesondert und verschieden von dem ersten Hybridkomplex, spezifisch zu hybridisieren, wobei bei den Bedingungen die Schmelztemperatur des ersten Hybridkomplexes höher als die des zweiten Hybridkomplexes ist, und

(b) eine nicht markierte Nicht-Ziel-Sonde mit einer zweiten Nucleotidsequenz, die in der Lage ist, mit einer Nicht-Ziel-Sequenz bei den Bedingungen unter Bildung eines dritten Hybridkomplexes spezifisch zu hybridisieren, wobei bei den Bedingungen die Schmelztemperatur des dritten Hybridkomplexes höher als die des zweiten Hybridkomplexes liegt.

17. Kit gemäß Anspruch 16, umfassend Ziel- und Nicht-Ziel-Sonden, wie in mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6 definiert.

18. Kit gemäß Anspruch 16 oder Anspruch 17 zur Durchführung eines Assay-Verfahrens gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 15.