DE3853792T2 - Amin-Derivate von Anthracyclin-Antibiotika. - Google Patents

Amin-Derivate von Anthracyclin-Antibiotika.

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Description

    1. ANWENDUNGSBREREICH DIESER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft neuartige Aminabkömmlinge von Anthracyclin-Antibiotika. Genauer betrachtet umfaßt diese Erfindung aminhaltige Abkömmlinge von Anthracyclin-Antibiotika mit antineoplastischer Aktivität, die an einen Antikörper oder an ein Antikörperfragment über eine reaktive Amingruppe des Anthracyclinabkömmlings kovalent gekoppelt werden können. Es werden Verfahren der Herstellung neuartiger Abkömmlinge von Anthracyclin-Antibiotika und Antikörper-Konjugaten sowie Verfahren der Nutzung der Antikörper- Konjugate beschrieben.
    • 2. HINTERGRUND
  • Anthracyclin-Antibiotika, insbesondere Daunorubicin und Doxorubicin besitzen einen enormen therapeutischen Wirkungsgrad gegen akute Leukämien und eine Vielzahl von Neoplasmen einschließlich einer Reihe von festen Tumoren. Wie bei den meisten antineoplastischen chemotherapeutischen Mitteln zeigen die Anthracyclin-Antibiotika eine Reihe von toxischen Erscheinungen wie Knochenmarkdepression, Mundhöhlenentzündung (Stomatitis), Glatzenbildung (Alopecia), Magen-Darm-Störungen und manchmal dermatologische Erscheinungen. Außerdem ist Kardiotoxizität eine einzige schädigende Eigenschaft von Anthracyclin-Antibiotika. Zwei Formen von Kardiotoxizität sind bisher beobachtet worden: (1) eine akute Form, gekennzeichnet durch anormale EKG-Änderungen einschließlich ST-T-Änderungen und Rhythmusstörungen; und (2) eine chronische, mit kumulierender Dosis zusammenhängende Toxizität, gekennzeichnet durch Blutandrang erzeugende Herzinsuffizienz, die nicht auf Digitalis anspricht. Mit einem Wort, Herzinsuffizienz zeigt sich in Herzjagen (Tachykardie), Rhythmusstörungen, Atemnot (Dyspnea), niedrigem Blutdruck (Hypotension) und Blutdrang erzeugender Herzinsuffizienz, die nicht auf Digitalis anspricht. Die kumulative, dosis-einschränkende Kardiotoxizität ist ein Haupthindernis für die therapeutische Nutzung von Anthracyclin-Antibiotika.
  • Es gibt somit einen seit langem empfundenen Bedarf an Analogen und/oder Abkömmlingen von Anthracyclin-Antibiotika, die therapeutische Wirksamkeit gegenüber Neoplasmen behalten aber geringere oder eliminierte Kardiotoxizität aufweisen. Für eine allgemeine Übersicht über Abkömmlinge von Anthracyclin-Antibiotika, die mit Blick auf eine Verringerung der Kardiotoxizität entwickelt worden sind, siehe Weiss u.a., 1986, Cancer Chemother. Phramacol 18: 185-197 und darin zitierte Referenzunterlagen.
  • In einem Versuch, Anthracyclin-Antibiotika herzustellen, die als Vorarzneimittel ("prodrugs") dienen sollen, welche selektive Substrate für das Enzym Plasmin sein würden, das oft in erhöhten Mengen an Festtumororten festgestellt werden, stellten Chakravarty u.a. (1983, J. Med. Chem. 26: 638-644) 3'-Peptidyl-Abkömmlinge von Doxorubicin synthetisch her. 3'-(D-Val-L-Leu-L-Lys)-Doxorubicin beispielsweise wurde gewonnen durch Verwendung eines gemischten Anhydrids des geschützten FMOC-Peptids in Isobutyl-chlorformat mit anschließender Entfernung der FMOC-Gruppe mit Hilfe von wasserfreiem Ammoniak.
  • Andere Forscher haben C-13-bis-hydrazon-Abkömmlinge von Anthracyclin-Antibiotika hergestellt. So werden z.B. in dem US-Patent Nr. 4.112.217, erteilt an Henry u.a., C-13-bis-hydrazon-Abkömmlinge von Doxorubicin und Daunorubicin beschrieben, gebildet durch Herbeiführen der Reaktion zwischen einer im molaren Überschuß vorliegenden Menge von entweder Doxorubicin oder Daunorubicin und einem Säurehydrazid. Erst vor kurzem haben Brownler u.a. (1986, J. Chem. Soc. Chem. Comm. 1986: 659-661) die Synthese eines Monohydrazon-Addukts von Daunorubicin mit einem freien Hydrazidbestandtell beschrieben, gebildet durch Herbeiführen der Reaktion zwischen Daunorubicin-Hydrochlorid und einem Dihydrazid mit der nachgenannten Formel:
    • 2.1 KONJUGATE VON ANTHRACYCLIN-ANTIBIOTIKA
  • Alternativ wurden in Versuchen zur Reduzierung der Kardiotoxizität Anthracyclin-Antibiotika wie z.B. Daunorubicin oder Doxorubicin kovalent an Antikörper, Fab-Dimere oder Lektine gekoppelt durch nicht-ortsspezifische oder zufallsbedingte Verknüpfungsverfahren wie z.B. Glutaraldehyd-, Carbodiimid- und Periodat-Oxidation des Arzneimittels (siehe Monsigny u.a., 1980, FEBS Lett. 119: 181-186 und darin zitierte Referenzunterlagen).
  • Hurwitz u.a. (1980, J. Appl. Biochem. 2: 25-35) beschreiben Antikörper-Daunorubicin-Konjugate, hergestellt in einem zweistufigen Verfahren. Zunächst wurden Kohlenwasserstoffbestandteile der Fc- Region von Ziegenserum-Immunglobulin mit Hilfe von Periodsäure oxidiert und wurden die resultierenden Aldehydgruppen zur Reaktion mit Polyglutamylhydrazid gebracht, um wasserlösliche Antikörper-Polyglutamylhydrazid-Makromoleküle zu bilden. In einigen Fällen wurden die Makromoleküle mittels Natriumzyanoborhydrid reduziert, um Hydrazonbindungen in stabile Hydrazidgruppen umzuwandeln. Sodann wurden die Antikörper-Polyglutamylhydrazid-Makromoleküle mit Daunorubicin zur Reaktion gebracht, um Antikörper-Daunorubicin- Konjugate zu bilden. In vollkommenem Gegensatz zu den Antikörper- Anthracyclin-Konjugaten der vorliegenden Erfindung, die durch Wasserlöslichkeit gekennzeichnet sind und sich somit zur In-vivo- Verabreichung eignen und vorteilhaft einsetzen lassen, wurden die Konjugate von Hurwitz u.a. unlöslich und waren völlig ungeeignet für eine In-vivo-Verabreichung.
  • Scourides u.a., 1984, J. Chromatog. 228: 27, und Brownlee u.a., 1986, J. Chem. Soc. Comm. 659 beschreiben Derivate mit einem an die C13-keto-Position von Daunorubicin gekoppelten hydrazidhaltigen Bestandteil. In dem US-Patent Nr. 3.957.755 werden Derivate beschrieben, in denen eine hydrazidähnliche Funktion an der C13-Keto-Position von Daunorubicin gekoppelt ist. Die belgische Patentanmeldung Nr. 869 485 enthüllt einen N-Leucyl-doxorubicin-Abkömmling.
    • 3. ZUSAMMENFASSUNG
  • Diese Erfindung umfaßt neuartige antineoplastische aminhaltige Abkömmlinge von Anthracyclin-Antibiotika wie z.B. Abkömmlinge von Daunorubicin, Doxorubicin, Epirubicin, Esorubicin, Idarubicin, Carminocyin, 4-Demethoxy-4'-O-methyldoxorubicin, 4'-O-Tetrahydropyranyl-doxorubicin, 3'-Deamino-3'(3"-zyano-4"-morpholinyl) doxorubicin, usw., in denen der Aminbestandteil ein reaktives Amin enthält, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Hydrazin, Hydrazid, Phenylhydrazin, Phenylhydrazid, Alkoxyamin, Phenoxyamin, Semicarbazid und Thiosemicarbazid, gekoppelt entweder
  • (a) an der 3'-Position des Anthracyclin-Antibiotikums über eine Verknüpfungsgruooe, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Aminosäure, einem Peptid, einer organischen Säure mit der Formel -CO(CH&sub2;)nCO- mit n=2 oder 3 und einem organischen Bestandteil mit der Formel
  • -Z-CONH-X, worin Z für
  • -OCH&sub2;-, -NH-CH&sub2;, -NHCOCH&sub2;CH&sub2;CH(NH&sub2;)- oder -NHCOCH(NH&sub2;)CH&sub2;CH&sub2;- steht und X für eine Aminosäure oder ein Peptid steht, oder
  • (b) an der 14. Position des Anthracyclin-Antibiotikums über einen Thioester oder einer tertiäre Amin-Verbindung.
  • Die Derivate sind besonders nützlich für die Herstellung von wasserlöslichen therapeutischen Antikörper-Konjugaten zur Behandlung von zellulären Störungen.
  • Die therapeutischen aminhaltigen Anthracyclin-Antibiotika- Abkömmlinge werden kovalent mit einem Antikörper oder Antikörperfragment verknüpft. Die kovalente Verknüpfung wird so bewerkstelligt, daß das resultierende Antikörper-Konjugat sowohl die Fähigkeit, Antigene zu binden, als auch die Fähigkeit, therapeutische Wirksamkeit bei In-vivo-Verabreichung zu zeigen, besitzt. Die kovalente Verknüpfung wird insbesondere realisiert durch Knüpfen einer kovalenten Bindung zwischen einem oxidierten Kohlenhydratbestandteil eines Antikörpers oder Antikörperfragments und einem reaktiven Amin in einem Derivat eines Anthracyclin-Antibiotikums, in dem das Amin ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Hydrazin, Hydrazid, Phenylhydrazin, Phenylhydrazid, Alkoxyamin, Phenoxyamin, Semicarbazid und Thiosemicarbazid. D.h. die Antikörper-Anthracyclin-Konjugate beinhalten einen über eine kovalente Bindung an einen oxidierten Kohlenhydratbestandteil eines Antikörpers oder Antikörperfragments gekoppelten aminhaltigen Anthracyclin-Antibiotika-Abkömmling und sind gekennzeichnet durch (1) Wasserlöslichkeit, so daß sich das Konjugat zur In- vivo-Verabreichung eignet; und (2) im wesentlichen dieselbe Immunspezifität wie der unkonjugierte Antikörper oder das unkonjugierte Antikörperfragment und wobei die kovalente Bindung ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Hydrazon, Phenylhydrazon, Acylhydrazon, Oxim, Semicarbazon, Thiosemicarbazon und Abkömmlingen derselben.
  • Ein die nachgenannten Schritte umfassendes Verfahren zur Darstellung von ortsselektiven therapeutischen Antikörper-Konjugaten:
  • (a) Herbeiführen einer Reaktion zwischen einem Antikörper oder Antikörperfragment und einem Oxidationsmittel zwecks Bildung einer Aldehygruppe in dem Kohlenhydratbestandteil des Antikörpers oder Antikörperfragments;
  • und
  • (b) Herbeiführen einer Reaktion zwischen der Aldehydgruppe des oxidierten Kohlenhydrats des Antikörpers oder Antikörperfragments und einer reaktiven Amingruppe eines aminhaltigen Anthracyclin-Antibiotikums, wobei das reaktive Amin ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Hydrazin, Hydrazid, Phenylhydrazin, Phenylhydrazid, Alkoxyamin, Phenoxyamin, Semicarbazid und Thiosemicarbazid zwecks Bildung eines Konjugats, das gekennzeichnet ist durch: (1) Wasserlöslichkeit, so daß sich das Konjugat zur In-vivo-Verabreichung eignet; und (2) im wesentlichen dieselbe Immunspezifität wie der unkonjugierte Antikörper oder das unkonjugierte Antikörperfragment.
  • Ein Verfahren zur Darstellung von ortsselektiven therapeutischen Antikörper-Konjugaten, umfassend: Herbeiführen einer Reaktion zwischen einer Aldehydgruppe eines oxidierten Kohlenhydrats eines Antikörpers oder Antikörperfragments und einer reaktiven Amingruppe eines aminhaltigen Anthracyclin-Antibiotikums, wobei das reaktive Amin ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Hydrazin, Hydrazid, Phenylhydrazin, Phenylhydrazid, Alkoxyamin, Phenoxyamin, Semicarbazid und Thiosemicarbazid zwecks Bildung eines Konjugats, das gekennzeichnet ist durch: (1) Wasserlöslichkeit, so daß sich das Konjugat zur In-vivo-Verabreichung eignet; und (2) im wesentlichen dieselbe Immunspezifität wie der unkonjugierte Antikörper oder das unkonjugierte Antikörperfragment.
  • Die wasserlöslichen Antikörper-Konjugate eignen sich besonders zur In-vivo-Therapie von zellulären Störungen durch Lieferung eines Anthracyclin-Antibiotikums an einen gewünschten Zielort. Ein Verfahren zur Behandlung von Zellstörungen umfaßt die Verabreichung - an einen Menschen oder ein Tier - einer therapeutisch wirksamen Menge eines wasserlöslichen Anthracyclin-Antibiotika-Konjugats, wobei das Konjugat Immunspezifität bezüglich einer Antigendeterminanten eines mit einer Zellstörungen verbundenen Zielorts besitzt und im wesentlichen keine Immunspezifität besitzt für Nicht-Zielorte und wobei die Antigendeterminante in Nicht-Zielorten nicht in bedeutenden Mengen festzustellen ist. Zielorte sind u.a. Zellen, Gewebe, Organe oder alle anderen Orte in vivo, die mit Zellstörungen in Verbindung stehen, die für eine Behandlung mit einem Anthracyclin-Antibiotikum oder einem Abkömmling desselben empfänglich sind. Zu den behandelbaren Zellstörungen zählen u.a.: akute Lymphozytenleukämie, akute Granulozytenleukämle, akute monolymphoblastische Leukämie, bösartige Lymphome wie u.a. Nicht-Hodgkinsche Lymphome, Karzinome wie u.a. Brustkrebs, kleinzelliges Bronchialkarzinom, Blasenkrebs, Bronchuskarzinom, metastatisches Schilddrüsenkarzinom und Karzinome am Endometrium, Hodenkrebs, Prostatakrebs, Zervixkarzinom, Karzinome am Kopf und am Hals; Sarkome wie u.a. Knochensarkom, Ewing- Sarkom und Weichgewebesarkome, metastatisches Brustdrüsenkarzinom und Plasmazellenmyelom.
    • 4. KURZBESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
  • Die vorliegende Erfindung wird verständlicher unter Hinzuziehung der nachfolgenden ausführlichen Beschreibung der Erfindung, der Beispiele für spezifische Verkörperungen derselben und der beigefügten Abbildungen, die folgendes zeigen:
  • Die ABBILDUNG 1 (A-F) zeigt in graphischer Form die therapeutische Wirksamkeit eines ortsselektiven adriamycin-adipin-(ADR-ADH)- dihydrazid-tumorspezifischen Antikörper-Konjugats gegen ein humanes Adenokarzinom-Xenotransplantat. (A) nur tumorspezifischer Antikörper; (B) nur nichtspezifischer oder bedeutungsloser Antikörper; (C) tumorspezifisches ADR-ADH-Antikörper-Konjugat; (D) nichtspezifisches ADR-ADH-Antikörper-Konjugat; (E) nur ADR-ADH; und (F) ein Gemisch aus tumorspezifischem Antikörper und ADR. Zu Vergleichszwecken mit angeführt (A-F) ist das Tumorwachstum in unbehandelten Kontrolltieren und in mit ADR mit ca. maximal zulässiger Dosis behandelten Tieren.
  • Die ABBILDUNG 2 (A-H) veranschaulicht graphisch die therapeutische Wirksamkeit eines ortsselektiven ADR-ADH-tumorspezifischen Antikörper-Konjugats und eines ortsselektiven adriamycin-(glutamyl- gamma-hydrazid)(ADR-E-gamma-Hy)tumorspezifischen Antikörper- Konjugats gegen das humane Adenokarzinom-Xenotransplantat. (A) Nur tumorspezifischer Antikörper; (B) nur ADR, niedrige Dosis; (C) Gemisch aus tumorspezifischem Antikörper und ADR (niedrige Dosis); (E) tumorspezifisches ADR-ADH-Antikörper-Konjugat; (F) tumorspezifisches ADR- E-Hy-Antikörper-Konjugat; (G) nichtspezifisches ADR-ADH-Antikörper- Konjugat; und (H) nichtspezifisches ADR-E-Hy-Antikörperkonjugat. Zu Vergleichszwecken mit angeführt (A-H) ist das Tumorwachstum in unbehandelten Kontrolltieren und in mit ADR in ca. maximal zulässiger Dosis (mtd) behandelten Tieren.
  • Die ABBILDUNG 3 (A-B) ist eine graphische Darstellung der therapeutischen Wirksamkeit von ortsselektivem ADR-ADH-tumorspezifischem Antikörper-Konjugat gegen ein Lymphom-Xenotransplantat. (A) Tumorspezifisches ADR-ADH-Antikörper-Konjugat; nichtspezifisches ADR-ADH-Antikörper-Konjugat; keine Behandlung; (B) nur tumorspezifischer Antikörper; nur ADR-ADH; und ein Gemisch aus tumorspezifischem Antikörper und ADR.
  • Die ABBILDUNG 4 zeigt in graphischer Form die Bioverteilung von [³H]-Me&sub2;ADR-ADH-tumorspezifischem Antikörper-Konjugat gegen das humane Adenokarzinom-Xenotransplantat im Blut, in den Lungen, der Milz, der Leber, der rechten und linken Niere, im Muskel und in Tumoren von vier Gruppen von Mäusen. Die Gruppen 1 ( ) und 2 ( ) wurden mit humanen Adenokarzinom-Xenotransplantaten in vivo behandelt, wohingegen die Gruppen 3 und 4 keine Behandlung erfuhren. Die Gruppen 1 ( ) und 3 ( ) wurden mit [³H]-Me&sub2;ADR-ADH- tumorspezifischem Antikörper-Konjugat behandelt. Die Gruppen 2 ( ) und 4 ( ) wurden nur mit [³H]-Me&sub2;ADR-ADH behandelt.
    • 5. DEFINITIONEN
  • In dieser Unterlage bedeutet der Begriff "Anthracyclin-Antibiotikum" jedes antineoplastische Mittel mit einer tetrazymischen chinoiden Ringstruktur einschließlich u.a. solcher Mittel, in denen die Ringstruktur über eine Glycosid-Verbindung an einen Zucker wie z.B. Daunosamin und Abkömmlinge desselben gekoppelt ist. Somit umfaßt der Begriff "Anthracyclin-Antibiotika" Daunorubicin, Doxorubicin, Epirubicin, Esorubicin, Idarubicin, Caiminomycin, 4-Demethoxy-4'-O- methyl-doxorubicin, 4'-O-Tetrahydropyranyl-doxorubicin, 3'-Deamino- 3'-(3"-zyano-4"-morpholinyl)doxorubicin, Aclacinomycin und alle antineoplastischen Analoge derselben.
  • Der Begriff "Aminabkömmlinge eines Anthracyclin-Antibiotikums" umfaßt jedes antineoplastische Anthracyclin-Antibiotikum, das ein reaktives Amin enthält bzw. das geändert wird, um ein solches zu enthalten.
  • Der Begriff "reaktives Amin" bedeutet die stickstoffhaltige funktionale Gruppe, die sich kovalent über ein Stickstoffatom an eine funktionale Aldehydgruppe durch eine einfache chemische Kondensationsreaktion koppeln oder binden läßt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Hydrazin, Hydrazid, Phenylhydrazin, Phenylhydrazid, Alkoxyamin, Phenoxyamin, Semicarbazid und Thiosemicarbazid.
    • 6. AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DIESER ERFINDUNG
  • Diese Erfindung betrifft antineoplastische Abkömmlinge von Anthracyclin-Antibiotika mit einem reaktiven Amin, das ortsselektiv kovalent an einen oxidierten Kohlenhydratbestandteil eines Antikörpers oder Antikörperfragments gekoppelt werden kann, um wasserlösliche therapeutische Antikörper-Konjugate zu bilden.
  • In einer Verkörperung dieser Erfindung wird eine reaktive Amingruppe über einen Kopplungsbestandteil bestehend aus einer Aminosäure, einem Peptid einem organischen Säurebestandteil mit der Formel -CO(CH&sub2;)nCO- mit n = 2-3 und einem organischen Bestandteil mit der Formel -Z-CONH-X, worin Z für
  • -OCH&sub2;-
  • -NH-CH&sub2;-
  • -NHCOCH&sub2;CH&sub2;CH(NH&sub2;)-
  • oder -NHCOCH(NH&sub2;)CH&sub2;CH&sub2;-
  • steht und X für eine Aminosäure oder ein Peptid steht, an die 3'-Aminogruppe des Zuckerbestandteils von Daunorubicin, Doxorubicin, Idarubicin, Epirubicin, Esorubicin, Carminomycin, 4-Demethoxy-4'-O- methyl-doxorubicin, 4'-O-Tetrahydropyranyl-doxorubicin oder 3'- Deamino-3'-(3"-zyano-4"-morpholinyl)doxorubicin gekoppelt.
  • In einer anderen Verkörperung wird die reaktive Amingruppe entweder über eine Thioether- oder einer tertiäre Amin-Verbindung an die C-14-Methylengruppe von Daunorubicin, Idarubicin oder Carminomycin und andere antineoplastische Anthracyclin-Antibiotika-Analoge mit einer geeigneten Methylengruppe gekoppelt.
    • 6.1 AMINABKÖMMLINGE
  • Zu den nach dieser Erfindung geeigneten Aminabkömmlingen von Anthracyclin-Antibiotika zählen u.a. Abkömmlinge von natürlich vorkommenden sowie synthetischen antineoplastischen Anthracyclin- Antibiotika, die entweder eine reaktive Amingruppe enthalten oder die geändert werden, um eine solche zu enthalten. Die Tabelle I zeigt eine nicht vollständige Auflistung von Beispielen antineoplastischer Anthracyclin-Antibiotika. TABELLE I ANTHRACYCLIN-ANTIBIOTIKA Daunorubicin (DNR) Doxorubicin (Adriamycin, ADR) Epirubicin Esorubicin Idarubicin Carminomycin 4-Demethoxy-4'-O-methyl-doxorubicin 4'-O-Tetrahydropyranyl-doxorubicin 3'-Deamino-3'-(3"-zyano-4"-morpholinyl)doxorubicin
  • D.h., zu den nach dieser Erfindung nützlichen Aminabkömmlingen von Anthracyclin-Antibiotika zählen u.a.:
  • Glutamyl-(gamma-hydrazid)-alpha-adriamycin (ADR-E-gamma-Hy); Glutamyl-(alpha-hydrazid)-gamma-adriamycin; Hydrazid-succinyladriamycin; Uydrazinacetyl-adriamycin; Aminoxyacetyl-adriamycin; Hydrazinbenzoyl-adriamycin; Hydrazinacetyl-tyrosinyl-alanyl-alanyl- alanyl-adriamycin; Adriamycin-adipin-dihydrazid (ADR-ADH); Dimethyladriamycin-adipin-dihydrazid; Idarubicin-adipin-dihydrazid; Adriamycin-pentaglutamylhydrazid; Daunorubicin-adipin-dihydrazid; Daunorubicin-14-S-(3-propionyl-hydrazid); Daunorubicin-14-N-methyl- (acetyl-hydrazid); usw..
  • Acylabkömmlinge von Anthracyclin-Antibiotika, die sich unter Anwendung von Muster 1a (unten) weiter ableiten lassen, um nach dieser Erfindung nützliche Abkömmlinge von Anthracyclin-Antibiotika, die ein reaktives Amin enthalten, hervorzubringen, sind u.a.: Glycyl- adriamycin; Alanyl-adriamycin; D-Alanyl-adriamycin; Isoleucinyl- adriamycin; Valyl-adriamycin; Tyrosinyl-adriamycin; Arginyl-adriamycin; Alanyl-alanyl-adriamycin; Alanyl-alanyl-alanyl-adriamycin; D- alanyl-alanyl-alanyl-adriamycin; Tyrosinyl-glycyl-glycyl-adriamycin; Tyrosinyl-glycyl-glycyl-arginyl-adriamycin; Tyrosinyl-alanyl-alanyl- alanyl-adriamycin; Tyrosinyl-valyl-leucyl-lysyl-adriamycin; Valyl-leucyl- lysyl-alanyl-adriamycin; Valyl-leucyl-lysyl-valyl-adriamycin; usw. Diese Acylabkömmlinge eignen sich ebenso für Forschungszwecke.
    • 6.2 AMINABKÖMMLINMGE VON ANTHRACYCLIN-ANTIBIOTIKA -SYNTHESEVERFAHREN-
  • Die nach dieser Erfindung nützlichen Aminabkömmlinge von Anthracyclin-Antibiotika lassen sich unter Anwendung einer Vielzahl von Verfahren synthetisch herstellen.
  • Einem Verfahren zufolge werden Acylabkömmlinge von ein reaktives Amin enthaltenden Anthracyclin-Antibiotika gemäß dem unten gezeigten Reaktionsmuster (Muster 1) synthetisiert, worin R für einen von N-Hydroxybernsteinsäureimid oder N-Hydroxybenzotriazol abgeleiteten aktiven Esterbestandteil, für ein von Isobutylchlorformat abgeleitetes gemischtes Carbon-carboxyl-anhydrid oder ein Chloratom steht. Aus praktischen Gründen ist Muster 1 am Beispiel des Anthracyclin- Antibiotikums Adriamycin (ADR) dargestellt. Das Verfahren jedoch beschränkt sich nicht auf diese Verbindung, sondern läßt sich vielmehr zur Herstellung von Acylabkömmlingen eines jeden Anthracyclin- Antibiotikums mit einer primären oder sekundären Aminogruppe an dem Zuckerbestandteil anwenden, Daunorubicin (DNR), Idarubicin, Epirubicin, Esorubicin, Carminomycin. 4-Demethoxy-4'-O-methyldoxorubicin, 4'-O-Tetrahydropyranyl-doxorubicin, usw. sowie ADR eingeschlossen, das ein Amin an der 3'-Position an dem Daunosamin- Zuckerbestandteil aufweist. MUSTER 1
  • (Für eine experimentelle Demonstration der Synthese von Anthracyclin-Abkömmlingen unter Anwendung dieses Verfahrens, siehe Abschnitte 7.1.17, 7.1.18, 7.1.20, 7.1.21, 7.1.22 und 7.1.23, unten).
  • Alternativ werden ein reaktives Amin enthaltende Acylabkömmlinge von Anthracyclin-Antibiotika nach dem im folgenden gezeigten Muster (Muster 1a) synthetisch hergestellt durch (1) Herbeiführen einer Reaktion zwischen einem Anthracyclin-Antibiotikum mit einer primären oder sekundären Amingruppe an dem Zuckerbestandteil und einem aktiven Ester, gemischten Anhydrid oder aktiven Chloratom einer fluorenylmethyloxycarbonyl-(FMOC-)geschützten Aminosäure oder eines fluorenylmethyloxycarbonyl-(FMOC-)geschützten Peptids (im folgenden allgemein bezeichnet als "FMOC-NH-Peptid-CO-R'", worin R' für einen von N-Hydroxybernsteinsäureimid abgeleiteten aktiven Esterbestandteil, ein von Isobutylchlorformat abgeleitetes gemischtes Carboncarboxyl-anhydrid oder ein Chloratom steht; und (2) Entfernen der FMOC-Schutzgruppe, um einen Acyl-anthracyclin-Antibiotika- Abkömmling herzustellen. (Für eine experimentelle Demonstration von nach diesem Verfahren synthetisch hergestellten 3'-Amidyl- oder 3'- Peptidyl-anthracyclin-Abkömmlingen, siehe Abschnitte 7.1.1 bis 7.1.16, unten).
  • Sodann wird der Amidyl- oder Peptidylabkömmling mit einem FMOC-NH-G-COR-Bestandteil wie oben definiert zur Reaktion gebracht, um einen ein reaktives Amin enthaltenden FMOC-Acyl-anthracyclin- Antibiotika-Abkömmling hervorzubringen. Die FMOC-Schutzgruppe wird unter absolut wasserfreien, basischen Bedingungen entfernt, um einen Acyl-anthracyclin-Antibiotika-Abkömmling hervorzubringen.
  • Aus praktischen Gründen wird die FMOC-Schutzgruppe in Muster 1 und Muster 1a mittels Diethylamin (Et&sub2;NH) unter wasserfreien Bedingungen in Dimethylformamid entfernt. Andere Hilfsmittel wie Dialkylamin, Piperidin, Morpholin oder Ammoniak können ebenso in Muster 1 und Muster 1a eingesetzt werden.
  • Das Muster 1a wird am Beispiel von ADR gezeigt, jedoch läßt es sich anwenden zur Herstellung von Acylabkömmlingen von jedem eine Amingruppe an dem Zuckerbestandteil aufweisenden Anthracyclin- Antibiotikum einschließlich ADR, DNR, Idarubicin, Epirubicin, Esorubicin, Carminomycin, 4-Demethoxy-4'-O-methyl-doxorubicin, 4'-O- Tetrahydropyranyl-doxorubicin, usw.. MUSTER 1a
  • Gemäß einem anderen Verfahren werden Acylabkömmlinge von Anthracyclin-Antibiotika, die ein reaktives Amin enthalten, nach dem unten gezeigten Reaktionsmuster (Muster 2) synthetisch hergestellt. In Muster 2 wird ADR nur zu Illustrationszwecken verwendet. Muster 2 zufolge handelt es sich bei den hergestellten aminhaltigen Derivaten um -hydrazid-succinyl- bzw. -hydrazid-glutar-anthracyclin-Abkömmlinge, wenn n gleich 2 oder 3 ist. MUSTER 2 triethylamine n=2,3 1. N-methylmorphine 2. Isobutylchloroformate
  • (Für eine experimentelle Demonstration eines nach diesem Verfahren hergestellten Anthracyclin-Antibiotika-Abkömmlings, siehe Abschnitt 7.1.19, unten).
  • Nach einem noch anderen Verfahren wird ein ein reaktives Amin enthaltendes Derivat eines Anthracyclin-Antibiotikums synthetisch hergestellt durch Bilden einer C-14-Methylen-thioether- oder einer tertiären C-14-Amin-Bindung gemäß einem der in den Mustern 4, 4a und 5 gezeigten Reaktionsmuster. MUSTER 4
  • (Für eine experimentelle Demonstration eines nach diesem Verfahren hergestellten Anthracyclin-Antibiotika-Abkömmlings, siehe Abschnitt 7.3, unten).
  • Wie in Muster 4 angegeben, werden bei Anwendung dieses Verfahrens sowohl das gewünschte S-Alkylierungsprodukt das ein reaktives Amin aufweist, als auch das N-Alkylierungsprodukt das nicht über ein reaktives Amin verfügt, gebildet. Das Gemisch der entstandenen Produkte stellt nicht wirklich ein Problem dar, da nur das S-Alkylierungsprodukt mi einem Aldehydbestandteil eines oxidierten Kohlenhydratbestandteils eines Antikkörpers oder Antikörperfragments reagieren wird, um ein Anthrayclin-Antibiotika-Antikörper-Konjugat entsprechend dieser Erfindung hervorzubringen. MUSTER 4a
  • Um die Bildung eines N-Alkylierungsprodukts zu vermeiden, wird ein C-14-Thioetherabkömmling eines Anthracyclin-Antibiotikums hergestellt, wie in obigem Muster 4a gezeigt. Als Beispiel wird anhand des in Muster 4a gezeigten Verfahrens DNR-14-S-Propionyl-hydrazid hergestellt, indem 14-Brom-DNR mit einem N-FMOC-3-Mercapto-propionyl- hydrazid zur Reaktion gebracht wird und anschließend der FMOC- Schutzbestandteil unter wasserfreien, basischen Bedingungen entfernt wird.
  • Wie in Muster 5 dargestellt, kann ein tertiärer C-14-Aminbestandteil mit 14-Brom-DNR zur Reaktion gebracht werden, um ein aminhaltiges Derivat zu bilden, das gemäß dieser Erfindung für die Herstellung eines therapeutischen Antikörper-Konjugats brauchbar ist. MUSTER 5 6.3 VERFAHREN FÜR DIE HERSTELLUNG VON ANTIKÖRPER-KONJUGATEN
  • Da Antikörper Glycoproteine sind, können Verbindungen an den kovalent an das Peptid-Gerüst des Moleküls gekoppelten Kohlenhydratbestandteil gebunden werden. Einige der Kohlenhydratbestandteile befinden sich in der Fc-Region des Immunglobulins und sind erforderlich, damit eine Anknüpfung von Komponenten des Komplementsystems erfolgen kann. Der Kohlenhydratbestandteil der Fc-Region eines Immunglobulins läßt sich in dem hier beschriebenen Muster verwenden. Wahlweise können die Fab- oder Fab'-Fragmente eines beliebigen Immunglobulins, das Kohlenhydratbestandteile enthält, in dem hier beschriebenen Reaktionsmuster verwendet werden. Ein Beispiel für solch ein Immunglobuiln ist das humane IgM, dessen Sequenz von Putnam u.a. (1973, Science 182: 287) analysiert worden ist.
  • Wie im folgenden im einzelnen erläutert, können die Kohlenhydrat-Seitenketten von Antikörpern oder Antikörperfragmenten selektiv oxidiert werden, um Aldehyde zu erzeugen. Das resultierende Aldehyd kann sodann mit einer Amingruppe (z.B. Ammoniakabkömmlingen wie z.B. Alkoxyamin, Hydrazin, Hydrazid, Phenylhydrazin, Phenylhydrazid Semicarbazid oder Thiosemicarbazid) zur Reaktion gebracht werden, um ein Oxim, Hydrazon, Phenylhydrazon, Semicarbazon oder Thiosemicarbazon zu bilden.
  • Wahlweise kann der Kohlenhydratbestandteil des Antikörpers durch enzymatische Techniken so geändert werden, daß eine Ankopplung an oder Reaktion mit Amingruppen ermöglicht wird. Beispielsweise können Neuraminidase plus Galactose eingesetzt werden, um einen Aldehydbestandteil zu bilden.
    • 6.3. 1 CHEMISCHE OXIDATIONSVERFAHREN
  • Eine Oxidation des Kohlenhydratteils oder Bestandteils von Antikörpermolekülen führt zur Bildung von Aldehydgruppen. Eine Vielzahl von Oxidationsmitteln kann eingesetzt werden, so z.B. Periodsäure, Paraperiodsäure. Natriummetaperiodat und Kaliummetaperiodat. Von diesen werden Oxosäure und Salze derselben bevorzugt, da sekundäre oder unerwünschte Nebenreaktionen weniger häufig auftreten. Für eine allgemeine Erörterung, siehe Jackson, 1944, in: Organic Reactions 2, S. 341; Bunton, 1965, Oxidation in Organic Chemistry, Vol. 1, Wiberg (Hrsg.), Academic Press, New York, S. 367.
  • Eine Oxidation von Antikörpern mit diesen Oxidationsmitteln läßt sich nach bekannten Verfahren durchführen. Während der Oxidation wird der Antikörper im allgemeinen in der Form einer wäßrigen Lösung eingesetzt, wobei die Konzentration im allgemeinen unter 100 mg/ml liegt, vorzugsweise zwischen 1 und 20 mg/ml. Wird eine Oxosäure oder ein Salz derselben als Oxidationsmittel verwendet, so wird sie bzw. es im allgemeinen in Form einer wäßrigen Lösung eingesetzt, und die Konzentration liegt im allgemeinen zwischen 0,001 und 10 mM, vorzugsweise zwischen 1,0 und 10 mM. Die Menge an Oxosäure oder eines Salzes derselben hängt von der Art des Antikörpers ab, jedoch liegt sie im allgemeinen im Überschuß vor, beispielsweise in der 10- bis 100fachen Menge der Menge des oxidierbaren Kohlenhydrats. Die optimale Menge jedoch läßt sich anhand von Routineversuchen ermitteln.
  • Während des Prozesses der Oxidation von Antikörpern mit Oxosäuren oder Salzen derselben gehören zu den optionalen Bereichen ein pH-Wert von ca. 4 bis 8, eine Temperatur zwischen 0ºC und 37ºC sowie eine Reaktionszeit von ca. 15 Minuten bis 12 Stunden.
  • Während der Oxidation des Glycoproteins mit einer Oxosäure oder einem Salz derselben wird jegliches Licht vorzugsweise ausgeschlossen, um eine Überoxidation des Glycoproteins zu vermeiden.
    • 6.3.2 ENZYMATISCHE OXIDATIONSVERFAHREN
  • Eine Oxidation des Kohlenhydratbestandteils von Antikörpermolekülen läßt sich ebenso mit Hilfe des Enzyms Galactoseoxidase (Cooper u.a., 1959, J. Biol. Chem. 234: 445) mit oder ohne Neruraminidase herbeiführen. Der Antikörper wird in wäßriger Lösung eingesetzt, wobei die Konzentration im allgemeinen zwischen 0,5 und 20 mg/ml liegt. Das Enzym wird im allgemeinen mit einem pH-Wert zwischen ca. 5,5 und ca. 8,0 verwendet. Welche Auswirkung der pH-Wert, die Stoffkonzentration, die Puffer und Pufferkonzentrationen auf die Enzymreaktion haben, ist in Cooper u.a. (Ref. siehe oben) beschrieben. Eine solche enzymatische Oxidation wäre nicht zweckmäßig, wenn es sich bei dem verwendeten Antikörper um ein IgG-Molekül handelt.
    • 6.3.3 KOPPELN EINES OXIDIERTEN ANTIKÖRPERS UND EINES ANTINEOPLASTISCHEN AMINABKÖMMLINGS EINES ANTHRACYCLIN-ANTIBIOTIKUMS
  • Die Antikörper-Konjugate werden hergestellt durch Herbeiführen der Reaktion zwischen einem oxidierten Antikörper und einem Anthracyclin-Antibiotikum mit einer verfügbaren Amingruppe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Hydrazin-, Hydrazid-, Phenylhydrazin-, Phenylhydrazid-, Alkoxyamin-, Phenoxyamin-, Semicarbazid- und Thiosemicarbazidgruppe. Stark mannosehaltige Antikörper lassen sich ebenso einsetzen, um Konjugate mit Anthracyclin-Antibiotika herzustellen (eingehend abgehandelt in der Patentanmeldung Nr. 153 175, eingereicht am 8.2.88 und durch Bezugnahme Bestandteil der vorliegenden Unterlage). Die unmittelbar resultierenden Produkte enthalten eine Kohlenstoff-Stickstoff-Doppelbindung als Ergebnis der Eliminierung eines Wassermoleküls aus den anfänglichen Additionsprodukten:
  • Antikörper - = O + NH&sub2;-R ---------- Antikörper - CH=N-R + H&sub2;O
  • Für eine allgemeine Erörterung der Reaktion von Aldehyden mit Hydrazinabkömmlingen, siehe March, 1978, in: Advanced Organic Chemistry: Reactions Mechanisms and Sructure, McGraw Hill Co., New York, S. 824-825.
  • Eine Lösung des oxidierten Antikörpers in einer Konzentration zwischen ca. 0,5 und 20 mg/ml wird mit einem Aminabkömmling eines Anthracyclin-Antibiotikums gemischt (Molarverhältnis zwischen der reaktiven Amingruppe und dem Antikörperaldehyd zwischen ca. 1 und ca. 10.000), und die Lösung wird für ca. 1 bis 18 Stunden, vorzugsweise im Dunkeln, inkubiert. Geeignete Temperaturen sind Temperaturen zwischen 0ºC und 37ºC, der pH-Wert kann zwischen ca. 6 und 8 liegen.
    • 6.3.4 ENTFERNUNG VON AGGREGATEN UND NICHT KOVALENT GEBUNDENEM ANTHRACYCLIN-ANTIBIOTIKUM
  • Die resultierenden Antikörper-Konjugate können Aggregate enthalten, die durch intramolekulare Schiffsche Basen-Bildung zwischen primären Aminen von Aminosäuren und den Aldehydbestandteilen des Antikörpermoleküls entstanden sind. Zusätzlich zeigen Aminabkömmlinge von Anthracyclin-Antibiotika eine starke nichtkovalente Bindung an Antikörper mit einem oxidierten Kohlenhydratbestandteil sowie eine mäßige Bindung an unveränderte Antikörper.
  • Entsprechend werden in diesen Fällen etwaige gebildete Aggregate und jedes nicht kovalent gebundene Anthracyclin-Antibiotikum optional aus den gewünschten Antikörper-Konjugaten durch geeignete Gelfiltrationsverfahren entfernt wie u.a. durch Hochleistungs-Gelpermeations- Flüssigkeitschromatographie.
  • Die Entfernung von unerwünschten Aggregaten ist besonders wichtig, da die Antikörper-Konjugate in vivo eingesetzt werden, um das gekoppelte therapeutische Anthracyclin-Antibiotikum an den gewünschten Zielort zu bringen. Alle derartigen Antikörper-Aggregate würden von dem retikuloendothelialen System zur Entfernung aufgenommen werden, und ein solcher Transport weg von dem Zielort oder spezifischen Gewebe würde den Umfang der Lokalisierung und somit den therapeutischen Wirkungsgrad der verabreichten Konjugate mindern und möglicherweise toxische Wirkungen an Nicht-Zielorten hervorrufen.
    • 6.4 VERWENDUNG VON AMINABKÖMMLINGEN VON ANTHRACYCLIN-ANTIBIOTIKA UND ANTIKÖRPER-KONJUGATEN
  • Die Aminabkömmlinge von Anthracyclin-Antibiotika der vorliegenden Erfindung sind besonders gut geeignet für einen Einsatz bei der Herstellung von therapeutischen Antikörper-Konjugaten. D.h., diese Abkömmlinge stellen Zwischenstufen bei der Darstellung von therapeutischen Antikörper-Anthracyclin-Antibiotika-Konjugaten dar. Die selektive Ankopplung eines Aminabkömmlings an einen oxidierten Kohlenhydratbestandteil eines Antikörpers oder Antikörperfragments bringt ein therapeutisch wirksames wasserlösliches Konjugat hervor, das die Immunspezifität des Antikörpers behält.
  • Solche Antikörper-Konjugate sind besonders vorteilhaft für die In- vivo-Therapie, da sie vorzugsweise dem Zielort zugeführt werden und eine Herzschädigung ausschließen sollten, worin eines der wesentlichen einschränkenden Probleme für die Verwendung von Anthracyclin-Antibiotika liegt.
  • Bei den eingesetzten Antikörpern kann es sich um herkömmliche Antikörper oder auch monoklonale Antikörper handeln. Der Einsatz von monoklonalen Antikörpern bietet verschiedene Vorteile, da jeder monoklonale Antikörper Spezifität für eine Antigendeterminante besitzt und problemlos in großen Mengen anhand von bekannten Verfahren hergestellt werden kann.
  • Brauchbare Antikörper sind gegen jedes Ziel gerichtet, das mit Zellstörungen in Verbindung steht, die sich mittels eines antineoplastischen Anthracyclin-Antibiotikums behandeln lassen. Der Begriff "Zellstörungen", so wie in dieser Anmeldung durchgehend verwendet, soll Neoplasmen und andere hyperplastische Bedingungen umfassen, die für eine Behandlung mittels antineoplastischer Anthracyclin- Antibiotika empfänglich sind. Zu solchen Zellstörungen gehören u.a.: akute Lymphozytenleukämie, akute Granulozytenleukämie, akute Monolymphoblastenleukämie, bösartige Lymphome wie u.a. Nicht- Hodgkinsche-Lymphome, Karzinome wie u.a. Brustkrebs, kleinzelliges Bronchialkarzinom, Blasenkrebs, Bronchuskarzinom, Karzinome des Endometriums, Hodenkrebs, Prostatakrebs, Zervixkarzinom, Karzinome am Kopf und am Hals; Sarkome wie u.a. Knochensarkom, Ewing- Sarkom und Weichgewebesarkome, metastatisches Brustdrüsenkarzinom, metastatisches Schilddrüsenkarzinom und Plasmazellenmyelom.
  • Außerdem soll der Begriff "Zellstörungen" desweiteren jegliches neoplastische Tumorwachstum umfassen, das für eine therapeutische Behandlung mittels der Antikörper-Konjugate von Aminabkömmlingen von Anthracyclin-Antibiotika empfänglich ist, wie durch den nachgenannten In-vivo-Versuch ermittelt.
  • Eine kleine Probe eines zu behandelnden Tumors wird auf herkömmliche Weise gewonnen und in verschiedene aliquote Teile aufgeteilt. Ein entweder monoklonaler oder polyklonaler Antikörper, der mit einer Immunspezifität für diesen speziellen Tumor immunreaktiv ist, wird unter Anwendung von herkömmlichen Verfahren oder Hybridom- Verfahren identifiziert und/oder hergestellt. Ein Antikörper-Anthracyclin-Antibiotika-Konjugat wird entsprechend dieser Erfindung hergestellt (siehe Abschnitt 6.3). Ein aliquoter Teile der Tumorprobe wird subkapsulär in die Niere eines Versuchstieres eingepflanzt. Eine normale Maus oder eine Nacktmaus stellt ein geeignetes Versuchstiermodell dar. Das Tumorfragment wird vor Ort vermessen mit Hilfe eines Okularmikrometers, und das Antikörper-Anthracyclin-Antibiotika- Konjugat wird über mehrere Tage intravenös verabreicht. Tiere, denen gleichermaßen ein gleichartiges Tumorfragment subkapsulär in die Niere eingepflanzt worden ist, die jedoch keine Behandlung erfahren, dienen als negative Kontroll-Einheiten. Messungen des implantierten Tumorgewebes werden entweder periodisch an einer Gruppe von Tieren durchgeführt oder nach einer gegebenen Zeitspanne nach Implantation, und eine Hemmung des Tumorwachstums oder eine Abnahme der Tumorgröße bei den behandelten Tieren weist hin auf therapeutische Wirksamkeit der Konjugate. Anhand des obengenannten Musters kann jedes Tumorgewebe vom Menschen auf In-vivo-Empfindlichkeit gegenüber den Antikörper-Anthracyclin-Antibiotika-Konjugaten dieser Erfindung überprüft werden.
  • Beispiele für Ziele, die mit Zellstörungen in Verbindung stehen, die sich wirksam mittels der Antikörper-Konjugate dieser Erfindung behandeln lassen, sind u.a.: Tumorantigene, Histokompatibilitäts-, Differenzierungs- und andere Zellmembran-Antigene, Enzyme, Hormonrezeptoren, Geschwulstbildungsprodukte, usw.. Außerdem kann eine Kombination von Antikörpern, die auf verschiedene Antigendeterminanten ansprechen, eingesetzt werden. Immunglobuline, die als Träger eingesetzt werden können, sind u.a. bestimmte Klassen von Antikörpern wie z.B. IgA, IgD, IgE, IgM; bestimmte Klassen von IgG; oder bestimmte Fragmente von Immunglobulinen, z.B. halbe Antikörpermoleküle (oder einfaches schwere:leichte Ketten-Paar), Fab, Fab' von (Fab')&sub2;-Fragmenten.
  • Ausweichsmöglichkeiten wie u.a. therapeutische Aktivität ohne Freisetzung aus dem Konjugat, enzymatisch beschleunigte Freisetzung und chemisch induzierte Freisetzung an einem In-vivo-Ziel werden vorgestellt, um die therapeutische Wirkung der Antikörper-Anthracyclin-Antibiotika-Konjugate der Erfindung in vivo zu erläutern. Diese Erfindung beschränkt sich jedoch nicht auf irgendeine bestimmte Theorie oder irgendeinen bestimmten Mechanismus für diese therapeutische Wirksamkeit.
  • Die Antikörper-Konjugate sind ideal geeignet für den Einsatz in Verfahren der therapeutischen In-vivo-Behandlung von Zellstörungen. Zu diesen Verfahren gehören die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Antikörper-Anthracyclin-Antibiotika-Konjugats dieser Erfindung, wobei dieses Konjugat Immunreaktivität mit einem und Immunspezifität für einen Zielort aufweist, der mit besagter Zellstörung in Verbindung steht, und im wesentlichen keine Immunreaktivität mit und keine Immunspezifität für Gewebe aufweist, das nicht mit besagter Zellstörung in Verbindung steht. Die Konjugate dieser Erfindung sind therapeutisch wirksam für die Behandlung von Zellstörungen, die auf eine Behandlung mit den Anthracyclin-Antibiotika-Vorstufen, aus denen die Konjugate abgeleitet werden, ansprechen.
  • Außerdem ist vorgesehen, daß die Antikörper-Anthracyclin-Antibiotika-Konjugate nützlich sind für die Behandlung von Tumoren, die gegen die freie Anthracyclin-Antibiotika-Vorstufe, aus der der Aminabkömmling abgeleitet wird, resistent sind. Um festzustellen, ob ein bestimmter Tumor therapeutisch in vivo mit einem bestimmten Antikörper-Anthracyclin-Antibiotika-Konjugat behandelt werden kann, wird der obenbeschriebene In-vivo-Test durchgeführt.
  • Die In-vivo-Verabreichung kann die Verwendung von pharmazeutischen Zusammensetzungen der Antikörper-Anthracyclin-Antibiotika- Konjugate in einem beliebigen Träger einschließlich Serum oder physiologische Kochsalzlösung, mit oder ohne weiteres Protein wie z.B. humanes Serumalbumin implizieren. Die Dosierungen der Konjugate lassen sich leicht von einem Durchschnittsfachmann ermitteln und können je nach Art der Zellstörung und des bestimmten eingesetzten Anthracyclin-Antibiotikums unterschiedlich sein. Die bevorzugte Art der Verabreichung ist im allgemeinen parenteral, über den intramuskulären, intravenösen, intraartiellen, intrathekalen, intraperitonealen und intralymphatischen Weg.
  • Die folgende Reihe von Beispielen dient auschließlich Illustrationszwecken und soll den Umfang dieser Erfindung in keiner Weise einschränken.
    • 7. SYNTHESE VON AMINHALTIGEN DERIVATEN VON DOXORUBICIN ODER ADRIMYCIN (ADR) 7.1 3'-ACYL-ADR-ABKÖMMLlNGE
  • In den nachfolgenden Beispielen wurden FMOC-geschützte 3'-Acyl- ADR-Abkömmlinge wie in Abschnitt 6.2 beschrieben hergestellt. Zeigte die Dünnschichtchromatographie [Chloroform/Methanol 8:2 (Siliziumdioxid); Acetonitril/0,1 % Trifluoressigsäure 1:1 (umgekehrte Phase)] an, daß das resultierende Produkt unrein war, dann wurde das Produkt gereinigt z.B. durch Flash-Chromatographie über Silicagel (Siebgröße 200-400) unter Verwendung eines Chloroform/Methanol-Gemischs.
    • 7.2 GLYCYL-ADR (1)
  • FMOC-Gly (1,0 Äquivalente) wurde in trockenem, mit Stickstoff durchperltem Dimethylformamid (DFM) gelöst und auf 0ºC abgekühlt. N-Methylmorpholin (1,0 Äquivalente) wurde hinzugegeben; das Gemisch wurde für ca. 5 Minuten inkubiert, danach wurde Isobutylchlorformat (1,0 Äquivalente) unter Schütteln hinzugegeben. Nach einer weiteren 3- bis 5-minütigen Inkubation wurde Adriamycin-Hydrochlorid (ADR-Cl) (0,9 - 1,0 Äquivalente) zusammen mit einer äquivalenten Menge an N- Methylmorpholin, suspendiert in DMF, hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde für 1 bis 2 Stunden bei 0ºC, anschließend bei ca 4ºC für 12 bis 16 Stunden unter Schütteln inkubiert. Der Rückstand wurde mit Ethylacetat aufgenommen und nacheinander mit gesättigter wäßriger Natriumbicarbonatlösung, 5 %iger wäßriger Zitronensäure oder Essigsäure und Wasser gewaschen. Die organische Schicht wurde über Natriumsulfat getrocknet, durch Rotationsverdampfung aufkonzentriert und entweder aus Methanol/Ether rekristallisiert oder mit Ether ausgefällt. Die Ausbeute an FMOC-Gly betrug 75 %; Schmelzpunkt: 154º-157ºC; RF-Wert: 0,92 [Chloroform/Methanol 8:2 (Siliziumdioxid)]; RF-Wert: 0,42 [Acetonitril/0,1 % wäßrige Trifluoressigsäure 1:1 (umgekehrte Phase)]. Elementaranalyse von C&sub4;&sub4;H&sub4;&sub2;N&sub2;O&sub1;&sub4;.2,5 H&sub2;O: nominell: C 60,89; H 5,46; Ist-Werte: C 60,96; H 5,48.
  • Um Gly-ADR zu bilden, wurde FMC-Gly-ADR in frisch mit Stickstoff durchperltem DMF (ca. 10 mg/ml) gelöst und auf 0ºC gekühlt. Destilliertes Diethylamin wurde unter Stickstoffatmosphäre bis zu einer Endkonzentration von ca. 10 % mittels einer Trocken-Glasspritze hinzugefügt. Nach 15- bis 30-minütiger Inkubation wurde das Amin unter einem starken Stickstoffstrom verdampft. Lösungsmittel wurden durch Rotationsverdampfung bei 35ºC entfernt. Der Rückstand wurde über Nacht in Ether bei 0ºC gelagert. Nach Entfernung des Ethers, z.B. durch Dekantation, wurde der Rückstand in 5 %iger Essigsäure gelöst und mit Ether extrahiert, bis sich keine weitere rote Farbe mehr in der organischen Schicht zeigte. Die wäßrige Schicht wurde gefriergetrocknet. Die Ausbeute an Gly-ADR (1).HOAc betrug 53 mg (72 %). Der Schmelzpunkt von (1) betrug 209ºC (zerfallen). RF-Wert: 0,05 [Chloroform/Methanol 8:2 (Siliziumdioxid)]; RF-Wert: 0,35 [Acetonitril/0,1 %ige wäßrige Trifluoressigsäure 1:1 (umgekehrte Phase)]. Elementaranalyse von C&sub3;&sub1;H&sub3;&sub6;N&sub2;O&sub1;&sub4;.0,5 H&sub2;O: nominell: C 55,60; H 5,57; N 4,20; Ist- Werte: C 55,78; H 5,52; N 4,63.
    • 7.1.2 ALANYL-ADR (2)
  • Alanyl-ADR (2) (Ala-ADR) wurde dargestellt wie oben für Gly-ADR beschrieben, mit der einzigen Ausnahme, daß FMOC-Ala als Ausgangsmaterial eingesetzt wurde. Die Ausbeute an FMOC-Ala-ADR betrug 97 %; der Schmelzpunkt betrug 118º- 120ºC; RF-Wert: 0,94 [Chloroform/Methanol 8:2 (Siliziumdioxid)]; RF-Wert: 0,79 [Acetonitril/0,1 % wäßrige Trifluoressigsäure 1:1 (umgekehrte Phase)]. Elementaranalyse von FMOC-Ala-ADR C&sub4;&sub5;H&sub4;&sub4;N&sub2;O&sub1;&sub4;.H&sub2;O: nominell: C 63,22; H 5,42; N 3,27; Ist-Werte: C 63,18; H 5,39; N 3,25.
  • Die Ausbeute an (2).HOAc betrug 560 mg (79 %). Der Schmelzpunkt von (2) betrug 170ºC (zerfallen). RF-Wert: 0,24 [Chloroform/Methanol 8:2 (Siliziumdioxid)]; RF-Wert: 0,21 [Acetonitril/0,1 %ige wäßrige Trifluoressigsäure 1:1 (umgekehrte Phase)]. Elementaranalyse von C&sub3;&sub2;H&sub3;&sub8;N&sub2;O&sub1;&sub4;.2,0 H&sub2;O: nominell: C 4,08; H 5,96; N 3,94; Ist- Werte: C 53,95; H 5,89; N 3,95.
    • 7.1.3 D-ALA-ADR (3)
  • D-Alanyl-ADR (3) (D-Ala-ADR) wurde wie oben für Gly-ADR beschrieben hergestellt, mit der einzigen Ausnahme, daß FMOC-D-Ala als Ausgangsmaterial eingesetzt wurde. Die Ausbeute an FMOC-D-Ala- ADR betrug 172 mg (64 %); der Schmelzpunkt betrug 170ºC (zerfallen). RF-Wert: 0,36 (Siliziumdioxid, Chloroform/Methanol/Essigsäure 90:5:5). Elementaranalyse von C&sub4;&sub5;H&sub4;&sub4;N&sub2;O&sub1;&sub4;.4,5 H&sub2;O: nominell: C 58,88; H 5,82; N 3,07; Ist-Werte: C 59,02; H 5,46; N 2,81.
  • Die Ausbeute an (3).HOAc betrug 73 mg (72 %). Der Schmelzpunkt von (3) betrug 204ºC (zerfallen). RF-Wert: 0,56 (Siliziumdioxid, Chloroform/Methanol/H&sub2;O 20:10:1). Elementaranalyse von C&sub3;&sub2;H&sub3;&sub8;N&sub2;O&sub1;&sub4;.1,5 H&sub2;O: nominell: C 54,78; H 5,89; N 4,01; Ist-Werte: C 54,96; H 5,83; N 4,49.
    • 7.1.4 ISOLEUCINYL-ADR (4)
  • FMOC-Ile (1,0 Äquivalente) und N-Hydroxybernsteinsäureimid (1,1 Äquivalente) wurden in DMF/CH&sub2;Cl&sub2; unter Stickstoff gelöst und auf -5ºC gekühlt. Dicyclohexylcarbodiimed (DCC) (0,5 M in Methylenchlorid, 1,0 bis 1,1 Äquivalente) wurde hinzugegeben, und das Gemisch wurde zunächst 1 Stunde lang bei 0ºC, sodann 18 Stunden lang bei Raumtemperatur geschüttelt. Weißer Niederschlag wurde gefiltert, und dem Filtrat wurde sodann ein Gemisch aus ADR (1,0 Äquivalente) und N- Methylmorpholin (1,1 Äquivalente) in DMF zugesetzt. Das Ganze wurde für weitere 7 Tage bei Raumtemperatur weiter geschüttelt. Lösungsmittel wurden durch Rotationsverdampfung entfernt, wobei ein Rohprodukt zurückblieb, das erneut in Ethylacetat gelöst wurde und nacheinander mit 10 %iger Essigsäure, Wasser, gesättigter Natriumbicarbonatlösung und Wasser extrahiert wurde. Die organische Schicht wurde über Natriumsulfat getrocknet, durch Rotationsverdampfung aufkonzentriert und entweder aus Methanol/Ether kristallisiert oder mit Ether ausgefällt. Das Produkt wurde vakuumgetrocknet. Die Ausbeute an FMOC-Ile-ADR betrug 33 %; der Schmelzpunkt betrug 147ºC (zerf.); RF- Wert: 0,45 [Chloroform/Methanol/Essigsäure 90:5:5 (Siliziumdioxid)]. RF-Wert: 0,25 [Chloroform/Methanol 95:5 (Siliziumdioxid)]. Elementaranalyse von C&sub4;&sub8;H&sub5;&sub0;N&sub2;O&sub1;&sub4;.H&sub2;O: nominell: C 64,28; H 5,84; N 3,12; Ist-Werte: C 63,98; H 5,81; N 3,11.
  • Der FMOC-Bestandteil wurde aus FMOC-Ile-ADR entfernt, um Ile- ADR (4) zu gewinnen, wie für Gly-ADR (1) beschrieben. Die Ausbeute an (4).HOAc betrug 48 %. Der Schmelzpunkt von (4) betrug 192ºC (zerf.). Elementaranalyse von C&sub3;&sub5;H&sub4;&sub5;N&sub2;O&sub1;&sub4;.H&sub2;O: nominell: C 57,14; H 6,44; N 3,81; Ist-Werte: C 57,47; H 6,12; N 3,84.
    • 7.1.5 VALYL-ADR (5)
  • Valyl-ADR (5) wurde wie oben für Ile-ADR beschrieben hergestellt, mit der einzigen Ausnahme, daß FMOC-Val als Ausgangsmaterial eingesetzt wurde. Die Ausbeute an FMOC-Val-ADR betrug 35 %; der Schmelzpunkt betrug 154ºC (zerf.). RF-Wert: 0,46 [Chloroform/Methanol/Essigsäure 95:5:5 (Siliziumdioxid)]; RF-Wert: 0,71 [Chloroform/Methanol 9:1 (Siliziumdioxid)]. Elementaranalyse von C&sub4;&sub7;H&sub4;&sub8;N&sub2;O&sub1;&sub4;.2,5 H&sub2;O: nominell: C 62,04; H 5,87; N 3,08; Ist-Werte: C 61,99; H 5,70; N 3,12.
  • Die Ausbeute an (5).HOAc betrug 90 %. Der Schmelzpunkt von (5) betrug 197ºC (zerf.). Elementaranalyse von C&sub3;&sub4;H&sub4;&sub2;N&sub2;O&sub1;&sub4;: nominell: C 58,11; H 6,02; N 3,99; Ist-Werte: C 58,10; H 6,07; N 4,04.
    • 7.1.6 TYROSINYL-ADR (6)
  • Tyrosinyl-ADR (Tyr-ADR) (6) wurde wie oben für Gly-ADR beschrieben hergestellt mit der einzigen Ausnahme, daß FMOC-Tyr als Ausgangsmaterial eingesetzt wurde. Die Ausbeute an FMOC-tyrosinyl- ADR betrug 82 %; der Schmelzpunkt betrug 180º-182ºC (zerf.). RF-Wert: 0,91 [Chloroform/Methanol 8:2 (Siliziumdioxid)]. Elementaranalyse von FMOC-ADR C&sub5;&sub1;H&sub4;&sub8;N&sub2;O&sub1;&sub5;.1,5 H&sub2;O: nominell: C 64,08; H 5,38; N 2,94; Ist-Werte: C 64,17; H 5,56; N 3,47.
  • Die Ausbeute an (6).HOAc betrug 140 mg (86 %). Der Schmelzpunkt von (6) betrug 200ºC (zerf.). RF-Wert: 0,58 [Chloroform/Methanol 8:2 (Siliziumdioxid)]; RF-Wert: 0,53 [Acetonitril/0,1 %ige wäßrige Trifluoresigsäure 1:1 (umgekehrte Phase)]. Elementaranalyse von C&sub3;&sub8;H&sub4;&sub2;N&sub2;O&sub1;&sub5;.0,5 H&sub2;O: nominell: C 58,83; H 5,59; N 3,63; Ist-Werte: C 58,67; H 5,82; N 4,29.
    • 7.1.7 ARGINYL-ADR (7)
  • Arginyl-ADR (Arg-ADR) (7) wurde wie oben für Gly-ADR beschrieben hergestellt, mit den folgenden Ausnahmen: (a) als Ausgangsmaterial wurde FMOC-Arg eingesetzt; und (b) nach Abschluß der Reaktion wurde das Rohproduktgemisch durch Rotationsverdampfung aufkonzentriert und durch präparative Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) in einer Rainin C-18-Dynamax-Säule (21,4 mm x 25 cm) mittels Gradienten-Elution (Lösungsmittel A: 0,1 %ige wäßrige Trifluoressigsäure; Lösungsmittel B: Acetonitril) mit 15 ml/min gereinigt. Eine nichtlinearer 38-Minuten-Gradient wurde entwickelt. Der Detektor wurde auf 300 nm eingestellt; Produkt-Spitzen wurden gesammelt und zusammengefaßt; und das gewonnene FMOC-Arg-ADR wurde durch Rotationsverdampfung und Gefriertrocknung aufkonzentriert. Die Ausbeute an FMOC-Arg-ADR betrug 80 %; der Schmelzpunkt betrug 150ºC. RF-Wert: 0,40 [n-Butanol/Essigsäure/Wasser 3:1:1 (Siliziumdioxid)]; RF-Wert: 0,23 [Acetonitril/0,1 %ige wäßrige Trifluoressigsäure 1:1 (umgekehrte Phase)]. Elementaranalyse von C&sub4;&sub9;H&sub5;&sub1;N&sub2;O&sub1;&sub6;.2 H&sub2;O: nominell: C 55,57; H 5,23; N 6,64; Ist-Werte: C 55,64; H 5,24; N 6,73.
  • Die FMOC-Schutzgruppe wurde aus dem FMOC-Arg-ADR wie oben beschrieben entfernt. Die Ausbeute an Arg-ADR (6).2 HOAc betrug 173 mg (70 %). Der Schmelzpunkt von (7) betrug 214ºC (zerf.). RF-Wert: 0,06 [Chloroform/Methanol 8:2 (Siliziumdioxid)]. RF-Wert: 0,15 [Acetonitril/0,1 %ige wäßrige Trifluoressigsäure 1:1 (umgekehrte Phase)].
    • 7.1.8 ALANYL-ALANYL-ADR (8)
  • Alanyl-alanyl-ADR (8) wurde wie oben für Ile-ADR beschrieben hergestellt mit der einzigen Ausnahme, daß FMOC-Ala-Ala als Ausgangsmaterial eingesetzt wurde. Die Ausbeute an FMOC-Ala-Ala-ADR betrug 203 mg (57 %); der Schmelzpunkt betrug 165º- 169ºC (zerf.). RF-Wert: 0,43 (Siliziumdioxid, Chloroform/Methanol 9:1). Elementaranalyse von C&sub4;&sub8;H&sub4;&sub9;N&sub3;O&sub1;&sub5; 0,5 H&sub2;O: nominell: C 62,87; H ,50; N 4,60; Ist-Werte: C 62,94; H 6,06; N 4,56.
  • Die Ausbeute an (8).HOAc betrug 100 mg (84 %). Der Schmelz punkt von (8) betrug 197ºC (zerf.). RF-Wert: 0,30 (Siliziumdioxid, Chloroform/Methanol/Essigsäure 20:10:1). Elementaranalyse von C&sub3;&sub5;H&sub4;&sub3;N&sub3;O&sub1;&sub5;: nominell: C 56,37; H 5,81; N 5,66; Ist-Werte: C 56,21; H 5,84; N5,50.
    • 7.1.9 ALANYL-ALANYL-ALANYL-ADR (9)
  • Alanyl-alanyl-alanyl-ADR (9) wurde wie oben für Ile-ADR beschrieben hergestellt mit der einzigen Ausnahme, daß FMOC-Ala-Ala-Ala-ADR als Ausgangsmaterial eingesetzt wurde. Die Ausbeute an FMOC-Ala- Ala-Ala-ADR betrug 158 mg (37 %); der Schmelzpunkt betrug 178º- 182ºC. RF-Wert: 0,65 (Siliziumdioxid, Chloroform/Methanol 9:1). RF- Wert: 0,18 (Siliziumdioxid, Chloroform/Methanol/Essigsäure 90:5:5). Elementaranalyse von C&sub5;&sub1;H&sub5;&sub4;N&sub4;O&sub1;&sub6;.0,5 H&sub2;O: nominell: C 61,99; H 5,61; N 5,70; Ist-Werte: C 61,73; H 5,97; N 5,66.
  • Die Ausbeute an (9).HOAc betrug 80 mg (89 %). Der Schmelzpunkt von (9) betrug 223ºC (zerf.). RF-Wert: 0,27 (Siliziumdioxid, Chloroform/Methanol/Essigsäure 20:10:1). Elementaranalyse von C&sub3;&sub8;H&sub4;&sub8;N&sub4;O&sub1;&sub6;.1,5 H&sub2;O: nominell: C 54,08; H 6,09; N 6,67; Ist-Werte: C 54,09; H 5,97; N 6,54.
    • 7.1.10 D-ALANYL-ALANYL-ALANYL-ADR (10)
  • D-Alanyl-alanyl-alanyl-ADR (10) wurde wie oben für Ile-ADR beschrieben hergestellt mit der einzigen Ausnahme, daß FMOC-D-Ala- Ala-Ala-Ala als Ausgangsmaterial eingesetzt wurde. Die Ausbeute an FMOC-D-Ala-Ala-Ala-ADR betrug 196 mg (61 %); der Schmelzpunkt betrug 195º-199ºC. RF-Wert: 0,32 (Siliziumdioxid, Chloroform/Methanol/Essigsäure 85:10:5). Elementaranalyse von C&sub5;&sub1;H&sub5;&sub4;N&sub4;O&sub1;&sub6;.1,5 H&sub2;O: nominell: C 60,88; H 5,71; N 5,59; Ist-Werte: C 0,96; H 5,92; N 5,64.
  • Die Ausbeute an (10).HOAc betrug 65 mg (80 %). Der Schmelzpunkt von (10) betrug 201º-203ºC (zerf.). RF-Wert: 0,40 (Siliziumdioxid, Chloroform/Methanol/Essigsäure 20:10:1). Elementaranalyse von C&sub3;&sub8;H&sub4;&sub8;N&sub4;O&sub1;&sub6;.1,0 H&sub2;O: nominell: C 54,66; H 6,04; N 6,74; Ist-Werte: C 54,44; H 5,99; N 6,84.
    • 7.1.11 TYR-GLY-GLY-ADR (11) FMOC-Tyr-Gly-Gly
  • FMOC-Tyr-Gly-Gly wurde zunächst wie folgt hergestellt:
  • Tyr-Gly-Gly (5,0 g, 16,9 mMol) und Natriumbicarbonat (1,42 g, 16,9 mMol) wurden in 20 ml Wasser suspendiert; zu dieser Suspension wurde 9-Fluorenylmethyl-bernsteinsäureimidylcarbonat (6,27 g, 1,86 mMol), gelöst in 30 ml Dioxan, gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 1,5 Stunden lang geschüttelt, in 112 %ige Natriumbicarbonatlösung gegeben und mit Ether (2 x 250 ml) extrahiert. Die wäßrige Schicht wurde auf einen pH-Wert 2 mit konzentrierter HCl mit 0ºC angesäuert, was zur Ausfällung eines weißen Feststoffes führte. Der Feststoff wurde gefiltert, mit Wasser und Ether gewaschen und luftgetrocknet. Ein zweimaliges Rekristallisieren aus Methanol ergab reines FMOC-Tyr-Gly- Gly. Ausbeute: 4,70 g (53,8 %); Schmelzpunkt 215º-216ºC; RF-Wert 0,33 [Chloroform/Essigsäure/Methanol 85:5:10 (Siliziumdioxid)]. Elementaranalyse von C&sub2;&sub8;H&sub2;&sub7;N&sub3;O&sub7;: nominell: C 64,98; H 5,26; N 8,12; Ist-Werte: C 64,76; H 5,32; N 8,07.
  • FMOC-Tyr-Gly-Gly wurde an ADR wie in Abschnit 7.1.1 für Gly- ADR gekoppelt. Die Ausbeute an FMOC-Tyr-Gly-Gly-ADR betrug 95 %; der Schmelzpunkt betrug 150º-153ºC. RF-Wert 0,63 [Chloroform/Methanol 8:2 (Siliziumdioxid)]. RF-Wert: 0,68 [Acetonitril/0,1 %ige wäßrige Trifluoressigsäure 1:1 (umgekehrte Phase)]. Elementaranalyse von C&sub5;&sub5;H&sub5;&sub4;N&sub4;O&sub1;&sub7;.H&sub2;O: nominell: C 62,25; H 5,32; N 5,30; Ist-Werte: C 62,17; H 5,92; N 5,09. Der FMOC-Schutzbestandteil wurde aus dem Produkt entfernt wie in Abschnitt 7.1.1 für Gly-ADR beschrieben. Die Ausbeute an dem Produkt Tyr-Gly-Gly-ADR.HOAc betrug 68 mg (80 %); der Schmelzpunkt betrug 165ºC (zerf.). RF-Wert 0,10 [Chloroform/Methanol 8:2 (Siliziumdioxid)]. RF-Wert: 0,53 [Acetonitril/0,1 %ige waßrige Trifluoressigsäure 1:1 (umgekehrte Phase)]. Elementaranalyse von C&sub4;&sub2;H&sub4;&sub8;N&sub4;O&sub1;&sub7;.2 H&sub2;O: nominell: C 55,01; H 5,72; Ist-Werte: C 55,15; H 5,54.
    • 7.1.12 TYR-GLY-GLY-ARG-ADR (12)
  • FMOC-Tyr-Gly-Gly (26 mg, 0,050 mMol) wurde wie in Abschnitt 7.1.1 für FMOC-Gly beschrieben aktiviert. Sodann wurde das FMOC- Tyr-Gly-Gly an Arg-ADR gekoppelt. In der Praxis wurden Arg-ADR.2 HOAc, hergestellt wie in Abschnitt 7.1.4 (41 mg, 0,050 mMol) beschrieben, und N-Methylmorpholin mit aktiviertem FMOC-Tyr-Gly-Gly in DMF zur Reaktion gebracht. Nach Ablauf einer Reaktionszeit von 18 Stunden wurden Lösungsmittel durch Rotationsverdampfung entfernt, und rohes FMOC-Tyr-Gly-Gly-Arg-ADR wurde durch Trituration mit Ether isoliert. Der Feststoff wurde gefiltert und luftgetrocknet und ergab 58 mg (92 %). RF-Wert: 0,36 [n-Butanol/Essigsäure/Wasser 4:1:1 (Siliziumdioxid)].
  • Der FMOC-Bestandteil von FMOC-Tyr-Gly-Gly-Arg-ADR wurde entfernt, um Tyr-Gly-Gly-Arg-ADR (12) hervorzubringen. Die Ausbeute an (12).2 HOAc betrug 36 mg (84 %); der Schmelzpunkt betrug 204ºC (zerf.). RF-Wert 0,06 [Chloroform/Methanol 8:2 (Siliziumdioxid)]. RF- Wert: 0,15 [Acetonitril/0,1 %ige wäßrige Trifluoressigsäure 1:1 (umgekehrte Phase)]. Elementaranalyse von C&sub4;&sub7;H&sub6;&sub1;N&sub8;O&sub1;&sub8;.2,5 H&sub2;O: nominell: C 52,11; H 6,07; Ist-Werte: C 51,72; H 5,64.
    • 7.1.13 TYR-ALA-ALA-ALA-ADR (13) CBZ-Ala-Ala-Ala-Ala-t-butylester
  • CBZ-Ala-Ala (10,0 g, 34,0 mMol) wurde in 150 ml Tetrahydrofuran (THF) bei 0ºC unter Stickstoff gelöst. N-Methylmorpholin (4,18 ml, 38 mMol) wurde hinzugefügt, und 5 Minuten später wurde Isobutylchlorformat (4,94 ml, 38 mMol) zugesetzt. Nach weiteren fünf Minuten wurde ein zuvor hergestelltes Gemisch aus Ala-O-t-butyl-HCl (6,76 g, 38 mMol) und N-methylmorpholin (4,18 ml, 38 mMol) in THF zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde unter Schütteln drei Tage lang bei 4ºC inkubiert. Danach wurde das Reaktionsgemisch gefiltert; das Filtrat wurde zu einem Feststoff durch Rotationsverdampfung aufkonzentriert. Der Feststoff wurde mit Ethylacetat aufgenommen und mit 5 %iger Zitronensäure (3 x), Wasser (2 x), gesättigter wäßriger Natriumbicarbonatlösung (3 x) und Wasser (2 x) exrahiert. Die organische Schicht wurde über Natriumsulfat getrocknet, dann durch Rotationsverdampfung zu einem Feststoff aufkonzentriert und vakuumgetrocknet, um schließlich CBZ-Ala-Ala-Ala-O-t-butylester zu ergeben. Ausbeute: 10,3 g (78 %). RF-Wert: 0,94 [Chloroform/Essigsäure/Methanol 85:5:10 (Siliziumdioxid)].
    • Ala-Ala-Ala-t-butylester
  • CBZ-Ala-Ala-Ala-O-t-butyl (10,0 g, 25 mMol) wurde bei 47 psi in 300 ml Methanol mit 5 %iger Essigsaure und 700 mg 5 %igem Pd/C- Katalysator 1,5 Stunden lang hydriert. Der Katalysator wurde durch Filtrieren entfernt, und das Filtrat wurde durch Rotationsverdampfung zu einem Öl konzentriert. Anschließendes Triturieren mit Ether ergab einen Feststoff, der gefiltert und danach vakuumgetrocknet wurde, um schließlich Ala-Ala-Ala-O-t-butyl.HOAc zu ergeben. Ausbeute: 7,2 g (88 %). RF-Wert: 0,10 [Chloroform/Essigsäure/Methanol 85:5:10 (Siliziumdioxid)].
    • FMOC-(O-t-butyl)-Tyr-Ala-Ala-Ala-t-butylester
  • FMOC-(O-t-butyl)Tyr (1,53 g, 3,3 mMol) wurde in 25 ml THF mit 0ºC unter Stickstoff gelöst. N-Methylmorpholin (363 ul, 3,3 mMol) wurde unter Schütteln hinzugefügt, und 5 Minuten später wurde Isobutylchlorformat (429 ul, 38 mMol) zugesetzt. Der weiße Niederschlag, der sich gebildet hatte, wurde nach 5 Minuten gefiltert, und das Filtrat wurde direkt einer Lösung aus Ala-Ala-Ala-O-t-butyl (1,0 g, 3,0 mMol) und N-Methylmorpholin (330 ul, 3,0 mMol) in 30 ml THF mit 0ºC zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde unter Schütteln über Nacht bei 4ºC inkubiert. Lösungsmittel wurden durch Rotationsverdampfung entfernt. Der Rückstand wurde in Ethylacetat gelöst und mit 10 %iger wäßriger Essigsäure (1 x), Wasser (2 x), gestättigter Natriumbicarbonatlösung (3 x), Wasser (2 x), 5 %iger Natriumbicarbonatlösung (3 x) und Wasser (2 x) extrahiert. Dem schloß sich ein Trocknen über Natriumsulfat an. Die organische Schicht wurde bis zur Trockenen verdampft und aus Methanolether kristallisiert. Das Produkt wurde über P&sub2;O&sub5; bei 60ºC vakuumgetrocknet. Ausbeute: 5,97 g (55 %); Schmelzpunkt: 189º-190ºC (Haupternte); 191º-192ºC (zweite Ernte aus Mutterlauge). RF-Wert: 0,81 [Cloroform/Methanol 9:1 (Silziumdioxid)]. Elementaranalyse von C&sub4;&sub1;H&sub5;&sub2;N&sub4;O&sub8;: nominell: C 67,54; H 7,19; Ist-Werte: C 67,45; H 7,23.
    • FMOC-Tyr-Ala-Ala-Ala
  • FMOC-(O-t-butyl)Tyr-Ala-Ala-Ala-O-t-butyl (957 mg, 1,32 mMol) wurde in 120 ml Trifluoressigsäure gelöst und 90 Minuten lang bei Raumtemperatur geschüttelt. Die Trifluoressigsäure wurde durch Rotationsverdampfung entfernt, und der Rückstand wurde mit Petrolether aufbereitet. Es bildete sich ein weißer Feststoff, der gefiltert, mit Petrolether gewaschen und anschließend vakuumgetrocknet wurde. Ausbeute: 776 mg (95 %); Schmelzpunkt: 196ºC (zerf.). RF-Wert: 0,53 [Methylenchlorid/Methanol 9:1 (Siliziumdioxid)]. Elementaranalyse von C&sub3;&sub3;H&sub3;&sub6;N&sub4;O&sub8;: nominell: C 63,33; H 5,96; Ist-Werte: C 67,07; H 5,95.
  • FMOC-Tyr-Ala-Ala-Ala wurde an ADR unter Verwendung von ADR- HCl wie in Abschnitt 7.1.1 für FMOC-Gly-ADR beschrieben gekoppelt. Die Ausbeute an FMOC-Tyr-Ala-Ala-Ala-ADR betrug 47 %; der Schmelzpunkt betrug 210º-212ºC. RF-Wert: 0,79 [Cloroform/Methanol 8:2 (Silziumdioxid)]. Elementaranalyse von FMOC-Tyr-Ala-Ala-Ala-ADR C&sub6;&sub0;H&sub6;&sub3;N&sub5;O&sub1;&sub8;.1,0 H&sub2;O: nominell: C 62,11; H 5,65; N 6,06; Ist-Werte: C 62,15; H 5,81; N 6,17.
  • Der FMOC-Bestandteil wurde wie oben beschrieben entfernt, um Tyr-Ala-Ala-Ala-ADR (13).HOAc zu erhalten. Ausbeute an ungeschütztem Endprodukt: 65 mg (76 %); Schmelzpunkt: 168º-170ºC. RF-Wert: 0,43 [Cloroform/Methanol 8:2 (Silziumdioxid)]. RF-Wert: 0,58 [Acetonitril/0,1 %ige wäßrige Trifluoressigsäure 1:1 (umgekehrte Phase)]. Elementaranalyse C&sub4;&sub7;H&sub5;&sub7;N&sub5;O&sub1;&sub8;.4,5 H&sub2;O: nominell: C 53,20; H 6,27; N 6,63; Ist-Werte: C 53,01; H 5,98; N 6,91.
    • 7.1.14 TYR-VAL-LEU-LYS-ADR (14) FMOC-(O-t-Butyl)Tyr-Val-benzylester
  • FMOC-(O-t-Butyl)Tyr (8,0 g, 17,4 mMol) wurde in 100 ml Tetrahydrofuran (THF) bei -10ºC unter Stickstoff gelöst. N-Methylmorpholin (1,9 ml, 17,4 mMol) wurde hinzugefügt, und 5 Minuten später wurde Isobutylchlorformat (2,25 ml, 17,4 mMol) zugesetzt. Nach weiteren fünfzehn Minuten wurden Val-benzylester-p-tosylat (6,6 g, 17,4 mMol) und N-Methylmorpholin (1,9 ml, 17,4 mMol) in 50 ml THF zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde unter Schütteln eine Stunde lang bei -10ºC, anschließend 18 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Lösungsmittel wurden durch Rotationsverdampfung entfernt ((und der Rückstand aufkonzentriert; Anm. d. Übers.)) zu einem Öl, das in Ethylacetat gelöst und anschließend mit gesättigter wäßriger Natriumbicarbonatlösung (2 x), 5 %iger Zitronensäure (3 x) und Wasser (2 x) extrahiert wurde. Die organische Schicht wurde über Natriumsulfat getrocknet, dann durch Rotationsverdampfung aufkonzentriert. Das zurückbleibende Öl wurde sodann in Chloroform gelöst und zweimal durch Silicagel geschickt, um unreagiertes FMOC-(O-t-butyl)Tyr zu entfernen. Die erste Elution erfolgte in einer 30-ml-Säule mit Chloroform und steigenden Mengen an Methanol (bis zu 20 %). Die produkthaltigen Fraktionen waren noch immer mit Ausgangsmaterial verunreinigt; daher wurde eine zweite Elution durch Silicagel in einem 2 x 3,5" Büchner-Trichter unter Einsatz von ausschließlich Methanol durchgeführt.
  • Die produkthaltigen Fraktionen wurden gesammelt und durch Rotationsverdampfung aufkonzentriert zu einem Feststoff. Eine Rekristallierung aus Ethanol ergab einen weißen Feststoff, der gefiltert und vakuumgetrocknet wurde. Ausbeute: 9,38 g (83 %); Schmelzpunkt 130º- 131,5ºC. RF-Wert: 0,89 [Cloroform/Methanol 9:1 (Silziumdioxid)]. RF- Wert: 0,93 [Chloroform/Essigsäure/Methanol 90:5:5 (Siliziumdioxid)]. Elementaranalyse von C&sub4;&sub0;H&sub4;&sub4;N&sub2;O&sub6;: nominell: C 74,05; H 6,84; Ist- Werte: C 73,90; H 6,90.
    • FMOC-(O-t-butyl)-Tyr-Val
  • FMOC-(O-t-butyl)Tyr-Val-benzylester (3,69 g, 5,70 mMol) wurde in 25 ml Methylenchlorid, dem 1 ml Essigsäure zugesetzt waren, gelöst. Diesem Gemisch wurde 1 g 5 %iger Pd-Katalysator auf aktiviertem Kohlenstoff hinzugefügt. 90 Minuten lang wurde durch das System Wasserstoff hindurchperlen lassen, dann wurden weitere 50 mg Katalysator, dem 1 ml Essigsäure zugesetzt waren, hinzugegeben. Das Hindurchperlenlassen wurde für 30 Minuten fortgesetzt. Der Katalysator wurde mittels Celite gefiltert, und das Filtrat wurde durch Rotationsverdampfung zu einem Feststoff aufkonzentriert. Dieser Feststoff wurde in Methanol gelöst und mit Wasser ausgefällt. Nach Filterung und Vakuumtrocknung wurde der Feststoff in Chloroform gelöst und mit Petrolether ausgefällt. Das Filtern und Vakuumtrocknen brachte reines Produkt hervor. Ausbeute: 3,19 g (100 %); Schmelzpunkt: 109º- 110ºC. RF-Wert: 0,69 [Chloroform/Essigsäure/Methanol 90:5:5 (Siliziumdioxid)]. RF-Wert: 0,49 [Methylenehlorid/Methanol 9:1 (Silziumdloxid)]. Elementaranalyse von C&sub3;&sub3;H&sub3;&sub8;N&sub2;O&sub6;: nominell: C 70,95; H 6,85; Ist-Werte: C 70,77; H 6,90.
    • FMOC-(O-t-butyl)Tyr-Val-hydroxy-bernsteinsäureimidester
  • FMOC-(O-t-butyl)Tyr-Val (1,0 g, 1,8 mMol) und N-Hydroxy-bernsteinsäurerimid (210 mg, 1,8 mMol) wurden unter Sticksoff bei 0ºC in 40 ml THF gelöst. Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) wurde als eine Methylenchloridlösung (0,5 M, 3,6 ml, 1,8 mMol) zugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde 2 Stunden lang unter Schütteln inkubiert, anschließend über Nacht bei 4ºC gelagert. Eine Dünnschichtchromatographie zeigte eine unvollständige Reaktion an, so daß zusätzliches DCC (0,45 mMol) zugesetzt wurden; das Reaktionsgemisch wurde einen Tag lang bei Raumtemperatur inkubiert. Das Dicyclohexylurea (DCU), das sich gebildet hatte, wurde gefiltert, und das Filtrat wurde zu einem Feststoff aufkonzentriert, der mit 4 %iger Natriumbicarbonatlösung trituriert wurde. Der Feststoff wurde gefiltert, mit Wasser gewaschen, getrocknet und anschließend aus Chloroform/Petrolether kristallisiert. Das Filtrieren und Lufttrocknen brachte einen weißen Feststoff hervor. Ausbeute: 761 mg (65 %). RF-Wert: 0,75 [Chloroform/Methanol 9:1 (Siliziumdioxid)]. Elementaranalyse von C&sub3;&sub7;H&sub4;&sub1;N&sub3;O&sub8;.0,5 H&sub2;O: nominell: C 66,85; H 6,37; Ist-Werte: C 67,04; H 6,85.
    • Leu-(FMOC)Lys
  • BOC-Leu-N-Bernsteinsäureimid (BOC-Leu-OSu) wurde nach dem Verfahren von Anderson u.a. [J. Organic Chem. 86: 1839 (1964)] hergestellt. Ausbeute: 4,89 g (50 %): Schmelzpunkt: 111º-112ºC (Lit. 116ºC). RF-Wert: 0,83 [Chloroform/Essigsäure/Methanol 85:5:10 (Siliziumdioxid)].
  • BOC-Leu-OSu (1,64 g, 5,0 mMol) und Epsilon-FMOC-Lys (1,84 g, 5,0 mMol) wurde in DMF gelöst und unter Schütteln drei Tage lang inkubiert. Eine Dünnschichtchromatographie zeigte, daß der Leu- Bestandteil aufgebraucht worden war, Jedoch unreagierter Lys- Bestandteil zurückgeblieben war. Es wurde zusätzliches BOC-Leu-OSu (0,82 g, 2,5 mMol) zugesetzt. Nach eintägigem Schütteln hatte der Lys- Bestandteil vollständig reagiert. Lösungsmitttel wurden durch Rotationsverdampfung entfernt; zurück blieb ein Öl, das mit verdünnter HCl (pH-Wert 2) trituriert und anschließend gekühlt wurde. Es bildete sich ein Feststoff, der gefiltert und dann vakuumgetrocknet wurde.
  • Das gewonnene rohe BOC-Leu-(FMOC)Lys wurde in 25 ml Trifluoressigsäure gelöst und eine Stunde lang geschüttelt. Die Trifluoressigsäure wurde durch Rotationsverdampfung entfernt; zurück blieb ein Öl, das über Nacht mit kaltem Ether behandelt wurde. Der entstandene Feststoff wurde gefiltert und lufttgetrocknet. Ausbeute: 1,73 g (58 % insgesamt von Boc-Leu-OSu). RF-Wert: 0,78 [n-Butanol/Essigsäure/Wasser 4:1:1 (Siliziumdioxid)]. RF-Wert: 0,28 [Chloroform/Essigsäure/Methanol 85:5:10 (Siliziumdioxid)]. Einige Verschmutzungen waren offensichilich. Dieses Material wurde sodann auf Amberlite CG- 400 (Cl-Form) mit Methanol/Wasser 1:1 eluiert, was eine teilweise Entfernung der Verunreinigungen bewirkte. Lösungsmittel wurden durch Rotationsverdampfung und Gefriertrocknung entfernt.
    • FMOC-(O-t-butyl)-Tyr-Val-Leu-(FMOC)Lys
  • Die freie Base von Leu-(FMOC)Lys wurde durch Aufbereitung des rohen Leu-(FMOC)Lys-HCl-Salzes (545 mg, 1,0 mMol) mit Diisopropylethylamin (174 ul, 1,0 mMol) in 60 ml THF über 10 Minuten unter Schütteln freigesetzt. Das Präzipitat, das sich bildete, wurde gefiltert, und FMOC-(O-t-Butyl)Tyr-Val-OSu (604 mg, 0,91 mMol) in THF wurde zugesetzt. Über die darauffolgenden fünf Tage wurden mehrere aliquoten Teile von Leu-(FMOC)Lys (freie Base) hinzugegeben, da die Dünnschichtchromatographie zeigte, daß dieser Bestandteil aufgebraucht worden war (an zusätzlichem Leu-(FMOC)Lys-HCl insgesamt hinzugefügt: 210 mg, 0,4 mMol). Lösungsmittel wurden durch Rotationsverdampfung auf 20 ml aufkonzentriert, dann wurde das Reaktionsgemisch in kalte 10 %ige Essigsäure gegossen. Es bildete sich ein weißer Niederschlag, der gefiltert, mit Wasser gewaschen, aus Isopropanol kristallisiert und vakuumgetrocknet wurde. Ausbeute: 500 mg (48 %); Schmelzpunkt: 218ºC (zerf.). RF-Wert: 0,83 [Chloroform/Essigsäure/Methanol 90:5:5 (Siliziumdioxid)]. Elementaranalyse von C&sub6;&sub0;H&sub7;&sub1;N&sub5;O&sub1;&sub0;.0,5 H&sub2;O: nominell: C 69,88; H 7,04; Ist-Werte: C 69,83; H 7,21.
    • FMOC-Tyr-Val-Leu-(FMOC)Lys
  • FMOC-(O-t-Butyl)Tyr-Val-Leu-(FMOC)Lys (400 mg, 0,39 mMol) wurde in 50 ml Trifluoressigsäure mit 2,2 ml Anisol gelöst und 30 Minuten lang geschüttelt. Nach der Entfernung von Lösungsmitteln durch Rotationsverdampfung und Trituration mit Ether bildete sich ein Feststoff. Dieser wurdegefiltert, mit Ether gewaschen und vakuumgetrocknet. Ausbeute: 375 mg (90 %); Schmelzpunkt: 200ºC (zerf.). RF- Wert: 0,42 [Chloroform/Essigsäure/Methanol 90:5:5 (Siliziumdioxid)]. Elementaranalyse von C&sub5;&sub6;H&sub6;&sub3;N&sub5;O&sub1;&sub0;.H&sub2;O: nominell: C 68,34; H 6,65; Ist-Werte: C 68,60; H 6,55.
    • FMOC-Tyr-Val-Leu-(FMOC)Lys-ADR
  • FMOC-Tyr-Val-Leu-(FMOC)Lys (96 mg, 0,10 mMol) und N- Hydroxy-Bernsteinsäureimid (13 mg, 0,11 mMol) wurden in 20 ml DMF gelöst und anschließend unter Stickstoff auf 0ºC gekühlt. 1-Ethyl-3-(3- dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDCI) (21 mg, 0,11 mMol) wurde hinzugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde 2 Stunden lang geschüttelt. ADR-HCl (59 mg, 0,10 mMol) und N-Methylmorpholin (12 ul, 0,10 mMol) wurden zu dem Reaktionsgemisch hinzugegeben, und das Schütteln wurde für weitere vier Tage bei Raumtemperatur fortgesetzt. Lösungsmittel wurden durch Rotationsverdampfung entfernt, zurück blieb ein roter Feststoff, der mit Wasser abgespült und anschließend in eine 2 x 10 Zoll Silicagel-Flash-Chromatographiesäule gegeben wurde. Die Elution erfolgte mit Chloroform/Methanol 95:5. Produktfraktionen wurden gesammelt, verdampft und vakuumgetrocknet. Ausbeute: 55 mg (36 %). RF-Wert: 0,33 [Chloroform/Essigsäure/Methanol 90:5:5 (Siliziumdioxid)]. RF-Wert: 0,20 [Chloroform/Methanol 95:5 (Siliziumdioxid)]. Elementaranalyse von C&sub8;&sub3;H&sub9;&sub0;N&sub6;O&sub2;&sub0;.2,0 H&sub2;O: nominell: C 65,26; H 6,20; Ist-Werte: C 5,37; H 6,18.
  • Die FMOC-Bestandteile wurde aus FMOC-Tyr-Val-Leu-(FMOC)Lys- ADR entfernt, um Tyr-Val-Leu-Lys-ADR (14) zu erhalten, wie in Abschnitt 6.1.1 für FMOC-Gly-ADR beschrieben, mit der Ausnahme jedoch, daß die Einwirkungszeit des Diethylamins 1,25 Stunden betrug (um eine vollständig ablaufende Reaktion zu erhalten, wie mittels Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie überwacht).
    • 7.1.15 VALYL-LEUCYL-LYSYL-VALYL-ADR (15) FMOC-Val-Leu-t-butylester
  • FMOC-Val (1,5 g, 4,42 mMol) und N-Hydroxy-Bernsteinsäureimid (525 mg, 4,56 mMol) wurden in DMF/CH&sub2;Cl&sub2; unter Stickstoff gelöst und auf -5ºC gekühlt. Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) (8,85 ml, 0,5 M in Methylenchlorid, 4,42 mMol) wurde zugesetzt, und das Gemisch wurde bei 0ºC eine Stunde lang, dann bei Raumtemperatur 1 Stunde lang geschüttelt. Das Präzipitat wurde gefiltert, und dem Filtrat wurde ein Gemisch aus Leu-t-Butylester-hydrochlorid (990 mg, 4,42 mMol) und N-Methylmorpholin (0,5 ml, 4,55 mMol) in DMF zugesetzt. Das Schütteln wurde für weitere 14 Stunden bei Raumtemperatur fortgesetzt; während dieser Zeit wurden weitere 1,0 Äquivalent N-Methylmorpholin hinzugegeben. Anschließend wurden Lösungsmittel durch Rotationsverdampfung entfernt, und zurück blieb ein Rohöl, welches in Ethylactet erneut gelöst und anschließend nacheinander mit 10 %iger Essigsäure, Wasser, gesättigter Natriumbicarbonatlösung und Wasser extrahiert wurde. Die organische Schicht wurde durch Rotationsverdampfung aufkonzentriert und durch Flash-Chromatographie weiter gereinigt (2 x 6 Zoll Silicagel-Säule, Petrolether/Ethylacetat 9:1). Geeignete Fraktionen wurden kombiniert und bis zur Trockenen aufkonzentriert. Ausbeute: 713 mg (32 %). Elementaranalyse von C&sub3;&sub0;H&sub4;&sub0;N&sub2;O&sub5;: nominell: C 70,48; H 7,93; N 5,51; Ist-Werte: C 70,72; H 7,98; N 5,43.
    • FMOC-Val-Leu
  • FMOC-Val-Leu-t-butylester (4,00 g, 7,86 mMol) wurde in 15 ml CH&sub2;Cl&sub2; unter N&sub2; gelöst und einer 2-stündigen Behandlung mit 15 ml Trifluoressigsäure und 0,5 ml Anisol unterzogen. Lösungsmittel wurden durch wiederholte Rotationsverdampfungsschritte aus Ethersuspensionen entfernt. Das Rohprodukt wurde mit Ether bei 0ºC trituriert, anschließend gefiltert und schließlich vakuumgetrocknet. Ausbeute: 3,04 g (86 %). Schmelzpunkt: 156º-159ºC. RF-Wert: 0,13 (Siliziumdioxid, Chloroform/Ethylacetat 3:1). Elementaranalyse von C&sub2;&sub6;H&sub3;&sub2;N&sub2;O&sub5;: nominell: C 69,01; H 7,12; N 6,19; Ist-Werte: C 68,75; H 7,22; N 6,10.
    • FMOC-Val-Leu-(FMOC)Lys
  • FMOC-Val-Leu (391 mg, 0,86 mMol) und N-Hydroxy-Bernsteinsäureimid (108 mg, 0,94 mMol) wurden in DMF/CH&sub2;Cl&sub2; unter Stickstoff gelöst und auf -5ºC gekühlt. Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) (1,73 ml, 0,5 M in Methylenchlorid, 0,87 mMol) wurde zugesetzt, und das Gemisch wurde bei 0ºC eine Stunde lang, dann bei Raumtemperatur 24 Stunden lang geschüttelt. Das Präzipitat wurde gefiltert, und dem Filtrat wurde eine Suspension aus Epsilon-FMOC-Lys (318 mg, 0,86 mMol) in 15 ml DMF zugesetzt. Das Schütteln wurde für weitere 7 Tage fortgesetzt. Anschließend wurden Lösungsmittel durch Rotationsverdampfung entfernt, und zurück blieb ein Rohprodukt, welches durch Flash-Chromatographie gereinigt wurde (2 x 7 Zoll Silicagel-Säule, Chloroform/Methanol/Essigsäure-Gradient 97:3:0, 1 bis 95:5:0,1). Geeignete Fraktionen wurden zusammengefaßt und bis zur Trockenen aufkonzentriert. Ausbeute: 410 mg (60 %). Schmelzpunkt: 195º-196ºC. Elementaranalyse von C&sub4;&sub7;H&sub5;&sub4;N&sub4;O&sub8;.0,25 H&sub2;O: nominell: C 69,91; H 6,80; N 6,94; Ist-Werte: C 69,90; H 7,01; N 6,95.
    • FMOC-Val-Leu-(FMOC)Lys-Val-ADR
  • FMOC-Val-Leu-(FMOC)Lys (100 mg, 0,11 mMol), N-Hydroxybenzotriazol (19 mg, 0,14 mMol) und N-Methylmorpholin (15 ul, 0,13 ml) wurden in trockenem, aminfreiem DMF bei 0ºC gelöst. Nach 10-minütigem Schütteln wurde Bis(2-oxo-3-oxozolidinyl)-phosphinsäure (BOP-Cl, 33 mg, 0,13 mMol) zugesetzt, und das Schütteln wurde für weitere 15 Minuten fortgesetzt. Sodann wurde eine Suspension aus Val-ADR (5) (71 mg, 0,10 mMol) und N-Methylmorpholin (25 ul, 0,23 mMol) in DMF zugegeben. Das Schütteln wurde für eine weitere Stunde bei 0ºC fortgesetzt. Eine zusätzliche Menge (0,07 mMol) an aktiviertem Peptid wurde nach demselben Verfahren dargestellt und dem Reaktionsgemisch bei 0ºC hinzugefügt. Nach einer Stunde wurde das Gemisch allmählich auf Raumtemperatur erwärmt und für weitere 15 Stunden geschüttelt. Nach Rotationsverdampfung wurde das Rohprodukt durch zweimalige Flash-Chromatographie gereinigt (1 x 6 Zoll Silicagel-Säule, CHCl&sub3;/Methanol 100:0 bis 97:3). Geeignete Fraktionen wurden zusammengefaßt und durch Rotationsverdampfung bis zur Trockenen aufkonzentriert. Ausbeute: 72 mg (55 %). RF-Wert: 0,61 (Siliziumdioxid, Chloroform/Methanol 9:1). Elementaranalyse von C&sub7;&sub9;H&sub8;&sub7;N&sub6;O&sub1;&sub9;.2,5 H&sub2;O: nominell: C 64,57; H 6,31; N 5,72; Ist-Werte: C 64,45; H 6,59; N 5,75.
    • Val-Leu-Lys-Val-ADR
  • Der FMOC-Bestandteil wurde wie für Gly-ADR (1) beschrieben aus FMOC-Val-Leu-(FMOC)Lys-Val-ADR entfernt, um Val-Leu-Lys-Val-ADR (15) zu erhalten. Die Ausbeute an (15).HOAc betrug 25 mg (40 %). Elementaranalyse von C&sub5;&sub3;H&sub6;&sub9;N&sub6;O&sub1;&sub5;.3,0 HOAc.5 H&sub2;O: nominell: C 54,49; H 7,05; N 6,46; Ist-Werte: C 54,54; H 7,08; N 6,76.
    • 7.1.16 VALYL-LEUCYL-LYSYL-ALANYL-ADR (16) FMOC-Val-Leu-(FMOC)Lys-Ala-ADR
  • FMOC-Val-Leu-(FMOC)Lys wurde an Ala-ADR nach demselben Verfahren wie dem zur Synthese von FMOC-Val-Leu-(FMOC)Lys-Val- ADR angewandten gekoppelt. Folgende Mengen an Reaktionsmitteln wurden eingesetzt: FMOC-Val-Leu(FMOC)Lys (133 mg, 0,15 mMol). N- Hydroxybenzotriazol (28 mg, 0,21 mMol), N-Methylmorpholin (17 ul, 0,15 mMol), BOP-Cl (38 mg, 0,15 mMol) und als eine Suspension in DMF: Ala-ADR-HOAc (2) (97 mg, 0,14 mMol) und N-Methylmorpholin (33 ul, 0,30 mMol). Die Ausbeute an FMOC-Val-Leu-(FMOC)Lys-Ala- ADR nach Flash-Chromatographie betrug 78 mg (39 %). RF-Wert: 0,27 (Siliziumdioxid, Chloroform/Methanol 94:6). Dieses Material wurde ohne weitere Charakterisierung von ihrem Schutzbestandteil befreit.
    • Val-Leu-Lys-Ala-ADR
  • Der FMOC-Bestandteil wurde wie für Gly-ADR (1) beschrieben aus FMOC-Val-Leu-(FMOC)Lys-Ala-ADR entfernt, was Val-Leu-Lys-Ala-ADR (16) hervorbrachte. Die Ausbeute an (16)HOAc betrug 22 mg (38 %). Elementaranalyse von C&sub4;&sub7;H&sub6;&sub6;N&sub6;O&sub1;&sub5;.2 HOAc.5,5 H&sub2;O: nominell: C 52,16; H 7,30; N 7,16; Ist-Werte: C 52,09; H 7,07; N 7,56.
    • 7.1.17 GLUTAMYL-(GAMMA-HYDRAZID)-ALPHA-ADR (17) FMOC-Glu-alpha-t-Butylester
  • Glutaminsäure-alpha-t-butylester (5,90 g, 29,0 mMol) wurde unter Schütteln einer Lösung aus Natriumbicarbonat (2,42 g, 29,0 mMol) in 120 ml Wasser/Aceton (1:1) bei Raumtemperatur hinzugegeben. Zu dieser homogenen Lösung wurde 9-Fluorenylmethyl-bernsteinsäureimidylcarbonat (9,77 g, 29,0 mMol) gegeben, und das Schütteln wurde für weitere 4 Stunden fortgesetzt. Flüchtige organische Stoffe wurden durch Rotationsverdampfung entfernt. Die resultierende wäßrige Suspension wurde extensiv mit Ether extrahiert. Zusammengefaßte Ether-Extrakte wurden über Natriumsulfat getrocknet, dann durch Rotationsverdampfung aufkonzentriert bis zur Trübe. Kristalle bildeten sich beim weiteren Kühlen. Diese wurden gefiltert und luftgetrocknet. Ausbeute: 10,6 g (86,5 %); Schmelzpunkt: 106º-108ºC. RF-Wert: 0,84 [Chloroform/Essigsäure/Methanol 90:5:5 (Siliziumdioxid)]. Elementaranalyse von C&sub2;&sub4;H&sub2;&sub7;NO&sub6;: nominell: C 67,75; H 6,40; Ist-Werte: C 67,59; H 6,45.
    • FMOC-Glu-alpha-t-Butylester-gamma-(N'-FMOC-hydrazid)
  • FMOC-Glutaminsäure-alpha-t-butylester (2,00 g, 4,7 mMol) und 2,4-Dinitrophenol (0,95 g, 5,1 mMol) wurden in 50 ml Ethylacetat unter einer Stickstoffatmosphäre gelöst. Nach dem Kühlen auf 0ºC wurde DCC (0,5 M, 9,5 ml, 4,75 mMol) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde unter Schütteln bei 0ºC eine Stunde lang inkubiert. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch allmählich auf Raumtemperatur erwärmt und 24 Stunden lang unter Schütteln inkubiert. Die Bildung von aktivem Ester wurde durch Dünnschichtchromatographie bestätigt. RF-Wert: 0,92 [Chloroform/Ethylacetat 3:1 (Siliziumdioxid)]. RF-Wert: 0,95 [Chloroform/Methanol 95:5 (Siliziumdioxid)]. Das DCU-Präzipitat, das sich gebildet hatte, wurde gefiltert, und das Filtrat wurde direkt zu 9-Fluorenylmethylcarbazat (1,20 g 4,72 mMol) gegeben. Nach 24- stündigem Schütteln wurde weiteres 9-Fluorenylmethylcarbazat (0,120 g, 0,47 mMol) hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde unter Schütteln für weitere 24 Stunden inkubiert, anschließend wurden die Lösungsmittel durch Rotationsverdampfung entfernt. Das resultierende Öl wurde in Ethylacetat gelöst und mit 5 %iger wäßriger Natriumcarbonatlösung extrahiert (bis sich keine weitere gelbe Farbe in der wäßrigen Schicht zeigte) und zweimal mit Wasser extrahiert. Das Rohprodukt wurde voradsorbiert auf Natriumsulfat und dann einer 1 x 9 Zoll Silicagel-(Siebgröße 230-400)-Flash-Chromatographiesäule beaufschlagt. Die Elution erfolgte in mehreren Stufen: (1) mit Petrolether/Ethylacetat 2:1; (2) mit Petrolether/Ethylacetat 1:1; und (3) mit Ethylacetat. Das Produkt wurde mit der Ethylacetat-Waschlösung eluiert. Geeignete Fraktionen wurden zusammengefaßt und bis zu einem Feststoff aufkonzentriert, dann erneut in Ethylacetat gelöst und mit Petrolether ausgefällt. Ein Feststoff wurde gefiltert und vakuumgetrocknet. Ausbeute: 2,43 g (80 %); Schmelzpunkt: 144,5º-147ºC. RF-Wert: 0,26 [Chloroform/Ethylacetat 3:1 (Siliziumdioxid)]. Elementaranalyse von C&sub3;&sub9;H&sub3;&sub9;N&sub3;O&sub6;: nominell: C 70,78; H 5,94; Ist-Werte: C 70,71; H 5,98.
    • FMOC-Glu-gamma-(N'-FMOC-hydrazid)
  • FMOC-Glutaminsäure-alpha-t-butylester-gamma-(N'-FMOC- hydrazid) (2,00 g, 3,0 mMol) wurde in 50 ml Trifluoressigsäure plus 2 ml Anisol gelöst und 75 Minuten lang bei Raumtemperatur geschüttelt. Lösungsmittel wurden durch Rotatationsverdampfung entfernt, und zurück blieb ein Öl, dem Ether zugesetzt wurde. Spuren von Trifluoressigsäure wurden durch weitere Rotationsverdampfung bis zur Trockenen entfernt. Dem gewonnenen Feststoff wurde Ether zugesetzt, und nach 2-stündigem Kühlen wurde der Feststoff gefiltert, mit Ether gewaschen und luftgetrocknet. Ausbeute: 1,65 g (91,0 %); Schmelzpunkt: 160º- 163ºC. RF-Wert: 0,52 [Chloroform/Essigsäure/Methanol 90:5:5 (Siliziumdioxid)]. Elementaranalyse von C&sub3;&sub5;H&sub3;&sub1;N&sub3;O&sub7;.0,5 H&sub2;O: nominell: C 68,39; H 5,24; Ist-Werte: C 68,90; H 5,35.
    • FMOC-Glu-gamma-(N'-FMOC-hydrazid)-alpha-3'-ADR
  • FMOC-Glu-gamma-(N'-FMOC-hydrazid) (200 mg, 0,33 mMol) wurde in 5 ml frisch mit Stickstoff durchperltem DMF gelöst und unter Stickstoff auf 0ºC gekühlt. Es wurde N-Methylmorpholin (36 ul, 0,33 mMol) hinzugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde 5 Minuten lang inkubiert. Anschließend wurde Isobutylchlorformat (42 ul, 0,33 mMol) zugesetzt. Eine Suspension von ADR-HCl (230 mg, 0,40 mMol) und N-Methylmorpholin (44 ul, 0,40 mMol) in DMF wurde tropfenweise nach einer Aktivierungszeit von 5 Minuten hinzugegeben. Das Gemisch wurde 1 Stunde lang bei 0ºC geschütttelt und dann über Nacht bei 4ºC unter Schütteln inkubiert. Lösungsmittel wurden durch Rotationsverdampfung entfernt. Der ölige Rückstand wurde in Chloroform/Methanol (95:5) gelöst, in eine 2 x 10 Zoll Silicagel-(Siebgröße 230-400)-Flash-Chromatographiesäule gegeben und mit demselben Lösungsmittelsystem eluiert. Geeignete Fraktionen wurden zusammengefaßt und rotationsverdampft, bis ein fester Rückstand übrig blieb. Der Rückstand wurde in Ether suspendiert, gefiltert und über Phosphorpentoxid (P&sub2;O&sub5;) bei 30ºC vakuumgetrocknet. Ausbeute: 245 mg (77 %); Schmelzpunkt: 180º-193ºC (zerf.). RF-Wert: 0,35 [Chloroform/Essigsäure/Methanol 90:5:5 (Siliziumdioxid)]. RF-Wert: 0,31 [Chloroform/Methanol 95:5:5 (Siliziumdioxid)]. Elementaranalyse von C&sub6;&sub2;H&sub5;&sub8;N&sub4;O&sub1;&sub7;.1 H&sub2;O: nominell: C 64,79; H 5,26; N 4,90; Ist- Werte: C 64,70; H 5,45; N 4,70.
  • Der FMOC-Bestandteil wurde wie in Abschnitt 7.1.1 beschrieben aus FMOC-Glu-(gamma-hydrazid)-alpha-ADR entfernt, um Glu(gamma-hydrazid)-alpha-ADR (17).2 HOAc zu erhalten. Die Ausbeute an (17) betrug 16 mg (89 %), der Schmelzpunkt betrug 188ºC (zerf.). Elementaranalyse von C&sub3;&sub6;H&sub4;&sub6;N&sub4;O&sub1;&sub7;.2,0 H&sub2;O: nominell: C 51,29; H 5,98; N 6,68; Ist-Werte: C 50,89; H 5,46; N 6,42.
    • 7.1.18 GLU-(ALPHA-HYDRAZID)-GAMMA-ADR (18) FMOC-Glu-gamma-t-Butylester-alpha-(N'-FMOC-hydrazid)
  • Diese Verbindung wurde nach einem Verfahren hergestellt, das mit dem identisch ist, das für die Darstellung von FMOC-Glu-alpha-t- Butylester-gamma-(N'-FMOC-hydrazid) angewandt worden war, unter Einsatz von im Handel erhältlichem FMOC-Glutaminsäure-gamma-t- butylester als Ausgangsmaterial. Ausbeute: 2,46 g (79,0 %); Schmelzpunkt: 141º-144ºC. RF-Wert: 0,56 [Chloroform/Ethylacetat 3:1 (Siliziumdioxid)]. Elementaranalyse von C&sub3;&sub5;H&sub3;&sub1;N&sub3;O&sub7;.0,5 H&sub2;O: nominell: C 68,91; H 5,24; Ist-Werte: C 68,71; H 5,39.
    • FMOC-Glu-alpha-(N'-FMOC-hydrazid)
  • Diese Verbindung wurde nach einem Verfahren hergestellt, das mit dem identisch ist, das für die Darstellung von FMOC-Glutaminsäuregamma-(N'-FMOC-hydrazid) angewandt worden war, unter Einsatz von FMOC-Glu-gamma-t-Butylester-alpha-(N'-FMOC-hydrazid) als Ausgangsmaterial. Ausbeute: 1,19 g (66,0 %); Schmelzpunkt: 174º- 177ºC. RF-Wert: 0,13 [Chloroform/Ethylacetat 3:1 (Sillziumdioxid)]. RF- Wert: 0,84 [Chloroform/Essigsäure/Methanol 90:5:5 (Siliziumdioxid)]. Elementaranalyse von C&sub3;&sub9;H&sub3;&sub9;N&sub3;O&sub7;.0,5 H&sub2;O: nominell: C 68,39; H 5,24; Ist-Werte: C 68,71; H 5,39.
    • FMOC-Glu-alpha-(N'-FMOC-hydrazid)-gamma-3'-ADR
  • FMOC-Glutaminsäure-alpha-(N'-FMOC-hydrazid) (222 mg, 0,361 mMol) wurde in 10 ml frisch mit Stickstoff durchperltem DMF gelöst und unter Stickstoff auf 0ºC gekühlt. N-Methylmorpholin (40 ul, 0,36 mMol) wurde hinzugefügt, und das Reaktionsgemisch wurde 5 Minuten lang inkubiert. Sodann wurde Isobutylchlorformat (47 ul, 0,36 mMol) zugesetzt. Eine Suspension aus ADR-HCl (188 mg, 0,324 mMol) und N-Methylmorpholin (38 ul, 0,35 mMol) in DMF wurde nach einer Aktivierungszeit von 4 Minuten hinzugegeben. Das Gemisch wurde 2 Stunden lang bei 0ºC geschüttelt. Zu diesem Zeitpunkt war die Reaktion nur ungefähr zu 50 % abgelaufen; daher wurde eine zweite Aktivierung der Glutamyl-Komponente unter Einsatz der nachgenannten Mengen in derselben Weise wie oben beschrieben durchgeführt: FMOC-Glutaminsäure-alpha-(N'-FMOC-hydrazid) (100 mg, 0,163 mMol), N-Methylmorpholin (18 ul, 0,163 mMol), Isobutylchlorformat (21 ul, 0,163 mMol). Zwei Stunden später war die Reaktion zu ca. 70 % abgelaufen, und eine weitere Aktivierung der Glutamyl- Komponente wurde unter Einsatz derselben Mengen wie bei der zweiten Aktivierung durchgeführt. Nach Ablauf von 2 Stunden schien die Reaktion zu 80 % abgelaufen zu sein, und die Lösungsmittel wurden durch Rotationsverdampfung entfernt. Der ölige Rückstand wurde in Chloroform/Methanol (95:5) gelöst, in eine 1 x 10 Zoll Silicagel- (Siebgröße 230-400)-Flash-Chromatographiesäule gegeben und mit demselben Lösungsmittelsystem eluiert. Geeignete Fraktionen wurden zusammengefaßt und rotationsverdampft, bis ein fester Rückstand zurückblieb. Der Rückstand wurde in Ether suspendiert, gefiltert und über Phosphorpentoxid bei 30ºC vakuumgetrocknet. Ausbeute: 271 mg (74 %). RF-Wert: 0,38 [Chloroform/Essigsäure/Methanol 90:5:5 (Siliziumdioxid)]. RF-Wert: 0,27 [Chloroform/Methanol 95:5 (Siliziumdioxid)]. Elementaranalyse von C&sub6;&sub2;H&sub5;&sub8;N&sub4;O&sub1;&sub7;.3 H&sub2;O: nominell: C 62,83; H 5,44; Ist-Werte: C 62,91; H 5,41.
  • Der FMOC-Bestandteil von FMOC-Glu-alpha-(N'-FMOC-Hydrazid)- gamma-ADR wurde wie in Abschnitt 6.1.1 beschrieben entfernt, um Glu-(alpha-Hydrazid)-gamma-ADR (18).2 HOAc zu erhalten. Ausbeute an (18): 55 mg (72 %). Elementaranalyse von C&sub3;&sub6;H&sub4;&sub6;N&sub4;O&sub1;&sub7;: nominell: C 53,59; H 5,75; Ist-Werte: C 53,47; H 5,84.
    • 7.1.19 HYDRAZID-SUCCINYL-ADRIAMYCIN (19)
  • Adriamycin (58 mg, 0,10 mMol) wurde in THF/DMF (20 ml/ 10 ml) suspendiert, und zu dieser Suspension wurde in THF (0,1 M) gelöstes Triethylamin (0,10 mMol) gegeben. Anschließend wurde Bernsteinsäure-Anhydrid (14 mg, 0,14 mMol) zugesetzt, und das Gemisch wurde unter Schütteln für insgesamt 65 Stunden inkubiert. Der Reaktionsablauf wurde mittels Dünnschichtchromatographie verfolgt [RF-Wert: Succinyl-Adriamycin-Produkt: 0,78; Adriamycin: 0,46 (n-Butanol/Essigsäure/Wasser 4:1:1 (Siliziumdioxid)], bis das ganze Adriamycin aufgebraucht war.
  • Succinyl-Adriamycin (30 mg, 0,05 mMol) wurde an wasserfreies Hydrazin wie folgt gekoppelt: Succinyl-ADR wurde in mit trockenem Stickstoff durchperltem DMF unter Stickstoffatmosphäre gelöst und auf 0ºC gekühlt. N-Methylmorpholin (1,0 Äquivalente) wurde hinzugefügt, und das Gemisch wurde 5 Minuten lang inkubiert. Isobutylchlorformat (1,0 Äquivalente) wurde zugesetzt, und das Gemisch wurde 3 bis 5 Minuten lang inkubiert. Wasserfreies Hydrazin (1,0 Äquivalente) wurde in DMF hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 1 bis 2 Stunden lang bei 0ºC, dann 12 bis 16 Stunden lang bei 4ºC inkubiert. Lösungsmittel wurden durch Rotationsverdampfung bei 35ºC entfernt. Eine Reinigung erfolgte durch Elution mittels einer präparativen C-18- Gegenphasen-Flash-Chromatographiesäule, zunächst mit Wasser, um nichtreagiertes Hydrazin zu entfernen, dann mit Methanol, um Produkt zu entfernen. Die Entfernung von Lösungsmitteln durch Rotationsverdampfung und Gefriertrocknung brachte einen roten Feststoff hervor. Ausbeute: 31 mg (94 %); Schmelzpunkt: 165ºC (zerf.). RF-Wert: 0,85 [n- Butanol/Essigsäure/Wasser 4:1:1 (Siliziumdioxid)]; RF-Wert: 0,71 [Acetonitril/1 %ige Trifluoressigsäure 1:1 (umgekehrte Phase)].
    • 7.1.20 HYDRAZINACETYL-ADR (20) Bis(FMOC)-Hydrazinessigsäure
  • Ethylhydrazinacetat-HCl (5 g, 32 mMol) und NaOH (2,8 g, 71 mMol) wurden in 200 ml Ethanol/Wasser (1:1) gelöst und unter Schütteln ca. 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Der pH- Wert wurde mit konzentrierter HCl auf pH 7,0 eingestellt, und die Lösungsmittel wurden durch Rotationsverdampfung bis zu einem Öl entfernt. Das Ergebnis war ein Dünnschichtchromatographie-homogenes Produkt, Hydrazinessigsäure. RF-Wert: 0,15 [n-Butanol/Essigsäure/Wasser 4:1:1 (Siliziumdioxid)].
  • Hydrazinessigsäure (4,1 g, 32 mMol) und Natriumbicarbonat (9,4 g, 112 mMol) wurden in THF/Wasser (1:1) mit 0ºC gelöst. 9-Fluorenylmethyl-chlorformat (20,7 g, 80 mMol) in THF wurde tropfenweise über einen 30- bis 60-minütigen Zeitraum hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde ruhenlassen, um sich allmählich auf Raumtemperatur zu erwärmen, und wurde sodann unter Schütteln bei dieser Temperatur fünfzehn Stunden lang inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde sodann einer Rotationsverdampfung unterzogen, um flüchtige Komponenten zu entfernen, anschließend wurde es einer Extraktion mit Ether unterzogen, um FMOC-Cl zu entfernen. Die wäßrige Schicht wurde mit 6 M HCl auf pH 3 eingestellt. Dies bewirkte die Ausfällung eines weißen Feststoffes, der gefiltert, mit Petrolether gewaschen und über P&sub2;O&sub5; bei 40ºC getrocknet wurde. Ausbeute: 15 g (88 %); Schmelzpunkt: 108º-109ºC (zerf.). RF-Wert: 0,73
  • [Chloroform/Essigsäure/Methanol 90:5:5 (Siliziumdioxid)]. Elementaranalyse von C&sub3;&sub2;H&sub2;&sub6;N&sub2;O&sub6;.1,5 H&sub2;O: nominell: C 68,43; H 5,22; N 5,01; Ist-Werte: C 68,71; H 5,17; N 5,77.
  • Bis(FMOC)-Hydrazinessigsäure wurde an ADR wie in Abschnitt 6.1.1 beschrieben gekoppelt, womit bis(FMOC)-Hydrazinacetyl-ADR gebildet wurde. Die Ausbeute an bis(FMOC)-Hydrazinacetyl-ADR betrug 89 %; der Schmelzpunkt betrug 159ºC (zerf.). RF-Wert: 0,58 [Chloroform/Essigsäure/Methanol 90:5:5 (Siliziumdioxid)]. Elementaranalyse von C&sub5;&sub9;H&sub5;&sub3;N&sub3;O&sub1;&sub6;: nominell: C 66,84; H 5,04; N 3,98; Ist-Werte: C 66,94; H 5,53; N 3,89.
  • Der FMOC-Bestandteil wurde wie oben beschrieben entfernt, um Hydrazinacetyl-ADR (20) zu erhalten. Ausbeute an ungeschütztem Endprodukt: 13 mg (75 %). Schmelzpunkt: 206ºC (zerf.). RF-Wert: 0,13 [Chloroform/Essigsäure/Methanol 90:5:5 (Siliziumdioxid)]. RF-Wert: 0,80 [n-Butanol/Essigsäure/Wasser 4:1:1 (Siliziumdioxid)].
    • 7.1.21 AMINOXYACETYL-ADR (21) FMOC-Aminoxyessigsäure
  • Carboxymethoxylamin-hemihydrochlorid (106 mg, 0,485 mMol) und N-Methylmorpholin (53 ul, 0,485 mMol) wurden in 200 ml Chloroform/Methanol (1:1) unter Stickstoff bei 0ºC gelöst. Eine Lösung aus 9- Fluorenylmethyl-bernsteinsäureimidylcarbonat (325 mg, 0,97 mMol) in Chloroform wurde tropfenweise über einen Zeitraum von 30 Minuten hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur erwärmt und unter Schütteln 15 bis 20 Stunden lang inkubiert. Sodann wurde das Reaktionsgemisch auf 55ºC erwärmt und 3 Stunden lang inkubiert. Lösungsmittel wurden durch Rotationsverdampfung entfernt, und der feste Rückstand wurde in Ethylacetat gelöst und mit 0,1 HCl (5 x) und Wasser (4 x) extrahiert. Die organische Schicht wurde über Natriumsulfat getrocknet und durch Rotationsverdampfung zu einem festen Rückstand aufkonzentriert, der mit Ether gewaschen und anschließend über P&sub2;O&sub5; bei 40ºC vakuumgetrocknet wurde. Ausbeute: 274 mg (90 %); Schmelzpunkt: 190ºC (zerf.). RF-Wert: 0,58 [Chloroform/Essigsäure/Methanol 90:5:5 (Siliziumdioxid)].
  • FMOC-Aminoxyessigsäure wurde an ADR gekoppelt wie in Abschnitt 6.1.1 beschrieben, womit FMOC-Aminoacetyl-ADR gebildet wurde. Ausbeute: 42 %; Schmelzpunkt: 168º-170,5ºC. RF-Wert: 0,38 [Chloroform/Essigsäure/Methanol 90:5:5 (Siliziumdioxid)]. Elementaranalyse von C&sub4;&sub4;H&sub4;&sub2;N&sub2;O&sub1;&sub5;: nominell: C 61,68; H 5,18; N 3,28; Ist- Werte: C 61,92; H 5,56; N 3,11.
  • Der FMOC-Bestandteil wurde wie beschrieben entfernt, um Aminoacetyl-ADR (21).HOAc zu erhalten. Die Ausbeute betrug 6 mg (25 %); der Schmelzpunkt betrug 192ºC (zerf.). RF-Wert: 0,12 [Chloroform/Essigsäure/Methanol 90:5:5 (Siliziumdioxid)]. RF-Wert: 0,82 [n-Butanol/Essigsäure/Wasser 4:1:1 (Siliziumdioxid)]. Elementaranalyse von C&sub3;&sub1;H&sub3;&sub6;N&sub2;O&sub1;&sub5;: nominell: C 54,30; H 5,50; N 4,10; Ist- Werte: C 54,07; H 5,65; N 4,77.
    • 7.1.22 HYDRAZINBENZOYL-ADR (22) Bis(FMOC)-Hydrazinbenzoesäure
  • Hydrazinbenzoesäure (50 g, 0,33 mMol) und Natriumbicarbonat (983 mg, 0,99 mMol) wurden in THF/Wasser (1:1) bei 0ºC gelöst. 9- Fluorenylmethyl-chlorformat (213 mg, 0,83 mMol) in THF wurde tropfenweise über einen 30- bis 60-minütigen Zeitraum hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde ruhenlassen, um sich allmählich auf Raumtemperatur zu erwärmen, und wurde sodann unter Schütteln bei dieser Temperatur fünfzehn Stunden lang inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde sodann einer Rotationsverdampfung unterzogen, um flüchtige Komponenten zu entfernen, anschließend wurde es einer Extraktion mit Ether unterzogen, um 9-Fluorenylmethyl-chlorformat zu entfernen. Die wäßrige Schicht wurde mit 6 M HCl auf pH 3 eingestellt. Dies bewirkte die Ausfällung eines weißen Feststoffes, der gefiltert, mit Petrolether gewaschen und über P&sub2;O&sub5; bei 40ºC getrocknet wurde. Ausbeute: 114 mg (58 %); Schmelzpunkt: 146º-148ºC (zerf.). RF-Wert: 0,71 [Ethylacetat/Petrolether 1:1 (Siliziumdioxid)]. Elementaranalyse von C&sub3;&sub7;H&sub2;&sub8;N&sub2;O&sub6;: nominell: C 74,47; H 4,73; N 4,72; Ist-Werte: C 74,60; H 4,77; N 4,66.
  • Bis(FMOC)-Hydrazinbenzoesäure wurde an ADR wie in Abschnitt 7.1.1 beschrieben gekoppelt. Die Ausbeute an bis(FMOC)-Hydrazinbenzoyl-ADR betrug 86 %; der Schmelzpunkt betrug 174º-176ºC. RF-Wert: 0,65 [Chloroform/Essigsäure/Methanol 90:5:5 (Siliziumdioxid)]. Elementaranalyse von C&sub6;&sub4;H&sub5;&sub5;N&sub3;O&sub1;&sub6;: nominell: C 67,42; H 5,04; N 3,70; Ist-Werte: C 67,65; H 5,63; N 3,68.
  • Der FMOC-Bestandteil wurde wie oben beschrieben entfernt, um Hydrazinbenzoyl-ADR (22).2 HOAc zu erhalten, mit der einzigen Ausnahme, daß die Entwirkungszeit von Diethylamin 1,5 Stunden betrug. Die Bildung von Aglycon in geringem Umfang wurde festgestellt, jedoch erwies sich die Extraktion wie oben beschrieben als erfolgreich bei der Entfernung des gebildeten Aglycons. Ausbeute an (22): 13 mg (36 %).
    • 7.1.23 HYDRAZINACETYL-TYR-ALA-ALA-ALA-ADR (23)
  • Bis(FMOC)-Hydrazinessigsäure, dargestellt wie in Abschnitt 7.1.12 beschrieben, wurde an Tyr-Ala-Ala-Ala-ADR (13) wie für Gly-ADR in Abschnitt 7.1.1 beschrieben gekoppelt. Ausbeute: 58 %; Schmelzpunkt: 188ºC (zerf.). RF-Wert: 0,10 [Chloroform/Essigsäure/Methanol 90:5:5 (Siliziumdioxid)]. RF-Wert: 0,86 [n-Butanol/Essigsäure/Wasser 4:1:1 (Siliziumdioxid)]. Elementaranalyse von C&sub7;&sub7;H&sub7;&sub7;N&sub7;O&sub2;&sub1;.2,5 H&sub2;O: nominell: C 63,14; H 4,47; N 6,72; Ist-Werte: C 63,26; H 5,89; N 6,46.
  • Der FMOC-Bestandteil wurde wie oben beschrieben entfernt, um Hydrazinacetyl-Tyr-Ala-Ala-Ala-ADR (23).2 HOAc zu erhalten. Die Ausbeute an (15) betrug 12 mg (80 %). Schmelzpunkt: 200ºC (zerf.). RF- Wert: 0,50 [n-Butanol/Essigsäure/Wasser 4:1:1 (Siliziumdioxid)]. RF- Wert: 0,44 [Methylenchlorid/Methanol/Wasser 100:20:1 (Siliziumdioxid)].
  • ((Abschnitt 7.2 im Original gestrichen; Anm. d. Übers.))
    • 7.3 14-THIOETHER-DNR-ABKÖMMLING 7.3.1 DNR-14-S-(3-PROPIONYLHYDRAZID) (290)
  • 14-Brom-DNR (50 mg) wurde mit K&sub2;CO&sub3; (12 mg) in 10 ml trockenem Methanol unter Stickstoff bei 0ºC gemischt. 2-Mercaptopropionylhydrazid (14 mg), gelöst in 5 ml Methanol, wurde hinzugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde unter Schütteln 40 Minuten lang bei 0ºC inkubiert. Lösungsmittel wurden mittels eines Stickstoffstroms entfernt, was einen unreinen Feststoff zurückließ, der sich bei der Dünnschichtchromatographie als ein Gemisch aus 2 Bestandteilen herausstellte, von denen angenommen wurde, daß es sich um das S- Alkylierungsprodukt und das N-Alkylierungsprodukt handelte.
  • Um die unerwünschte N-Substitution zu umgehen, könnte N- FMOC-3-Mercapto-propionylhydrazid synthetisiert werden. Dies sollte nach Entfernen der Schutzgruppe nur den Thioether hervorbringen.
    • 8. DARSTELLUNG VON ANTIKÖRPER-KONJUGATEN 8.1 ADR-ADH-ANTIKÖRPER-KONJUGAT
  • In einer Versuchsreihe wurden ADR-ADH-Antikörper-Konjugate wie folgt hergestellt:
  • Ein monoklonaler Antikörper von der Maus, bezeichnet mit B72.3, mit Spezifität für ein Antigen des humanen Adenokarzinoms (Colcher u.a., 1981, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 78: 3199-3203), bezogen von Celltech, wurde eingesetzt.
  • Der Oligosaccharidbestandteil des Antikörpers B72.3 wurde durch Inkubation im Dunkeln mit 10 mM NaIO&sub4; in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (0,15 M NaCl, 0,01 M PO&sub4;&supmin;² pH 6,0) für eine Stunde auf Eis oxidiert. Überschüssiges NaIO&sub4; wurde aus dem oxidierten Antikörper durch Dialyse gegen phosphatgepufferte Kochsalzlösung entfernt. Der geänderte Antikörper (1,2 mg/ml) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung wurde sodann mit ADR-ADH im 30fachem Überschuß inkubiert. Nichtreagiertes ADR-ADH wurde durch Elution des Reaktionsgemischs mittels einer Dowex 50W-Säule mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung, pH 7,5, entfernt. Die gewonnenen ADR-ADH-B72.3-Konjugate wurden durch Hochleistungs-Gelfiltrations-Flüssigkeitschromatographie in einer Biosil TSK 250-Säule mit einer mobilen Kationentensid- Phase, Cetyltrimethyl-ammoniumbromit (0,5 %ige CTAB, 0,05 M NaOAc, 0,1 M NaCl), analysiert. Nach Elution durch die Dowex 50W- Säule (2 ml Harz/100 mg Konjugat, pH 7) war kein freies ADR-ADH festzustellen. Die entgültige Antikörperkonzentration des Konjugats betrug 2,4 mg/ml, und das Konjugat enthielt 1,6 Mol ADR-ADH pro Mol B72.3.
    • 8.2 [³H]-Me&sub2;-ADR-ADH-ANTIKÖRPER-KONJUGAT
  • [³H]-Me&sub2;-ADR-ADH wurde an einen oxidierten Bestandteil von B7.23 gekoppelt, um ein stark wasserlösliches Konjugat mit einer spezifischen Aktivität von 77.000 cpm/500 ug und mit 3,5 Mol [³H]- Me&sub2;-ADR/Mol Antikörper zu bilden.
    • 8.3 IDARUBICIN-ADH-ANTIKÖRPER-KONJUGAT
  • Idarubicin-ADH wurde an einen oxidierten Bestandteil von B72.3 gekoppelt, um ein stark wasserlösliches Konjugat zu bilden, das 3,8 Mol IDA/Mol Antikörper enthält.
    • 8.4 ADR-PENTAGLUTAMYLHYDRAZID-ANTIKÖRPER-KONJUGAT
  • ADR-Pentaglutamylhydrazid wurde an einen oxidierten Kohlenhydratbestandteil von R9,75 gekoppelt, um ein stark wasserlösliches Konjugat herzustellen, das 6 Mol ADR/Mol Antikörper enthält.
    • 8.5 ADR-GLU-(GAMMA-HYDRAZID) (ADR-E-GAMMA- Hy-ANTIKÖRPER-KONJUGAT
  • ADR-E-gamma-Hy wurde durch Inkubation bei 20fachem Überschuß in 0,05 M MOPS-, MES- oder Bicarbonatpuffer selektiv an den oxidierten Kohlenhydratbestandteil von Antikörper B72.3 oder S4 gekoppelt, um ADR-Gly-gamma-Hydrazid-Antikörper-Konjugat (2,5 Mol ADR/Mol Antikörper) zu bilden.
    • 8.6 ADR-GW-(ALPHA-HYDRAZID)-(ADR-E-ALPHA- Hy)-ANTIKÖRPER-KONJUGAT
  • ADR-E-alpha-Hy wurde durch Inkubation bei 20fachem Überschuß in MOPS (pH 6,0) selektiv an den oxidierten Kohlenhydratbestandteil von Antikörper B72.3 oder S4 gekoppelt, um ADR-Gly-alpha- Hydrazid-Antikörper-Konjugat mit leichter Aggregat-Bildung (2 Mol ADR/Mol Antikörper) herzustellen.
    • 9. THERAPEUTISCHE WIRKUNGEN VON ORTSSELEKTIVEN ADRIAMYCIN-ADIPINSÄURE-DIHYDRAZID- ANTIKÖRPER-KONJUGAT 9.1 THERAPEUTISCHE WIRKUNGEN GEGEN KOLON- ADENOKARZINOM DES MENSCHEN
  • Die nachgenannte Versuchsreihe zeigt, daß ein ortsselektives Adriamycin-adipinsäure-dihydrazid (ADR-ADH)- und Adriamycin-alpha- glutamyl-gamma-hydrazid (ADR-E-gamma-Hy)-Antitumor-Antikörper- Konjugat, hergestellt entsprechend der vorliegenden Erfindung, bedeutende therapeutische Wirkungen auf Adenokarzinom-Tumorxenotransplantate ausübt, wenn in vivo verabreicht. ADR-ADH alleine oder ortsselektiv an einen bedeutungslosen Antikörper gekoppelt bewirkt keinen Unterschied in dem Wachstum von Tumorxenotransplantaten im Vergleich mit unbehandelten Tieren.
  • Bei der Tumorzellinie, die bei diesen Versuchen eingesetzt wurde, handelte es sich um einen humanen Kolon-Adenokarzinom-Tumor BL/CX-3, bezogen von Bodgen Laboratories (Worchester, MA). Diese Zellinie war in Nacktmäusen aus einem frischen chirurgischen Explantat einer Metastase angelegt worden, das von einem 50jährigen Patienten männlichen Geschlechts des St. Joseph's Hospital (Houston, TX) stammte. Erste Versuche (Ergebnisse nicht angegeben) ergaben, daß die BL/CX-3-Zellinie empfindlich auf ADR reagiert (Versuch mit subrenaler Kapsel) und das TAG-72-Antigen exprimiert, das von dem von Colcher u.a. (1982, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 78: 3199-3203) beschriebenen monoklonalen Antikörper B72.3 speziell erkannt wird.
  • In einem Versuch wurde ein tumorspezifisches ADR-ADH-Antikörper-Konjugat unter Verwendung von Antikörper B72.3 (bezogen von Celltech) wie in Abschnitt 8 beschrieben hergestellt ("ADR-ADH-B72.3" bezeichnet). Außerdem wurde ein bedeutungsloses ADR-ADH-Antikörper-Konjugat unter Verwendung von Antikörper R9.75, der Spezifität für das "Major Histocompatibility"-Antigen der Klasse I von Brown Norway-Ratten besitzt (siehe Smilek u.a., 1980. J. Exp. Med. 151: 1139), hergestellt, wie in Abschnitt 8 beschrieben.
  • Die therapeutischen Wirkungen in vivo wurden in weiblichen Nacktmäusen (NIH Swiss Webster, Taconic Farms, Germantown, NY), die ein Gewicht von durchschnittlich 28 g aufwiesen und denen am Tage 0 ca. 3 mm³ von BL/CX3 subkutan injiziert wurde, beim vierten Serienmausdurchgang bestimmt.
  • Achzig tumortragende Mäuse wurden in 8 Gruppen mit jeweils 10 Mäusen aufgeteilt. Vom 7. Tage an, als die Tumore meßbar wurden, erhielten die Tiere intravenös (über die Schwanzvene) therapeutische Wirkstoffe injiziert und zwar am 7., 14., 21., 28. und 35. Tage, entsprechend dem nachgenannten Behandlungsprotokoll:
  • Gruppe 1: (Kontrollgruppe): keine Behandlung
  • Gruppe 2: 0,92 mg gereinigter B72.3-Antikörper (tumorspezifischer Antikörper)
  • Gruppe 3: 1,0 mg gereinigter R9.75-Antikörper (bedeutungsloser Antikörper)
  • Gruppe 4: 6 ug ADR-ADH-B72.3 (0,96 mg) (tumorspezifisches ADR-ADH-Konjugat)
  • Gruppe 5: 10 ug ADR-ADH-R9.75 (0,99 mg) (bedeutungsloses ADR-ADH-Konjugat)
  • Gruppe 6: 200 ug ADR-ADH
  • Gruppe 7: 200 ug ADR [ca. 7 mg/kg Körpergewicht; maximal zulässige Dosis pro Tier];
  • und
  • Gruppe 8: 200 ug ADR plus 0,92 mg B72.3 (Gemisch aus spezifischem Antikörper und Arzneimittel)
  • Alle 2 oder 3 Tage ab dem 7. Tage bis zum 76. Tage wurden die Tiere gewogen und die Tumore vermessen (in Länge und Breite). Die Ergebnisse sind in Abbildung 1 (A-F) graphisch dargestellt.
  • Wie in Abbildung 1 (A-F) gezeigt, war das Tumorwachstum bei den Tieren, die mit ortsselektivem ADR-ADH-(B72.3)-Konjugat behandelt worden waren (Gruppe 4, Abb. 1C), erheblich gehemmt im Vergleich mit der unbehandelten Gruppe (P 0,05 am 12. bis 40. Tage). Die tumorwachstumshemmende Wirkung scheint der zu entsprechen, die bei Tieren festgestellt wurde, die über ca. 35 Tage 200 ug von ADR alleine empfangen hatten, d.h. ca. die maximal zulässige Dosis von ADR. Die Hemmung des Tumorwachstums dauert über den 35. Tag an, dem Ende der Behandlung.
  • Wie in dieser Abbildung gezeigt wurde bis zum 21. Tage nach der Injektion von Tumor-Xenotransplantaten eine statistisch bedeutende Hemmung des Tumorwachstums bei solchen Tieren festgestellt, die mit ortsselektivem ADR-ADH-(B72.3)-Konjugat behandelt worden waren (Gruppe 4) - im Vergleich zu unbehandelten Tieren (Gruppe 1). Demgegenüber zeigten Tiere, die mit Konjugat aus ADR-ADH und bedeutungslosem Antikörper behandelt worden waren (Gruppe 5), keinen Unterschied zu der unbehandelten Gruppe.
  • Eine statistisch gesehen bedeutende Hemmung des Tumorwachstums wurde ebenso bei solchen Tieren beobachtet, die mit ADR in der maximal zulässigen Dosis entweder alleine (Gruppe 7) oder gemischt mit einem für diesen Tumor spezifischen Antikörper (Gruppe 8) behandelt worden waren. Jedoch zeigte das Tumorwachstum bei Tieren, die mit ADR-ADH in einer äquivalenten Dosis (Gruppe 6, 200 ug) behandelt worden waren, keinen bedeutenden Unterschied gegenüber dem Wachstum, das bei unbehandelten Tieren festgestellt wurde.
  • In einem anderen Versuch wurde tumorspezifisches ADR-ADH- B72.3-Antikörper-Konjugat wie oben beschrieben hergestellt. Ebenso wurde tumorspezifisches ADR-E-gamma-Hy-B72.3-Antikörper-Konjugat wie oben beschrieben hergestellt. Außerdem wurden ein bedeutungsloses ADR-ADH-Antikörper-Konjugat sowie ein bedeutungsloses ADR-E- gamma-Hy-Antikörper-Konjugat unter Verwendung von S4-Antikörper, einem Antikörper von der Maus mit Spezifität für Nierenzellenkarzinom (bezogen von Lloyd Old, Memorial Sloan-Kettering, New York), hergestellt wie oben beschrieben.
  • Einhundertundzehn weibliche Nackmäuse (nu/nu Swiss, Taconic Farms Germantown, NY) wurden auf 11 Gruppen mit Jeweils 10 Tieren aufteilt. Das durchschnitiliche Gewicht der Mäuse betrug 23,6 g. Am Tage 0 wurde allen Tieren ausgenommen der Tiere in Gruppe 13 mm³ BL/CX3 des vierten Seriendurchlaufs injiziert. Ab dem 7. Tage, als die Tumore meßbar wurden, wurde den Tieren intravenös (über die Schwanzvene) therapeutische Wirkstoffe injiziert, und zwar am 7., 14., 21., 20. und 35. Tage, entsprechend dem folgenden Protokoll:
  • Gruppe 1: (Wachstumskontrolle) nicht-tumortragend; keine Behandlung
  • Gruppe 2: (Kontrollgruppe) keine Behandlung
  • Gruppe 3: 1,0 mg gereinigter B72.3-Antikörper (tumorspezifischer Antikörper)
  • Gruppe 4: 190 ug ADR [ca. maximal zulässige Dosis pro Tier]
  • Gruppe 5: 12,4 ug ADR
  • Gruppe 6: 190 ug ADR plus 1,0 mg B72.3 [Gemisch aus spezifischem Antikörper und Arzneimittel (max. zulässige Dosis)]
  • Gruppe 7: 12,4 ug ADR plus 1,0 mg B72.3 [Gemisch aus spezifischem Antikörper und Arzneimittel (niedrige Dosis)]
  • Gruppe 8: 12,4 ug ADR-ADH-B72.3 (1,06 mg) (tumorspezifisches ADR-ADH-Konjugat)
  • Gruppe 9: 12,6 ug ADR-E-gamma-Hy-B72,3 (1,03 mg) (tumorspezifisches ADE-E-gamma-Hy-Konjugat)
  • Gruppe 10: 11,5 ug ADR-ADH-S&sub4; (0,46 mg) (bedeutungsloses ADR-ADH-Konjugat)
  • Gruppe 11: ca. 10 ug ADR-E-gamma-Hy-S&sub4; (0,25 mg) (bedeutungsloses ADR-E-gamma-Hy-Konjugat)
  • Alle 2 bis 4 Tage von dem 7. Tage an wurden die Tumore vermessen. Die Ergebnisse sind in Abbildung 2 (A-H) graphisch dargestellt.
  • Wie in Abbildung 2 (E und F) gezeigt, konnte eine statistisch bedeutsame Hemmung des Tumorwachstums bei Tieren, die vom 10. bis zum 24. Tage mit dem ortsselektiven ADR-ADH-B72.3-Konjugat behandelt worden waren (Gruppe 8, Abb. 2 E) sowie bei Tieren, die vom 10. bis zum 17. Tage mit ortsselektivem ADR-E-gamma-Hy-B72.3- Konjugat behandelt worden waren (Gruppe 9, Abb. 2F), festgestellt werden im Vergleich zu den Ergebnissen, die bei unbehandelten Tieren (Gruppe 2, Abb. 2 A-H) festgestellt worden waren. Diese Ergebnisse bestätigen und erweitern somit die Ergebnisse, die in dem alleine beschriebenen Versuch erzielt worden waren. Demgegenüber zeigte sich bei Tieren, die mit bedeutungslosem Antikörperkonjugat-Antikörper behandelt worden waren (Gruppe 10, Abb. 2G und Gruppe 11, Abb. 2H), kein Unterschied zur unbehandelten Gruppe.
  • Tiere, die mit Arzneimittel alleine behandelt worden waren, ADR in der maximal zulässigen Dosis (Gruppe 4, Abb. 2 A-H), zeigten eine bedeutende Hemmung des Tumorwachstums ab dem 10. bis zum 40. Tage verglichen mit unbehandelten Tieren. Das Tumorwachstum wurde ebenso gehemmt bei Tieren, die mit einem Gemisch aus tumorspezifischem Antikörper und ADR in der maximal zulässigen Dosis behandelt worden waren (Gruppe 6, Abb. 2C). Keine größere Hemmung wurde festgestellt bei Einsatz des Gemischs im Vergleich zu einem Einsatz von Arzneimittel alleine in derselben Dosis. Jedoch, und dies ist bedeutsam, wurde keine bedeutende Hemmung bei Tieren festgestellt, die mit ADR in einer Dosis, die der Dosis entspricht, in der ADR an Antikörper in Konjugaten gekoppelt ist, entweder alleine (Gruppe 5, Abb. 28) oder in einem Gemisch mit tumorspezifischem Antikörper (Gruppe 7, Abb. 2D) behandelt worden waren.
    • 9.2 THERAPEUTISCHE WIRKUNGEN GEGEN LYMPHOM- XENOTRANSPLANTATE
  • Dieser Versuch zeigt, daß ein ortsselektives ADR-ADH-Tumor- Antikörper-Konjugat therapeutische tumorwachstumshemmende Wirkungen in bezug auf Lymphom-Xenotransplantate ausübt, wenn in vivo verabreicht.
  • Ein tumorspeziftsches ADR-ADH-Antikörper-Konjugat wurde wie oben beschrieben unter Verwendung von R9.75-Antikörper mit Spezifität für eine Lymphom-Zellinie der Brown Norway (BN)-Ratte hergestellt ("ADR-ADH-R9.75" bezeichnet). Ebenso wurde ein bedeutungsloses ADR-ADH-Antikörper-Konjugat wie oben beschrieben hergestellt.
  • Siebzig weibliche Nacktmäuse (nu/nu Swiss; Taconic Farms, Germantown, NY) mit einem Gewicht von 20 g bis 24 g wurden auf 7 Gruppen 10 Mäusen aufgeteilt. Am Tage 0 wurde allen Tieren bis auf die Tiere der Gruppe 1 (nichtbehandelt, Wachstumskontrollgruppe) 1 x 10&sup6; Brown Norway (BN)-Lymphomzellen injiziert. Am 1., 5., 9., 13. und 17. Tage erhielten alle Mäuse-Versuchsgruppen wie im folgenden angegeben therapeutische Mittel intravenöse injiziert (über die Schwanzvene):
  • Gruppe 2: tumortragend, keine Behandlung
  • Gruppe 3: 1,0 mg gereinigter B9,75-Antikörper (tumorspezifischer Antikörper alleine)
  • Gruppe 4: 14,3 ug ADR-ADH
  • Gruppe 5: 14,3 ug ADR-ADH + 1,0 mg R9.75-Antikörper (Gemisch)
  • Gruppe 6: ADR-ADH-R9.75-Konjugat (11,2 ug ADR-ADH gekoppelt an 1,0 mg R.75; 2.3 Mol ADR/Antikörper) (spezifisches Konjugat)
  • Gruppe 7: bedeutungsloses ADR-ADH-Antikörper-Konjugat (5,8 ug ADR-ADH gekoppelt an 1,0 mg Antikörper) (bedeutungsloses Konjugat)
  • Jeweils ein über den anderen Tag während der gesamten Versuchsdauer wurden die Tiere gewogen und die Tumore vermessen (in Länge und Breite). Die Ergebnisse (Mittelwerte SEM) sind in Abbildung 3 (A-B) graphisch dargestellt.
  • Das durchschnitiliche Tumorwachstum bei unbehandelten Kontrolltieren (Gruppe 2) und bei mit tumorspezifischem ADR-ADH- Antikörper-Konjugat (Gruppe 6) und mit bedeutungslosem ADR-ADH- Antikörper-Konjugat (Gruppe 7) behandelten Tieren ist in Abbildung 3A angegeben. Das durchschnittliche Tumorwachstum bei Tieren, die allein mit ADR-ADH (Gruppe 4), mit einem Gemisch aus tumorspezifischem Antikörper und ADR-ADH (Gruppe 5) und mit tumorspezifischem Anttikörper alleine (Gruppe 3) behandelt worden waren, ist in Abbildung 3B angegeben.
  • Wie in Abbildung 3A gezeigt, wurde das Tumorwachstum bei Tieren, die mit ortsselektivem tumorspezifischem ADR-ADH-Konjugat (Gruppe 6) behandelt worden waren, sehr stark gehemmt (p = 0,001) im Vergleich mit unbehandelten tumortragenden Tieren (Gruppe 2). Demgegenüber unterschied sich das Tumorwachstum bei Tieren, die allein mit Antikörper (Gruppe 3), ADR-ADH (Gruppe 4) oder bedeutungslosem ADR-ADH-Anikörper-Konjugat (Gruppe 7) behandelt worden waren, nicht wesenilich von dem unbehandelter Tiere (Abbildungen 3A-B). Das Tumorwachstum bei solchen Tieren, die ein Gemisch aus ADR-ADH und tumorspezifischem Antikörper empfangen hatten (Gruppe 5), war ebenso stark gehemmt im Vergleich mit unbehandelten Tieren (p = 0,01).
  • Die hier offenbarten spezifischen Verkörperungen sollen die in dieser Beschreibung und den Ansprüchen beschriebene Erfindung nicht in ihrem Umfang begrenzen, sie sollen vielmehr die verschiedenen Aspekte dieser Erfindung illustrieren. Etwaige äquivalente Beispiele sollen als in dem Umfang dieser Erfindung enthalten erachtet werden. In der Tat werden sich dem Fachmann aus der vorhergehenden Beschreibung verschiedene Änderungen dieser Erfindung zusätzlich zu den hier gezeigten und beschriebenen erschließen. Derartige Änderungen sind ebenso als in dem Umfang der als Anlage beigefügten Ansprüche enthalten zu erachten.
    • 10. BIOVERTEILUNG VON B72.3-[³H]-Me&sub2;ADR-ADH
  • Dieser Versuch zeigt, daß das ([³H]-Dimethyladriamycin-ADH)[³H]- Me&sub2;ADR-ADH-Antikörper-Konjugat ortsspezifisch ist, d.h. der größte Teil des quantitativen Befunds findet sich in erster Linie in den Tumoren von Mäusen verteilt, denen Adenokarzinom-Tumor-Xenotransplantate verabreicht worden waren.
  • Radioaktiv markiertes Me&sub2;ADR-ADH wurde nach dem in Abschnitt 7.2.5 beschriebenen Verfahren hergestellt und anschließend anhand des in Abschnitt 8.2 beschriebenen Verfahrens an den Antikörper B72.3 konjugiert.
  • Nacktmäusen mit einem Durchschnittsgewicht von 25 g wurde die humane Kolon-Adenokarzinom-Zellinie LS174T implantiert. Nachdem die Tumore eine Größe von 10 mm x 10 mm erreicht hatten, gewöhnlich sieben Tage nach der Implantation, wurden die mit den fremden Transplantaten versehenen sowie normale (nicht-tumortragende) Mäuse wie folgt geimpft und seziert: Gruppe Xenotransplantat Probe Sektion Tag keines
  • Die Tiere wurden am 3. Tage seziert, die Organe wurden mit Hilfe eines Gewebe-Lösungsvermittlers löslich gemacht, sodann wurde Szintillationsfluid hinzugegeben, und schließlich wurde eine Zählung in einem Beta-Zähler durchgeführt. Der Prozentsatz der injizierten Dosis pro Gramm wurde rechnerisch ermittelt. Die Ergebnisse sind in Tabelle II unten sowie in Abbildung 4 zusammengefaßt. TABELLE II PROZENT INJIZIERTE DOSIS PRO GRAMM (% ID/g)* XENOTRANSPLANTAT NICHT-TUMORTRAGEND ORGAN BLUT LUNGE MILZ LEBER NIERE TUMOR MUSKEL * Durchschnittswerte (Standardabweichungen in Klammern)
  • Die Ergebnisse dieser Untersuchungen zeigen, daß sich das Antikörper- Konjugat nur auf den Tumor begrenzt hatte, mit einem Durchschnittswert von ca. 10 % ID/g. Der freie Arzneistoff zeigte eine Konzentration im Tumor von weniger als 0,5 % ID/g und eine geringfügige Aufnahme (1 bis 2,5 % ID/g) in der Milz.

Claims (12)

ANSPRÜCHE - außer für Spanien und Griechenland
1. Ein Amin-Derivat eines Anthracyclin-Antibiotikums, bei dem es sich um antineoplastisches Anthracyclin-Antibiotikum handelt, das ein eingeführtes reaktives Amin enthält, das entweder
(a) an der 3'-Position des Anthracyclin-Antibiotikums über eine Linker-Gruppe gekoppelt ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Aminosäure, einem Peptid, einer organischen Säure mit der Formel -CO(CH&sub2;)nCO- mit n=2 oder 3 und einem organischen Anteil mit der Formel -Z-CONH-X, worin Z für
-OCH&sub2;-, -NH-CH&sub2;, -NHCOCH&sub2;CH&sub2;CH(NH&sub2;)- oder -NHCOCH(NH&sub2;)CH&sub2;CH&sub2;- und X für eine Aminosäure oder ein Peptid stehen, oder
(b) an der Position 14 des Anthracyclin-Antibiotikums über eine Thioether- oder tertiäre Amin-Verbindung gekoppelt ist, wobei das eingeführte resultierende reaktive Amin ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Hydrazin, Hydrazid, Phenylhydrazin, Phenylhydrazid, Alkoxyamin, Phenoxyamin, Semicarbazid und Thiosemicarbazid.
2. Das Derivat gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Anthracyclin-Antibiotikum ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus: Daunorubicin, Doxorubicin, Epirubicin, Esorubicin, Idarubicin, Carminocyin, 4-Demethoxy-4'-0-methyldoxorubicin, 4'-0-Tetrahydropyranyl-doxorubicin, 3'-Deamino-3'(3"-cyano-4"-morpholinyl) doxorubicin.
3. Das Derivat gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um Glutamyl-(gamma-hydrazid)-alpha-adriamycin handelt.
4. Das Derivat gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um Glutamyl-(alpha-hydrazid)-gamma-adriamycin handelt.
5. Das Derivat gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um Hydrazid-succinyl-adriamycin handelt.
6. Das Derivat gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sieh um Hydrazinacetyl-tyrosinyl-alanyl-alanyl-alanyladriamycin handelt.
7. Das Derivat gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um Adriamycin-pentaglutamylhydrazid handelt.
8. Das Derivat gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um Daunorubicin-14-S-(3-propionylhydrazid) handelt.
9. Das Derivat gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um Daunorubicin-14-N-methyl-(acetylhydrazid) handelt.
10. 3'-Hydrazinacetyl-adriamycin.
11. 3'-Aminoxyacetyl-adriamycin.
12. 3'-Hydrazinbenzoyl-adriamycin.
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