DE3851973T2

DE3851973T2 - Heparine mit niedrigem Molekulargewicht und regelmässiger Struktur, ihre Herstellung und biologische Verwendungen.

Info

Publication number: DE3851973T2
Application number: DE3851973T
Authority: DE
Inventors: Jean Choay; Jean-Claude Lormeau; Maurice Petitou
Original assignee: Sanofi SA
Current assignee: Sanofi Aventis France
Priority date: 1987-04-16
Filing date: 1988-04-15
Publication date: 1995-06-08
Anticipated expiration: 2008-04-16
Also published as: IE64884B1; AU1466388A; EP0287477B1; FI881783L; FI88046C; DK210388A; PT87261A; IE881150L; DE3851973D1; ZA882662B; EP0287477A3; KR880012644A; NO881660D0; JPS63278901A; FI88046B; AU601566B2; NO170940B; IL86091A0; NO170940C; US4990502A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Heparine mit niedrigem Molekulargewicht und regelmäßiger Struktur, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre biologische Anwendung.
Sie ist insbesondere auf Heparine mit niedrigem Molekulargewicht gerichtet. die eine Wirkung auf den Bereich der Regulierung bestimmter physiologischer Systeme aufweisen und ist dabei praktisch vollständig frei von einer antikoagulierenden Wirkung, die über Antithrombin III (AT III) bewirkt wird.
Es ist bekannt, daß Heparin eine antikoagulierende Wirkung besitzt, die sich überwiegend über Antithrombin III (AT III) manifestiert.
Arbeiten bezüglich der Struktur/Wirkungs-Beziehung von Heparin haben gezeigt, daß diese antikoagulierende Wirkung insbesondere mit Bereichen des Heparins korreliert, die als unregelmäßig bezeichnet werden und insbesondere dem Bereich, der dem Pentasaccharid der Struktur DEFGH entspricht, der in der französischen Patentanmeldung Nr. 2 535 324 beschrieben ist und die folgende Formel besitzt:
Es ist darüber hinaus bekannt, daß bestimmte Wirkungen von Heparin oder von Heparinfragmenten bis zu einem gewissen Ausmaß auch in Abwesenheit des Bindungsorts für AT III aufrechterhalten werden, wenn dieses modifiziert ist, wobei die für diese Wirkungen verantwortlichen Strukturen nicht bekannt sind.
So haben Folkman et al. (Science,Vol. 221 (1983), S. 719-725) eine die Angiogenese inhibierende Wirkung für Hexasaccharidmischungen beschrieben, die frei ist von einer antikoagulierenden Wirkung. und welche Mischungen in Kombination mit Corticoiden verwendet werden.
Karnovsky et al. haben Untersuchungen an O-desulfatierten und N-desulfatierten Heparinen durchgeführt und gezeigt. daß sie stets noch in einem gewissen Ausmaß, jedoch in geringerem Ausmaß, die inhibierenden Wirkungen des Standard-Heparins auf die Vermehrung von glatten Muskelzellen ausüben.
Darüber hinaus wurde eine Anti-Ergänzungswirkung des Heparins, die unabhängig von der antikoagulierenden Wirkung ist, nachgewiesen.
In der europäischen Patentanmeldung 0 208 623 wird die Verwendung bestimmter Poly- oder Oligosaccharide für die Herstellung von Arzneimitteln beschrieben, die bei der Behandlung von pathologischen Zuständen des Bindegewebes wirksam sind. Die als für die Herstellung solcher Arzneimittel nützlich beschriebenen Heparine besitzen eine Struktur, die aus alternierenden D-Glucosamin-Uronsäure-Einheiten [L-Iduronsäure oder D-Glucuronsäure] aufgebaut ist.
Andere Arbeiten haben gezeigt, daß die antikoagulierende Wirkung des Heparins dadurch modifiziert werden kann, daß mit Hilfe von Natriumperiodat Bindungen im Bereich der Kohlenstoffatome C&sub2;-C&sub3; der nichtsulfatierten Uronsäuren aufgebrochen werden.
So haben Fransson und Lewis in Febs. Letters, Vol. 97, Nr. 1 (1979), S. 119-123 Verfahrensbedingungen beschrieben, die darin bestehen, Heparin entweder bei einem pH-Wert von 3 und 4ºC oder bei einem pH-Wert von 7 und 37ºC der Einwirkung von Periodat zu unterwerfen. Die erhaltenen Heparinketten werden im ersten Falle selektiv im Bereich der D-Glucuronsäuren oxidiert, während bei der zweiten Art von Bedingungen eine Oxidation im Bereich sämtlicher Uronsäureeinheiten erfolgt.
Die erhaltenen Ketten werden mit NaBH&sub4; reduziert oder nach einem β-Eliminierngsverfahren in alkalischem Medium fragmentiert.
Die Autoren haben den Schluß gezogen, daß die Oxidation und die Spaltung der D-Glucuronsäure-Einheiten zu einer schwachen Verminderung der Molekulargewichte, jedoch zu einer Beibehaltung der antikoagulierenden Wirkung führt.
Im Gegensatz dazu führt die Spaltung der nichtsulfatierten D-Glucuronsäuren und L-Iduronsäuren bei einem pH-Wert von 7 und bei 37ºC zu einer Unterdrükkung der antikoagulierenden Wirkung und zu einer stärkeren Fragmentierung des Moleküls.
Fransson und Havsmark (Carbohydrate Research, Vol. 104 (1982), S. 139-146) haben im Rahmen einer Strukturanalyse von Präparaten, die Heparinoide enthalten, die aus Rinderlungen oder Schweineschleimhaut extrahiert worden sind und eine erhöhte Anti-Xa-Wirkung besitzen, festgestellt, daß, wenn die Periodoxidation bei einem pH-Wert von 3 und bei 4ºC durchgeführt wird, sie zu einer Spaltung der D-Glucuronsäuren führt, die einem N-Acetylglucosamin benachbart sind. Wenn andererseits die Period-oxidation bei einem pH-Wert von 7 und bei 37ºC durchgeführt wird, führt sie zu einer nicht-selektiven Spaltung im Bereich sämtlicher Uronsäuren.
In einem in Carbohydrate Research 36 (1974), S. 339-348 erschienenen Artikel hat Fransson über die Period-oxidation von Uroneinheiten in Dermatansulfat bei unterschieden pH-Werten bei 4ºC oder 37ºC berichtet.
Der Autor gibt an, daß bei einem pH-Wert von 5 die Spaltungen im Bereich der Glucuronsäuren nur in einem Ausmaß von weniger als 5 % erfolgen und daß beim Arbeiten bei einem pH-Wert von 3 diese Spaltungen überhaupt nicht eintreten. Diese Ergebnisse erscheinen daher widersprüchlich zu den mit Heparin erhaltenen, bei denen bei einem pH-Wert von 3 die Spaltungen bevorzugt im Bereich der D-Glucuronsäuren erfolgen.
Die Wirkung von Periodat wurde ebenfalls von Casu et al. in Arzneim. Forsch./Drug Res. 36(1), Nr. 4 (1986). S. 637-642 beschrieben.
Nach diesem Artikel wurden unterschiedliche Heparinpräparate einer Periodoxidation (pH-Wert von 5,3 bei 4ºC während 24 Stunden) unterworfen, bei der ein Schnitt zwischen den Kohlenstoffatomen in den Stellungen 2 und 3 sämtlicher nichtsulfatierter Uronsäuren erfolgt. Zum Vergleich wurde ein Präparat einer abschließenden teilweisen sauren Hydrolyse unterworfen und die dabei erhaltenen Fragmente wurden dialysiert.
Diese saure Teilhydrolyse führte zu einer beträchtlichen Fragmentierung der Ketten und mindestens zu einer teilweisen Zerstörung von funktionellen Gruppen, wie es von Fransson in Carbohydr. Res. 80 (1980), 131 - 145 angegeben wird.
Darüber hinaus erhält man nach dieser Methode zwangsläufig eine Mischung von Ketten mit innerhalb eines breiten Bereichs variierendem Molekulargewicht und insbesondere eine Vielzahl von Di-, Tetra- und Hexasacchariden.
Die Patentanmeldung WO 80/01383 beschreibt Heparinfragmente mit einer selektiven antikoagulierenden Wirkung. die man durch verschiedene Depolymerisationsverfahren, darunter die Depolymerisation mit Hilfe von Periodsäure. erhalten hat. Die beschriebenen Produkte enthalten eine nichtsulfatierte L-Iduronsäureeinheit, die in 3 - 5 "L-Iduronsäure- oder Glucosamin-"Einheiten ausgehend von der nichtreduzierenden Endgruppe angeordnet sind, sowie einige D- Glucuronsäureeinheiten. die nicht an den Enden der Ketten der Makromoleküle angeordnet sein können. Darüber hinaus enthalten die in der Patentanmeldung WO 80/01383 beschriebenen Produkte etwa 30% Bestandteile mit einer Affinität für Antithrombin III.
Die Patentanmeldung BE-A-620 906 beschreibt Makromoleküle, die man ausgehend von nichtfraktioniertem oder fragmentiertem Heparin nach einer Glykolspaltung erhält und die zur Behandlung der Hyperlipämie geeignet sind.
Diese Produkte erhält man nach einer sehr starken Modifizierung der Grundstruktur von Heparin - unter Anwendung der Period-oxidation neben anderen Methoden - und sie besitzen eine sehr stark verminderte antikoagulierende Wirkung im Bereich von 4 bis 8 IE/mg (USP). Damit sie eine solche antikoagulierende Wirkung aufweisen, ist es jedoch erforderlich, etwa 50 % der Uronsäureeinheiten der Grundstruktur des Heparins zu modifizieren, was zu einem Verhältnis von Uronsäureeinheiten/Glucosamineinheiten von etwa 0.5 führt.
Die Erfinder haben nun festgestellt, daß zur Gewinnung von stabilen pharmazeutischen Zubereitungen, die in der Therapie zur Steuerung bestimmter physiologischer Systeme verwendet werden können, die folgenden Eigenschaften in Kombination erforderlich sind, um die mit einer antikoagulierenden Wirkung verknüpften unerwünschten Wirkungen zu vermeiden:
Länge der Fragmente: Ausmaß der Ladung; und Abwesenheit einer Bindungsstelle für AT III.
Die Untersuchung der Prozesse der Spaltung mit Hilfe von Periodsäure und die Fragmentierungsmittel haben sie zu der Feststellung gebracht. daß es bei der Durchführung einer Period-oxidation unter spezifischen Verfahrensbedingungen und gleichzeitig unter Anwendung einer Kombination von besonderen Stufen möglich ist, eine Zubereitung aus Heparinfragmenten mit niedrigem Molekulargewicht, das jedoch in einem günstigen Bereich liegt. zu erhalten, die frei sind von einer Bindungsstelle für AT III und die dennoch mindestens den Hauptteil ihrer funktionellen Gruppen beibehalten.
Die vorliegende Erfindung zielt somit darauf ab, Heparinzubereitungen anzugeben, die bei wirksamen Dosierungen pharmakologische Eigenschaften von großem Interesse aufweisen, die im wesentlichen äquivalent sind mit jenen von Heparin, ohne daß sie die Nachteile des Vorhandenseins von antikoagulierenden Eigenschaften besitzen.
Sie zielt weiterhin darauf ab, ein Verfahren zur Fragmentierung von Heparin anzugeben. welches es ermöglicht, Fragmente mit gegebenem Molekulargewicht zu erhalten, die frei sind von einer Bindungsstelle für AT III und deren Ladungszustand im wesentlichen dem von entsprechenden Sequenzen in den Ketten von natürlichem Heparin entspricht.
Die Erfindung ist weiterhin auf die Anwendung dieser Zubereitungen für die Herstellung von wirksamen Arzneimitteln gerichtet, insbesondere für die Regulierung bestimmter physiologischer Systeme.
Die Erfindung betrifft somit Zubereitungen aus Heparinen. wovon 90 % ein Molekulargewicht zwischen 3600 und 11000 Da besitzen, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie aus Fragmenten gebildet sind, die frei sind von Disaccharidketten des Typs nichtsulfatierte Uronsäure-Glucosamin-N-sulfat, welche Fragmente der folgenden allgemeinen Formel I entsprechen:
R-(X-Y)n-R' (I)
in der
- X entweder einen sulfatierten lduronsäurerest der Formel II:
oder, in einem Verhältnis von mindestens einem Rest pro zwei Ketten, einen nichtsulfatierten Uronsäurerest (D-Glucuronsäure oder L-Iduronsäure), der zwischen den Kohlenstoffatomen in den Positionen 2 und 3 geöffnet ist, der Formel III:
- Y einen D-Glucosaminrest der Formel IV:
worin
R&sub1; ein Wasserstoffatom oder eine Gruppe -SO&sub3;&supmin;,
R&sub2; eine Gruppe -SO&sub3;&supmin; oder -CO-CH&sub3;, wobei der Anteil der Gruppen -SO&sub3;&supmin; mindestens 90 % beträgt, und
R&sub3; eine Gruppe -SO&sub3;&supmin; oder ein Wasserstoffatom, wobei der Anteil der Gruppen -SO&sub3;&supmin; mindestens 70 % beträgt. darstellen,
- R ein Wasserstoffatom oder einen Rest der Formel V:
worin
R&sub1; bis R&sub3; die oben angegebenen Bedeutungen besitzen und
R&sub4; ein Wasserstoffatom oder den Uronsäurerest darstellt,
- R' entweder ein Wasserstoffatom oder einen natürlichen Uronsäurerest oder den Uronsäurerest. der im Verlaufe der Period-oxidation modifiziert worden ist und dessen Aldehydgruppen zu Alkoholgruppen reduziert worden sind, und 7 ≤ n ≤ 15 für die Mehrzahl der Bestandteile bedeuten, was Ketten mit einem Molekulargewicht von etwa 4800 bis 9000 entspricht,
wobei die Molekulargewichte durch HPLC mit einer TSK 2000 SW-Säule, die mit einem photometrischen Detektor gekuppelt ist, der bei 205 nm arbeitet, unter Verwendung von 0,5 M Na&sub2;SO&sub4; als Lösungsmittel bei einem Durchsatz von 1 ml/min bestimmt worden sind,
und deren pharmazeutisch annehmbare Salze.
Es ist festzuhalten, daß die offenkettigen Reste X Reste sind, die im Verlaufe der Stufe der β-Eliminierung in alkalischem pH-Bereich in der Glucosamino-Glykan- Kette vollständig geblieben sind. Es handelt sich somit entweder um eine nichtsulfatierte D-Glucuronsäure oder eine nichtsulfatierte L-Iduronsäure, deren Bindungen zwischen den Kohlenstoffatomen in den Stellungen 2 und 3 gespalten worden sind.
Die erfindungsgemäßen Zubereitungen besitzen:
- ein mittleres Molekulargewicht im Bereich von 6000 - 7000 Da, genauer von 5800 bis 7000 Da und insbesondere im Bereich von 6000 Da, wobei 70 % der Bestandteile zwischen 4800 und 9000 Dalton und 90 % zwischen 3600 und 11000 Da liegen.
- ein Molekulargewicht am Maximum des Peaks im Bereich von 5500 bis 6500 Da, genauer 5500 bis 6500 Da und insbesondere im Bereich von 5500 bis 6000 Da,
- wobei weniger als 5 % der Ketten kürzer sind als Dodecasaccharide, und
- weniger als 5 % Ketten jenseits von 11.000 besitzt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform sind die erfindungsgemäßen Heparinzubereitungen jene, die man dadurch erhält, daß man eine Mischung, die durch Depolymerisation von Heparin durch Einwirkung einer starken Base auf Heparinketten, die zuvor der Einwirkung von Periodat unterworfen worden sind, wobei die Depolymerisation von einer Reduktion der im Verlaufe der Period-oxidation gebildeten Aldehydgruppen gefolgt wird, gebildet worden ist, mit Hilfe von Alkohol in Gegenwart eines anorganischen Salzes fraktioniert.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform besitzen die erfindungsgemäßen Zubereitungen ein Verhältnis von dem Gehalt der Sulfatgruppen SO&sub3;&supmin; und der Carboxylgruppen COO&supmin; pro Mol zwischen 2,2 und 2,8. Dieses Verhältnis beträgt insbesondere 2,4. Dieser erhöhte Anteil im Vergleich zu den Durchschnittswerten der Heparinketten ergibt sich aus der Struktur der erfindungsgemäßen Heparinketten mit niedrigem Molekulargewicht. die im wesentlichen aus trisulfatierten Disaccharidketten aufgebaut sind. Diese Heparine mit niedrigem Molekulargewicht werden als solche mit einer regelmäßigen Struktur bezeichnet wegen der Anwesenheit dieser Disaccharideinheiten und unter Bezugnahme auf die wissenschaftliche Literatur (A.S. Perlln, B. Casu, Gr. Sanderson, "220 MHz Spectra of Heparin, Chondroitins and Ohter Mucopolysaccharides", Can. J. Chem. (1970), 48: 2260-2268).
Die Erfindung umfaßt weiterhin die Salze dieser Zubereitungen, insbesondere die Natrium-, Kalium-, Calcium- und Magnsiumsalze, sowie die Salze mit physiologisch annehmbaren organischen Kationen.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von Zubereitungen von Heparinfragmenten der oben definierten Art, welches eine milde Oxidation von Heparin mit Periodat umfaßt.
Das erfindungsgemäßen Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man:
a) eine wäßrlge Lösung von Heparin mit einer Endkonzentration von 0,5 bis 5 % (Gew./Vol.) mit einem Salz der Periodsäure mit einer Endkonzentration von 0.5 bis 4% (Gew./Vol.) bei einem pH-Wert von 4,5 bis 6,5 und einer Temperatur von 0 bis 10ºC behandelt;
b) die in dieser Weise erhaltenen Heparinketten mit einer starken Base mit einem pH von mehr als etwa 11 behandelt;
c) die in dieser Weise erhaltenen Depolymerisations-Fragmente mit einem Reduktionsmittel behandelt;
d) nach der eventuellen Entfernung des überschüssigen Reduktionsmittels die reduzierten Fragmente nach der Zugabe eines anorganischen Salzes mit Hilfe eines alkoholischen Lösungsmittels ausfällt;
e) eine wäßrige Lösung des in dieser Weise erhaltenen Niederschlags nach Zugabe eines anorganischen Salzes mit Alkohol behandelt, um die Fragmente mit sehr niedrigem Molekulargewicht zu beseitigen;
f) das in dieser Weise ausgefällte Produkt gewinnt und gegebenenfalls das der verwendeten starken Base entsprechende Salz in ein anderes pharmazeutisch annehmbares Salz umwandelt.
Es ist festzuhalten, daß die Stufe e) einer Fraktionierung entspricht, die dazu dient, bestimmte Ketten abzutrennen, jedoch nicht eine vollständige Ausfällung zu bewirken.
Insbesondere umfaßt dieses Verfahren die Kombination der folgenden Stufen:
- milde Oxidation von Heparin durch Umsetzen von Heparin in wäßriger Lösung bei einer Endkonzentration von 0,5 bis 5 % (Gew./Vol.) mit einem Salz der Periodsäure bei einer Endkonzentration von 0,5 bis 4% (Gew./Vol.) bei einem pH-Wert zwischen 4.5 und 6,5 bei einer Temperatur von 0 bis 10ºC während etwa 15 bis 48 Stunden unter Lichtausschluß,
- Depolymerisation der erhaltenen Heparinketten durch Zugabe einer starken Base in einer Menge bis zu einem pH von mehr als 11, insbesondere zwischen 11 und 12, mit Vorteil zwischen 11,2 und 11,6 und vorzugsweise von etwa 11,5,
- Reduktion der Depolymerlsations-Fragmente mit Hilfe eines Reduktionsmittels und anschließend gegebenenfalls die Entfernung des nichtumgesetzten Reduktionsmittels,
- Gewinnung der reduzierten Heparinfragmente durch Ausfällen mit Hilfe eines Lösungsmittelmediums, in dem sie unlöslich sind.
- Isolierung der gewünschten Fragmente aus einer durch Inlösungbringen des in der oben beschriebenen Weise isolierten Niederschlags in Wasser erhaltenen wäßrigen Lösung durch Fraktionierung mit Hilfe von Alkohol in Gegenwart eines anorganischen Salzes und Gewinnen des gebildeten Niederschlags.
Die Durchführung der Depolymerlsation gemäß einer besonderen Verfahrensweise in Kombination mit der erfindungsgemäßen Anwendung einer Fraktionierungsstufe ermöglicht die Isolierung einer Zubereitung aus Fragmenten, die einem besonderen therapeutischen Profil entsprechen und insbesondere einen zufriedenstellenden therapeutischen Index aufweisen.
In der Stufe der Period-oxidation verwendet man vorzugsweise Heparin und das Salz der Periodsäure in Mengen, die zu Endkonzentrationen von 1.5 bis 5 % bzw. 1.5 bis 2.5 % (Gew./Vol.) führen.
Das Salz der Periodsäure ist vorzugsweise Natriummetaperiodat.
Zur Beseitigung des restlichen Periodats bewirkt man eine Dialyse mit Dialyseschläuchen mit einer Porosität von 3 bis 4000 Da während etwa 15 Stunden.
Man kann auch eine Chromatographie über einem Anionenaustauscherharz durchführen, beispielsweise ein Harz, wie es unter der Bezeichnung Amberlite IRA 400 im Handel erhältlich ist, wobei dieses Harz in einer Menge verwendet wird, die dazu ausreicht, das restliche Periodat und die im Verlaufe der Reaktion gebildeten Periodat-Derivate zurückzuhalten, d. h. beispielsweise 1/6 bis 1/8 des Reaktionsvolumens. Diese Verfahrensweise ist schneller als die Dialyse. ist sehr gut reproduzierbar und ermöglicht, ausgehend von leicht zu standardisierenden Bedingungen. die β-Eliminierung durchzuführen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung löst man Heparin in Wasser, insbesondere in entmineralisiertem Wasser mit einer Temperatur von 4ºC bei einer Konzentration von etwa 5 % (Gew.-/Vol.) und gibt ein Salz der Periodsäure, wie Natriummetaperiodat, in der Weise zu, daß sich eine Endkonzentration von etwa 2 % (Gew. /Vol,) ergibt. Der pH-Wert der Lösung wird sofort mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure oder verdünnter Natriumhydroxidlösung auf 5 eingestellt.
Man läßt die Lösung vorzugsweise während 24 Stunden bei einer Temperatur von +4ºC im Dunkeln stehen.
Zur Beseitigung des restlichen Periodats bewirkt man eine Dialyse mit Dialyseschläuchen mit einer Porosität von 3 bis 4000 Da während etwa 15 Stunden gegen fließendes entmineralisiertes Wasser.
Die erhaltenen Heparinketten werden dann einer Stufe der Depolymerisation in basischem Medium unterworfen.
Hierzu gibt man eine starke Base und insbesondere konzentrierte Natronlauge in der Weise zu, daß man eine Endmolarität der Base von 0,2N erreicht.
Die erhaltene basische Lösung wird während 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt.
Anschließend unterzieht man die Fragmente der Depolymerisation von Heparin einer Reduktionsstufe zur Umwandlung der durch die Spaltung der Bindung zwischen den Kohlenstoffatomen C&sub2; und C&sub3; der Uroneinheiten gebildeten Aldehydgruppen.
Man verwendet ein Reduktionsmittel, wie Natriumborhydrid, in einer Menge von 50 mg pro Gramm des eingesetzten Heparins und rührt während 6 Stunden bei Raumtemperatur.
Das nicht umgesetzte Reaktionsmittel wird durch Absenken des pH-Werts auf 4 mit Hilfe einer Säure, beispielsweise Chlorwasserstoffsäure, und mit Vorteil unter heftigem Rühren während etwa 15 Minuten zerstört.
Die reduzierten Heparinfragmente werden durch Ausfällen gewonnen.
Mit Vorteil stellt man den pH-Wert mit Hilfe einer Base, insbesondere konzentrierter Natriumhydroxidlösung, auf einen Wert von 7 ein und gibt 20 g/Liter des anorganischen Salzes zu und bewirkt eine Ausfällung mit Hilfe von 1,5 Volumen Alkohol.
Das verwendete anorganische Salz ist mit Vorteil Natriumchlorid. Für die alkoholische Ausfällung verwendet man vorzugsweise Ethanol.
Der gebildete Niederschlag wird durch Zentrifugieren gewonnen. mit einem Lösungsmittel, in dem er unlöslich ist, wie Ethanol, gewaschen und dann im Vakuum bei 40ºC getrocknet.
Zur Isolierung der erfindungsgemäßen Fragmente aus diesem Niederschlag führt man eine Fraktionierungsstufe durch.
Man bewirkt mit Vorteil eine alkoholische Fraktionierung wie folgt:
Man bringt den Niederschlag der Heparinfragmente in Wasser in Lösung und insbesondere in demineralisiertem Wasser bei Raumtemperatur, d. h. einer Temperatur von etwa 18 bis 20ºC. um eine Lösung mit einer Konzentration von 5 % (Gew./Vol.) zu erhalten.
Man gibt ein anorganisches Salz, wie Natriumchlorid. In ausreichender Menge zu. um eine Endkonzentration von 1 % zu erreichen. Man stellt den pH-Wert der Lösung mit Säure. beispielsweise verdünnter Chlorwasserstoffsäure, auf 3,5 ein.
Dann gibt man unter mäßigem Rühren 0.85 Volumen eines Lösungsmittels. In dem die gewünschten Fragmente unlöslich sind, wie Ethanol, zu.
Man läßt das Ganze während etwa 10 Stunden bei 18 - 20ºC stehen.
Man gewinnt den Niederschlag durch Zentrifugieren, wäscht mit einem Lösungsmittel, wie Ethanol, und trocknet im Vakuum während 24 Stunden bei 40ºC.
Dieser Niederschlag kann gegebenenfalls einer ergänzenden Reinigungsstufe unterworfen werden, nachdem man ihn erneut in entmineralisiertem Wasser in Lösung gebracht hat, und zwar durch Chromatographie eines Anionenaustauscherharzes, wie einem Amberlite-Harz IRA 400 in der OH&supmin;-Form in einem Volumen von etwa 1/10 Volumen des Reaktionsvolumens. um in dieser Weise eventuelle Verunreinigungen zu entfernen.
Er besteht aus einer Mischung von Heparinfragmenten. deren Hauptmenge der Moleküle ein Molekulargewicht zwischen etwa 4800 bis 9000 Da aufweist.
Das in dieser Weise erhaltene Produkt kann gegebenenfalls in ein anderes pharmazeutisch annehmbares Salz umgewandelt werden, wie ein Calciumsalz, ein Kaliumsalz oder ein Magnesiumsalz, wozu man an sich bekannte Verfahrensweisen anwendet.
Die erfindungsgemäßen Heparinzubereitungen. die im wesentlichen aus Fragmenten mit einem Molekulargewicht zwischen etwa 4800 bis 9000 bestehen und frei sind von Bindungsstellen für AT III, ermöglichen die Ausnutzung von pharmakologischen Eigenschaften mit großem Interesse, welche den regelmäßigen Bereichen des Heparins zuzuordnen sind. Diese Zubereitungen besitzen in wirksamen Dosierungen nur eine sehr geringe antikoagulierende Wirkung.
Die Untersuchung ihrer pharmakologischen Eigenschaften hat in dieser Weise gezeigt, daß diese Zubereitungen eine inhibierende Wirkung auf das Wachstum der glatten Muskelzellen ausüben, die im wesentlichen jener von Heparin entspricht.
Verschiedene Untersuchungen haben es ermöglicht, andere inhibierende Wirkungen nachzuweisen, insbesondere gegenüber der Kompelentaktivierung, und inflammatorischen Reaktionen der Hypersensibilität des verzögerten Typs sowie gegenüber der enzymatischen Wirkung von Heparanase.
Sie können auch eine verstärkende und stabilisierende Wirkung gegenüber bestimmten Zellwachstumsfaktoren ausüben.
Diese Zubereitungen besitzen darüber hinaus eine große Unschädlichkeit und sind besonders stabil.
Sie sind insofern besonders geeignet zur Verwendung als Wirkstoffe von Arzneimitteln.
Die Erfindung betrifft daher auch pharmazeutische Zubereitungen, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie eine wirksame Menge einer Zubereitung enthalten, die im wesentlichen aus Heparinfragmenten der oben definierten Art in Kombination mit einem pharmazeutischen Trägermaterial gebildet sind.
Aufgrund ihrer Eigenschaften können die erfindungsgemäßen Arzneimittel insbesondere für die folgenden therapeutischen Indikationen angewandt werden:
- Vorbeugung der Wucherung von glatten Muskelzellen im Verlaufe von Angioplastien.
- Beschleunigung der Gewebewiederherstellung insbesondere bei Hauterkrankungen,
- Verhinderung der Ausbreitung von fortschreitenden atherogenen Verletzungen und von Phänomenen der arteriosklerotischen Degeneration.
- Vorbeugung von Schockzuständen,
- Vorbeugung von bestimmten Metastaseentwicklungen.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitungen können in unterschiedlicher Form verabreicht werden.
Zur Verabreichung auf oralem Wege verwendet man insbesondere Gelkapseln, Tabletten, Kompretten, Pillen und Liposome. Diese Präparate enthalten pro Dosiseinheit mit Vorteil 50 mg bis 5 g und vorzugsweise 200 bis 250 mg des Wirkstoffs im Fall von Gelkapseln, Tabletten und Pillen.
Ersichtlich hängen die Verabreichungsformen im wesentlichen von der zu verabreichenden Dosis ab. Die Gelkapseln. Tabletten und Pillen stellen eine praktische Anwendungsform für die Verabreichung geringer Dosen dar. Zur Verabreichung größerer Dosierungen können trinkbare Lösungen besser geeignet sein.
Andere Verabreichungsformen gemäß der Erfindung umfassen Sprühprodukte, Aerosole, Salben oder Cremes.
Die Erfindung betrifft weiterhin sterile oder sterllisierbare injizierbare pharmazeutische Zubereitungen zur Verabreichung auf intravenösem, intramuskulärem oder subkutanem Wege.
Diese Lösungen enthalten mit Vorteil etwa 10 bis 150 mg/ml des Wirkstoffs, wenn sie auf subkutanem Wege injiziert werden sollen, oder etwa 10 bis 100 mg/ml, wenn sie durch intravenöse Injektion oder Perfusion verabreicht werden sollen.
Zur weiteren Verdeutlichung der Erfindung sei als Hinweis im folgenden ein Beispiel einer für den Menschen geeigneten Dosierung angegeben: Diese Dosierung umfaßt beispielsweise die Verabreichung des Wirkstoffs in einer Dosis von 500 mg pro Verabreichungsgabe bei subkutaner Verabreichung zwei- bis dreimal täglich. Bei Intravenöser Verabreichung gibt man etwa 1000 mg pro Tag unter Berücksichtigung der Tatsache, daß im Fall der Perfusion die injizierten Mengen mehrere 10 ml betragen können. Diese Verabreichungen erfolgen diskontinuierlich in regelmäßigen Intervallen oder kontinuierlich durch Perfusion.
Die Erfindung betrifft auch biologische Reagenzien, die als Wirkstoff die oben definierten Zubereitungen aus Heparinfragmenten umfassen. Diese biologischen Reagenzien können als Vergleichsstandards bei Verglelchsuntersuchungen in verschiedenen physiologischen Systemen verwendet werden, bei deren Steuerung die Glykosaminoglykane involviert sind.
Andere Eigenschaften und Vorteile der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus den folgenden Beispielen, die auf die Flguren 1 bis 5 Bezug nehmen.
- Die Figuren 1 und 3 einerseits und 2 und 4 andererseits zeigen HPLC-Kurven einer reduzierten Depolymerisationsmlschung bzw. einer erfindungsgemäßen Zubereitung.
- die Figur 5 gibt das ¹³C-NMR-Spektrum einer erfindungsgemäßen Zubereitung wieder.

BEISPIEL 1:

Verfahren zur Herstellung einer Zubereitung von Heparinfragmenten

1/ - Spaltung der Heparinketten mit Periodsäure

Man löst 10 g Injizierbares Heparin aus der Schleimhaut von Schweinen in Form des Natriumsalzes mit einem Titer von 157 IE/mg bei der Codex-Bestimmung und 155 Einhelten/mg bei der Bestimmung des Antifaktors Xa gemäß Yin et al., bei 4ºC in 250 ml entmineralisiertem Wasser. Man stellt den pH-Wert der Lösung mit konzentrierter Chlorwasserstoffsäure auf 5,0 ein. Dann gibt man unter mäßigem Rühren 10g Natriummetaperiodat (NaIO&sub4;, MG: 213,89) in Lösung in 250 ml entmineralisiertem Wasser bei 4ºC zu. Man stellt den pH-Wert des Ganzen mit konzentrierter Chlorwasserstoffsäure auf 5,0 ein und läßt sich Lösung während 24 Stunden im Dunkeln im Kühlschrank bei +4ºC stehen.

2/ - Entfernung des restlichen Periodats

Man verteilt die Reaktionslösung anschließend in drei Dialyseschläuche NOJAX 40 (mit einer Porosität von 3 bis 4000 Da) und bewirkt eine Dlalyse während 15 Stunden gegen fließendes entmineralisiertes Wasser.

3/ - Depolymerisation in basischem Medium

Zu 780 ml der nach der Dialyse erhaltenen Lösung gibt man 16 ml 10N Natriumhydroxldlösung und rührt das Ganze während 3 Stunden bei Raumtemperatur (von etwa 18 - 21ºC).

4/ - Reduktion

Anschließend gibt man 500 mg Natriumborhydrid (NaBH&sub4;, MG: 37,83) zu und rührt die Lösung erneut während 4 Stunden bei Raumtemperatur. Dann stellt man den pH-Wert der Lösung mit konzentrierter Chlorwasserstoffsäure auf 4 ein. Nach 15-minütigem Rühren stellt man den pH-Wert mit konzentrierter Natriumhydroxidlosung auf 7 ein.
Zu 820 ml der in dieser Weise erhaltenen Lösung gibt man 16,5g NaCl und dann 1270 ml Ethanol.
Man läßt das Ganze während 3 Stunden stehen und zentrifugiert dann während Minuten bei 2500 min&supmin;¹.
Der Niederschlag wird gewonnen, in 200 ml reinem Ethanol suspendiert, mit einem Ultra-Turrax -Rührer verrieben und schließlich mit einer Büchner-Fritte abfiltriert.
Anschließend wird das Material während 5 Stunden im Vakuum bei 40ºC getrocknet.
Man erhält in diese Weise 8,9 g eines Zwischenprodukts mit folgenden Eigenschaften:
- Codex-Bestimmung: 8 IE/mg
- APTT-Bestimmung: 7 IE/mg
- Anti-Xa-Bestimmung: 8 E/mg
Die Molekulargewichtsverteilung der Zubereitung ist in der Figur 1 wiedergegeben, welche der HPLC-Kurve entspricht. die bei den auf Seite 7 angegebenen Bedingungen bestimmt worden ist.

5/ - Alkoholische Fraktionierung

Man löst diese 8,9g in etwa 120 ml entmineralisiertem Wasser bei Raumtemperatur. Man gibt 1.78 g NaCl zu und senkt den pH-Wert der Lösung mit Chlorwasserstoffsäure auf 3,5 ab. Man stellt dann das Volumen der Lösung mit entmineralisiertem Wasser auf 178 ml ein. Man gibt 151 ml reines Ethanol unter Rühren zu. Man setzt das Rühren während 15 Minuten nach Beendigung der Zugabe fort und läßt das Ganze dann während 10 Stunden bei Raumtemperatur stehen.
Man gewinnt den gebildeten Niederschlag durch Zentrifugieren während 20 Minuten bei 2500 min&supmin;¹. Man suspendiert das Material erneut in 150 ml reinem Ethanol, verreibt mit einem Ultra-Turrax, gewinnt durch Filtration über einer Büchner-Fritte, wäscht mit 300 ml reinem Ethanol und trocknet schließlich während 24 Stunden im Vakuum bei 40ºC.
Man gewinnt in dieser Weise 5,0 g in Form eines weißen Pulvers, wobei die 5.0 g des Produkts IC 1772 die folgenden Eigenschaften besitzen:
- Codex-Titer: 1 1 IE/mg
- APTT-Titer: 9 IE/mg
- Anti-Xa-Titer: 12 E/mg
Die Molekulargewichtsverteilung der erhaltenen Zubereitung ergibt sich aus der Figur 2, welche der HPLC-Kurve entspricht, die unter den oben angegebenen Bedingungen aufgezeichnet worden ist.

¹³C-NMR-Analyse

Das Kohlenstoff-13-NMR-Spektrum ist in der Figur 5 dargestellt. Dieses Spektrum wurde an einer Lösung der Verbindung in Deuteriumoxid bei 25 MHz bei 35ºC aufgezeichnet. Die chemischen Verschiebungen sind auf Methanol bezogen (51,6 ppm).
Die Untersuchung dieses Spektrums zeigt, daß es charakteristische Signale für eine Disaccharidkette des Typs 2-O-Sulfo-α-L-iduronsäure (1-> 4) 6-O-Sulfo-N- sulfo-α-D-glucosamin (1-> 4) aufweist.
Man stellt insbesondere die Anwesenheit von Signalen für anomeren Kohlenstoff bei 101,7 ppm (2-O-Sulfo-α-L-iduronsäure) fest, während die für die nicht-sulfatierte D-Glucuronsäure und L-Iduronsäure charakteristischen Signale (104.5 ppm) nicht vorhanden sind im Gegensatz zu dem Spektrum eines Heparinpräparats, bei dem sie bis zu 30 bis 40 % der Gesamtsignale der Uronsäuren darstellen können.
Im C-2-Bereich des Glucosamlns ist lediglich das Signal bei 60.5 ppm (C-2 des N- Sulfo-glucosamlns) vorhanden. Das für N-Acetyl-glucosamln charakteristische Signal (56.4 ppm) ist kaum feststellbar, während es in dem Ausgangs-Heparin vorhanden ist.
Im Bereich der C-6 von Glucosamln (62,5 für C-6-OH und 69 für C-6-OS) beobachtet man die Anwesenheit von zwei Signalen der nicht-sulfatierten und sulfatierten Formen.
Es ist wesentlich festzustellen, daß das Verhältnis der Intensität der Signale bei 99.4 ppm und 101,7 ppm gleich 1 ist, was die alleinige Anwesenheit der 2-O-Sulfo-L-iduronsäure bestätigt.
Man stellt die Anwesenheit von einigen N-Acetyl-glucosaminresten fest. In ähnlicher Weise tritt das Signal von NHAc auf (24.6 ppm).

Analyse der Leitfähigkeit

Der über die Leitfähigkeit bestimmte Sulfatierungsgrad beträgt 2,3. Die Anzahl der Ladungen pro Disaccharideinheit beträgt 3,3.

BEISPIEL 2

1/ - Man löst 200g injizierbares Heparin in Form des Natriumsalzes mit einem Codex-Titer von 154 IE/mg und einem Anti-Xa-Faktor-Titer von 158 E/mg bei +4ºC in 5 Liter entmineralisiertem Wasser.
Man stellt den pH-Wert der Lösung mit konzentrierter HCl auf 5.0 ein und gibt dann unter mäßigem Rühren:
200 g Natriummetaperiodat in Lösung in 5 Liter entmineralisiertem Wasser bei +4ºC zu. Man stellt den pH-Wert der Mischung erneut mit konzentrierter HCl auf 5,0 ein.
Man läßt die erhaltene Lösung während 24 Stunden im Dunkeln unter mäßigem Rühren bei +4ºC im Kühlschrank stehen.
2/ - Man verteilt das Material dann in 50 Dialyseschläuche und dialyslert während 14 Stunden bei Raumtemperatur gegen fließendes entmlneralisiertes Wasser.
3/ - Am Ende dieser Dialyse gewinnt man 14.5 Liter Lösung. zu der man 116 g reines Natriumhydroxid in Pastillenform zugibt. Man rührt die in dieser Weise erhaltene Lösung während 3 Stunden bei Raumtemperatur.
4/ - Anschließend gibt man 10 g Natriumborhydrid zu und setzt das Rühren während 4 Stunden fort.
Man senkt den pH-Wert der Lösung mit konzentrierter HCl im Verlaufe von 15 Minuten auf 4 ab und stellt dann mit konzentrierter Natrlumhydroxidlösung erneut auf 7 ein.
Das in dieser Weise erhaltene Volumen der Lösung beträgt 15.2 Liter. Man gibt dann 304 g NaCl und anschließend 22,8 Liter Ethanol zu.
Man läßt das Ganze während 48 Stunden bei Raumtemperatur stehen. Man hebert die klare überstehende Lösung ab, gewinnt den Niederschlag, suspendiert ihn erneut in 3 Liter reinem Ethanol, verreibt mit einem Ultra-Turrax und filtriert über eine Glasfritte.
Das Material wird schließlich während 15 Stunden im Vakuum bei 40ºC getrockent.
Man gewinnt 181 g Heparinfragmente mit den folgenden Eigenschaften:
- Codex-Bestlmmung: 10 IE/mg
- APTT-Bestimmung: 9 IE/mg
- Anti-Xa-Bestimmung: 9 E/mg
Molekulargewichtsverteilung: siehe Figur 3
5/ - Man löst diese 181 g in etwa 3 Liter entmineralisiertem Wasser von Raumtemperatur.
Man gibt 36.2 g NaCl zu und stellt den pH-Wert der Lösung mit konzentrlerter HCl auf 3,5 ein.
Man bringt das Volumen der Lösung mit entmineralisiertem Wasser auf 3,62 Liter und gibt unter mäßigem Rühren 3,077 L.iter reines Ethanol zu. Nach Beendigung der Zugabe setzt man das Rühren während 15 Minuten fort und läßt dann während 10 Stunden bei Raumtemperatur stehen. Man gewinnt den gebildeten Niederschlag durch Zentrifugieren während 20 Minuten bei 2500 min&supmin;¹. Man suspendiert das Material erneut in 2 Liter reinem Ethanol, verreibt mit einem Ultra- Turrax, gewinnt durch Filtration über einer Fritte, wäscht mit 3 Liter reinem Ethanol und trocknet schließlich während 24 Stunden bei 40ºC im Vakuum.
Man erhält schließlich 104g eines weißen Pulvers mit den folgenden Eigenschaften:
- Codex-Titer: 13 IE/mg
- APTT-Titer: 10 IE/mg
- Anti-Xa-Titer: 13 E/mg
Molekulargewichtsverteilung: siehe Figur 4

BEISPIEL 3

1/ - Spaltung der Heparinketten mit Periodsäure

Man löst 45 g Injizierbares Heparin aus Schweineschleimhaut in Form des Natriumsalzes in 600 ml entmineralisiertem Wasser. Dann gibt man unter mäßigem Rühren 18 g Natriummetaperiodat in Lösung in 200 ml entmineralisiertem Wasser bei 5ºC zu. Man stellt den pH-Wert durch Zugabe von konzentrierter HCl auf 5 ein und bringt das Reaktionsvolumen mit destilliertem Wasser auf 900 ml. Man hält die Lösung während 24 bis 26 Stunden im Eisschrank (0 - 10ºC) im Dunkeln. Der gebildete Niederschlag wird durch Filtration abgetrennt.

2/ - Entfernung des restlichen Periodats

Man gibt die 900 ml des Reaktionsmediums der Oxidation von Periodat im Verlaufe von 2 Stunden auf ein Ionenaustauscherharz (Amberlite IRA 400 in der C1&supmin;- Form (Rohm and Haas Company, USA)), welches ein Volumen besitzt, das 1/8 des Reaktionsvolumens (110 ml) entspricht.
Man spült die Säure mit 225 ml entmineralisiertem Wasser und vereinigt die Spülflüssigkeit mit der durch den Ionenaustauscher geführten Lösung. Man erhält in dieser Weise 1125 ml der von Periodat und Iodat befreiten Lösung. DieAbwesenheit des Periodats wird titrimetrisch überprüft. Die Titrationskurve von 5 ml der Oxyheparinlösung mit 2.5 ml 1N Natriumhydroxidlösung ermöglicht die visuelle Überprüfung der Abwesenheit von Periodat. Das in Lösung vorliegende Periodat manifestiert sich durch einen charakteristischen Wendepunkt bei einem pKa-Wert von etwa 7.8.

3/ - Depolymerisation in basischem Medium

Man iniziiert die β-Eliminierung durch stufenweise Zugabe von 10N Natriumhydroxidlösung bis zu einem pH-Wert von 11,5. Die Reaktion erfolgt unter Rühren während etwa 1 Stunde bei Raumtemperatur (18 - 23ºC).

4/ - Reduktion

Man gibt dann Natriumborhydrid in einer Menge von 10 g pro 100g des eingesetzten Ausgangsmaterials zu.
Man bewirkt diese Reduktion während mindestens 3 Stunden unter Rühren. Das überschüssige Reduktionsmittel wird anschließend durch Zugabe von 25 g/l NaCl beseitigt, worauf man die Lösung mit konzentrierter HCl auf einen pH-Wert von 4 einstellt. Anschließend stellt man die Lösung mit konzentrierter NaOH auf einen neutralen pH-Wert ein.
Man fällt das Produkt aus durch Zugabe von 1.5 Volumen reinem Ethanol. Man dekantiert den Niederschlag während 48 bis 72 Stunden, entwässert mit Ethanol und trocknet während 12 Stunden bei 40ºC im Vakuum.

5/ - Alkoholische Fraktionierng

Man nimmt das Produkt in entmineralisiertem Wasser auf (180 ml pro 10 g des eingesetzten Heparins). Man gibt pro 10g des Materials 2 g NaCl zu. stellt den pH- Wert auf 3,5 ein und bringt die Lösung pro 10g des eingesetzten Materials mit entmineralisiertem Wasser auf 200 ml.
Man gibt dann 0,85 Volumen reinen Ethanols unter langsamem Rühren zu. Man läßt den Niederschlag sich während 48 bis 72 Stunden absitzen, nimmt ihn dann auf, entwässert mit reinem Ethanol, verreibt mit dem Ultra-Turrax und trocknet bei 40ºC. Man erhält das Produkt in Form eines weißen Pulvers. Das in Alkohol lösliche Produkt wird mit HPLC analysiert. Es ist festzustellen, daß die Oligosaccharide ein mittleres Molekulargewicht im Bereich von 3500 besitzen.

6/ - Reinigung

Man löst das in der vorhergehenden Stufe erhaltene Produkt in einer Konzentration in 5 % entmineralisiertem Wasser und reinigt über eine Ionenaustauschersäule (Amberlite IRA 400, in der OH&supmin;-Form) (1/10 des Reaktionsvolumens).
Anschließend untersucht man das Produkt auf die folgenden Eigenschaften:
Sulfatierungsgrad (bestimmt nach J.R. Helbert und M.A. Marini, Blochemistry 2 (1968). 1101-1106).
Das SO&sub3;/COO-Verhältnis beträgt 2.2 bis 2.4.
Anti-IIa- und Anti-Xa-Wirkungen:
- TCK(1): 4 E/mg
- USP (2): 13 E/mg
- Anti-IIa-Aktivität (3): 12 E/mg
- Anti-Xa-Aktivität (4) (Yin und Wessler): 8 E/mg
- Anti-Xa-Aktivität (auf einem chromogenen Substrat S 2222 in einem gereinigten System): 1 E/mg
Die zur Durchführung der oben angegebenen Meßergebnisse angewandten Systeme sind die folgenden:
(1): R.R. Proctor und S. Rapaport - Am. J. Clin. Pathol. 36 (1961), 212-219
(2): US-Pharmakopoe XXI
(3): Gemessen durch Verlängerung der Thrombinzeit.
(4): E.T. Yin, S. Wessler, J.V. Butler - J. Lab. Clin. Med. 81 (1973), 298-310

Nachweis von geöffneten Ringen der Uronsäuren zwischen C&sub2; und C&sub3;

Der Smith-Abbau bei einem pH-Wert von 3 und bei 100ºC während 1 Stunde einer 5 %-igen Lösung von IC 1772 führt zu einer spezifischen Spaltung der Oligosaccharidketten im Bereich der geöffneten Uronsäuren zwischen C&sub2; und C&sub3;. Es ergibt sich eine Absenkung des mittleren Molekulargewichts des Produkts, die durch Gelfiltration über TSK 2000 bei refraktometrischer Bestimmung beobachtet wird.
Die Ergebnisse sind wie folgt angegeben:
- Mna steht für das "zahlenmittlere Molekulargewicht". wie es von W.W. Yau, J.J. Kirkland und D.D. Bly (in Modern Size-Exclusion Liquid Chromatography, Wiley Interscience Pulbication) des Produkts, welches so, wie es ist, untersucht wird;
- Mnb steht für das "zahlenmittlere Molekulargewicht" nach der Durchführung eines Smith-Abbaus in der oben beschriebenen Weise;
- (Mna/Mnb)- 1 steht für die Anzahl der für diesen Smith-Abbau der Oligosaccharidkette empfindlichen Bereiche, was der Anzahl der geöffneten Uronsäuren zwischen C&sub2; und C&sub3; entspricht.
Die Untersuchung erfolgt an zwei Gruppen von Produkten IC 1772:
Es ist daher festzuhalten, daß bei den Analysebedingungen IC 1772 pro jeweils zwei Ketten mindestens eine geöffnete Uronsäure enthält.

ANTIKOAGULIERENDE WIRKUNG VON IC 1772 IN MENSCHLICHEM PLASMA

Nachfolgend sind die Ergebnisse der folgenden Untersuchungen angegeben:
1. Anti-IIa- und Anti-Xa-Aktivität in vitro bei verschiedenen Systemen.
2. Koagulationszeit für Thrombin (TCT). 1/ - Anti-IIa- und Anti-Xa-Aktivität in vitro Untersuchung Heparinstandard E/mg Anti-IIa-Aktivität Anti-IIa-Aktivität (auf dem chromogenen Substratin gereinigtem System) Anti-IIa-Aktivität (auf chromogenem Substrat S 2238 in Plasmasystem) Anti-Xa-Aktivität&sup4; (Yin und Wessler) Anti-Xa-Aktivität (auf dem chromogenen Substrat S 2222 in gereinigtem gereinigtem System) Anti-IIa-Aktivität (auf chromogenem Substrat S 2222 in Plasmasystem)
Die Angaben der für die Durchführung der Messungen verwendeten Systeme sind die folgenden:
1/ R.R. Proctor und S. Rapaport - Am. J. Clin. Pathol. 36 (1961). 212-219
2/ US-Pharmakopoe XXI
3/ Gemessen durch Verlängerung der Thrombinzeit.
4/ E.T. Yin, S. Wessler, J.V. Butler - J. Lab. Clin. Med. 81(1973). 298-310
2/- TCT
In der nachfolgenden Tabelle 1 sind die Ergebnisse von drei Untersuchungen an drei Typen von verwendetem Plasma zur Untersuchung der APTF-Aktivität in Form der Koagulationszeit in Sekunden angegeben. Die Kontrolle erfolgte in normalem Plasmamedium, Die Ergebnisse entsprechen dem Mittelwert von zwei unabhängigen Untersuchungen. TABELLE 1 Normales Plasma Plasma verarmt an
Es ist festzuhalten, daß bei einer Dosis von 5 und Insbesondere 10 ug/ml eine Verlängerung der Thrombinzeit auftritt, die von HC II abhängt.

- INHIBIERNG DER WUCHERNG VON GLATTEN MUSKELZELLEN (GMZ) IN VITRO

Experimentelle Methode

Die glatten Muskelzellen (GMZ) stammen von einem Bauchsegment der Aorta von Sprague Dawley-Ratten. Man gibt kleine Stücke des Mediums in das Kulturmedium RPMI-1640, das mit 20 % Kalbsfötenserum (KFS) versetzt worden ist. Nach Ablauf von 1 bis 2 Wochen wandern die GMZ aus dem Gewebe aus und beginnen sich zu vermehren.
Man gibt 5 - 8.10³ GMZ in die Kultur in Vielnäpfenplatten. Nach 24 Stunden unterbricht man das Wachstum durch Waschen. gefolgt von der Zugabe des Mediums RPMI + 2 % plättchenfreiem Plasma (oder RPMI + 0,4 % KFS) während 72 Stunden.
Die Zellen werden dann während 5 bis 7 Tagen in das Medium RPMI eingebracht, das mit 20 % KFS und mit oder ohne die zu untersuchende Verbindung versetzt worden ist, wobei diese letztere Verbindung in unterschiedlichen Konzentrationen zugegeben wird.
Das Nettowachstum der GMZ bei den Kontrollversuchen oder den Versuchen mit den zu untersuchenden Produkten ermittelt man durch Abziehen der Anzahl der Ausgangszellen von der Anzahl der Zellen am Ende der Untersuchung (Doppelmessung mit einer Coulter-Zählvorrichtung).
Die prozentuale Inhibierung wird mit Hilfe der folgenden Formel berechnet:
% Inhibierung = [1 - Nettowachstum der untersuchten Zellen/Nettowachstum der Kontrollzellen]x 100
(siehe Castellot et al., J. Cell. Biol. 102 (1986), 1979-1984).
Die in Abhängigkeit von der Konzentration von IC 1772 in dem Kulturmedium erzielten Ergebnisse sind die folgenden (zu Vergleichszwecken sind die mit Heparin erhaltenen Inhibierungswerte angegeben). Menge des Produkts Inhibierung Heparin Kulturmedium
Bei diesem experimentellen Modell beobachtet man eine Aktivität, die sehr ähnlich ist der des Heparinstandards.

- INHIBIERUNG DER WUCHERUNG VON GLATTEN MUSKELZELLEN (GMZ) IN VIVO: BALLONKATHETER-MODELL

Experimentelle Methode:

Die Untersuchung erfolgt an männlichen Sprague Dawley-Ratten mit einem Alter von 5 Monaten und einem Gewicht von etwa 500 g.
Die Tiere werden betäubt und das Endothelium der linken Kopfschlagader wird durch intraluminales Einführen eines Ballonkatheters für die Embolektomie, der in den äußeren Zweig der Kopfschlagader eingeführt wird, freigelegt.
Das zu untersuchende Produkt oder eine sterile Kontrollösung wird durch kontinuierliche Infusion in einer Ringer-Lactoselösung in die linke Drosselvene verabreicht (man verwendet eine osmotische Infusionspumpe (Alzet), die auf dem Rücken der Tiere befestigt ist). Die Behandlung wird während 4 Wochen bei einer Dosis von 2,5 ul/Stunde fortgesetzt. Die verabreichte Dosis beträgt 1mg/kg/Stunde.
Nach 28 Tagen werden die Tiere betäubt und es werden die Kopfarterien entnommen. 17,9 und 1 Stunde vor der Betäubung injiziert man den Tieren Tritium-thymidin auf Intraperitonealem Wege.
Die Ergebnisse sind als der DNA-Gehalt in den verletzten rechten Kopfschlagadern (CD) und den nicht verletzten linken Kopfschlagadern (CG) gemäß der folgenden Gleichung angegeben:
Inhibierung (%) = [1 - DNA* der behandelten Tiere/DNA* der Kontrolltiere]x 100
DNA*= DNACG -DNACD/DNACD
(siehe A.W. Clowes und M.M. Clowes, Labor. Investig. 52(6) (1985), 612-616).

Ergebnisse:

Bei einer ersten Untersuchung an 10 Tieren beobachtet man mit dem untersuchten Produkt IC 1772 eine Inhibierung von etwa 50 %, die sehr ähnlich ist der von Heparin.

INHIBIERUNG DES KOMPLEMENT-SYSTEMS

Heparin inhibiert die Bildung der C&sub3;-Konvertase, die die wechselweise Verstärkung des Komplements bewirkt durch Inhibieren der Bildung des bimolekularen Komplexes zwischen den Proteinen C&sub3;b und B.
Die Wirkung von Heparin und des Produkts IC 1772 auf die C&sub3;b-B-Bindung wurde unter Verwendung von mit ¹²&sup5;I markierten Proteinen B (¹²&sup5;I-B) und von Schaf-Erythrozyten, die das Protein C&sub3;b tragen (ESC&sub3;b), untersucht.
Man bezeichnet mit IC&sub5;&sub0; die Konzentration von Heparin oder des untersuchten Oligosaccharids, das dazu erforderlich ist, die Bildung des Komplexes C&sub3;b-B zu 50 % zu inhlbieren.
Diese Untersuchung erfolgt in vitro in einem System von gereinigten Proteinen.

Experimentelles System

Man Inkubiert die ESC&sub3;b (0,75 - 2,5 x 10&sup7;) in unterschiedlichen Konzentrationen von ¹²&sup5;I-B in einem Veronal-Puffer, der 0.1 % Gelatine und 5 mM Mg²&spplus; enthält, während 30 Minuten bei 30ºC.
Man gibt Probenvonjeweils 70 ul. doppelt für jede Reaktion, auf 300 ul einer Mischung aus Dibutylphthalat (Merck-Clevenot, Frankreich) und Dinonylphthalat (Coger. Paris) (7:3, V/V) in 0.5 ml-Polypropylenröhrchen.
Man zentrifugiert die Röhrchen während 1 Minute bei 8000 g in einer Beckman- Mikrozentrifuge (Beckman, Paris) und schneidet dann unmittelbar oberhalb des Niederschlags durch. Man zählt die Radioaktivität des gebundenen Liganden aus.
Das Produkt IC 1772 wurde im Vergleich zu Heparin bestimmt. Die in IC&sub5;&sub0; angegebenen Ergebnisse sind die folgenden:
IC 1772: 0,4 ug/ml
Heparinstandard: 0,5 ug/ml
- Blutungszeit:
Man verabreicht das Produkt in einer Dosis von 5 mg/kg 15 Minuten und 1 Stunde vor der Untersuchung auf intravenösem Wege an Kaninchen.
Das angewandte experimentelle Modell ist das von Cade, wie es von Cade et al. in Thromb. Res. 35 (1986), 613-625 beschrieben worden ist.
Die durchgeführten Untersuchungen zeigen, daß das Produkt bei der Verabreichung auf intravenösem Wege in einer Dosis von 5 mg/kg zu keiner Verlängerung der Blutungszeit führt.

1 - Untersuchung der antithrombotischen Wirkung von IC 1772

Das angewandte Modell ist das folgende:
Man betäubt die Tiere durch intramuskuläre Verabreichung von 70 mg/kg Ketaset (Bristol Lab, Syracuse, NY). Mit Hilfe einer chirurgischen Methode isoliert man eine Länge von 2 cm der rechten und linken Drosselvenen. Man injiziert das zu untersuchende Produkt genau 5 Minuten vor der Injektion einer thrombogenen Substanz, beispielsweise einer Mischung aus dem konzentrierten Komplex von Prothrombin und dem Gift von Viper venum (PCC/RVV) Intravenös in die Randvene des Ohrs. Nach Ablaufvon 20 Sekunden bindet man die Drosselvene ab und nach einer Stockungsdauer von 10 Minuten entnimmt man Venensegmente. die man in physiologisches Serum einbringt und an denen man dann das Ausmaß der Bildung eines Blutpfropfens anhand eines Maßstabs von 0 bis 4 bestimmt (wobei 4 einem einzigen Pfropfen ohne freie Erythrozyten entspricht). (J. Fareed, J.M. Walenga, Z. Kiumar und A. Rock, "A Modified Stasis Thrombosis Model to Study the Antithrombotic Actions of Heparin and its Fractions", Sem. Thromb. Hemost. 11(2) (1985), 155-175).
Das in einer Dosis von 1 mg/kg auf intravenösem Wege an Gruppen von 10 Kaninchen verabreichte Produkt IC 1772 zeigt bei sämtlichen Tieren eine sehr gute antithrombotische Wirkung.

Claims

1. Zubereitung aus Heparinen. wovon 90 % ein Molekulargewicht zwischen 3600 und 11000 Da besitzen, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Fragmenten gebildet ist, die frei sind von Disaccharidketten des Typs nichtsulfatierte Uronsäure-Glucosamin-N-sulfat, welche Fragmente der folgenden allgemeinen Formel I entsprechen:

R-(X-Y)n-R' (I)

in der

- X entweder einen sulfatierten Iduronsäurerest der Formel II:

oder, in einem Verhältnis von mindestens einem Rest pro zwei Ketten, einen nichtsulfatierten Uronsäurerest (D-Glucuronsäure oder L-Iduronsäure), der zwischen den Kohlenstoffatomen in den Positionen 2 und 3 geöffnet ist. der Formel III:

- Y einen D-Glucosaminrest der Formel IV:

worin

R&sub1; ein Wasserstoffatom oder eine Gruppe -SO&sub3;&supmin;,

R&sub2; eine Gruppe -SO&sub3;&supmin; oder -CO-CH&sub3;, wobei der Anteil der Gruppen -SO&sub3;&supmin; mindestens 90 % beträgt, und

R&sub3; eine Gruppe -SO&sub3;&supmin; oder ein Wasserstoffatom, wobei der Anteil der Gruppen -SO&sub3;&supmin; mindestens 70 % beträgt, darstellen,

- R ein Wasserstoffatom oder einen Rest der Formel V:

worin

R&sub1; bis R&sub3; die oben angegebenen Bedeutungen besitzen und

R4 ein Wasserstoffatom oder den Uronsäurerest darstellt,

- R' entweder ein Wasserstoffatom oder einen natürlichen Uronsäurerest oder den Uronsäurerest, der im Verlaufe der Period-oxidation modifiziert worden ist und dessen Aldehydgruppen zu Alkoholgruppen reduziert worden sind, und 7 ≤ n ≤ 15 für die Mehrzahl der Bestandteile bedeuten, was Ketten mit einem Molekulargewicht von 4800 bis 9000 entspricht,

wobei die Molekulargewichte durch HPLC mit einer TSK 2000 SW-Säule, die mit einem photometrischen Detektor gekuppelt ist der bei 205 nm arbeitet. unter Verwendung von 0,5 M Na&sub2;SO&sub4; als Lösungsmittel bei einem Durchsatz von 1 ml/min bestimmt worden sind,

und deren pharmazeutisch annehmbare Salze.

2. Zubereitung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie im Mittel 3,3 Ladungen pro Disaccharideinheit aufweist.

3. Zubereitung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie:

- ein mittleres Molekulargewicht im Bereich von 5800 bis 7000 Da, wobei 70 % der Bestandteile zwischen 4800 und 9000 Dalton und 90 % zwischen 3600 und 11000 Da liegen,

- ein Molekulargewicht am Maximum des Peaks im Bereich von 5500 bis 6500 Da,

- weniger als 5 % Ketten kürzer als Dodecasaccharide und

- weniger als 5 % Ketten jenseits von 11000 besitzt.

4. Zubereitung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das NMR-Spektrum dem in Figur 5 dargestellten entspricht.

5. Zubereitung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet. daß die enthaltenen Fragmente in Form von Natrium-, Kalium-, Calcium- oder Magnesiumsalzen vorliegen.

6. Verfahren zur Herstellung von Zubereitungen aus Heparinen mit niedrigem Molekulargewicht. wie sie in Anspruch 1 definiert sind. dadurch gekennzeichnet, daß man:

a) eine wäßrige Lösung von Heparin mit einer Endkonzentration von 0,5 bis 5 % (Gew./Vol.) mit einem Salz der Periodsäure mit einer Endkonzentratlon von 0,5 bis 4 % (Gew./Vol.) bei einem pH-Wert von 4.5 bis 6,5 und einer Temperaturvon 0 bis 10ºC behandelt;

b) die in dieser Weise erhaltenen Heparinketten mit einer starken Base mit einer Endbasen-Molarität von 0,1 bis 0,3 N behandelt;

c) die in dieser Weise erhaltenen Depolymerisations-Fragmente mit einem Reduktionsmittel behandelt;

d) nach der eventuellen Entfernung des überschüssigen Reduktionsmittels die reduzierten Fragmente nach der Zugabe eines anorganischen Salzes mit Hilfe eines alkoholischen Lösungsmittels ausfällt;

e) eine wäßrige Lösung des in dieser Weise erhaltenen Niederschlags nach Zugabe eines anorganischen Salzes mit Alkohol behandelt;

f) das in dieser Weise ausgefällte Produkt gewinnt und gegebenenfalls das der verwendeten starken Base entsprechende Salz in ein anderes pharmazeutlsch annehmbares Salz umwandelt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es die Kombination der folgenden Stufen umfaßt:

- milde Oxidation von Heparin durch Umsetzen von Heparin in wäßriger Lösung bei einer Endkonzentration von 0,5 bis 5 % (Gew./Vol.) mit einem Salz der Period- Säure bei einer Endkonzentrationvon 0,5 bis 4% (Gew./Vol.) bei einem pH-Wert zwischen 4.5 und 6.5 bei einerTemperaturvon 0 bis 10ºC während etwa 15 bis 48 Stunden unter Lichtausschluß,

- Depolymerisation der erhaltencn Heparlnketten durch Zugabe einer starken Base in einer Menge, die zu einer Endmolarität der Base von 0,1 bis 0,3 N und zu einem pH zwischen 11 und 12 führt,

- Reduktion der Depolymerisations-Fragmente mit Hilfe eines Reduktionsmittels und anschließend gegebenenfalls die Entfernung des nichtumgesetzten Reduktionsmittels.

- Gewinnung der reduzierten Heparinfragmente durch Ausfällen mit Hilfe eines Lösungsmittelmediums, in dem sie unlöslich sind,

- Isolierung der gewünschten Fragmente aus einer durch Inlösungbringen des in der oben beschriebenen Weise isolierten Niederschlags in Wasser erhaltenen wäßrigen Lösung durch Fraktionierung mit Hilfe von Alkohol in Gegenwart eines anorganischen Salzes und Gewinnen des gebildeten Niederschlags.

8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß man in der Stufe der Period-oxidation Heparin und das Salz der Periodsäure in Mengen verwendet, die zu Endkonzentrationen von 1,5 % bis 5 % bzw. 1,5 % bis 2.5 % (Gew./Vol.) führen.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man die Stufe der Period-oxidation bei einem PH-Wert von 5 und bei 4ºC durchführt.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 9. dadurch gekennzeichnet, daß das Salz der Periodsäure Natriummetaperiodat ist.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Beseitigung des restlichen Periodats eine Dialyse mit Dialyseschläuchen mit einer Porosität von 3 bis 4000 Da während etwa 15 h durchführt.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Gewinnung der reduzierten Heparinfragmente dadurch bewirkt wird, daß man den pH auf 7 einstellt und nach der Zugabe eines anorganischen Salzes, wie NaCl, 1 bis 5 Volumen eines Lösungsmittels. wie Ethanol, zusetzt.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß man die ausgefällten reduzierten Heparinfragmente in einer Konzentration von 5 % (Gew./Vol.) in mit einem anorganischen Salz versetzten Wasser löst bis zu einer Endkonzcntratlon von 1 %. wobei der pH dieser Lösung auf 3.5 eingestellt wird und man 0,85 Volumen eines alkoholischen Lösungsmittels zugibt.

14. Pharmazeutische Zubereitung, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine wirksame Menge einer Zubereitung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 in Kombination mit einem pharmazeutischen Trägermaterial umfaßt.

15. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß sie in Form einer konzentrierten, injizierbaren sterilen Lösung vorliegt. die, wenn sie für die subkutane Injektion bestimmt ist, 10 bis 150 mg/ml oder, wenn sie für die intravenöse Injektion oder für die Perfusion bestimmt ist, 10 bis 100 mg/ml enthält.

16. Biologisches Reagens, gebildet durch eine Zubereitung nach einem der Ansprüche 1 bis 5.