DE3852950T2 - Lipohaptene und Verwendung trägergebundener Lipohaptene im Immuntest. - Google Patents
Lipohaptene und Verwendung trägergebundener Lipohaptene im Immuntest.Info
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Description
- Antigene, die in immunologischen Reaktionen für diagnostische oder therapeutische Zwecke verwendet werden, insbesondere Proteine, haben eine beträchtliche molekulare Größe entsprechend einem Molekulargewicht von mindestens 10.000, am häufigsten über 100.000 oder sogar über 1.000.000. Wegen ihrer Größe werden diese Proteine normalerweise nicht synthetisch produziert, aber durch biologische Verfahren erhalten. Während es bekannt ist, daß Proteine einer beträchtlich kleineren Größe antigene Eigenschaften haben, sind sie nicht in immunologischen Reaktionen verwendet worden, unter anderem aus dem Grund, daß sie bei diesen Reaktionen leicht verloren werden, sei es wegen ihre Löslichkeit in dem verwendeten Reagens oder wegen ihres Nicht-Anhaftens an gewöhnliche in Immunoassays verwendete Substrate, z. B. solchen, die in Radioimmunoassays (RIA) oder "enzyme-linked immunosorbent assays" (ELISA) verwendet werden.
- Es wurde nun gefunden, daß der vorher erwähnte Nachteil durch Verwendung eines Antigens mit geringem Molekulargewicht überwunden werden kann, welches an ein multifunktionelles, substituiertes lipophiles Akzeptormolekül als Träger für dieses Antigen mit geringem Molekulargewicht gebunden ist.
- Demgemäß betrifft die Erfindung Lipohaptene der allgemeinen Formel I
- (X)m-R-Y-(S)n-P (I)
- wobei
- - R ein Kohlenwasserstoff-Grundgerüst mit 2 bis 30 Kohlenwasserstoffatomen ist
- - X eine Kohlenwasserstoff-Gruppe (beziehungsweise eine Hydrocarbylen-Gruppe) mit 6 bis 30 Kohlenstoffatomen ist, welche mit R über eine Bindungsgruppe enthaltend ein oder mehrere Heteroatome verbunden ist
- - m eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist
- - P ein Polypeptid- oder Polysaccharid-Rest mit 2 bis 100 Aminosäuren- oder Glykosyl-Einheiten ist
- - Y eine funktionelle Gruppe (bzw. diese funktionelle Gruppe in ihrer reagierten Form) ist, welche fähig ist, an eine freie Aminogruppe des Polypeptids P oder an eine Carboxy-, Halbacetal- oder Hydroxyl- Gruppe des Polypeptids P zu binden
- - S eine difunktionelle Spacer-Gruppe ist, wobei die funktionellen Gruppen davon fähig sind, mit der funktionellen Gruppe Y auf der einen Seite und einer freien Amino-, Carboxyl-, oder Hydroxyl-Gruppe des Polypeptids oder Polysaccharids P auf der anderen Seite zu binden, und
- - n 0 oder 1 ist.
- Das Kohlenwasserstoff-Grundgerüst R hat 2 bis 30 Kohlenstoffatome, vorzugsweise 3 bis 18 Kohlenstoffatome. Die Kohlenwasserstoffgruppe kann eine aliphatische einschließlich gesättigte und ungesättigte, ebenso wie eine alicyklische Gruppe sein. Bei aromatischen Gruppen ist die minimale Anzahl der Kohlenstoffatome offensichtlicherweise 6. Am meisten bevorzugt ist R eine Alkylgruppe.
- Die Kohlenwasserstoff-Gruppe X verbunden mit dem Grundgerüst R hat 6 bis 30 Kohlenstoffatome, vorzugsweise 12 bis 20 Kohlenstoffatome und am bevorzugtesten 16 bis 18 Kohlenstoffatome. Aromatische und alizyklische Substituenten sind weniger bevorzugt, so daß die bevorzugten Substituenten X aliphatische einschließlich gesättigte und ungesättigte Gruppen sind. Am meisten bevorzugt ist X eine Alkyl-oder Alkenyl-Gruppe. Die Gruppe X kann andere Atome als Kohlenstoff oder Wasserstoff enthalten, so lange die Hydrophobizität und biologische Verträglichkeit nicht beeinträchtigt wird.
- Die Bindungsgruppe von X enthaltend ein oder mehrere Heteroatome, welche den Substituenten X an das Grundgerüst R bindet, ist vorzugsweise eine Gruppe, die unter biologischen Bedingungen spaltbar ist. Geeignete Beispiele sind Ester-, Ether-, Amid-, Urethan- und Thiourethan-Gruppen. Ester- und Ether-Gruppen sind bevorzugt.
- m ist eine ganze Zahl von 1 bis 5, vorzugsweise 1, 2 oder 3 und am bevorzugtesten 2. Falls m größer als 1 ist, kann ein Kohlenstoffatom des Grundgerüsts R nicht mehr als einen Substituenten X enthalten. Wenn m 2 ist, sind die zwei Substituenten X vorzugsweise an benachbarten Kohlenstoffatomen lokalisiert. Der Wert von 2 für m ist aus kommerziellen Gründen bevorzugt, weil diese Verbindungen leicht erhältlich sind. In einer speziellen Ausfuhrungsform, wenn m 2 oder 3 ist, vorzugsweise 2, sind die Substituenten X dieselben und sind an benachbarten Kohlenstoffatomen lokalisiert.
- P ist ein Polypeptid- oder Polysaccharid-Rest mit 2 bis 100 basischen Einheiten, d. h. entweder Aminosäure- oder Glykosyl-Einheiten. Es ist bemerkenswert, daß die Anzahl der Einheiten eine so kleine Zahl wie 2 oder zum Beispiel 3 oder 4 oder 5 sein kann. Andererseits kann die Anzahl der Einheiten eine so hohe Zahl wie 100 oder zum Beispiel 80 oder 70 oder 60 oder 50 sein. Vorzugsweise ist die Anzahl der Einheiten 4 bis 50, bevorzugter 6 bis 40 und am bevorzugtesten 5 bis 20.
- Y ist eine funktionelle Gruppe, die fähig ist, das Grundgerüst R an das Polypeptid oder Polysaccharid P entweder direkt oder über einen Spacer S, zu binden. Geeignete Beispiele für funktionelle Gruppen Y sind Carboxyl-, Amino-, Hydroxyl-, Cyanat- und Isothiocyanat-Gruppen. Wenn n 0 und P ein Peptid ist, dann ist Y vorzugsweise eine Carboxyl- Gruppe oder eine modifizierte Carboxyl-Gruppe, um eine einfache Bindung mit der Aminogruppe des Polypeptids zu erhalten.
- Ein Spacer S wird vorzugsweise verwendet, wenn der Charakter der verbindende n Gruppe zwischen Y und P verändert werden soll. Zum Beispiel kann durch Verwendung eines Spacers die Ausbeute der Reaktion zwischen dem Träger und Polypeptid oder Polysaccharid sehr häufig beträchtlich verbessert werden. Zusätzlich, falls die Reaktivität der Gruppe Y, die an P bindet, verändert werden soll, kann dies durch Einfügen eines Spacers S getan werden. Eine bevorzugte Spacer-Gruppe (funktionelle Gruppen sind nicht gezeigt), hat die Formel -(CH&sub2;)r- wobei r eine ganze Zahl von 2 bis 16 ist. Erfindungsgemäße Lipohaptene umfassen lipophile Akzeptormoleküle oder Träger der allgemeinen Formel II
- (X)m-R-Y (II)
- wobei X, m, R und Y die vorerwähnten Bedeutungen haben.
- Verbindungen, die strukturell mit den lipophilen Akzeptormolekülen, die in den erfindungsgemäßen Lipohapten enthalten sind, verwandt sind, sind in US-A-4 167 641, Journal of Medicinal Chemistry 15(2), 212-214 (1972), und Tetrahedron 39(13), 2211-2217(1983) gezeigt.
- Eine bevorzugte Klasse von Trägern der allgemeinen Formel II sind 9,10- Dihydroxystearinsäure acyliert mit aktivierten langkettigen Fettsäuren, um Ester zu erhalten, oder alkyliert mit aktivierten langkettigen Fettalkoholen, um die entsprechenden Ether zu erhalten.
- Weiter bevorzugte Klassen von Trägern sind 2,3-Diamino-1-Propionsäure oder 2,3-Diamino-1-Propanol acyliert mit aktivierten langkettigen Fettsäuren. Im letzteren Falle werden die erhaltenen Ester einer alkalischen Hydrolyse unterworfen und die freien Alkoholgruppen werden dann mit Bernsteinsäureanhydrid verestert.
- Eine noch andere bevorzugte Klasse von Trägern wird durch Acylierung von 2,4-Diaminobenzoesäure mit aktivierten Fettsäuren erhalten, um Verbindungen der Formel zu erhalten
- wobei R ein Kohlenwasserstoffrest, vorzugsweise Alkyl, mit 5 bis 25 Kohlenstoffatomen ist.
- Die synthetischen antigenen Peptide, die den Epitopen der untersuchten Antigene ähneln, werden synthetisiert, zum Beispiel durch Festphasen- Peptidsynthese nach Merrifield oder durch das Fmoc-Verfahren für Festphasen-Peptidsynthese. Die Bindung des Trägers an das Polypeptid wird im allgemeinen auf der Stufe des geschützten Peptid bewirkt, das noch an die Festphase gebunden ist. Der aktivierte lipophile Träger wird dann kovalent an den N-Terminus des Peptids gebunden. Standardspaltverfahren setzen den lipophilen Träger, der kovalent an das antigene Polypeptid gebunden ist, mit gleichzeitiger Auflösung des Schutzes der Aminosäure-Reste frei, wobei der Schutz der Aminosäurereste während der Peptidsynthese erforderlich war. Polysaccharide werden an den lipophilen Träger gekoppelt, welcher durch einen Spacer mit einer NH&sub2;-Gruppe verlängert worden ist, um eine Schiff-Base mit der reduzierenden Gruppe des Polysaccharids zu bilden. Diese Schiff-Base kann reduziert werden, zum Beispiel mit Natriumborhydrid, um die Imino-Gruppe in eine substituierte Amino-Gruppe umzuwandeln. In den meisten Fällen ist keine weitere Reinigung des Lipohaptens, das den Träger kovalent gebunden an das Polypeptid enthält, erforderlich. Andererseits kann die Reinigung durch verschiedene chromatographische Verfahren, wie z. B. Hochleistungsflüssigchromatographie oder Molekularsieb-(Form)-Chromatographie bewirkt werden. Die Träger werden als gereinigte Verbindungen in den End-Kopplungsschritt eingeführt. Die Antigene sind wegen der Festphasensynthese rein.
- Spezifische Vorteile der erfindungsgemäßen Lipohaptene umfassend die lipophilen Träger gebunden an das Antigen, vorzugsweise ein Peptid- Antigen, bestehen darin, daß die Peptide automatisch synthetisiert werden können, was das System unabhängig von biologischen Herstellungsverfahren macht. Auch ist, im Gegensatz zu einem bekannten System, wo ein Oligopeptid an ein Protein (mit hohem Molekulargewicht) gebunden wird, kein Freunds-Adjuvans notwendig, was zu einer Aufnahme durch Lymphozyten führt. Schließlich zeigen die Lipohaptene in immunologischen Assays, wie RIA oder ELISA, eine gute Adhesion an das Substrat, so daß nicht länger die Gefahr besteht, die Antigene zu verlieren.
- Die Lipohaptene der Formel I können in Immunoassays zum Nachweis von Antikörpern beziehungsweise Antigenen verwendet werden.
- Somit betrifft eine weitere Ausführungsform der Erfindung ein Verfahren zum Nachweis von Antikörpern in einer biologischen Flüssigkeit, wie einem Serum oder Spinalflüssigkeit, umfassend
- (a) Beschichten eines Substrats mit einem Lipohapten der Formel I, wie vorhergehend definiert, mit einem Antigen P-Kognat für diese Antikörper
- (b) Zusetzen von zu diagnostizierender Körperflüssigkeit eines Patienten, und
- (c) Nachweisen des gebildeten immunologischen Konjugats.
- Eine noch andere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Antigenen in einer biologischen Flüssigkeit, wie einem Serum oder Spinalflüssigkeit, umfassend
- (a) Beschichten eines Substrats mit einem Lipohapten der Formel I, wie vorhergehend definiert, mit einem Antikörper P-Kognat für diese Antigene
- (b) Zusetzen von zu diagnostizierender Körperflüssigkeit eines Patienten, und
- (c) Nachweisen des gebildeten immunologischen Konjugats.
- Der Nachweis dieses immunologischen Konjugats wird erreicht durch seine Reaktion, z.B. mit einem markierten Reagens, ausgewählt aus Anti- Mensch-Immunglobulin-Antikörpern und bakteriellem A-Protein, und Nachweis des gebildeten Komplexes zwischen dem Konjugat und dem Reagens.
- Anstelle der Markierung des gebildeten Immunkomplexes kann man den Antikörper bzw. das Antigen vor Auftreten der Immunreaktion markieren.
- Zu kommerziellen Zwecken wird das Lipohapten in Form eines Kits sein. Demgemäß besteht eine weitere Ausführungsform der Erfindung in einem Kit zum Nachweis von Antikörpern in einer biologischen Flüssigkeit, umfassend
- - ein Lipohapten der allgemeinen Formel I, wie vorstehend definiert, und
- - Mittel zum Nachweis eines gebildeten immunologischen Konjugats.
- In dem vorher erwähnten Kit umfaßt ein bevorzugtes Mittel zum Nachweis des immunologischen Konjugats ein Reagens, ausgewählt aus Anti- Mensch-Immunglobulin-Antikörpern und Protein A, und ein Mittel zum Nachweis des mit dem Reagens gebildeten immunologischen Komplexes.
- Eine große Vielfalt von Immunoassays und Modifikationen davon, wie direkte, indirekte, kompetitive usw. Modifikationen, sind verfügbar, und die Bedingungen, unter welchen solche Immunoassays ausgeführt werden, sind ebenfalls gut bekannt. Bezug wird genommen auf L. Hudson und F.C. Hay "Practical Immunology", 2. Aufl. 1980, Handbook of Experimental Immunology, insbes. Bd. 1, W.M. Hunter, Radioimmunoassay, Hrsg. D.M. Weir, 3. Aufl., Kap. 14.2 - 14.21; Measurement of monoclonal Immunoglobulin concentrations in Hybridoma Cultures by competitive Enzyme Immunoassay, K.W. Hunter & J.M. Bosworth; Methods in Enzymology, Bd. 121, Kap. 51, S. 541 - 547, Hrsg. J.J. Langone und H. van Vunakis, 1986; Kemeny, D.M. und Challacombe, S.J., 1986, "Advances in ELISA and solid phase Immunoatsay" Immunology today 7, S. 67 - 68. Speziell bevorzugte Immunoassays zur Verwendung der erfindungsgemäßen Lipohaptene sind Radioimmunoassay (RIA) und "enzyrne-linked immunosorbent assay" (ELISA).
- Ein Verfahren für einen ELISA-Test ist unten angegeben. Wasser bedeutet immer destilliertes Wasser.
- 1. Costar-Platten werden mit Antigen, d.h. dem Lipohapten von Anspruch 1, beschichtet; Konzentration 10 ug/ml Borat-gepufferte Kochsalzlösung ("borate buffered saline")
- Di-Na-Tetraborat 0,953 g
- NaCl 0,9 g
- 0.1 N HCl 17.7 ml
- Hinzufügen von Wasser auf 100 ml (pH 8,3)
- 200 ul pro Vertiefung; 4 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 -C.
- 2. 200 ul 1% BSA (Rinderserum-Albumin) in PBS (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung); 1 bis 2 Stunden bei Raumtemperatur.
- 3. Zweimaliges Waschen mit der folgenden Kochsalzlösung.
- NaCl 8,8 g
- Tween 20 (1%) 500 ul
- NaN&sub3; 200 mg
- Hinzufügen von Phosphatpuffer, um eine End-Puffer- Konzentration in der Kochsalzlösung von 0,1 M und einen End- pH von 6,5 zu erhalten
- Hinzufügen von Wasser auf 1000 ml
- 4. Hinzufügen von Antiserum verdünnt mit PBS; 90 Minuten bei 37 ºC oder über Nacht bei 4 ºC.
- 5. Dreimaliges Waschen mit Kochsalzlösung.
- 6. Hinzufügen von 200 ul zweitem Antikörper gekoppelt mit alkalischer Phosphatase, verdünnt in Trisma-Puffer 1:1000; 90 Minuten bei 37 ºC oder über Nacht bei 4 ºC.
- BSA 50 g
- Tris 6,05 g
- 30 MgCl&sub2; x 6 H&sub2;O 200 mg
- NaN&sub3; 400 mg
- Hinzufugen von Wasser auf 1000 ml (pH 8,0)
- 7. Dreimaliges Waschen mit Kochsalzlösung.
- 8. Hinzufügen von 200 ul Substrat (30 mg p-Nitrophenylphosphat Na&sub2;- Salz x 5 H&sub2;O in 50 ml Puffer).
- Diethanolamin 48 ml
- MgCl&sub2; x 6 H&sub2;O 24.5 mg
- Hinzufügen von Wasser auf 500 ml (pH 9,8)
- 9. Stop-Reaktion mit 50 ul 3N NaOH.
- 10. Messen bei 405 nm.
Claims (13)
1. Lipohaptene der allgemeinen Formel I
(X)m-R-Y-(S)n-P (I)
wobei
- R ein Kohlenwasserstoff-Grundgerüst mit 2 bis 30
Kohlenstoffatomen ist,
- X eine Kohlenwasserstoff-Gruppe mit 6 bis 30
Kohlenstoffatomen ist, welche mit R über eine Verbindungsgruppe, die
ein oder mehrere Heteroatome enthält, verbunden ist,
- m eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist,
- P ein Polypeptid oder ein Polysaccharidrest mit 2 bis 100
Aniinosäure- oder Glykosyl-Einheiten ist,
- Y eine funktionelle Gruppe ist, die befähigt ist, an eine
freie Amino-Gruppe des Polypeptids P oder eine Carboxyl-,
Halbacetal- oder Hydroxyl-Gruppe des Polysaccharids P zu
binden,
- S eine difunktionelle Spacer-Gruppe ist, wobei deren
funktionelle Gruppen fähig sind, sich mit der funktionellen
Gruppe Y auf der einen Seite und einer freien Amino-,
Carboxyl- oder Hydroxyl-Gruppe des Polypeptides oder
Polysaccharids P auf der anderen Seite zu verbinden, und
- n 0 oder 1 ist.
2. Lipohaptene nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R eine
Alkyl-Gruppe mit 3 bis 18 Kohlenstoffatomen ist.
3. Lipohaptene nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß
X eine Alkyl- oder Alkenyl-Gruppe mit 16 bis 18 Kohlenstoffatomen
ist, welche über eine Ester- oder Ether-Gruppe an R gebunden ist.
4. Lipohaptene nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß m 1, 2 oder 3, vorzugsweise 2, ist.
5. Lipohaptene nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß, wenn m
2 oder 3, vorzugsweise 2, ist, die Substituenten X dieselben sind und
isan benachbarten Kohlenstoffatomen lokalisiert sind.
6. Lipohaptene nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß P ein Peptidrest mit 5 bis 20
Aminosäure-Einheiten ist.
7. Lipohaptene nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß Y eine
Carboxyl- oder modifizierte Carboxyl-Gruppe ist.
8. Verfahren zum Nachweis von Antikörpern in einer biologischen
Flüssigkeit, wie einem Serum oder Spinalfiüssigkeit, umfassend
(a) Beschichten eines Substrats mit einem Lipohapten der
Formel I, wie es in einem der Ansprüche 1 bis 7 definiert ist,
mit einem Antigen P-Kognat für diese Antikörper,
(b) Hinzufugen von zu diagnostizierender Körperflüssigkeit eines
Patienten und
(c) Nachweisen des gebildeten immunologischen Konjugats.
9. Verfahren zum Nachweis von Antigenen in einer biologischen
Flüssigkeit, wie einem Serum oder Spinalflüssigkeit, umfassend
(a) Beschichten eines Substrats mit einem Lipohapten der
Formel I, wie es in einem der Ansprüche 1 bis 7 definiert ist,
mit einem Antikörper P-Kognat für diese Antigene,
(b) Hinzufügen von zu diagnostizierender Körperflüssigkeit eines
Patienten und
(c) Nachweisen des gebildeten immunologischen Konjugats.
10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß der
Nachweis durch Reaktion dieses immunologischen Konjugats mit
einem markierten Reagens, ausgewählt aus
Anti-Mensch-Immunglobulin-Antikörpern und bakteriellem A-Protein, und Nachweisen des
zwischen dem Konjugat und dem Reagens gebildeten Komplexes
durchgeführt wird.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch
gekennzeichnet, daß es unter Standardbedingungen des RIA oder ELISA
ausgeführt wird.
12. Kit für die Detektion von Antikörpern in einer biologischen
Flüssigkeit, umfassend
- ein Lipohapten, wie es in einem der Ansprüche 1 bis 7
definiert ist, und
- Mittel zum Nachweis eines gebildeten immunologischen
Konjugats.
13. Kit nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel zum
Nachweis des immunologischen Konjugats ein Reagens, ausgewählt
aus Anti-Mensch-Immunglobulin-Antikörpern und Protein A, und
Mittel zum Nachweis des mit diesem Reagens gebildeten
immunologischen Komplexes umfassen.
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