DE3855802T2

DE3855802T2 - Von Makrophagen abstammender Entzündungsvermittler(MIP-1-alpha et MIP-1-beta)

Info

Publication number: DE3855802T2
Application number: DE3855802T
Authority: DE
Inventors: Bruce Dallas Texas 75240 Beutler; Anthony Shelter Island New York 11964 Cerami; Stephen D. New York New York 10044 Wolpe
Original assignee: Rockefeller University
Current assignee: Rockefeller University
Priority date: 1987-10-02
Filing date: 1988-10-03
Publication date: 1997-06-12
Anticipated expiration: 2008-10-04
Also published as: EP0761685A2; GR3022689T3; JP3051834B2; JP3022566B2; EP0310136B1; DE3855802D1; AU2333688A; ES2100839T3; EP0310136A2; AU626800B2; EP0761685A3; ATE149176T1; JPH029391A; JPH10185899A; EP0310136A3

Description

Verwandte Veröffentlichungen

Die Anmelder sind Autoren oder Co-Autoren von mehreren Artikeln, die auf den Gegenstand der vorliegenden Erfindung gerichtet sind. Diese Artikel stellen eine Ergänzung zu den Artikeln dar, die in dem US-Patent Nr. 4,603,106 aufgelistet sind, welches frühere Artikel sind, (1) [Die Anmelder Cerami und Beutler sind Co-Autoren mit J. Mahoney, N. Le Trang und P. Pekala] "Purification of Cachectin, a Lipoprotein Lipase- Suppressing Hormone Secreted By Endotoxin-Induced RAW 264.7 Cells", J. EXP. MED. 161 984-995 (Mai, 1985); (2) [Die Anmelder sind Co-Autoren mit J.R. Mahoney, N. Le Trang, W. Vine und Y. Ikeda] "Lipopolysaccaride-Treated RAW 264.7 Cells Produce a Mediator Which Inhibits Lipoprotein Lipase in 3T3-L1 Cells", J. IMMUNOL. 134 (3) 1673-1675 (März, 1985); (3) [Der Anmelder Cerami ist Co-Autor mit P.J. Hotez, N. Le Trang und A.H. Fairlamb] "Lipoprotein Lipase Suppression in 3T3-L1 Cells by a Haemoatoprotozoan-Induced Mediator From Peritoneal Exudate Cells." PARASITE IMMUNOL. (Oxf.) 6:203 (1984); (4) [Die Anmelder Cerami und Beutler sind Co-Autoren mit D. Greenwald, J.D. Hulmes, M. Chang. Y.-C.E. Pan, J. Mathison und R. Ulevitch] "Identity of Tumor Necrosis Factor and Macrophage- Secreted Factor Cachectin", NATURE 316:552-554, (1985); (5) [Die Anmelder Cerami und Beutler sind Co-Autoren mit F.M. Torti, B. Dieckmann und G.M. Ringold] "A Macrophage Factor Inhibits Adipocyte Gene Expression: An In Vitro Model of Cachexia" SCIENCE 229:867-869, (1985); (6) [Die Anmelder Cerami und Beutler sind Co-Autoren mit I.W. Milsark] "Passive Immunization Against Cachectin/Tumor Necrosis Factor (TNF) Protects Mice From the Lethal Effect of Endotoxin" SCIENCE 229:869-871, (1985); (7) [Die Anmelder Cerami, Beutler und S.D. Wolpe sind Co-Autoren mit G. Davatelis, B. Sherry, D.G. Hesse, H.T. Nguyen, L.I. Moldawer, C.F. Nathan und S.F. Lowry] "Macrophages Secrete A Novel Heparin-Binding Protein With Inflammatory And Neutrophil Chemokinetic Properties", J. EXP. MED. 167: 570-581 (1988); (8) [Die Anmelder Cerami und Wolpe sind Co-Autoren mit G. Davatelis, P. Tekamp-Olson, K. Hermsen, C. Luedke, C. Gallegos, D. Coit und J. Merryweather) "Cloning and Characterization of a cDNA for Murine Macrophage Inflammatory protein (MIP), A Novel Monokine with Inflammatory and Chemokinetic Properties", J. EXP. MED., 167: 1939-1944 (1988); und (9) [Die Anmelder Cerami und Wolpe sind Co-Autoren mit B. Sherry, P. Tekamp-Olson, C. Gallegos, D. Bauer, G. Davatelis, F. Masiarz und D. Coit) "Resolution of the Two Components of Macrophage Inflammatory Protein-1, and Cloning and Characterization of One of Those Components, MIP-1β", J. EXP. MED., (im Druck) (1988).
Die Forschung, die zu der vorliegenden Erfindung führte, wurde zum Teil über Gelder des National Institute of Health und die Rockefeller Foundation finanziert.

Hintergrund der Erfindung

Die vorliegende Erfindung ist allgemein auf Stoffe und damit verbundene Verfahren für die Analyse und Behandlung der Auswirkungen und des entsprechenden Verlaufs von invasiven Stimuli wie einer Infektion bei tierischen Wirten gerichtet und ist insbesondere mit der Identifizierung von Stoffen, die bei der Wirtsantwort gegen solche invasive Stimuli teilnehmen, befaßt.
Man hat mehrere allgemeine physiologische und biochemische Zustände bei verschiedenen Säugetierwirten, die auf eine Vielzahl von invasiven Stimuli wie eine bakterielle, virale oder protozoale Infektion; Tumore; oder Endotoxämie (endotoxemia); als auch aufidiopathische Zustände reagieren, beobachtet. Diese Reaktionen schließen zum Beispiel Fieber, Leukocytose, Hyperlipidämie, verminderte Nahrungsmittelaufnahme (Anorexie), verminderte Aktivität, Auszehrung (Kachexie) und andere Veränderungen beim Muskel-, weißen Blutzell- und Lebermetabolismus ein. Insbesondere zeigten die jüngsten Studien, die auf eine Erklärung der biochemischen Mechanismen von Kachexie in Kaninchen, die mit Trypanosoma brucei infiziert wurden, gerichtet waren, daß Tiere bei einer geringen Parasitenbelastung krank wurden und eine außerordentliche Hypertriglyceridämie mit einer deutlichen Erhöhung des Lipoproteins mit sehr geringer Dichte (VLDL) im Plasma zeigten. Siehe C.A. Rouser und A. Cerami, MOL. BIOCHEM. PARASITOL. 1:31- 38 (1980). Der hypertriglyceridämische Zustand war im Hinblick auf die schwere Auszehrungsdiathese, die diese experimentelle Infektion begleitete, bemerkenswert. Es wurde gezeigt, daß die Erhöhung des Plasma-VLDL auf einen Clearing-Defekt, der durch einen Verlust von Liproteinlipase (LPL)-Aktivität im peripheren Gewebe verursacht wird, zurückzuführen ist.
Die verringerte LPL-Aktivität wurde auch von anderen beobachtet, und es wurde angemerkt, daß dieser Zustand auftrat, wenn sich der menschliche Körper in einem Schockzustand befindet. Siehe E.B. Man, et al., "The Lipids of Serum and Liver in Patients with Hepatic Diseases", CLIN. INVEST. 24 623, et seq. (1945); siehe auch John I. Gallin, et al., "Serum Lipids in Infection", N. ENGL. J. MED. 281 1081-1086 (13. November, 1969); D. Farstchi, et al., "Effects of Three Bacterial Infections on Serum Lipids of Rabbits", J. BACTERIOL. 95 1615, et seq. (1968); S.E. Grossberg, et al., "Hyperlipaemia Following Viral Infection in the Chicken Embryo: A New Syndrome", NATURE (London) 208 954, et seq. (1965); Robert L. Hirsch, et al., "Hyperlipidemia, Fatty Liver and Bromsulfophthalein Retention in Rabbits Injected Intravenously with Bacterial Endotoxin", J. LIPID. RES. 5 563-568 (1964); und Osamu Sakaguchi, et al., "Alternations of Lipid Metabolism in Mice Injected With Endotoxins", MICROBIOL. IMMUNOL. 23 (2) 71- 85 (1979); R.F. Kampschmidt, "The Activity of Partially Purified Leukocytic Endogenous Mediator in Endotoxin Resistant C3H/HeJ Mice", J. LAB. CLIN. MED. 95 616, et seq. (1980); und Ralph F. Kampschmidt, "Leukocytic Endogenous Mediator", J. RET. SOC. 23 (4) 287-297 (1978).
Zusätzlich sind den Anmeldern Veröffentlichungen bekannt, die die Identifizierung und das Vorhandensein von "Mediatoren" diskutieren, die bei der Wirtsantwort gegenüber einer Infektion beteiligt zu sein scheinen, und insbesondere werden die folgenden Artikel, deren Texte unter Bezugnahme darauf hier aufgenommen sind, aufgelistet: Sipe, J.D., et al., J. EXP. MED., 150:597-606 (1979); und Barney, C.C., et al., LIPTON, J.M. (Hrsg.), FEVER: INTERNATIONAL SYMPOSIUM, Dallas, Texas, April 11-12, 1979 XII + 263P. Raven Press: New York, Illus. ISBN 0-89004-451-1 (08877), 0 (0), Seiten 111-122 (1980); und Dinarello, C.A., "Human Leukocytic Pyrogen: Purification and Development of a Radioimmunoassay", PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, 74(10) 4624-4627 (Oktober, 1977). Bei allen diesen Faktoren, die von jedem der Autoren der oben erwähnten Artikel und den Artikeln, die von Kampschmidt verfaßt oder mitverfaßt wurden, identifiziert und untersucht wurden, wurde festgestellt, daß sie eine einzelne Gruppierung von Faktoren, die als Interleukin-1 (IL-1) identifiziert wurden, umfassen. Diese Feststellung wurde in einem Artikel von Charles A. Dinarello, der in REVIEWS OF INFECTIOUS DISEASES, Band 6, Nr. 1 (January- February, 1984) veröffentlicht wurde, dargestellt.
Ein ähnlicher Mangel an LPL-Aktivität wurde von den Anmeldern bei C3H/HeN-Mäusen nach der Verabreichung von Eschericha coli Lipopolysaccharid (LPS) beobachtet. Im Gegensatz dazu war ein Verlust der LPL-Aktivität in C3H/HeJ-Mäusen, die gegenüber LPS genetisch resistent sind, nicht nachweisbar. Diese Resistenz gegenüber einem durch Endotoxin-induzierten LPL-Mangel konnte durch die Verabreichung von Serum, das von Endotoxin-sensitiven Tieren, denen zwei Stunden vorher LPS injiziert wurde, erhalten wurde, überwunden werden. Ähnlich konnte die Resistenz durch Injektion von konditioniertem Medium von Endotoxin-stimulierten Thioglycolat-induzierten peritonealen Macrophagen, die aus sensitiven Mäusen erhalten wurden, überwunden werden. Diese Ergebnisse wurden ausführlich in der Anmeldung mit dem Aktenzeichen 414,098, jetzt das US-Patent Nr. 4,603,106, dargestellt.
Die obige Arbeit wurde von dem Glauben der Anmelder vorangetrieben, daß ein "Mediator" oder "Mediatoren" existierte(n) und von denen man vermutete, daß sie eine bedeutende Wirkung auf die allgemeine metabolische Aktivität energiespeichernder Zellen bei dem tierischen Wirt haben. Es wurde vermutet, daß solche "Mediatoren" eine supprimierende Wirkung auf die Aktivität von bestimmten anabolischen Enzymen ausüben, deren verringerte Aktivität zum Beispiel dort beobachtet wurde, wo der Wirt in den Zustand eintritt, der als Schock bekannt ist, als Reaktion auf eine Invasion. Demzufolge wurden der Einfluß des Mediators, der von Endotoxin- stimulierten peritonealen Mausexudatzellen hergestellt wurde, auf Endotoxin-sensitive und genauso auf Endotoxin- nichtsensitive Mäuse, und die Entwicklung infolge der Untersuchung von einem Reagenz zur Messung einer anabolischen Enzymaktivität in der ersten eingereichten Anmeldung mit dem Aktenzeichen 299,932, die zurückgezogen wurde, weiter ausgeführt.
Es wurde eine weitere Untersuchung bei diesem System in Verbindung mit dem 3T3-L1 "Präadipocyt" Modellsystem durchgeführt, und die entsprechende Entwicklung von Verfahren und damit verbundenen Stoffen für die Entwicklung von Antikörpern gegen den "Mediator" und anderer diagnostischer Verfahren wurde in der Anmeldung mit dem Aktenzeichen 351,290 fortgesetzt. Danach stellten die Anmelder in einer nachfolgenden Anmeldung mit dem Aktenzeichen Nr. 414,098, jetzt das US-Patent Nr. 4,603,106, fest, daß der Mediatorstoff, den sie über die Endotoxinstimulation von Macrophagenzellen erhalten hatten, die Aktivitäten zeigte, die anabolischen Enzyme Lipoproteinlipase, Acetyl-Coenzym A-Carboxylase und Fettsäuresynthetase zu supprimieren und außerdem das Wachstum und die Differenzierung von Erythroid-abhängigen Zellen (erythroid-committed cells) inhibierte.
Eine weitere Arbeit, die in den Artikeln (1) und (4) von Beutler et al. und der Anmeldung mit dem Aktenzeichen Nr. 766,852 dargestellt ist, hat zu der Entdeckung geführt, daß der früher identifizierte Mediatorstoff eine weitere Proteinkomponente enthält, die eine Anzahl von Aktivitäten besitzt, die diesen sowohl von dem Mediatorstoff als auch von den anderen Faktoren, die im Stand der Technik identifiziert sind und die als Interleukin 1 und Interleukin 2 bekannt sind, unterscheidet. Eine weitere Arbeit, die in dem Artikel (7) von Beutler et al. und der Stammanmeldung mit dem Aktenzeichen 104,827, deren Offenbarung hiermit unter Bezugnahme aufgenommen ist, dargestellt ist, stellte das Vorhandensein eines zusätzlichen Faktors (MIP-1) bei dem Mediatorstoff, der ein unterscheidbares Aktivitätsprofil zeigt, fest.
Seit dieser Zeit wurde das MIP-1 in Komponentenpeptide aufgetrennt, und es wurden die N-terminalen Sequenzen von zwei solchen Peptiden, die nun als MIP-1α und MIP-1β bezeichnet werden, verglichen. Demzufolge ist die vorliegende Anmeldung auf die neu entdeckten Peptidextrakte und die Aktivitäten von MIP-1 und die sowohl diagnostischen als auch therapeutischen Anwendungen, zu denen diese Extrakte verwendet werden können, gerichtet.

Zusammenfassung der Erfindung

Gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird das inflammatorische Cytokin, das der neu entdeckte Extrakt des Mediatorstoffes ist, offenbart, und das umfaßt ein Protein, das gereinigt wurde und das unter physiologischen Bedingungen anionisch ist. Das inflammatorische Cytokin der vorliegenden Erfindung zeigt die Fähigkeit, sogar bei hohen Salzkonzentrationen an Heparin zu binden, eine lokale Entzündung, die durch die Infiltration polymorphkerniger Zellen gekennzeichnet ist, zu induzieren, wenn es subkutan verabreicht wird, und in vitro eine Chemokinese polymorphkerniger Zellen induzierten. Dem vorliegenden inflammatorischen Cytokin fehlen jedoch bestimmte Aktivitäten, die anderen Faktoren gemein sind, die aus dem Mediatorstoff, der in dem US-Patent Nr. 4,603,106 offenbart ist, isoliert wurden.
Insbesondere fehlt dem vorliegenden inflammatorischen Cytokin die Eigenschaft, die Aktivität des anabolischen Enzyms Lipoproteinlipase (LPL) zu supprimieren, und es ist nicht in der Lage, die Cytotoxizität von Cachectin/TNF-empfindlichen L929-Zellen zu verursachen, die Blastogenese von Endotoxin- resistenten C3H/HeJ Thymocyten zu stimulieren oder die Herstellung von Cachectin/TNF durch primäre Thioglycolat induzierte Mausmacrophagenzellen zu induzieren. Diese letzteren Eigenschaften, die alle dem vorliegenden inflammatorischen Cytokin fehlen, werden von den bekannten Faktoren Cachectin/TNF und Interleukin-1 (IL-1) gezeigt und unterscheiden dadurch das vorliegende infiammatorische Cytokin davon.
Von den gezeigten anerkannten Aktivitäten scheint die Fähigkeit, an Heparin zu binden und eine lokale Entzündung, die durch die Infiltration polymorphkerniger Zellen (PMN) gekennzeichnet ist, zu induzieren, besonders bedeutsam. Demzufolge ist, während die genaue Rolle, die der vorliegende Extrakt bei der Kaskade von Reaktionen gegenüber einer Invasion des Wirtes spielt, nicht genau bestimmt ist, dessen Teilnahme an der Hervorrufung von bestimmten Aktivitäten und Zuständen, die mit der Aktivierung gegen eine Invasion des Wirtes verbunden sind, eindeutig. Demzufolge besitzt das inflammatorische Cytokin die Eignung zur Verwendung als ein diagnostisches Mittel, um verschiedene Stimuli zu identifizieren und um vielleicht zwischen diesen über die Aktivierung des vorliegenden inflammatorischen Cytokins, das solche Stimuli fördern kann, zu differenzieren, ob diese invasiv oder idiopathisch sind.
Das vorliegende inflammatorische Zytokin wurde anfänglich teilweise identifiziert und charakterisiert, und man fand, daß es bestimmte Polypeptidsegmente mit einem apparenten Molekulargewicht von annähernd 8000 Dalton, wie über Polyacrylamidgelelektrophorese in der Gegenwart von Natriumdodecylsulfat (SDS-PAGE) bestimmt, und mit der Neigung, Aggregate mit einem hohen Molekulargewicht von mehr als ungefähr 10&sup6; Dalton in Puffern mit niedrigem Salzgehalt zu bilden, enthält. Insbesondere hat man bei dem vorliegenden inflammatorischen Cytokin bemerkt, daß es Aggregate bildet, die größer als 2 x 10&sup6; Dalton sind, wie über Gelfiltration ermittelt wurde. Demzufolge zeigten die vorläufigen Daten der N-terminalen Aminosäurekonsensusteilsequenz, die hier in Figur 3 dargestellt ist, zu dieser Zeit keine deutliche Homologie mit vormals beschriebenen Proteinen. Mittels bekannter cDNA Klonierungstechniken, die auf den bestimmten Peptidteilsequenzen basierten, wurden vollständig translatierte Peptidsequenzen erhalten, von denen man fand, daß sie Molekulargewichte von annähernd 8 Kilodalton besitzen. Von MIP- 1 wurde mittels Chromatofocussierung gezeigt, daß es einen pI von annähernd 4,6 hat.
Weitere Eigenschaften des vorliegenden inflammatorischen Cytokins schließen dessen Fähigkeit ein, bei Kaninchen Fieber zu induzieren und bei humanen Neutrophilen in vitro die Superoxidbildung oder einen respiratorischen Burst zu induzieren. Diese Eigenschaften werden durch die hier dargestellten Daten veranschaulicht.
Die vorliegende Erfindung ist auch auf die Auftrennung des gereinigten nativen MIP-1 gerichtet, das als ein Paar mit nahezu identischen apparenten Molekulargewichten der Komponenten von ungefähr 8000 Dalton bei der SDS-PAGE läuft. Ein Chromatographie über Hydroxylapatit trennte in der Gegenwart von SDS die zwei Komponenten erfolgreich. Die partielle N-terminale Sequenzanalyse von jeder Komponente zeigte, daß die beiden Proteine in ihren N-terminalen Sequenzen sehr ähnlich sind, sich aber in dem Vorhandensein und in Positionen bei bestimmten Aminosäuren unterscheiden. Insbesondere hat das Protein, das der niedrigeren Molekulargewichtsbande bei der SDS-PAGE entspricht (jetzt als "MIP-1α" bezeichnet), die N-terminale Aminosäureteilsequenz, die in Figur 14A hier dargestellt ist, wobei die höhere Molekulargewichtsbande (bezeichnet als "MIP-1β") die N- terminale Sequenz ergab, die in Figur 14B gezeigt ist. Die cDNAs wurden sowohl für MIP-1α als auch für MIP-1β kloniert, welches die Vorhersage der vollständigen Aminosäuresequenz von jeder der Peptidkomponenten ermöglicht, deren cDNA und reife Aminosäuresequenzen in den Figuren 10 und 15 jeweils dargestellt sind.
Die cDNA für MIP-1α sagt ein reifes Protein mit 69 Aminosäuren in der Länge mit einem vorhergesagten Molekulargewicht von 7889 voraus. Es gibt keine apparenten N-Glykosylierungsstellen. Die cDNA für MIP-1β sagt ein reifes Protein auch mit 69 Aminosäuren in der Länge mit einem vorhergesagten Molekulargewicht von 7832 Dalton voraus. Hier gibt es eine möglich N-Glykosylierungsstelle (Asn-Pro-Ser) an den Positionen 53 bis 55.
Wie vorher erwähnt, kann das vorliegende inflammatorische Cytokin durch die Stimulation von tierischen Zellen mit einem Material, das einen invasiven Stimulus begleiten könnte, hergestellt werden. Insbesondere kann eine Probe von Macrophagenzellen, die aus einer Vielzahl von Quellen erhalten werden kann, mit einem Stimulatormaterial wie einem Endotoxin oder Trypanosomen inkubiert werden, um den Mediatorstoff, der in dem US-Patent Nr. 4,613,106 offenbart ist, herzustellen. Eine solche Inkubation kann für einen Zeitraum von bis zu 20 Stunden durchgeführt werden, und die genauen Zeitgrenzen werden mit den jeweiligen Zellen, die für die Inkubation ausgewählt wurden, variieren.
Nach einer solchen Inkubation kann das Medium entsprechend behandelt werden, wie durch Zentrifugation, um einen Überstand, der den rohen Mediatorstoff enthält, abzutrennen. Der Mediatorstoff kann dann weiter mittels Filtration oder Abscheidung behandelt werden. Danach kann der rohe Mediatorstoff einer Reihe von bekannten Isolierungstechniken unterworfen werden, wobei das inflammatorische Cytokin erhalten werden kann. Die vorliegende Erfindung umfaßt natürlich alternative Mittel für die Herstellung des inflammatorischen Cytokins, die, wenn anwendbar, bekannte genetische Replikationstechniken einschließen, und demzufolge ist beabsichtigt, daß die Erfindung solche synthetischen Herstellungen innerhalb ihres Rahmens abdeckt.
Wie oben angegeben, beinhaltet die vorliegende Erfindung auch die Identifizierung der gereinigten Peptidkomponenten des vorliegenden Cytokins, das in Kombination die oben erwähnten Aktivitäten und Eigenschaften zeigt, das die reifen Aminosäuresequenzen, die unten und in den Figuren 10 und 15, wie sie bei Mäusen bestimmt wurde, aufweist. MIP-1α MIP-1β
Wie vorher angegeben, weist die vorstehende Sequenz keine auffallende Ähnlichkeit mit den bekannten Mediatorfaktoren auf und stellt demzufolge sicher, daß das vorliegende inflammatorische Cytokin von diesen unterscheidbar ist. Die kürzlich erfolgte Isolierung der obigen Aminosäuresequenzen und die Entwicklung der mRNA Sequenz haben die Herstellung dieses Cytokins über herkömmliche rekombinante genetische Techniken ermöglicht.
Die Erfindung beinhaltet ferner Verfahren für die Identifizierung idiopathischer oder invasiver Stimuli auf der Basis von deren Fähigkeit, das vorliegende inflammatorische Cytokin oder die Aktivitäten, die es beeinflußt, zu induzieren. Insbesondere können solche Stimuli über deren Fähigkeit, daß sie Mediatoren induzieren, die an Heparin binden und eine lokale Entzündung mit neutrophiler Infiltration und Chemokinese induzieren, identifiziert und nachgewiesen werden. Bei diesen Verfahren können Macrophagenzellen, die zum Beispiel von der RAW 264.7 Zellinie abstammen, mit einer Anzahl bekannter Stimulatormaterialien wie Endotoxin, Trypanosomen oder ähnlichem als einer Kontrolle beimpft werden, während parallel zelluläre Proben mit einem Extrakt des Materials aus den vermuteten Stellen des infektiösen Stimulus beimpft werden. Alle Proben können danach in Übereinstimmung mit den oben beschriebenen Verfahren inkubiert und danach einer Reihe von Trennungstechniken, die auch definiert sind, unterworfen werden, worauf die Untersuchung der sich ergebenden Extrakte, die von der Kontrolle und den unbekannten Proben stammen, verglichen werden können, um zu bestimmen, ob das hervorgerufene inflammatorische Cytokin, wenn vorhanden, identisch oder auch ähnlich ist.
Alternativ können veränderte mRNA Level des inflammatorischen Cytokins über Techniken nachgewiesen werden, die im Stand der Technik verwendet werden, wobei man von den hierin offenbarten cDNA-Sequenzen Gebrauch macht.
Auf eine ähnliche Weise kann ein Untersuchungssystem für das Screening von potentiellen Drogen, die wirksam sind, um entweder das inflammatorische Cytokin nachzuahmen oder diesem entgegenzuwirken, hergestellt werden. In einem Beispiel kann die Testdroge an eine stimulierte Macrophagenprobe verabreicht werden, um deren Wirkung auf die Herstellung des inflammatorischen Cytokins zu bestimmen. In einem alternativen Verfahren kann das inflammatorische Cytokin in ein zelluläres Testsystem eingebracht werden, von dem bekannt ist, daß das Cytokin wirksam ist, und die voraussichtliche Droge kann auch in die gleiche Zellkultur eingebracht werden, und die Kultur kann danach untersucht werden, um jegliche Änderungen in der Aktivität des inflammatorischen Cytokins im Vergleich mit der Zugabe der voraussichtlichen Droge allein, oder die Wirkung der zugegebenen Mengen des bekannten inflammatorischen Cytokins zu bestimmen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren für die Bestimmung des Vorhandenseins von stimulierten, spontanen oder idiopathischen pathologischen Zuständen in Säugetieren, wobei man die Aktivität und das Vorhandensein des inflammatorischen Cytokins der vorliegenden Erfindung bestimmt. Insbesondere kann die Aktivität des inflammatorischen Cytokins über die Untersuchungstechniken, die später diskutiert werden, durch die Verwendung einer geeignet markierten Menge des Cytokins direkt erfaßt werden. Alternativ kann das Cytokin verwendet werden, um Bindungspartner oder Antikörper hervorzurufen, die wiederum markiert und in ein Medium wie Serum eingebracht werden können, um das Vorhandensein des inflammatorischen Cytokins darin zu untersuchen und dadurch den Zustand des Wirtes, dem das Medium entnommen wurde, zu beurteilen.
So sind sowohl das inflammatorische Cytokin und jegliche Antikörper, die dagegen hervorgerufen werden können, für die Verwendung in Verbindung mit verschiedenen diagnostischen Techniken einschließlich Immunoassays wie einem Radioimmunoassay geeignet, wobei man zum Beispiel einen Antikörper gegen das inflammatorische Cytokin, entweder über radioaktive Addition, Reduktion mit Natriumborhydrid oder Radioiodierung markiert, verwendet.
In einem beispielhaften Immunoassay kann eine Kontrollmenge des inflammatorischen Cytokins, des Antikörpers, oder ähnliches hergestellt und mit einem Enzym, einem spezifischen Bindungspartner und/oder einem radioaktiven Element markiert werden und kann dann in eine Blutprobe eines Säugetieres, von dem man glaubt, daß es eine Invasion durchmacht, eingebracht werden. Nachdem das markierte Material oder der(en) Bindungspartner die Möglichkeit hatte(n), mit den Stellen in der Probe zu reagieren, kann die erhaltene Menge über bekannte Techniken, die mit der Natur der angebrachten Markierung variieren können, untersucht werden.
In dem Beispiel, wo eine radioaktive Markierung wie die Isotope ¹&sup4;C, ¹³¹I, ³H, ¹²&sup5;I und ³&sup5;S verwendet werden, können die zur Zeit verfügbaren Zählverfahren verwendet werden. In dem Beispiel, wo die Markierung ein Enzym ist, kann der Nachweis durch eine der verwendeten kolorimetrischen, spektrophotometrischen, fluorospektrophotometrischen oder gasometrischen Techniken, die im Stand der Technik bekannt sind, erfolgen.
Die vorliegende Erfindung schließt ein Untersuchungssystem ein, das in der Form eines Testkits für die quantitative Analyse des Ausmaßes des Vorhandenseins des inflammatorischen Cytokins hergestellt werden kann. Das System oder der Testkit können eine markierte Komponente umfassen, die über die radioaktiven und/oder enzymatischen Techniken, die hier diskutiert werden, hergestellt ist, wobei man eine Markierung an das inflammatorische Cytokin koppelt, und eine oder mehrere zusätzliche immunchemische Reagenzien, von denen wenigstens eine ein freier oder immobilisierter Ligand ist, der entweder geeignet ist, mit der markierten Komponente, deren Bindungspartner, eine der Komponenten, die bestimmt werden sollen, oder dessen (deren) Bindungspartner zu binden.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung des inflammatorischen Cytokins, von Antikörpern gegen das inflammatorische Cytokin oder von anderen Mitteln oder Drogen, von denen bestimmt wurde, daß sie die gleiche oder eine antagonistische Aktivität in bestimmten therapeutischen Verfahren besitzten. Eine erste Verwendung ist mit der Verhinderung des Auftretens der Aktivitäten des inflammatorischen Cytokins in Säugetieren wie bei Entzündung und Fieber verbunden und umfaßt eine Verabreichung von entweder einem Antikörper gegen das Cytokin, einem Mittel, das geeignet ist, die Herstellung und/oder Aktivität des Cytokins zu modulieren, oder einem Mittel, das kein Antikörper gegen das Cytokin ist, das geeignet ist, als ein Antagonist gegen das Cytokin zu wirken, entweder allein oder in Mischung mit jedem anderen in einer wirksamen Menge, um die Entwicklung von solchen Zuständen in dem Wirt zu verhindern.
Insbesondere können die therapeutischen Verwendungen, auf die hier allgemein Bezug genommen wird, die Verwendung für die Behandlung von Entzündung und Fieber durch die Verabreichung von pharmazeutischen Zusammensetzungen, die wirksame Mengen von Antikörpern gegen das inflammatorische Cytokin oder andere gleich wirksame Drogen, die entwickelt wurden, umfassen, beinhalten, zum Beispiel über einen Screeningtest für Drogen, der in Übereinstimmung mit einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung hergestellt und verwendet wird. Eine abweichende Ausführungsform dieser therapeutischen Verwendung könnte zu Beginn den Nachweis des Vorhandenseins und der Aktivität des inflammatorischen Cytokins und danach die Verabreichung der geeigneten pharmazeutischen Zusammensetzung umfassen.
Ein zweite therapeutische Verwendung versucht die inflammatorische Aktivität des Cytokins vorteilhaft zu verwenden und insbesondere dessen Fähigkeit, die Bewegung und Mobilisierung von Neutrophilen als Reaktion auf invasive Stimuli wie Infektion zu verursachen. Demzufolge kann das infiammatorische Cytokin in einer geeigneten Formulierung zur Verabreichung an dem Infektionsort, der zum Beispiel entstehen kann, wenn eine Gewebeverletzung aufgetreten ist, hergestellt werden. In einem solchen Beispiel wird das inflammatorische Cytokin in einer sterilen Lösung hergestellt und in die Verletzung oder die Wunde als Teil einer Spülflüssigkeit oder über eine direkte Verabreichung wie bei einer pharmazeutischen Zusammensetzung, wobei die letztere Verabreichungsweise topische und parenterale Wege umfaßt, abgegeben. Natürlicherweise kann das inflammatorische Cytokin verwendet werden, um gleich wirksame Mittel oder Drogen über bekannte Verfahren bereitzustellen, die dann in pharmazeutischen Zusammensetzungen, die für die Verabreichung auf die gleiche Weise und für die gleichen Zwecke wie für das inflammatorische Cytokin selbst geeignet sind, formuliert werden können.
Demzufolge ist es ein Hauptziel der vorliegenden Erfindung, ein infiammatorisches Cytokin in gereinigter Form, das bestimmte Eigenschaften und Aktivitäten, die mit der Wirtsantwort gegenüber invasiven Stimuli in Säugetieren verbunden sind, zeigt, bereitzustellen.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren für den Nachweis des Vorhandenseins des inflammatorischen Zytokins in Säugetieren, bei denen vermutet wird, daß invasive, spontane oder idiophatisch pathologische Zustände wie eine Infektion vorhanden sind, bereitzustellen.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren und damit verbundenes Untersuchungssystem für das Screening von Stoffen wie Drogen, Mitteln und ähnlichem, die möglicherweise entweder beim Nachahmen der Aktivität oder beim Bekämpfen der nachteiligen Wirkungen des inflammatorischen Cytokins in Säugetieren wirksam sind, bereitzustellen.
Es ist noch ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, eine medizinische Verwendung für die Behandlung von Säugetieren bereitzustellen, um die Menge oder Aktivität des inflammatorischen Cytokins zu kontrollieren, um so die Folgen von einem solchen Vorhandensein oder einer solchen Aktivität zu ändern.
Es ist noch ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, eine medizinische Verwendung für die Behandlung von Saugetieren bereitzustellen, um die Menge oder Aktivität des inflammatorischen Cytokins zu fördern, um so die nachteiligen Folgen von invasiven, spontanen oder idiopathisch pathologischen Zuständen zu behandeln oder abzuwenden.
Es ist noch ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, pharmazeutische Zusammensetzungen für die Verwendung bei therapeutischen Verfahren bereitzustellen, die umfassen oder basieren auf den inflammatorischen Cytokinen oder dessen (deren) Bindungspartner(n), oder auf Mitteln oder Drogen, die die Herstellung kontrollieren oder die die Aktivitäten des inflammatorischen Cytokins nachahmen oder diesen entgegenwirken.
Andere Ziele und Vorteile werden für solche Fachleute aus einer Betrachtung der folgenden Beschreibung, die mit einer Bezugnahme auf die folgenden veranschaulichenden Abbildungen fortfährt, ersichtlich sein.

Kurze Beschreibungen der Abbildungen

FIGUR 1 ist eine kombinierte graphische und Elektrophoresegel Darstellung hinsichtlich der Herstellung und Gewinnung des inflammatorischen Cytokins aus einem Überstand von RAW 264.7 Zellen. Die Fraktionierung des konzentrierten diafiltrierten Überstandes von RAW 264.7 wurde auf Mono Q durchgeführt. Zwei Liter des Überstandes (Mediatorstoff) wurden 20-fach konzentriert und gegen sechs Liter 20 mM Tris-HCl, pH 8, diafiltriert. Derkonzentrierte Überstand wurde auf Mono Q gegeben und mit einem linearen Gradienten von 0 bis 1 M NaCl in dem gleichen Puffer eluiert. MIP-1 (*) eluierte leicht vor Cachectin/TNF (**) bei annähernd 0,37 M NaCl. ber Einschub zeigt ein 10 bis 15% SDS-PAGE Gel, auf das 50 µl der angegebenen Fraktionen gegeben wurden.
FIGUR 2 ist eine kombinierte graphische und Elektrophoresegel Darstellung hinsichtlich einer weiteren Gelauftrennung und Reinigung des vorliegenden inflammatorischen Cytokins. Der MIP- 1 Peak, der die Mono Q-Fraktionen enthält, wurde auf 200 µl konzentriert und auf eine Superose 12 Säule, die mit 100 mM Ammoniumacetat äquilibriert wurde, gegeben. Das MIP-1 (*) eluierte in dem Leervolumen gut abgetrennt vom Cachectin/TNF (**). Der Einschub zeigt ein 10 bis 18%iges SDS-PAGE Gel, auf das 50 µl Teilmengen der angegebenen Fraktionen gegeben wurden. Der Dolch zeigt gereinigtes MIP-1 an, das als ein Marker verwendet wurde.
FIGUR 3 stellt eine Konsensusaminosäureteilsequenz der ersten 31 Positionen des inflammatorischen Cytokins der vorliegenden Erfindung dar. Die Reste in Klammern zeigen Positionen an, bei denen "Neben"reste bei verschiedenen Sequenzläufen von verschiedenen Ansätzen des Materiales reproduzierbar erhalten wurden.
FIGUR 4 ist eine kombinierte graphische und Elektrophoresegel Darstellung hinsichtlich der Bindung und Elution des inflammatorischen Cytokins der vorliegenden Erfindung an Heparin. Zwei ml eines 12-fach konzentrierten und diafiltrierten LPS-stimulierten RAW 264.7 Überstandes wurden auf eine Heparin-Sepharose Säule gegeben und mit einem linearen Gradienten von 0 bis 2 M NaCl in 0,02 M Tris-HCl Puffer, pH 7,8 eluiert. Zwei Hauptpeaks wurden erhalten, wobei MIP-1 (*) in dem zweiten Peak eluierte, was 0,6 bis 0,75 M NaCl entspricht. Der Einschub zeigt ein 10 bis 18%iges Acrylamidgradienten SDS- PAGE Gel, auf das 50 µl Teilmengen der angegebenen Fraktionen gegeben wurden.
FIGUR 5 zeigt Photomikroaufnahmen von C3H/HeJ Fußballen, die vier Stunden nach erfolgter subkutaner Injektion des inflammatorischen Cytokins der vorliegenden Erfindung mit Kontrollen und Vergleichsiniektionen von Cachectin/TNF fixiert wurden. Die Gewebe wurden in gepuffertem Formalin fixiert und mit Hämatoxylin-Eosin angefärbt. Die Vergrößerung beträgt 400X. Platte A - Placeboinjektionen, die eine normale Histologie zeigen. Platte B - 100 ng MIP-1: mäßige Infiltration von Neutrophilen und Mastzellen. Platte C - 100 ng Cachectin/TNF: mäßige Infiltration von Neutrophilen. Platte D - 10&supmin;¹&sup0; Mol fMLP: ausgedehnte Infiltration mit örtlicher Nekrose.
FIGUR 6 stellt graphisch die Ergebnisse der Untersuchungen für die Induktion von neutrophiler Chemokinese durch das inflammatorische Cytokin der vorliegenden Erfindung dar. Die Daten stellen den mittleren Prozentsatz der migratorischen Reaktion der Kontrolle von fünf Experimenten dar. Die Werte werden als der prozentuale Anstieg der neutrophilen Migration relativ zur Geys Basissalzlösung (Gey's basic salt solution) als negativer Kontrolle (0%) und den 10&supmin;&sup8; M fMLP als positiver Kontrolle (100%) dargestellt.
* = Konzentrationen von MIP-1, die signifikante Anstiege bei der chemokinetischen Antwort in Prozent gegen GBSS allein (p < 0,01 von ANOVA) zeigen.
FIGUR 7 ist eine graphische Darstellung der Untersuchungsergebnisse für die Fähigkeit des inflammatorischen Cytokins, die H&sub2;O&sub2;-Freisetzung bei humanen Neutrophilen (PMNs) zu stimulieren. Menschliche PMNs, die in Serum-beschichteten Näpfen von Microtestplatten inkubiert wurden, wurden zum Zeitpunkt 0 mit PMA (100 ng/ml) ( ), rekombinanten Cachectin/TNF (10 ng/ml) (Δ), MIP-1 (1000 ng/ml) (o) oder mit einem äquivalenten Volumen des Puffers allein (Kontrolle) ( ) behandelt. Die H&sub2;O&sub2;-Freisetzung wurde über die nächsten 4,5 Stunden (2 Stunden bei Cachectin/TNF) beobachtet. Die Werte entsprechen Mittelwerten ± SEM für Triplikate bei einem von vier ähnlichen Experimenten.
FIGUR 8A ist eine Darstellung der aus der cDNA vorhergesagten reifen Aminosäuresequenz von MIP-1α, wie sie ursprünglich aus Mauszellen gewonnen wurde.
FIGUR 8B ist eine Darstellung der aus der cDNA vorhergesagten reifen Aminosäuresequenz von MIP-1β, wie sie ursprünglich aus Mauszellen gewonnen wurde.
FIGUR 9 stellt die 512-fach degenerierten Sondenpools dar, die bei der cDNA Klonierung von MIP-1α verwendet wurden. Ein Sternchen unterhalb einer Base zeigt einen konstanten Basenaustausch zwischen den Sondenpools an.
FIGUR 10 stellt die vollständige Nukleotidsequenz eines cDNA Klones für MIP-1α dar. Die unterstrichene Sequenz stellt die komplementäre Sequenz zu dem bei den Primer- Verlängerungsexperimenten verwendeten Oligonukleotid dar. Das vorhergesagte translatierte Molekulargewicht des Vorläuferpeptids beträgt 10346. Die reife Peptidsequenz, die bei Position 1 beginnt, beträgt 69 Aminosäuren in der Länge und hat ein vorhergesagtes Molekulargewicht von 7889.
FIGUR 11 ist ein Autoradiogramm eines Northern Blots von Gesamt-RNA aus RAW 264.7 Zellen, die eine transformierte Maus- Macrophagenzellinie sind. Die Zellen wurden mit 2 µg/ml LPS in einem serumfreien Medium für sechs Stunden stimuliert. Den Kontrollzellen wurde serurmfreies Medium ohne das zugegebene LPS für sechs Stunden gegeben. Die Gesamtmenge an RNA, die in jeder Spur geladen ist, ist in der Figur angegeben.
FIGUR 12 ist eine Darstellung einer Zeitverlaufsstudie der RAW 264.7 mRNA Induktion durch LPS. Der Zeitverlauf ist in Stunden gemessen. Alle drei Proben waren Plasmid cDNA Klone, die mit a[³²P] dCTP markiert waren.
FIGUR 13 ist eine graphische Darstellung der Fraktionierung von MIP-1 in die Peptide der Komponenten mittels SDS- Hydroxylapatit-Chromatographie. MIP-1 (500 µg) wurde auf SDS- Hydroxylapatit gegeben und wie beschrieben fraktioniert. 0,5 ml Fraktionen wurden gesammelt, über SDS-PAGE analysiert und, wie über die Klammern angegeben, vereinigt (1 = MIP-1α; 2 = MIP-1β).
FIGUR 14 stellt N-terminale Aminosäuresequenzen dar: (A) die N- terminale Aminosäuresequenz von gereinigtem MIP-1α; (B) die N- terminale Aminosäuresequenz von gereinigtem MIP-1β, wobei die unterstrichenen Reste (2-8) die waren, die verwendet wurden, um einen Pool von Oligonukleotidsonden zu konstruieren; (C ) die ursprüngliche N-terminale Aminosäurekonsensussequenz, die für gereinigtes natives MIP-1 berichtet wurde. Die Aminosäurenreste, die den Nebenresten entsprechen, sind in Klammer angegeben.
FIGUR 15 stellt die vollständige Nukleotidsequenz des cDNA Klones für MIP-1β dar. Das vorhergesagte translatierte Molekulargewicht beträgt 10169 Dalton. Die reife Proteinsequenz, die an Position 1 beginnt, beträgt 69 Aminosäuren in der Länge und hat ein vorhergesagtes Molekulargewicht von 7832 Dalton.
FIGUR 16 ist eine graphische Darstellung des eingeschätzten örtlichen Hydrophathicity-Verlaufes entlang der Länge von MIP- 1α (---) und MIP-1β (), der über eine Anpassung des Algorithmusses von Hopp und Woods berechnet wurde.

Genaue Beschreibung

Primär betrifft die vorliegende Erfindung die Isolierung und Identifizierung eines besonderen Faktors, der im folgenden als inflammatorisches Cytokin oder Makrophagen inflammatorisches Protein MIP-1 bezeichnet wird, von dem man fand, daß es bei oder von Makrophagen oder Makrophagenzellinien, die durch Materialien stimuliert wurden, die hier als Stimulatormaterialien bezeichnet werden, vorhanden ist oder sekretiert wird, der kennzeichnenderweise einen invasiven Stimulus wie Bakterien, Viren, bestimmte Tumoren, Protozoen und andere Toxine wie Endotoxin oder einen idiopathischen Zustand begleitet. Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Trennung des MIP-1 in die Peptide seiner Komponenten, MIP-1α und MIP-1β. Wie der Mediatorstoff, der in dem US-Patent Nr. 4,603,106 offenbart ist, scheint das vorliegende inflammatorische Cytokin, von dem man bestimmt hat, daß es eine Komponente des früheren Mediatorstoffes ist, in der Lage zu sein, daß es bestimmte Zustände wie Entzündung, die sich in den Geweben eines Säugetieres entwickeln, was die Reaktion eines Säugetieres bei einem stimulierten oder spontanen pathologischen Zustand widergibt, verursacht.
Insbesondere scheint das inflammatorische Cytokin in der Lage zu sein, wenn es subkutan verabreicht wird, eine lokale Entzündung, die durch die Infiltration polymorphkerniger Zellen gekennzeichnet ist, zu induzieren. Auch verursacht das Cytokin in vitro eine polymorphkernige Zellchemokinese, wobei diese Zustände für den Einfluß eines Cytokins, das bei der Mobilisierung des Säugetierwirtes gegen einen invasiven Stimulus beteiligt ist, beispielhaft sind. Während die vollständige und genaue Rolle, die durch das vorliegende inflammatorische Cytokin gespielt wird, unklar ist, vermutet man, daß das Cytokin in Verbindung mit anderen, früher identifizierten Faktoren und solchen, die noch aufgeklärt werden müssen, als ein Teil eines Kommunikationssystemes zwischen dem Immunsystem des Wirtes und anderen Körpergeweben und Organen fungiert.
Die Fähigkeit des vorliegenden inflammatorischen Cytokins, an Heparin zu binden, gab Anlaß zu der Überlegung, daß das Cytokin bestimmten Heparin-bindenden Wachstumsfaktoren wie FGF oder PDGF entsprechen könnte. Die Daten, die anzeigen, daß das inflammatorische Cytokin nicht mitogen für glatte Muskelzellen ist, legen jedoch einen Unterschied zu diesen bekannten Wachstumsfaktoren nahe. Demzufolge nimmt, was zu diesem Zeitpunkt sicher ist, das Cytokin der vorliegenden Erfindung an der Entwicklung der inflammatorischen Antwort, von der bekannt ist, daß sie ein Teil der Reaktionen des Wirtes gegen eine solche Invasion ist, teil.
Wie vorher angegeben, hat man bei dem vorliegenden inflammatorischen Cytokin bestätigt, daß es ein Protein umfaßt, das einen isoelektrischen Punkt (pI) von annähernd 4,6 hat. Das inflammatorische Cytokin kann als ein Paar mit fast identischen Molekulargewichten der Untereinheiten von annähernd 8000 Dalton isoliert werden und kann Multimere mit verschiedenen Molekulargewichten von bis zu und mehr als 2 x 10&sup6; Dalton bilden, wie aus den Ergebnissen der Untersuchungen bestimmt wurde, die zu deren Isolierung führt, welche in dem Beispiel unten ausgeführt werden. Diese Untersuchungen identifizierten ebenso die N-terminalen Peptidsequenzen, und die anschließend über bekannte genetische Replikationstechniken aufgeklärten vollständigen Sequenzen bestatigen, daß sich die spezifischen Peptidsequenzen des vorliegenden inflammatorischen Cytokins sich von denen anderer bekannter Mediatorfaktoren unterscheiden. Demzufolge bestehen sowohl strukturelle als auch funktionelle Unterschiede zwischen dem vorliegenden inflammatorischen Cytokin und den aus dem Stand der Technik bekannten Mediatorfaktoren, wie es durch die Daten, die in dem Beispiel dargestellt werden, bestätigt wird.
Insbesondere besitzt das infiammatorische Cytokin der vorliegenden Erfindung bestimmte andere Eigenschaften in Verbindung mit denen, die oben ausgeführt wurden, da es in der Lage ist, an Heparin bei hohen Salzkonzentrationen zu binden, d.h. bei annähernd 0,7 M. Ein weiteres Kennzeichen des vorliegenden infiammatorischen Cytokins ist, daß es unter physiologischen Bedingungen anionisch ist. Das Cytokin ist auch in solchen Aktivitäten unterscheidbar, die ihm fehlen, wie die Unfähigkeit das anabolische Enzym Lipoproteinlipase (LPL) zu supprimieren, die Cytotoxizität von Cachectin/TNF-empfindlichen L929-Zellen zu verursachen, die Blastogenese von Endotoxin- resistenten C3H/HeJ Thymocyten zu stimulieren oder die Herstellung von Cachectin/TNF durch primäre Thioglycolat- induzierte Mausmacrophagenzellen zu induzieren. All diese letzteren Aktivitäten sind solche, die von den anderen bekannten Macrophagen-abstarnmenden Mediatorfaktoren geteilt werden, deren allgemeine Eigenschaften und Aktivitäten diese als Teilnehmende bei der Wirtsantwort gegenüber einer Invasion identifiziert haben. Dieses unterscheidet demzufolge das vorliegende inflammatorische Cytokin von solchen bekannten Faktoren und bestätigt in Verbindung mit der cDNA und den hier dargestellten Proteinsequenzdaten, daß das vorliegende inflammatorische Cytokin in der Tat von den anderen Macrophagen-abstammenden Mediatorfaktoren verschieden ist.
Das inflammatorische Cytokin wurde in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung aus Mäusen isoliert und analysiert wie in dem Beispiel hier ausgeführt ist. Weitere Arbeit, die in bezug auf Klonierung und Sequenzierung der cDNA des Boten für die bestimmten Polypeptide des inflammatorischen Cytokins nach dem Abschluß der in dem Beispiel ausgeführten Experimente durchgeführt wurde, hat zu der Aufklärung der vollständigen Sequenz der Peptide MIP-1α und MIP-1β geführt, und deren Sequenzen werden hier in den Figuren 10 und 15 entsprechend dargestellt. Deshalb hat man bestimmt, daß das gereinigte inflammatorische Protein durch zwei Sequenzen mit jeweils 69 Aminosäuren bestimmt ist.
Eine cDNA Library wurde von Endotoxin-stimulierten RAW 264.7 Zellen hergestellt und wurde unter Verwendung von zwei synthetischen Oligonukleotidpoolen, die auf der N-terminalen "Haupt"aminosäureteilsequenz des MIP- 1 basierten, durchsucht. Von der so klonierten cDNA wurde gezeigt, daß sie der Peptidkette, die nun als MIP-1α bekannt ist, entspricht. Die cDNA für MIP-1β wurde unter Verwendung einer ähnlichen Strategie kloniert, obwohl hier der Oligonukleotidpool verwendet wurde, der von einem Teil des Moleküles abgeleitet wurde, bei dem drei der sieben Aminosäurereste verschieden von den entsprechenden Resten bei MIP-1α sind.
Die cDNA für MIP-1α sagt ein reifes Protein von 69 Aminosäuren in der Länge mit einem vorhergesagten Molekulargewicht von 7889 voraus. Es gibt keine apparenten N-Glykosylierungsstellen. Die cDNA für MIP-1β sagt auch ein reifes Protein von 69 Aminosäuren in der Länge mit einem vorhergesagten Molekulargewicht von 7832 Dalton voraus, bei dem es eine mögliche N-Glykosylierungsstelle (Asn-Pro-Ser) an den Positionen 53 bis 55 gibt. Da das MIP-1β auf der SDS-PAGE als ein leicht größeres Molekül als MIP-1α läuft, ist es möglich, daß es glykosyliert ist. Es ist bekannt, daß Prolin an der Position X in dem Asn-X-Ser/Thr-Signal für N- verknüpfte Glykosylierung zu einer beeinträchtigten oder nichtvorhandenen Glykosylierung an dieser Stelle führt. Dieses könnte für den relativ kleinen Unterschied in dem Molekulargewicht zwischen MIP-1α und MIP-1β verantwortlich sein, wenn das letztere glykosyliert sein sollte.
Es werden nun Experimente durchgeführt, um die rekombinante Form von diesem offenbarten Protein zu exprimieren. Das humane infiammatorische Cytokin MIP-1 ist vermutlich dem Maus MIP-1 ähnlich, da das Maus MIP-1 eine Wirkung auf humane Neutrophile hat. Wie hier offenbart, kann diese Aktivität des inflammatorischen Cytokins durch Verabreichen des inflammatorischen Cytokins an die Stellen einer Infektion des Gewebes nutzbar gemacht werden, um die Freisetzung von Neutrophilen an dieser Stelle zu fördern.
Die genetische Replikation des inflammatorischen Cytokins umfaßt viele der allgemeinen Prinzipien der rekombinanten Technik, die im Stand der Technik wohl bekannt sind, und demzufolge scheint eine genaue Darstellung von solchen Techniken nicht notwendig zu sein und wird hier nicht dargestellt. Die vorliegende Erfindung beabsichtigt jedoch die Herstellung des vorliegenden inflammatorischen Cytokins und insbesondere des Materials, das die Aminosäuresequenzen, die in den FIGUREN 10 und 15 dargestellt sind, aufweist, über bekannte rekombinante Techniken. Die Herstellung des inflammatorischen Cytokins wurde in Kürze vorher hier diskutiert, und es wird bestatigt, daß sie hinsichtlich eines Aspektes des Verfahrens über den Beginn der Inkubation einer Vielzahl von Zellen mit Stimulatormaterialien wie die eines invasiven Stimuli durchführbar ist. Insbesondere kann die Zellinie RAW 264.7 verwendet werden, um die Herstellung des Mediatorstoffes, aus dem das inflammatorische Cytokin isoliert werden kann, zu starten. Die Mausmacrophagenzellinie RAW 264.7 hat die Isolierung des inflammatorischen Cytokins in Mengen, die groß genug sind, um die Analyse und Reinigung zu erlauben, ermöglicht. Natürlicherweise werden andere Zellinien oder andere Quellen für die Gewinnung von entweder des Materials, aus dem das inflammatorische Cytokin später isoliert wird (Mediatorstoff) 1 oder des inflammatorischen Cytokins oder dessen aufbauenden Peptide hier betrachtet, und die vorliegende Erfindung ist demzufolge nicht begrenzt. So werden in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung alternative Mittel wie über die genetische Replikation hiermit beansprucht.
Wie vorher diskutiert, kann das inflammatorische Cytokin, dessen aufbauende Peptide, (dessen) deren Bindungspartner oder andere Liganden oder Mittel, die entweder eine Nachahmung oder einen Antagonismus gegenüber dem Cytokin zeigen oder dessen Herstellung kontrollieren, in pharmazeutischen Zusammensetzungen mit einem geeigneten Träger und in einer Stärke, die für die Verabreichung über verschiedene Mittel an einen Patienten mit einer Infektion des Gewebes oder einem anderen pathologischen Mißzustand und für deren Behandlung wirksam ist, hergestellt werden. Eine Vielzahl von Verabreichungstechniken, unter denen sich topische Verabreichungen wie Salben oder chirurgische und andere topische Mittel wie chirurgische Schwämme, Verbände, Gazetupfer und ähnliches befinden, können verwendet werden. Auch solche Zusammensetzungen können über parenterale Techniken wie subkutane, intravenöse und intraperitoneale Injektionen verabreicht werden einschließlich der Freisetzung aus einer Spülflüssigkeit, die verwendet wird, um verletzte Körperbereiche zu waschen, Katheterisierung und ähnliches. Die Durchschnittsmengen des inflammatorischen Cytokins und/oder der oben erwähnten verwandten Mittel kann variieren und sollte im besonderen auf die Empfehlungen und Verschreibung eines qualifizierten Arztes oder Veterinärmediziners zurückgeführt werden.
Wie oben ausgeführt und vorher angegeben, können Antikörper und Drogen, die die Herstellung und Aktivität des inflammatorischen Cytokins modulieren, bestimmte therapeutische Anwendungen haben und können daher für den Zweck der Behandlung der Auswirkungen, die der Wirkung des inflammatorischen Cytokins wie Entzündung und Fieber zuzuordnen sind, verwendet werden. Insbesondere kann das inflammatorische Cytokin verwendet werden, um Antikörper gegen es selbst in einer Vielzahl von Säugetieren über bekannte Techniken wie die Hybridomatechnik, wobei man zum Beispiel fusionierte Mausmilzlymphozyten und Myelomazellen verwendet, herzustellen. Die sich ergebenden Antikörper können dann in einer geeigneten pharmazeutischen Zusammensetzung hergestellt und verabreicht werden, um den ungewünschten Zustand abzuwenden oder zu behandeln. Die genauen Mengen, Verabreichungsintervalle und Verabreichungstechniken, die solche pharmazeutischen Zusammensetzungen betreffen, können in Übereinstimmung mit denen, die im medizinischen Stand der Technik bekannt sind und in bezug auf die spezifischen Anweisungen eines qualifizierten Arztes oder Veterinärmediziners variieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vielzahl von diagnostischen Anwendungen, einschließlich Verfahren für die Bestimmung des Vorhandenseins von invasiven Stimuli unter Bezug auf deren Fähigkeit, die Aktivitäten, die durch das vorliegende inflammatorische Cytokin beinflußt werden, hervorzurufen. Wie vorher erwähnt, kann das inflammatorische Cytokin verwendet werden, um Antikörper gegen es selbst über eine Vielzahl von bekannten Techniken zu erzeugen, und solche Antikörper können dann isoliert und in Untersuchungen in bezug auf das Vorhandensein des inflammatorischen Cytokins in verdächtigen Säugetieren verwendet werden.
Der (die) Antikörper gegen die Peptide des inflammatorischen Cytokins können über Standardverfahren einschließlich der gut bekannten Hybridomatechniken hergestellt und isoliert werden. Aus Bequemlichkeit werden der (die) Antikörper gegen die inflammatorischen Cytokine hierin als Ak, und der (die) Antikörper, der (die) in anderen Spezien hervorgerufen wurde(n) als Ak&sub2; bezeichnet.
Das Vorhandensein der inflammatorischen Cytokinaktivität in Säugetieren kann über die gewöhnlichen immunologischen Verfahren, die für solche Bestimmungen anwendbar sind, ermittelt werden. Eine Anzahl von verwendbaren Verfahren sind bekannt. Drei der Verfahren, die besonders verwendbar sind, verwenden entweder das inflammatorische Cytokin, das mit einer nachweisbaren Markierung markiert ist, den Antikörper Ak&sub1;, der mit einer nachweisbaren Markierung markiert ist oder den Antikörper Ak&sub2;, der mit einer nachweisbaren Markierung markiert ist. Die Verfahren können durch die folgenden Gleichungen zusammengefaßt werden, wobei die Sternchen anzeigen, daß das Partikel markiert ist, und wobei "Cyt" für das inflammatorische Cytokin steht:
A. Cyt* + Ak&sub1; = Cyt*Ak&sub1;
B. Cyt + Ak* = CytAk&sub1;*
C. Cyt + Ak&sub1; + Ak&sub2;* = CytAk&sub1;Ak&sub2;*
Die Verfahren und deren Anwendung sind für alle Fachleute vertraut und werden hier als veranschaulichend und nicht beschränkend für die Verfahren, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, dargestellt. Das "kompetitive" Verfahren, das Verfahren A, ist in den US- Patenten mit den Nrn. 3,654,090 und 3,850,752 beschrieben. Das Verfahren C, das "Sandwich" Verfahren, ist in den US-Patenten mit den Nrn. RE 31,006 und 4,016,043 beschrieben. Es sind noch andere Verfahren bekannt, wie der "doppelte Antikörper" oder das "DASP" Verfahren.
In jedem Beispiel bildet das inflammatorischen Cytokin Komplexe mit einem oder mehreren Antikörper(n) oder Bindungspartnern, und ein Mitglied des Komplexes ist mit einer nachweisbaren Markierung markiert. Die Tatsache, daß ein Komplex gebildet wurde und, wenn gewünscht, die Menge davon kann über die bekannten Verfahren, die für den Nachweis von Markierungen anwendbar sind, bestimmt werden.
Aus dem obigen kann gesehen werden, daß es eine kennzeichnende Größe des Ak&sub2; ist, daß er mit Ak&sub1; reagiert. Dies ist, weil die Antikörper, die in einer Säugetierspezies hervorgerufen wurden, in einer anderen Spezies als ein Antigen verwendet wurden, um Antikörper wie Ak&sub2; zu erzeugen. Zum Beispiel kann der Ak&sub2; in Ziegen unter Verwendung von Kaninchenantikörpern als Antigene erzeugt werden. Der Ak&sub2; würde daher ein anti- Kaninchenantikörper sein, der in Ziegen erzeugt wurde. Für die Zwecke dieser Beschreibung und Ansprüche wird der Ak&sub1; als ein primärer oder antiinflammatorischer Cytokinantikörper bezeichnet, und der Ak&sub2; wird als ein sekundärer oder anti-Ak&sub1; Antikörper bezeichnet.
Die Markierungen, die üblicherweise für diese Studien verwendet werden, sind radioaktive Elemente, Enzyme, Chemikalien, die fluoreszieren, wenn sie mit ultraviolettem Licht bestrahlt werden, und andere.
Eine Anzahl von fluoreszierenden Materialien sind bekannt und können als Markierung verwendet werden. Diese beinhalten zum Beispiel Fluoreszein, Rhodamin und Auramin. Ein besonderes Nachweismaterial ist ein anti-Kaninchenantikörper, der in Ziegen hergestellt wurde und mit Fluoreszein über ein Isothiocyanat verbunden wurde.
Die Peptide des inflammatorischen Cytokins oder dessen (deren) Bindungspartner kann (können) auch mit einem radioaktivem Element oder mit einem Enyzm markiert sein. Die radioaktive Markierung kann über jede der zur Zeit verfügbaren Zählverfahren nachgewiesen werden. Die bevorzugten Isotope können aus ¹&sup4;C, ¹³¹I, ³H, ¹²&sup5;I und ³&sup5;S ausgewählt werden.
Enzymmarkierungen sind ebenso verwendbar und können über jede der zur Zeit verwendeten kolorimetrischen, spektrophotometrischen, fluorospektrophotometrischen oder gasometrischen Techniken nachgewiesen werden. Das Enzym ist an das ausgewählte Partikel über eine Reaktion mit Brückenmolekülen wie Carbodiimide, Diisocyanate, Glutaraldehyd und ähnliche gekoppelt. Viele Enzyme, die bei diesen Verfahren verwendet werden können, sind bekannt und können verwendet werden. Die bevorzugten sind Peroxidase, β-Glukuronidase, β-D- Glukosidase, β-D-Galaktosidase, Urease, Glukose-Oxidase sowie Peroxidase und alkalische Phosphatase. Auf die US-Patentnummern 3,654,090; 3,850,752 und 4,016,043 wird als Beispiel hiermit hinsichtlich deren Offenbarung in bezug auf alternatives Markierungsmaterial und Verfahren Bezug genommen.
Ein besonderes Untersuchungssystem, das in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung entwickelt und verwendet wird, ist als ein Rezeptortest bekannt. In einem Rezeptortest wird das Material, das untersucht wird, geeignet markiert, und dann werden bestimmte zelluläre Testkolonien mit einer Menge des sowohl markierten als auch unmarkierten Materials beimpft, wonach Bindungsstudien durchgeführt werden, um das Ausmaß zu bestimmen, in dem das markierte Material an die Zellrezeptoren bindet. Auf diesem Weg können Unterschiede in der Affinität zwischen Materialien ermittelt werden.
Demzufolge kann eine gereinigte Menge des inflammatorischen Cytokins radioaktiv markiert werden, wonach Bindungsstudien unter Verwendung von zum Beispiel vor kurzem differenzierten Neutrophilen ausgeführt werden würden. Es würden dann Lösungen hergestellt werden, die verschiedene Mengen des markierten und nichtmarkierten inflammatorischen Cytokins enthalten und unbekannte Zellproben würden dann beimpft und danach inkubiert werden. Die sich ergebenden Zellmonolayer würde dann gewaschen, aufgelöst und dann in einem Gammacounter über eine Zeitspanne, die ausreichend ist, um einen Standardfehler von < 5% zu ergeben, gezählt werden. Diese Daten würden dann einer Scatchard-Analyse unterworfen werden, wonach Bewertungen und Schlußfolgerungen in bezug auf die Materialaktivität gezogen werden können. Während das vorstehende Protokoll beispielhaft ist, veranschaulicht es die Art in der ein Rezeptortest in dem Beispiel, wo die zelluläre Bindungsfähigkeit des untersuchten Materials als eine Unterscheidungseigenschaft dient, durchgeführt und verwendet werden kann.
In einer weiteren Ausführungsform dieser Erfindung können im Handel erhältliche Testkits, die für die Verwendung durch einen medizinischen Fachmann geeignet sind, hergestellt werden, um das Vorhandensein oder die Abwesenheit eines inflammatorischen Cytokins in einem verdächtigen Säugetier zu bestimmen. Zum Beispiel wird eine Klasse von solchen Kits wenigstens eine markierte Komponente enthalten, die ausgewählt wird aus dem inflammatorischen Cytokin oder dessen Bindungspartner, zum Beispiel ein dafür spezifischer Antikörper, und Anweisungen, die natürlich von dem ausgewählten Verfahren abhängen, z.B. "kompetitiv", "Sandwich", "DASP" und ähnlichen. Die Kits können auch zusätzliche Reagenzien wie Puffer, Stabilisatoren, etc. enthalten.
Demzufolge kann ein Testkit für den Nachweis der Reaktion eines Säugetierwirtes gegenüber invasiver Stimuli hergestellt werden, umfassend:
(a) eine vorbestimmte Menge von wenigstens einer markierten immunchemisch reaktiven Komponente, erhalten durch die direkte oder indirekte Anbringung des vorliegenden inflammatorischen Cytokins oder eines spezifischen Bindungspartners dafür an eine nachweisbare Markierung;
(b) andere Reagenzien; und
(c) Anweisungen für die Verwendung des Kits.
Insbesondere kann das diagnostische Testkit umfassen:
(a) eine bekannte Menge des inflammatorischen Cytokins wie oben beschrieben (oder eines Bindungspartners), das im allgemeinen an eine feste Phase gebunden ist, um ein Immunosorbens zu bilden, oder das als Alternative an eine geeignete Markierung gebunden ist, oder mehrere von solchen Endprodukten, etc. (oder deren Bindungspartnern) jeweils eins von jedem;
(b) wenn notwendig andere Reagenzien; und
(c) Anweisungen für die Verwendung des Testkits.
In einer weiteren Abwandlung kann das Testkit für die oben angegebenen Zwecke hergestellt und verwendet werden, die gemäß einem vorgegebenen Protokoll (z.B. "kompetitiv", "Sandwich", "doppelte Antikörper", etc.) funktionieren, und das umfaßt:
(a) eine markierte Komponente, die durch Kopplung des inflammatorischen Cytokins an eine nachweisbare Markierung erhalten wurde;
(b) eine oder mehrere immunchemische Reagenzien, von denen wenigstens ein Reagens ein Ligand oder eine immobilisierter Ligand ist, wobei der Ligand aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus:
(i) einem Liganden, der in der Lage ist, an die markierte Komponente (a) zu binden;
(ii) einem Liganden, der in der Lage ist, an einen Bindungspartner der markierten Komponente (a) zu binden;
(iii) einem Liganden, der in der Lage ist, an wenigstens eine (der) Komponente(n), die bestimmt wird (werden), zu binden; und
(iv) einem Liganden, der in der Lage ist, mit wenigstens einem der Bindungspartner von wenigstens einer (der) Komponente(n), die bestimmt wird (werden), zu binden; und
(c) Anweisungen für die Durchführung eines Protokolls für den Nachweis und/oder die Bestimmung von einer oder mehreren Komponenten einer immunchemischen Reaktion zwischen dem inflammatorischen Cytokin und einem spezifischen Bindungspartner dafür.
In Übereinstimmung mit dem obigen kann ein Untersuchungssystem für das Screening von möglichen Drogen, die wirksam sind, die Synthese, Freisetzung oder Aktivität des inflammatorischen Cytokins zu modulieren, hergestellt werden. In einem ersten Verfahren könnte die Testdroge an eine stimulierte Macrophagenprobe verabreicht werden, um deren Wirkung auf die Herstellung des inflammatorischen Cytokins zu bestimmen. In einem alternativen Verfahren kann das inflammatorische Cytokin in ein zelluläres Testsystem wie Neutrophile eingebracht werden, und die voraussichtliche Droge kann auch in die Zellkultur eingebracht werden, und die Kultur wird danach untersucht, um Änderungen in der Aktivität des inflammatorischen Cytokins zu bestimmen, die sich entweder aus der Zugabe der voraussichtlichen Droge allein oder aus der Wirkung der zugegebenen Mengen des bekannten inflammatorischen Cytokins ergeben.
Die reifen Aminosäuresequenzen, die in den FIGUREN 8A und 8B gezeigt sind, sind nur veranschaulichend für die in der vorliegenden Erfindung verwendbaren Proteine, und ähnliche Sequenzen können sich bei Proteinen ergeben, die im wesentlichen eine äquivalente oder geänderte Aktivität verglichen mit dem, was in den FIGUREN 8A und 8B dargestellt ist, haben. Diese Veränderungen können wohlüberlegt sein, wie zum Beispiel solche Veränderungen, die über gezielte Mutagenese erhalten werden, oder können zufällig sein, wie solche, die durch Mutationen in Wirten, die MIP-1 Hersteller sind, erhalten werden. Alle diese Veränderungen sind in der vorliegenden Erfindung so lang eingeschlossen, wie die wie oben definierte MIP-1 ähnliche Aktivität erhalten wird. Demzufolge schließt die Definition von MIP-1 und die Bezeichnung "inflammatorisches Cytokin" wie hierin verwendet spezifisch Proteinmaterial mit Peptidkomponenten, die eine Aminosäuresequenz haben, die im wesentlichen äquivalent zu der in den FIGUREN 8A und 8B sind, entweder einzeln oder in Kombination ein.
Ähnlich ist es beabsichtigt, die Bezeichnung "Stimulus" oder dessen Plural auf invasive Ereignisse wie Infektion als auch auf Zustände, die durch Verletzung verursacht sind, und auf idiopathische oder spontane Zustände, die zum Beispiel aus zellulären oder metabolischen Mißzuständen oder anderen Ursachen hervorgehen, anzuwenden.
Wie vorher angegegeben führt das folgende Beispiel die Details der Isolierung und Identifizierung des vorliegenden inflammatorischen Cytokins und die Beobachtungen auf, die zu deren Aktivität angegeben werden, die sowohl die Unterschiede als auch die Ähnlichkeiten in der Aktivität zwischen dem vorliegenden inflammatorischen Cytokin und solchen Faktoren, die früher sowohl durch die Anmelder als auch von anderen auf diesem Gebiet identifiziert wurden. Natürlich sind die spezifischen Materialien und Techniken, die im folgenden dargestellt werden, nur beispielshaft und können variieren, so daß das folgende als veranschaulichend, aber nicht als beschränkend für die vorliegende Erfindung dargestellt ist.

Beispiel

Die folgenden Experimente wurden durchgeführt, um das inflammatorische Cytokin der vorliegenden Erfindung zu identifizieren und weiter zu charakterisieren. Zu Beginn wurde der Mediatorstoff kultiviert, das inflammatorische Cytokin wurde isoliert und dessen Struktur dann bestimmt, wonach eine Vielzahl von Untersuchungen in dem Bemühen durchgeführt wurden, dessen Aktivitäten zu klären und, wenn möglich, die Identität mit anderen bekannten Macrophagen-abstammenden Faktoren festzustellen oder zu wiederlegen.

Materialien und Verfahren

Materialien - Gereinigtes, rekombinantes humanes Cachectin/TNF wurde von der Chiron Corp., Emeryville, CA erhalten. Gereinigtes, rekombinantes humanes IL-1α war das großzügige Geschenk von Dr. P. Lomedico (Hoffmann LaRoche, Nutley, NJ).
Alle Chemikalien waren in den höchsten Reinheitsgraden, die von den Händlern erhältlich waren.
Tiere - C3H/HeN Mäuse wurden vom Charles River (Kingston, NY) erhalten. Mäuse des Endotoxin-resistenten C3H/HeJ Stammes wurden von den Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) erhalten.
Zellkultur - Die Mausmacrophagenzellinie RAW 264.7 und die Cachectin/TNF empfindliche Zelline L929 wurden von der American Type Culture Collection (Rockville, MD) erhalten und entsprechend in RPMI 1640 oder Dulbeccos modifiziertem MEM ((DMEM) GIBCO, Grand Island, NY) gehalten. Beide Medien wurden mit 20 mM Hepes und 10% fötalem Rinderserum (Hydone, Logan, UT) ergänzt. Für die Herstellung von stimulierten RAW 264.7 Überständen wurden die Zellen in 150 mm Gewebekulturplatten (Falcon) in RPMI mit 10% fötalem Rinderserum gezogen, bis sie Konfluenz erreichten. Die Zellen wurden fünfmal in Hank's balanced salt solution gewaschen und das Medium wurde durch serumfreies RPMI, das mit 1 µg/ml des Lipopolysaccharids (LPS W, E. coli 0127:B8, Difco, Detroit, MI) ergänzt war, ersetzt. Die Zellen wurden bei 37ºC für 16 bis 18 Stunden inkubiert, und die Überstände wurden durch 0,22 µm Filter filtriert.
Reinigung von MIP-1 - Ein bis fünf Liter des Überstandes an Mediatorstoff wurde 16-40-fach in einem DC2 Hohlfaserkonzentrationssystem mit einem Ausschlußmolekulargewicht von 10000 Dalton (Amicon Corp., Lexington, MA) konzentriert und gegen sechs Liter 20 mM Tris- Puffer, pH 8,0 unter Verwendung der gleichen Vorrichtung diafiltriert. Octylglykosit wurde zu dem konzentrierten diafiltrierten Überstand in einer Endkonzentration von 1% (w/v) gegeben, und die Mischung wurde auf eine Mono Q 10/10 (Anionenaustauscher (Pharmacia, Rahway, NJ)) Säule gegeben, die zuvor mit 20 mM Tris-Puffer, pH 8,0 äquilibriert wurde, und diese wurde mit einer Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC, Pharmacia) Vorrichtung verbunden. Ein linearer Gradient von 114 ml (Gesamtvolumen) von 0 bis 1 M NaCl in dem gleichen Puffer (und bei einer Flußrate von 2 ml/min.) wurde für die Elution verwendet.
Proben von jeder Fraktion wurden einer Polyacrylamidgel- Elektrophorese in einem denaturierenden System, das Natriumdodecylsulfat (SDS-PAGE) in 10 bis 15% oder 10 bis 18% linearen Gradientenflachgelen unter reduzierenden Bedingungen enthält, unterworfen. Die Molekulargewichtmarker (BRL, Inc. Bethesda, MD) liefen parallel dazu. Die Fraktionen, die MIP-1 enthielten, eluierten in dem gleichen Bereich wie Cachectin/TNF und wurden als ein characteristisches Paar mit einem Molekulargewicht von annähernd 8000 leicht erkannt.
Die MIP-1 enthaltenden Peakfraktionen (wie über SDS-PAGE und Silberanfärbung ermittelt) wurden vereinigt, konzentriert und auf einer Hochdruckgelfiltrationssäule (Superose 12; Pharmacia) fraktioniert, die zuvor mit 100 mM Ammoniumacetat äquilibriert wurde. Das MIP-1 wurde in dem Leervolumen der Säule wiedergewonnen und war zu mehr als 95% rein, wie über die SDS- PAGE und Silberanfärbung beurteilt wurde. Das MIP-1, das auf diese Weise gereinigt wurde, enthielt annähernd 0,2 ng LPS/µg MIP-1.
Heparinchromatographie - Heparin-konjugierte Sepharose (Pharmacia) wurde verwendet, um die Fähigkeit von MIP-1, an Heparin zu binden, zu untersuchen. Eine C10/20 Säule (Pharmacia), die mit 8 ml Gel gefüllt war, wurde an ein FPLC- Gerät angeschlossen und mit 20 mM Tris, pH 8,0 äquilibriert Zwei ml des 12-fach konzentrierten und diafiltrierten RAW 264.7 Überstandes (siehe oben) wurden auf die Säule aufgebracht, und es wurde ein linearer Gradient von 0 bis 2 M NaCl in dem gleichen Puffer für die Elution verwendet.
Chromatofocussierung - Acht Microgramm einer MIP-1 enthaltenden Peakfraktion der Mono Q Chromatographie wurden in 25 mM bis- Tris mit 10% Betain (w/v), pH 7,1 äquilibriert und auf eine Mono P Säule, die zuvor mit dem gleichen Puffer äquilibriert wurde, aufgebracht. Das Protein wurde mit einem linearen Gradienten des Polypuffers 74 (Pharmacia) (1:10 in zweifach destilliertem Wasser) mit 10% Betain (pH 4,0), was zu einem abfallenden pH Gradienten in dem Bereich von 7 bis 4 führte, eluiert.
Proteinbestimmung - Der Proteingehalt wurde durch einen Test (Bradford, M., ANAL. BLOCH. 72:248-254, (1976)) unter Verwendung von BSA als Standard (Bio-Rad. Richmond, CA) bestimmt.
Endotoxinbestimmung - Die Endotoxinspiegel wurden unter Verwendung eines farbbildenden Limulustestes (Whittaker M.A. Bioproducts, Walkersville, MD) gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt.
Proteinsequenzierung - Gereinigtes MIP-1 wurde von der Proteinsequenzierungseinrichtung der Rockefeller Universität sequenziert. Die Dayhoff Proteinsequenzdatenbank wurde nach homologen Aminosäurensequenzen unter Verwendung des Computerprogrammes d-FAST-P durchsucht.
In Vivo inflammatorische Aktivität - Die polymorphkernige Leukocyten (PMN) Infiltration wurde unter Verwendung von Fußballeninjektionen gemäß Granstein, R.D., et al., J. CLIN. INVEST. 22:1020-1027 (1986) bewertet. In Kürze, weibliche C3H/HeJ Mäuse (6 - 12 Wochen) wurden mit Phenobarbital (25 mg/kg Körpergewicht, i.p.) leicht anästhesiert. Die Tiere wurden zufällig angeordnet, damit sie eine subkutane Fußballeninjektion von 0,05 ml erhalten, die 10&supmin;¹&sup0; Mol N- Formylmethionylleucylphenylalanin (fMLP); 10, 100 oder 1000 ng an rekombinantem humanen IL-1α oder rekombinantem humanen Cachectin/TNF; oder 1, 10, 100 oder 1000 ng an Maus MIP-1 (gereinigt, siehe oben) in RPMI 1640 mit 0,1% fötalem Rinderserum enthielt. RPMI 1640 mit 0,1% fötalem Rinderserum allein diente als eine Kontrolle. In einigen Fällen erhielten die Mäuse die Teststoffe in einen Fußballen des hinteren Gliedes und die Kontroliträger in das anderseitige hintere Glied. In anderen Fällen wurde eine willkürliche Blockanordnung verwendet. Die Mäuse wurden vier Stunden nach der Injektion getötet, und die hinteren Glieder wurden in 10% gepuffertem Formalin fixiert. Die hinteren Glieder wurden entkalkt, in Paraffin eingelegt und dünne Schnitte der Fußballen wurden mit Hämatoxylin und Eosin angefärbt.
In Vitro PMN Migrationsteste - Heparinisiertes venöses Blut wurde von gesunden Freiwilligen erhalten. Die Leukocyten, die mehr als 95% PMNs enthielten, wie über eine Cell Sorter Analyse beurteilt wurde, wurden über Ficoll-Hypaque Dichtegradientenzentrifugation und Dextransedimentation (Klempner, M.S., et al., J. CLIN. INVEST. 64:996-1002 (1979)) isoliert. Die verbliebenen Erythrocyten wurden durch Lyse mit hypotoner Sahne entfernt. Die Zellen wurden in Gey's Balanced Salt Solution (GBSS, pH 7,4) und 2% Rinderserumalbumin (BSA) in einer Endkonzentration von 2,5 x 10&sup6; Zellen/ml resuspendiert.
Die in vitro Chemokinese wurde unter Verwendung einer Veränderung der Technik, die von Boyden (Boyden, S.V., J. EXP. MED. 115:453-466 (1962)) beschrieben ist, untersucht. Die unteren Näpfe der undurchsichtigen Napfkammern wurden mit 25 µl an Puffer, der die Testverbindung, d.h. fMLP (10&supmin;&sup8; M), MIP-1 oder Puffer allein enthielt, be füllt; und die oberen Näpfe wurden mit 45 µl an GBSS/BSA, die 1,1 x 10&sup4; PMNs enthielten, befüllt. Die beiden Näpfe wurden durch eine Cellulosenitratmembran mit einer Porengröße von 3 µm (SM 11302, Sartorius, Westbury, CT) getrennt. Die Kammern wurden bei 37ºC in einer feuchten 50% CO&sub2;-95% Raumluftkammer für 45 Minuten inkubiert. Die Membranen wurden entfernt und gemäß einem vorher beschriebenen Protokoll (Hesse, D.G., et al., J. CLIN. INVEST. 73:1078-1085 (1984)) angefärbt. Die Anzahl von PMNs, die in die Membran wanderten, wurden für alle 10 µM bis zu 130 µm unter Verwendung eines automatisierten Optomax-Abbildungssystems (Optomax, Inc., Hollis, NH) gezählt. Die Wanderung wurde in drei zufällig ausgewählten Feldern für jede Membran mit jeder untersuchten Probe in Triplikaten quantifiziert. Die Chemokinese wurde als die mittlere Distanz, die in die Membran gewandert wurde, bestimmt (ausgedrückt in Prozent), verglichen mit GBSS allein (0%) und der positiven fMLP Kontrolle (1000%).
Die chemokinetischen Daten wurden in Prozenten (Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwertes (SEM)) der chemokinetischen Antwort der Kontrolle ausgedrückt. Eine Einweganalyse der Varianz (one way analysis of variance, ANOVA) wurde verwendet, um die Antwort gegenüber MIP-1 mit der gegenüber GBSS allein in den unteren Näpfen der Kammer zu vergleichen.
Induktion von Wasserstoffperoxidfreisetzung - Die Fähigkeit von MIP-1, die Freisetzung von H&sub2;O&sub2; von anhaftenden humanen PMN oder Monocyten hervorzurufen, wurde über das Verfahren, das kürzlich im Detail beschrieben wurde (Nathan, C.F. 1987, J. CLIN. INVEST. (im Druck), untersucht. In Kürze, PMN und mononukleäre Leukocyten aus heparinisierten oder Citratblut wurden in Neutrophil Isolation Medium (Packard Instrument Co., Downer's Grove, IL) isoliert, gewaschen und mit 1,5 x 10&sup4; PMN oder 2 x 10&sup5; mononukleärer Zellen pro Napfin Flachboden- Polystyrolgewebekulturplatten mit 6 mm Durchmesser, die zuvor mit fötalem Rinderserum beschichtet und umfassend gewaschen wurden, getrennt ausplattiert. Die Untersuchungsmischung enthielt 2,4 nM Scopoletin, 0,5 µg Meerrettichperoxidase, 1 mM Natriumazid und die angegebenen Testmittel in einem Endvolumen von 0,13 ml Krebs-Ringer Phosphatpuffer mit Glukose bei 37ºC. Der Verlust der Fluoreszenz von Scopoletin aufgrund der Oxidation durch H&sub2;O&sub2; wurde in 15- oder 30-Minuten Intervallen in einem Plattenleserfluorometer aufgenommen und über Microcomputer in nM H&sub2;O&sub2; umgerechnet (de la Harpe, J., et al., J. IMMUN. METHODS 78:323-336 (1985)).
IL-1 und Cachectin/TNF Bioteste - MIP-1 wurde auf IL-1 Aktivität über dessen Fähigkeit, die Blastogenese von C3H/HeJ Thymocyten in der Gegenwart von suboptimalen Mengen an Phytohämagglutinin, wie vorher beschrieben (Moldawer, L.L., et al., J. IMMUN. 138:4270-4274 (1987)), zu stimulieren, untersucht.
Die Cachectin/TNF Aktitivität wurde über deren Fähigkeit, Actinomycin D-behandelte L929 Mausfibroblasten (Ostrove, J.M., et al., PROC. SOC. EXP. BIOL. MED. 160:354-358 (1979)) zu töten, untersucht. Annähernd 50000 L929 Zellen wurden in jedem Napf einer 96 Napfplatte (Falcon) in DME Medium, das 1 µg/ml Actinomycin D und ansteigende Mengen an MIP-1 enthielt, ausplattiert. Nach 14 bis 16 Stunden wurde der Farberzeuger (3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolbromid (MTT)) zugegeben und die Zellen für weitere vier Stunden inkubiert. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde über die Fähigkeit der Zellen, den Farberzeuger während dieser Zeitperiode zu reduzieren, über eine Abänderung eines bekannten Verfahrens (Mosmann T., J. IMMUN. METHODS 65:55-63 (1985)) beurteilt. Das Medium wurde abgesaugt und die Zellen mit 0,04 N Salzsäure in Isopropanol lysiert. Nach Zugabe von einem Volumen doppelt destilliertem Wasser wurde das Ausmaß der Reduktion des Farberzeugers durch Lesen der Platten bei O.D. 570/690 unter Verwendung eines automatisierten ELISA-Plattenlesers gemessen, und die Werte wurden mit einer Standardzytotoxizitätskurve verglichen, die auf ähnliche Weise mit rekombinantem humanem Cachectin/TNF erhalten wurde.
Das Cachectin/TNF wurde auch über die Suppression der Lipoproteinlipase bei 3T3-L1 Zellen, wie vorher beschrieben (Beutler, B., et al., J. EXP. MED. 161:984-995 (1985)), untersucht. Die Fähigkeit von MIP-1, in primären Kulturen von Macrophagen Cachectin/TNF zu induzieren, wurde untersucht über die Stimulation von Macrophagen mit einer i.p. Injektion von 2 ml einer sterilen Thioglycolatbrühe (DIFCO) und der Gewinnung der Zellen vier bis sechs Tage später durch peritoneale Spülung. Die Zellen wurden gewaschen und in Serum-freien RPMI resuspendiert und mit 10&sup6; Zellen/Napf in 24- Napfgewebekulturplatten ausplattiert. Die Testsubstanzen (LPS, 0,0001-1 µg/ml; MIP-1, 1 µg/ml) wurden zugegeben und die Zellen bei 37ºC für 18 Stunden inkubiert. Die zelifreien Überstände wurden gesammelt und auf Cachectin/TNF Aktivität über die Cytotoxizität auf L929 Zellen wie oben beschrieben untersucht.
Reinigung von MIP-1α und MIP-1β: Die MIP-1 enthaltenden Fraktionen der Hochdruckgelfiltrationschromatographie über Superose 12 wurden vereinigt, unter Verwendung einer PM-10 Membran in einer Rührzelle (Amicon Corp., Danvers, MA) konzentriert, und gegen 0,01 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,4 diafiltriert. Zwei Komponenten des MIP-1 wurden dann über SDS- Hydroxylapatitchromatographie gemäß einem bekannten Verfahren (Moss, B. and E.N. Rosenblum., J. BIOL. CHEM., 247:5194, (1972)) aufgetrennt. In Kürze, eine 500 µg Teilmenge MIP-1 wurde in 0,01 Natriumphosphatpuffer, pH 6,4, der 1% SDS und 1% Mercaptoethanol enthielt, äquilibriert, und in einem kochenden Wasserbad für zwei Minuten angeordnet. Die Probe wurde sofort 10-fach mit 0,01 M Natriumphosphatpuffer (pH 6,4), der 0,1% SDS und 1,0 mM DTT (Puffer A) enthält, verdünnt, und direkt auf eine Hydroxylapatitsäule (Bio Gel HPHT, Bio-Rad, Richmond, CA), die in Puffer A voräquilibriert war, aufgebracht. Ein 25 ml linearer Gradient von 0,01 M bis 0,35 M Natriumphosphatpuffer (pH 6,4), der 0,1% SDS und 1,0% mM DTT enthielt, wurde für die Elution verwendet.
Proteinsequenzierung: Die N-terminale Aminosäuresequenzanalyse von MIP-1α und MIP-1β wurde auf einem Applied Biosystems Gasphasensequenator durchgeführt. Die Dayhoff Proteinsequenzdatenbank wurde auf homologe Aminosäuresequenzen unter Verwendung des Computerprogrammes d-FAST-P durchsucht.
Hydropathicity Plots: Die Hydropathicity Plots von MIP-1α und MIP-1β wurden über eine Veränderung eines bekannten Algorithmusses (Hopp, T.P. und K.R. Woods., PROC. NATL. ACAD. SCI. U.S.A. 78:3824 (1981)) berechnet.
Konstruktion einer cDNA Library: Eine cDNA Library aus LPS- stimulierten RAW 264.7 Zellen wurde erhalten, wie vorher beschrieben (G. Davatelis, P. Tekamp-Olson, S.D. Wolpe, K. Hermsen, C. Luedke, C. Gallegos, D. Coit, J. Merryweather und A. Cerami, J. EXP. MED., 167:1939-1944 (1988)). In Kürze, konfluente Monolayer von RAW 264.7 Zellen wurden fünfmal in HBSS gewaschen und mit Serum-freiem RPMI 1640 Kulturmedium, das 1,0 µg/ml LPS enthielt, bedeckt. Nach Inkubation bei 37ºC für zwei Stunden wurde die Gesamt-RNA in 6M Guanidiniumthiocyanat (Ullrich, A., J. Shine, J. Chirgwin, R. Pictet, E. Tischer, W. J. Rutter und H.M. Goodman, SCIENCE 196:1313 (1977)) extrahiert. Die Poly(A)+ RNA wurde dann über zwei Oligo(dT)- Zellulosechromatographie-Durchläufe gemäß einer Abänderung eines bekannten Verfahrens isoliert (Maniatis, T., E.F. Fritsch und J. Sambrook, "Molecular Cloning. A Laboratory Manual." Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. Seite 197 (1982)). Doppelsträngige cDNA wurde von der Poly(A)+ selektionierten RNA gemäß einem bekannten Verfahren hergestellt (Gubler, U., und B.J. Hoffman, GENE. 25:263 (1983)). Interne Eco R1-Stellen wurden methyliert, Eco R1-Linker wurden angefügt, und dann wurde die cDNA in die Eco R1-Stellen des Bakteriophagen Lambda gt10 eingefügt (Huynh, T.V., R.A. Young und R.W. Davis, DNA Cloning : A Practical Approach, D.M. Gloves, Hrsg., IRL Press, Oxford. 149 (1985)).
Konstruktion der Sondenpools: Zwei Pools von Oligonukleotidsonden, die der "Haupt"sequenz entsprachen, wurden gemäß Warner, B.D., M.E. Warner, G.A. Karns, L. Ku, S. Brown-Shimer und M.S. Urdea, DNA. 3:401 (1984) gegen die Aminosäuren #22-30 einer aminoterminalen Teilsequenz synthetisiert. Dieser Teil des Polypeptids wurde aufgrund von deren geringeren Degeneration bei der Kodonübersetzung ausgewählt, wenn man diese mit dem Rest der Sequenz vergleicht. Die sich ergebenden Sondenpools sind zwei 512-fach degenerierte Pools mit 26 Nukleotiden in der Länge.
Ein Oligonukleotidsondenpool, der den Aminosäuren 2 bis 8 einer N-terminalen Teilsequenz des MIP-1β entspricht, wurde wie über eine von Warner, B.D., M.E. Warner, G.A. Karns, L. Ku, S. Brown-Shimer und M.S. Urdea, DNA. 3:401 (1984) beschriebene Abänderung synthetisiert. Diese besondere Sequenz wurde ausgewählt, weil sie der Bereich mit der geringsten apparenten Homologie zwischen den MIP-1α und MIP-1β Sequenzen war.
Screening der Library: In bezug auf MIP-1α wurden Abdrücke des Nitrocellulosefilters einer Ausplattierung der Library in geringer Dichte (5 x 10³ pfu/Platte) unter Verwendung des synthetischen Probenpools, der am 5'-Ende mit ³²P-ATP (New England Nuclear, Boston, MA) markiert wurde, hybridisiert. Nach der Hybridisierung wurden die Abdrücke unter Verwendung des Verfahrens von Wood et al. (10) gewaschen. Nach mehreren Screening-Durchgängen wurden 18 rekombinante Phagenklone isoliert und in größerem Umfang für die DNA-Isolierung gezogen.
In bezug auf MIP-1β wurden duplikate Abdrücke des Nitrocellulosefilters der ausplattierten Library (4 x 10&sup5; Plaques) über Nacht bei 42ºC in 4 x SSC, 2x Denhardts Lösung, 40 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, 0,3 mg/ml beschallter Lachssperma-DNA, 0,1% SDS und 2,5 bis 5 x 10&sup4; cpm/ml/Degeneration des ³²P-ATP 5'-endmarkierten synthetischen Oligonukleotidsondenpools hybridisiert. Im Anschluß an die Hybridisierung wurden die Filter gewaschen, wobei die letzten Waschdurchgänge unter Bedingungen einer mäßigen Stringenz durchgeführt wurden: 2 x SSC, 0,1% SDS bei 50ºC. Die Plaques, die auf den Duplikatfiltern positiv waren, wurden einem weiteren Durchlauf einer Ausplattierung in niedriger Dichte und einem Screening unterworfen. Auf diesem Weg wurden unabhängig zwei positive Phagenklone isoliert, aus denen DNA für weitere Analysen isoliert wurde.
DNA Sequenzanalyse: Die cDNA Einfügungen, die analysiert werden sollen, wurde in M13 Phagenvektoren subkloniert, und die DNA Sequenzierung wurde über das Didesoxy-Kettenabbruchsverfahren von Sanger et al. (F. Sanger und S. Nicklen, R. Coulson, PROC. NATL. ACAD. SCI. U.S.A. 74:5463 (1977)) durchgeführt.
Blot Hybridisierungsanalyse - Northern Blot Hybridisierung wurde über eine Anpassung eines bekannten Verfahrens (Lehrach, H., D. Diamond, J.M. Wozney und H. Boedtker, BIOCHEMISTRY. 16:4743 (1977)) durchgeführt. Die Gesamt-RNA von LPS- stimulierten und nichtstimulierten RAW 264.7 Zellen wurde auf 1,2% Agarosegelen elektrophoretisch aufgetrennt und auf Nitrocellulosefilter überführt.
Primerverlängerung - Die synthetischen Oligonukleotidprimer wurden unter Verwendung von [γ-³²P]ATP (3000 Ci/mmol, Amersham Corp., Arlington Heights, IL) und der T4 Polynukleotidkinase endmarkiert. Das Primerverlängerungsverfahren war eine Abänderung eines bekannten Verfahrens (Walker, M.D., T. Edlund, A.M. Boulet und W.J. Rutter, NATURE LOND. 306:557 (1983)).

Ergebnisse

Reinigung von MIP-1 - Wenn die Überstände von stimulierten RAW 264.7 Zellen über Mono Q (Anionenaustauscher) Chromatographie fraktioniert wurden, war das MIP-1 als ein unterscheidbares Paar von ungefähr 8000 Dalton auf der SDS-PAGE nach Silberanfärbung ersichtlich (FIGUR 1). Das MIP-1 eluierte reproduzierbar innerhalb einer Fraktion oder zwei des Cachectin/TNF bei annähernd 0,37 M NaCl, und es schien, daß es in annähernd den gleichen Mengen, wie über Silberanfärbung festgestellt wurde, hergestellt wird.
Die Chromatofocussierung ergab, daß Mono Q-gereinigtes MIP-1 bei einem leicht acideren pH eluierte als Cachectin/TNF. Dieses enspricht einem pI von 4,6 (nicht gezeigt).
Um MIP-1 weiter zu reinigen, wurde dessen Neigung zu aggregieren vorteilhaft genutzt. Es wurde beobachtet, daß die Aggregation des MIP-1 während der Konzentration des Rohmateriales und vor der Diafiltration oder der Fraktionierung auf Mono Q (Daten nicht gezeigt) auftritt. Wenn es über Diafiltration in Phosphat-gepufferter Sahne fraktioniert wird, bildet das MIP-1 Multimere mit verschiedenen Molekulargewichten, die in dem Bereich von annähernd 20000 Dalton bis zu dem Material, das in dem Leervolumen eluiert (≥ 2 X 10&sup6; Dalton; Daten nicht gezeigt) liegen. In 100 mM Ammoniumacetat wird diese Tendenz verstärkt und der Hauptteil des Proteines eluierte in den Hochmolekulargewichtfraktionen (FIGUR 2). Unter diesen Bedingungen wurde MIP-1 mit einer Reinheit von mehr als 95%, wie über SDS-PAGE und Silberanfärbung beurteilt wurde, erhalten.
Die Daten der N-terminalen Aminosäureteilsequenz von gereinigtem MIP-1 (FIGUR 3) ergaben eine einzige Hauptsequenz, obwohl die Sequenzen von zwei getrennten Ansätzen übereinstimmend Nebenaminosäuren an verschiedenen spezifischen Positionen in dem N-terminalen Bereich aufwiesen. Eine Computer-gestützte Analyse dieser Sequenzdaten zeigte keine signifikante Homologie mit irgendeinem früher beschriebenen Protein.
Affinität von MIP-1 für Heparin - Während der Reinigung von MIP-1 wurde dessen Affinität für Heparin (FIGUR 4) bemerkt. Wenn 2 ml von 12fach konzentriertem RAW 264.7 Überstand auf eine Säule gegeben und mit einem linearen Gradienten von 0 bis 2 M NaCl eluiert wurde, war MIP-1 eins von zwei Hauptproteinen, die über SDS-PAGE und Silberanfärbung nachweisbar waren, die bei annähernd 0,7 M NaCl eluierten.
Bestimmung der biologischen Aktivitäten - Bei Konzentrationen, die so hoch wie 20 µg/ml waren, stimulierte gereinigtes MIP-1 nicht die Blastogenese von C3H/HeJ Thymocyten. Rekombinantes humanes IL-1 war auf der anderen Seite in diesem Test bei Konzentrationen von weniger als 10 pg/ml (Daten nicht gezeigt) aktiv. Ähnlich tötete gereinigtes MIP-1 nicht L929 Zellen in der Gegenwart von Actinomycin D, sogar bei Konzentrationen von 1 µg/ml, wobei rekombinantes humanes Cachectin/TNF in der Lage war, bei Konzentrationen von weniger als 15 pg/ml ein Tötung zu induzieren (Daten nicht gezeigt). Weiter induzierte gereinigtes MIP-1 nicht die Runterregulation von Lipoproteinlipase in 3T3- L1 Zellen (Daten nicht gezeigt). Bei 1 µg/ml induzierte gereinigtes MIP-1 nicht die Herstellung von Cachectin/TNF bei primären Thioglycolat-stimulierten Mausmacrophagen in der Gegenwart von 10 µg/ml Polymyxin B (Daten nicht gezeigt).
Obwohl es frei von den oben erwähnten IL-1 und Cachectin/TNF ähnlichen Aktivitäten ist, induzierte MIP-1 nach vier Stunden eine lokale Entzündungsreaktion, wenn es subkutan in die Fußballen von C3H/HeJ Mäusen injiziert wurde. Eine maximale Entzündung trat auf, wenn 100 ng von MIP-1 verabreicht wurden, und war primär durch eine PMN Leukocyteninfiltration (FIGUR 5, Platte A) gekennzeichnet. Die Reaktion der Kontrolle auf eine Injektion des Trägers ist in Platte B gezeigt. Das Ausmaß an neutrophiler Infiltration, das mit MIP-1 gesehen wurde, war nicht so bedeutend wie das, das gesehen wurde, wenn 10&supmin;¹&sup0; Mol fMLP verabreicht wurden (FIGUR 5, Platte C). Das Ausmaß der neutrophilen Infiltration war jedoch mit dem vergleichbar, das mit 10 ng rekombinantem Cachectin/TNF beobachtet wurde. Rekombinantes humanes IL-1 rief keine inflammatorische Antwort nach vier Stunden hervor, wenn es in diesen Dosen verabreicht wurde (Daten nicht gezeigt).
Das MIP-1 induzierte in vitro eine Chemokinese bei humanen Neutrophilen. Die Daten, die in FIGUR 6 dargestellt sind, stellen den Mittelwert von fünf Experimenten in Prozent der Migrationsantwort der Kontrolle dar. Die Werte werden als Anstiege in Prozent der Migration der Neutrophilen relativ zu der negativen GBSS (0%) und der positiven fMLP 10&supmin;&sup8;M Kontrolle (100%) dargestellt. Bei Konzentrationen gleich oder größer als 100 ng/ml rief das MIP-1 einen signifikanten Anstieg bei der Migration der Neutrophilen (p < 0,01 über ANOVA) hervor.
Der Einschluß von Polymyxin B (10 µg/ml) hatte keine Wirkung auf die MIP-1 induzierte Chemokinese. Weiter war LPS bei Konzentrationen von 10-1000 ng/ml in diesem Test nicht aktiv (Daten nicht gezeigt).
Das rekombinante Cachectin/TNF, aber nicht rIL-1α, löst einen verzögerten aber signifikanten respiratorischen Burst in humanen PMN aus, vorausgesetzt, daß die Zellen auf einer Oberfläche, die mit Serum oder extrazellulären Matrixproteinen (Nathan, C.F. 1987, J. CLIN. INVEST. (im Druck) beschichtet ist, anhaftend sind. Ähnlich stimulierte MIP-1 bei ≥ 1 µg/ml anhaftende PMN in vier Experimenten, von denen eines in FIGUR 7 veranschaulicht ist, daß sie H&sub2;O&sub2; freisetzen. Verglichen mit Cachectin/TNF, das in parallelen Kulturen untersucht wurde, war die Antwort von MIP-1 stärker verzögert (60 Minuten Verzögerung gegenüber 15 Minuten Verzögerung bei Cachectin/TNF), und die maximal andauernde Geschwindigkeit war niedriger (1,2 nmol/min pro 10&sup6; PMN gegen 3.0 bei Cachectin/TNF und 2,1 bei PMA). Die Dauer der Antwort war jedoch größer (2,5 Stunden verglichen mit 1 Stunde für Cachectin/TNF) und so waren die Gesamtmengen an freigesetztem H&sub2;O&sub2; ähnlich. Weil MIP-1 an Heparin bindet, wurden die Experimente auch mit PMN, die aus Citrat- denn aus heparinisiertem Blut isoliert wurden, durchgeführt und ergaben ähnliche Ergebnisse. Weder MIP-1 (nicht gezeigt) noch Cachectin/TNF (Nathan, C.F. 1987, J. CLIN. INVEST. (im Druck)) lösten eine H&sub2;O&sub2; Freisetzung bei Monocyten aus.

Diskussion

Die oben dargestellten Daten zeigen an, daß, während das inflammatorische Cytokin MIP-1 keine signifikante Sequenzhomologie mit einem zuvor beschriebenen Protein aufweist, es einige der überlappenden Eigenschaften, die für inflammatorische Mediatoren wie Cachectin/TNF und IL-1 typisch sind, teilt.
Das MIP-1 wurde auf der Basis von dessen interessanten physikalischen Eigenschaften isoliert. Wie vorher angegeben, bildet es leicht, obwohl das MIP-1 als ein Paar von ungefähr 8000 Dalton auf der SDS-PAGE läuft, hochmolekulargewichtige Aggregate im Überschuß von 2 x 10&sup6; Dalton, wie über die Gelfiltration bestimmt wurde. Die Daten der Aminosäureteilsequenz zeigen eine "Haupt"sequenz mit "Neben"substitut ionen an mehreren Positionen.
Die Bindung von MIP-1 an Heparin unter Bedingungen, wo das Protein anionisch ist, legt eine spezifische Wechselwirkung nahe. Dies wird weiter durch die Beobachtung verstärkt, daß MIP-1 eines von zwei von Macrophagen-sekretierten Hauptproteinen ist, das an Heparin bei hohen Salzkonzentrationen bindet. Es ist möglich, daß MIP-1 eine Rolle bei der Koordination der inflammatorischen Aktivitäten von Macrophagen, Mastzellen und Neutrophilen spielt. MIP-1 kann auch mit Proteoglycanen der Basalmembran während einer Entzündung wechselwirken.
Die hier dargestellten Ergebnisse sind übereinstimmend mit dem Vorschlag, daß entweder Cachectin/TNF oder MIP-1 in der Lage sind, eine inflammatorische Antwort zu induzieren. Man hat von Cachectin/TNF zuvor gezeigt, daß es die neutrophile Chemokinese induziert (Figari, I.S., et al. 1987, BLOOD (im Druck); und Ming, W.J., et al., J. IMMUN. 138:1469-1474, 135:2069-2073 (1985); und Tsujimoto, M., et al., BIOCH. BIOPHYS. RES. COMMUN. 137:1094-1100 (1986)). In der vorliegenden Studie wurde gezeigt, daß MIP-1 auch in der Lage ist, eine neutrophile Chemokinese zu induzieren. Weiterhin rufen bei den hier verwendeten Dosen Cachectin/TNF und MIP-1 in vivo jeweils ähnliche Entzündungsgrade hervor. Obwohl andere gezeigt haben, daß rekombinantes IL-1 eine inflammatorische Reaktion in vivo induzieren kann (Granstein, R.D., et al., J. CLIN. INVEST. 77:1020-1027 (1986)), wurde hier keine solche Wirkung gefunden; es ist möglich, daß das rekombinante humane IL-1α, das hier verwendet wurde, in dieser Hinsicht weniger aktiv als das Maus IL-1α ist, das in den veröffentlichten Experimenten verwendet wurde (Granstein, R.D., et al., J. CLIN. INVEST. 77:1020-1027 (1986)).
Es ist unwahrscheinlich, daß die Wirkungen der MIP-1 Verabreichung auf eine Cachectin/TNF Kontamination zurückzuführen sind, da keine Cachectin/TNF Bioaktivität bei dem L929 Cytotoxizitätstest bei den verwendeten Dosen nachgewiesen wurde. Weiter induzierte MIP-1 nicht primäre Thioglycolat-induzierte Macrophagen, daß sie Cachectin/TNF produzierten. Eine Endotoxinkontamination wurde als eine Erklärung für die chemokinetische Wirkung ausgeschlossen, da die Chemokinese nicht durch Vorhandensein von Polymyxin B beeinflußt wurde; und LPS hatte selbst bei größeren Konzentrationen als bei denen, die bei den MIP-1 Untersuchungen vorhanden waren, keine chemokinetische Wirkung.
Die über MIP-1 induzierte Entzündung wurde in Mäusen des Endotoxin-resistenten C3H/HeJ Stammes unter Verwendung von Aufbereitungen mit niedrigen Gehalten einer Kontamination an Endotoxin (0,2 ng LPS/µg MIP-1) beobachtet.
Wie vorher beschrieben wird das native Maus MIP-1 als ein Paar mit nahezu identischen Molekulargewichten der Untereinheiten von annähernd 8000 Dalton isoliert. Obwohl zwei MIP-1 Komponenten in einem gewissen Ausmaß über die SDS-PAGE getrennt wurden, sind ihre elektrophoretischen Beweglichkeiten so ähnlich, daß eine präperative SDS-PAGE als ein untaugliches Mittel zur Reinigung erschien. Das native MIP-1 (Paar) wurde einer SDS-Hydroxylapatitchromatographie unterworfen, einer Technik, die erfolgreich verwendet wurde, um Proteinuntereinheiten mit ähnlichen elektrophoretischen Beweglichkeiten zu trennen (B. Moss und E.N. Rosenblum, J. BIOL. CHEM. 247:5194 (1972)). Wie in FIGUR 12 gesehen werden kann, werden zwei verschiedene Proteinpeaks nach der Fraktionierung von nativen MIP-1 auf einer Hydroxylapatitsäule in der Gegenwart von SDS beobachtet. Der erste Peak eluiert bei 0,24 M Natriumphosphat, und der zweite Peak eluiert bei 0,27 M Natriumphosphat. Die N-terminale Aminosäure und die SDS-PAGE Analysen der Säulenfraktionen zeigten, daß der erste Peak der niedriger molekulargewichtigen Bande des MIP-1, nun als MIP-1α bezeichnet, entspricht, während der zweite Peak der höher molekulargewichtigen Bande, die als MIP-1β bezeichnet wird, entspricht. Unter Verwendung dieser Technik wurde jede Komponente in reiner Form (> 95% wie über SDS-PAGE beurteilt) für die N-terminale Aminosäuresequenzanalyse erhalten.
Um die molekulare Struktur von Maus MIP-1α zu klären, wurde ein cDNA Klon isoliert, der die für MIP-1α kodierende Sequenz enthielt. Als ein erster Schritt wurde die Mausmacrophagenzellinie RAW 264.7 mit LPS stimuliert. Da von RAW 264.7 Zellen gezeigt wurde, daß sie eine Quelle für das MIP-1α Protein nach LPS Stimulation sind, wurde erwartet, daß die MIP-1α mRNA stark vervielf;ltigt bei diesen LPS-induzierten Zellen vorliegt.
Die Poly(A)+RNA wurde aus der Gesamt-RNA mittels zweier Lambda Oligo-dT-Chromatographie-Durchläufe isoliert, und eine cDNA Library wurde in Lambda gtlo konstruiert. Die Klonierungseffizienz betrug 10&sup6; Klone/µg an Poly(A)+RNA. Die Library wurde vervielfältigt, und es wurde gezeigt, daß sie Einfügungen von mehr als 1000 Bp in ungefähr 60% der Rekombinationsplaques enthielt. Die Abdrücke des Nitrocellulosefilters einer Ausplattierung der Library in niedriger Dichte wurde unter Verwendung von zwei synthetischen Oligonukleotidpools, die auf der Konsensus NH&sub2;-terminalen Aminosäureteilsequenz von gereinigtem MIP-1 (S.D. Wolpe, G. Davatelis, B. Sherry, B. Beutler, D.G. Hesse, H.T. Nguyen, L.L. Moldawer, C.F. Nathan, S.F. Lowrey und A. Cerami, J. EXP. MED. 167:570 (1987)) beruhten, durchsucht. Jeder Pool bestand aus einem 512-fach degenerierten Pool mit 26 Nukleotiden in der Länge (FIGUR 9).
Nach dem anfänglichen Screening der Library wurden positive Plaques auffrischen Bakterienrasen ausgestrichen und mittels differentieller Plaquehybridisierung wurde ein zweites Screening durchgeführt. Replikaabdrücke der zweiten Ausstriche wurden entweder mit dem ³²P-markierten Pool #1 oder Pool #2 hybridisiert. Da die Schmelztemperatur (T) von DNA/DNA Hybriden über die empirische Formel:
T = 16,6(log[Na+]+0,41(%[G+C])+81,5-500/Anzahl von homologen Bp abgeschätzt werden kann, wurde einer der Sondenpools über die differentiellen Schmelztemperaturen der Hybride, die auf einer Homologie von 26 Bp beruhte, wirksam entfernt. Unter Verwendung einer Waschtechnik mit Tetramethylammoniumchlorid (W. Wood, I.J. Gitschier, L.A. Laskey und R.M. Lawn, PROC. NATL. ACAD. SCI. USA. 82:1585 81985)), die das bevorzugte Schmelzen von A-T gegenüber G-C Basenpaaren verhindert, werden die Schmelztemperaturen (Tm) nur von der Länge des Hybrids abhängig.
Nach mehreren Durchgängen der differentiellen Hybridisierung ergab der Sondenpool #1 unter 10&sup4; durchsuchten 18 rekombinante Phagenklone, die unter maximal stringenten Bedingungen für MIP- 1α hybridisierten. Die Plaques wurden alle gereinigt, und von jedem wurde die DNA isoliert. Der rekombinante Phagenklon 52 schien die größte cDNA Eco-RI Einfügung mit ungefähr 750 Bp zu enthalten und wurde für die weitere Charakterisierung ausgewählt. Die vollständige Nukleotidsequenz des cDNA Klones 52 als auch 262 Bp einer 5'-Sequenz eines anderen partiell überlappenden Klones 32 wurden bestimmt und sind in FIGUR 10 dargestellt. Der letztere Klon, der bei einem späteren Screening isoliert wurde, hatte eine kleinere Eco RI-Einfügung als Klon 52, aber ein größeres Fragment am 5'-Ende und deshalb vermutlich einen kürzeren Poly(A) -Bereich. Die MIP-1α Nukleotidsequenz von 763 Bp sagt ein einziges offenes Leseraster, das bei Nukleotid 2 beginnt, voraus. Die reife Proteinsequenz, die an Position 1 beginnt, beträgt 69 Aminosäuren in der Länge und umfaßt die "Haupt"sequenz, die zuvor durch die NH&sub2;-terminale Analyse des gereinigten MIP-1 Proteins definiert wurde (S.D. Wolpe, G. Davatelis, B. Sherry, B. Beutler, D.G. Hesse, H.T. Nguyen, L.L. Moldawer, C.F. Nathan, S.F. Lowrey und A. Cerami, J. EXP. MED. 167.570 (1987)).
Das erste in der Sequenz vorhandene Methionin findet man an Position -23. Von diesem wird postuliert, daß es das Startmethionin für den MIP-1α Vorläufer ist, was auf den folgenden Beobachtungen basiert. Die Strukturanalyse der vermeintlichen Präsequenz (-23 bis -1) zeigt an, daß diese Eigenschaften hat, die für typische Signalsequenzen (d.h. α- Helix und ein hydrohober Kern (D. Perlman und H.O. Halvorson, J. MOLE. BIOL., 167:391 (1983)) kennzeichnend sind. Das vorhergesagte Start-ATG hat ein Purin in der relativen Position -3, von der gezeigt wurde (M. Kozak, CELL. 44:283 (1986)), daß diese einen starken Einfluß auf die Effizienz der Translationsinitation hat. Weiterhin hatten in einer Übersicht bezüglich der Häufigkeit von A,C,T,G um die Translationsstartstelle der mRNAs von 699 Vertebraten herum, 97% ein Purin in Position -3, wobei 61% ein A in dieser Position haben (M. Kozak, NUCLEIC ACIDS RES: 15:8125 (1987)).
Eine Primer-Verlängerungsanalyse wurde auch durchgeführt, um den 5'-Sequenzbereich, der dem cDNA Klon fehlt, zu bestimmen. Ein markierter Oligonukleotid-Primer (FIGUR 10) wurde an die Poly(A)+RNA von LPS-stimulierten RAW 264.7 hybridisiert und mit reverser Transkriptase verlängert. Nach Hybridisierung wurde ein verlängerter Primer von 98 ± 2 Nukleotiden erhalten (Daten nicht gezeigt). Nach Abzug der Primerlänge von 25 Nukleotiden und der 5' vom Primer liegenden Sequenz, die wir zuvor bestimmt hatten (61 Nukleotide), kann man schließen, daß die bekannte Sequenz 10-14 Nukleotide kürzer als eine cDNA in Gesamtlänge ist. Während es möglich ist, daß ein AUG im Leseraster in dieser klonierten Region vorhanden ist, scheint es unwahrscheinlich zu sein, daß nur 14 von 346 sequenzierten mRNAs aus Vertebraten 5'-nichtkodierende Sequenzen mit weniger als 19 Nukleotiden in der Länge haben ((M. Kozak, NUCLEIC ACIDS RES. 15:8125 (1987)). Es kann dann geschätzt werden, daß die 5'-nichttranslatierte Sequenz ungefähr 82 Nukleotide umfaßt, was gut innerhalb der Länge von 20-100 Nukleotiden der 5q nichtkodierenden Regionen, die bis heute sequenziert sind, der meisten Vertebraten liegt.
Das vorgeschlagene prä-MIP-1α umfaßt 92 Aminosäuren in der Länge. Es gibt keine in dem Molekül offensichtliche Konsensusstelle Asn-X-Ser,Thr für N-verknüpfte Glykosylierung. Es gibt 7 Cysteine, 3 in der Präsequenz und 4 in der reifen Sequenz. Der Kodongebrauch des vermeintlichen prä-MIP-1α stimmt gut mit dem überein, was für 66 andere sequenzierte Gene aus der Maus bestimmt wurde (T. Marayama, T. Gojobon, S. Aota, und T. Ikemura, NUCLEIC ACIDS RES. 14 (Suppl.): r151 (1986)). Anfänglich wies das Peptid keine signifikante Sequenzähnlichkeit mit irgendeinem Protein auf, wie zu dieser Zeit über die Homologierecherche mittels des d-fast-P Programms (D.J.Lipman und W. R. Pearson, SCIENCE, 227:1435, (1985)) in der Dayhoff Proteindatenbank bestimmt wurde. Ähnlich wurde auch die DNA-Sequenz mit genetischen Sequenzdaten der GenBank mit einem negativen Ergebnis verglichen.
In der 3'-nichttranslatierten Region gibt es eine einzige Konsensus-Polyadenylierungsstelle von Bp 711 bis Bp 716. Es gibt auch 4 Sequenzen, die nur eine Fehlpaarung zu einer bekannten Konsensus 3'-nichttranslatierten Cytokinsequenz aufweisen (anhängige Anmeldung mit dem Aktenzeichen Nr. 017,360, eingereicht am 24. Februar 1987, wobei die Offenbarung von dieser hiermit unter Bezugnahme aufgenommen ist. Siehe auch D. Caput, B. Beutler, K. Hartog, R. Thayer, S. Brown-Shimer, und A. Cerami, PROC. NATL. ACAD. SCI, 83:1670 (1986)). Die 3'- nichttranslatierte Cytokin-Consensussequenz (TATT)n ist auch vorhanden (R. Reeves, A.G. Spies, M.S. Nissen, L.D. Buch, A.D. Weinberg, P.J. Barr, N.S Maguuson und J.A. Maguuson, PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 83: 3228 (1986)). Wenn n=2 und eine Fehlpaarung erlaubt ist, findet man vier von diesen Sequenzen. Bei drei von diesen gibt es eine Überlappung mit der Sequenz, die von Caput et al. bestimmt wurde, und der, die von Reeves et al. bestimmt wurde.
Da MIP-1 ein induzierbares Protein ist, wurde auch die Expression der Maus MIP-1α mRNA über Northern Blot Hybridisierung bei zellulärer DNA aus RAW 264.7 studiert. Wie in FIGUR 11 gezeigt, zeigte die Gesamt-RNA von LPS-induzierten Zellen eine positive Hybridisierungsbande mit einer geschätzten Größe von 800 Bp, während die Gesamt-RNA von nichtinduzierten Zellen kaum ein positives Signal bei dieser oder irgendeiner anderen Größe zeigte. In einer Zeitverlaufsstudie der Induktion von Maus MIP-1α mRNA über Endotoxin in den gleichen Zellen (FIGUR 12) wird die Maus MIP-1 mRNA innerhalb einer Stunde nach der LPS-Stimulation nachgewiesen und erreicht ein Maximum zwischen 8-16 Stunden nach der LPS-Simulation. Dieser Zeitverlauf unterscheidet sich von dem Auftreten von entweder der Maus TNF-α/Cachectin oder der IL-1α mRNAs, wenn deren entsprechenden Plasmidsonden auf dem gleichen Blot hybridisiert wurden.
Eine mRNA, die von humanen tonsillären Lymphocyten als Antwort auf ein Mitogen produziert wird, wurde von Obaru, M. Fukuda, S. Maeda, und K. Shimada, J. BIOCHEM, 99:885 (1986) berichtet. Während die Sequenz nicht in der Dayhoff Proteindatenbank oder der genetischen Sequenzdatenbank der Genbank aufgeführt ist, ist eine Ähnlichkeit in der Aminosäuresequenz von 75,3% zwischen diesem Protein und dem Maus MIP-1α vorhanden. Die Beziehung zwischen diesen Proteinen ist unbekannt.
Die Ergebnisse der N-terminalen Sequenzanalyse der höher molekulargewichtigen Komponente von MIP-1 (nun als MIP-1α bezeichnet) ist in FIGUR 14B dargestellt. Die "Neben"reste, die an den Positonen 3 und 7 in der ursprünglichen N-terminalen Aminosäurekonsensussequenz beobachtet wurden, entsprechen den Aminosäureunterschieden zwischen MIP-1β und MIP-1α. In FIGUR 14C wird die ursprüngliche N-terrninale Aminosäurekonsensussequenz für natives MIP-1 zum Vergleich angegeben.
Ein cDNA-Klon, der die kodierende Sequenz für MIP-1β enthält, wurde isoliert und charakterisiert. Um dieses zu erreichen, wurde eine cDNA-Library aus LPS-stimulierten RAW 264.7 Zellen hergestellt. Der Oligonukleotidsondenpool, der verwendet wurde, um die cDNA-Library zu durchsuchen, wurde gegen die in FIGUR 14B unterstrichene Sequenz hergestellt. Drei von diesen sieben MIP-1β Aminosäuren unterscheiden sich von der entsprechenden Sequenz des MIP-1α. Der Sondenpool, der für das Screening der Library verwendet wurde, war 5'-CCXATGGGX GA CCXCC-3'. Die Wahl an der dritten Position (*) wurde basierend auf dem Kodongebrauch, der für klonierte Mausgene (F. Sanger, S. Nicklen, und R. Coulson, PROC. NATL. ACAD. SCI. (U.S.A.) 74: 5463, (1977)) und den Kodongebrauch von MIP-1α berichtet wurde, durchgeführt.
Unter Verwendung des markierten Sondenpools wurde die Library unter mäßigen Stringenzbedingungen durchsucht. Zwei unabhängige Klone wurden aus 4x10&sup5; durchsuchten rekombinanten Phagenplaques isoliert. Dieses war eine beträchtlich geringere Frequenz als erwartet. Nach der DNA-Sequenzierung der isolierten Klone fand man, daß die Wahl von C an der dritten Position des Ser5 Kodons nicht korrekt war. Die korrekte Wahl war tatsächlich ein T, wodurch sich keine perfekte Paarung der Sondenpool-Sequenzen an die tatsächliche MIP-1β Sequenz ergab. So ist das Verhandensein der MIP-1β Sequenz in der Library wahrscheinlich unterschätzt worden, was auf die Hybridisierung mit dem obigen Sondenpool zurückzuführen ist. Ein nachfolgendes Screening der Library mit speziellen Oligonukleotidsonden, die spezifisch für vergleichbare Regionen von MIP-1α und MIP-1β sind, zeigt an, daß MIP-1β spezifische Sequenzen 5-mal weniger häufig auftreten als MIP-1α Sequenzen.
Nach der Plaquereinigung hat man von der DNA-Einfügung (=700 Bp) der zwei positiven rekombinanten Phagen gezeigt, daß diese mit der MIP-1α cDNA-Sonde kreuzhybridisisieren. Die cDNA- Einfügung wurde aus jeder rekombinanten Phagenpopulation isoliert und in m13 kloniert, aus dem die vollständige Nukleotidsequenz bestimmt wurde. Die zwei Nukleotidsequenzen unterschieden sich nur in der Länge der vorhandenen 5'- nichttranslatierten Sequenz. Die längere Nukleotidsequenz ist in der FIGUR 15 dargestellt.
Die MIP-1β cDNA hat 650 Basenpaare (wobei über Primer- Verlängerungsanalyse gezeigt wurde, daß diese nicht mehr als 11-12 Nukleotide kürzer ist als eine vollständige cDNA Sequenz). Die Nukleotidsequenz von MIP-1β enthält ein einziges offenes Leseraster, das mit dem ersten ATG-Kodon, das am 5'- Ende der Sequenz (Nukleotide + 62 bis + 64) nach einem im Leseraster befindlichen Stopkodon auftritt, beginnt. Das über dieses Kodon spezifizierte Methionin definiert den Beginn einer vermeintlichen Signalsequenz (die Reste -23 und -1) mit charakteristischen Eigenschaften, die eine α-Helix und eine zentral angeordnete hydrophobe Region einschließen (D. Perlman und H. O. Halvorson, J. MOL. BIOL., 167: 391 (1983)). Die Sequenz, die dieses ATG-Kodon umgibt, paßt zu der Konsensussequenz, die von vielen mRNAs höherer Eukaryoten geteilt wird (M. Kozak, NATURE LONDON. 308:241 (1984)).
Das TGA-Terminationstriplett ist 91 Kodons stromabwärts von dem Startkodon angeordnet. Die 3'-nichttranslatierte Region von MIP-1β umfaßt 315 Nukleotide und enthält das Hexanukleotid AATAAA (Nukleotide +283 bis 288), das der Polyadenylierungsstelle in vielen eukaryotischen mRNAs vorausgeht (N.J. Proudfoot und G. G. Brownlee, NATURE; LONDON 263:211 (1976)).
Es gibt eine einzige Sequenz bei den Nukleotiden +174 bis +181, die genau mit einer bekannten 3'-nichttranslatierten Cytokin- Konsensussequenz (TTATTTAT) paart, die für viele immunmodulatorische Proteine kennzeichnend ist. Außerdem gibt es zwei zusätzlich vorhandene Sequenzen, die eine einzige Fehlpaarung zu dieser Konsensussequenz aufweisen (Nukleotide +165 bis +175 und Nukleotide +185 bis +192).
Die reife Proteinsequenz, die an Position 1 beginnt, umfaßt 69 Aminosäuren in der Länge. Das Molekulargewicht des reifen Proteines beträgt, wie über dessen cDNA-Klon bestimmt, 7832 Dalton, das mit dem über die SDS-PAGE vorhergesagten Molekulargewicht übereinstimmt. Die aus der klonierten DNA- Sequenz vorhergesagte Aminosäuresequenz ist mit den ersten 13 Aminosäuren, die über die N-terrninale Aminosäuresequenzierung des gereinigten nativen MIP-1β erhalten wurden, übereinstimmend.
Das MIP-1β hat eine einzige N-verknüpfte Glykosylierungsstelle, die in dem reifen Protein bei den Aminosäuren 53 bis 55 (Asn- Pro-Ser) vorhanden ist. Ob das native MIP-1 tatsächlich an dieser Stelle glycosyliert ist, ist noch nicht bestimmt worden, aber es ist wohlbekannt, daß Prolin in der Position X des Konsensussignales Asn-X-Ser,Thr für die N-verknüpften Glycosylierung zu einer beeinträchtigten oder zu keiner Glycosylierung an dieser Stelle führt (I. Moronen, und E. Karajalainen, BIOCHEM. BIOPHYS. ACTA., 788:364 (1984)).
Die Hydropathicity-Plots für MIP-1α und MIP-1β, die die vorhergesagten Polaritätsprofile der zwei Proteine einschätzen, sind in FIGUR 16 gezeigt. Aus FIGUR 16 ist klar, daß die örtlichen Polaritätsverteilungen innerhalb des MIP-1α und MIP- 1β auffallend ähnlich sind.
Die vollständige Nukleotidsequenz der MIP-1β-cDNA aus der Maus wurde mit Sequenzen in der Nukleotiddatenbank der Genbank (Nagetier, Primat, andere Säugetiere und andere Vertebraten Libraries) als auch mit der MIP-1α cDNA-Sequenz verglichen (G. Davatelis, P. Tekamp-Olson, S. D. Wolpe, K. Hermsen, C. Luedke, C. Gallegos, D. Coit,J. Merryweather und A. Cerami, J. EXP. MED., 167: 1939-1944 (1988)). Die MIP-1β und MIP-1α cDNAs waren zu 56,7% identisch. Die einzige signifikante Homologie, die in der Genbank gefunden wurde, war der humane LD78 cDNA Klon, der aus einer T-Zell-Lymphocyt cDNA-Library auf der Basis, daß dessen mRNA entweder durch den Tumorpromotor PMA oder durch Phytohämagglutinin induziert wurde, isoliert wurde (K. Obaru, M. Fukada, S. Meada, und K. Shimada, J. BIOCHEM., 99:885 (1986)). Die Maus MIP-1β cDNA wies eine Identität von 57,1% in einer 592 Nukleotid-langen Überlappung mit der humanen LD78 cDNA auf, die Maus MIP-1α cDNA wies eine noch größere Homologie auf, mit einer Identität von 69% in einer 746 Nukleotid-langen Überlappung
Als die vorhergesagte Aminosäuresequenz von MIP-1β auf Homologie mit den Sequenzen in der Dayhoff Datenbank unter Verwendung des p-Fast-D Computer-Homologie-Algorithmusses untersucht wurde, wurde keine umfallend hohe Homologie gefunden. Jedoch zeigt der Vergleich der vorhergesagten Proteinsequenzen von Maus MIP-1β, Maus MIP-1α, humanern LD78 als auch von den kürzlich berichteten vorhergesagten Sequenzen für ein Maus-Cytokin (JE), das induzierbar ist über PDGF, IL-1, oder doppelsträngige RNA (P.R. Burd, G.J. Freeman, S.D. Wilson, M. Berman, R. Dekruyff, P.R. Billings, und M.E. Dorf, J. IMMUNOL., 139:3126 (1987), und ein Maus T- Zellaktivierungsprotein (TCA3) (B. F. Rollins, E. D. Morrison, und C. D. Stiles, PROC. NATL. ACAD. SCI. U.S.A., 85:3738 (1988)), daß diese Proteine bemerkenswert homolog sind. Die von MIP-1β abgeleitete Aminosäuresequenz weist eine Identität von 59,8% zu der von MIP-1α und 58,7%, 38,9% und 31,9% Identität zu den vorhergesagten Aminosäurensequenzen von entsprechend LD78, JE und TCA3. All diesen Sequenzen ist das Vorhandensein von vier konservierten Cysteinen in den jeweils reifen Peptidsequenzen gemeinsam. Interessanterweise ist die vorhergesagte Aminosäuresequenz von Maus MIP-1α homologer zu dem humanen LD78 (75,3% Identität) als sie es zu der vorhergesagten Aminosäuresequenz des Maus MIP-1β (59,8% Identität) ist. So teilen diese Proteine Ähnlichkeiten in der Sequenz, die eine Familie von Peptiden, die bei inflammatorischen und/oder Immunantworten beteiligt sein können, zu definieren scheinen.

Claims

1. Ein inflammatorisches Zytokin, das ein Protein, das in der Lage ist, an Heparin zu binden, in gereinigter Form umfasst, welches, wenn es subkutan verabreicht wird, eine lokale Entzündung, die durch die Infiltration polymorphkerniger Zellen gekennzeichnet ist, induziert und das in vitro eine Chemokinese polymorphkerniger Zellen induziert, wobei die Fähigkeit fehlt, die Aktivität des anabolischen Enzyms Lipoproteinlipase zu supprimieren, die Zytotoxizität von Cachectin/TNF-empfindlichen Zellen zu verursachen, die Blastogenese von Endotoxin- resistenten C3H/HeJ Thymocyten zu stimulieren oder die Herstellung von Cachectin/TNF durch primäre Thioglycolat- induzierte Mausmakrophagenzellen zu induzieren, wobei das Protein unter physiologischen Bedingungen anionisch ist und ein apparentes Molekulargewicht von annähernd 8000 Dalton, wie über SDS-PAGE bestimmt, hat.

2. Das inflammatorische Zytokin von Anspruch 1, wobei das Zytokin bei hohen Salzkonzentrationen an Heparin bindet und dazu neigt, in Puffern mit niedrigem Salzgehalt Aggregate mit einem hohen Molekulargewicht von mehr als ungefähr 10&sup6; Dalton zu bilden.

3. Das inflammatorische Zytokin von Anspruch 1, wobei das Zytokin in der Lage ist, bei Kaninchen Fieber zu induzieren und bei humanen Neutrophilen in vitro die Superoxidbildung oder einen respiratorischen burst zu induzieren.

4. Das inflammatorische Zytokin von Anspruch 1, wobei das Zytokin von tierischen Zellen, die mit einem stimulatorischen Material, das einen invasiven Stimulus begleiten könnte, inkubiert sein können, erhältlich ist.

5. Das inflammatorische Zytokin von Anspruch 1, wobei das Zytokin von Zellen, die durch klonale Vermehrung gezogen wurden, erhalten wurde.

6. Das inflammatorische Zytokin von Anspruch 1, wobei die Aminosäuresequenz im wesentlichen zu der äquivalent ist, die in Figur 10 dargestellt ist.

7. Das inflammatorische Zytokin von Anspruch 1, wobei die Aminosäuresequenz im wesentlichen zu der äquivalent ist, die in Figur 8B dargestellt ist.

8. Das inflammatorische Zytokin von Anspruch 1, wobei das Zytokin ein Peptidpaar mit Aminosäuresequenzen, die im wesentlichen zu denen äquivalent sind, die in den Figuren 8A und 8B dargestellt sind, umfaßt.

9. Das inflammatorische Zytokin von Anspruch 1, das mit einer nachweisbaren Markierung markiert ist.

10. Das inflammatorische Zytokin von Anspruch 9, wobei die Markierung ein Enzym ist.

11. Das inflammatorische Zytokin von Anspruch 10, wobei die Markierung aus der Gruppe, die aus Peroxidase, β-Glucuronidase, β-D-Glucosidase, β-D-Galactosidase, Urease, Glucose-Oxidase sowie Peroxidase, Galactose-Oxidase sowie Peroxidase, und alkalischer Phosphatase besteht, ausgewählt wird.

12. Das inflammatorische Zytokin von Anspruch 9, wobei die Markierung eine Chemikalie ist, die, wenn sie mit ultraviolettem Licht bestrahlt wird, fluoresziert.

13. Das inflammatorische Zytokin von Anspruch 12, wobei die Chemikalie aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Fluorescein, Rhodamin und Auramin besteht.

14. Das inflammatorische Zytokin von Anspruch 9, wobei die Markierung ein radioaktives Element ist.

15. Das inflammatorische Zytokin von Anspruch 14, wobei das radioaktive Element aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus ¹&sup4;C, ¹²&sup5;I, ¹³¹I, ³&sup5;S und ³H besteht.

16. Ein Verfahren zum Bestimmen des Vorhandensseins eines inflammatorischen Zytokins, das ein Protein, das in der Lage ist, an Heparin zu binden, in gereinigter Form umfasst, welches, wenn es subkutan verabreicht wird, eine lokale Entzündung, die durch die Infiltration polymorphkerniger Zellen gekennzeichnet ist, induziert und das in vitro eine Chemokinese polymorphkerniger Zellen induziert, wobei die Fähigkeit fehlt, die Aktivität des anabolischen Enzyms Lipoproteinlipase zu supprimieren, die Zytotoxizität von Cachectin/TNF-empfindlichen Zellen zu verursachen, die Blastogenese von Endotoxin- resistenten C3H/HeJ Thymocyten zu stimulieren oder die Herstellung von Cachectin/TNF durch primäre Thioglycolat induzierte Mausmakrophagenzellen zu induzieren, wobei das Protein unter physiologischen Bedingungen anionisch ist und ein apparentes Molekulargewicht von annähernd 8000 Dalton, wie über SDS-PAGE bestimmt, hat, wobei das inflammatorisches Zytokin bestimmt wird durch:

A. Herstellen von wenigstens einer Probe des inflammatorischen Zytokins von tierischen Zellen, die einer entsprechenden Anzahl von bestimmten bekannten invasiven Stimuli ausgesetzt wurden;

B. Herstellen wenigstens eines entsprechenden Antikörpers oder Bindepartners, der gegen die inflammatorischen Zytokinproben gerichtet ist;

C. Anbringen einer nachweisbaren Markierung auf einem Material, das aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus den inflammatorischen Zytokinproben und dem Antikörper oder den Bindepartnern dafür besteht;

D. Immobilisieren eines Materials, das aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus dem Material von Stufe C, das nicht markiert ist, besteht und einer biologischen Probe aus einem Säugetier, in der das inflammatorische Zytokin vermutet wird, auf einem geeigneten Träger;

E. Anbringen des markierten Materials aus Stufe C in Kontakt mit der biologischen Probe und in Kontakt mit dem immobilisierten Material;

F. Abtrennen des Materials aus Stufe C, das an das immobilisierte Material gebunden ist, von dem Material aus Stufe C, das nicht an das immobilisierte Material gebunden ist; und

G. Untersuchen des gebundenen Materials auf das Vorhandensein des markierten Materials.

17. Ein Verfahren zum Bestimmen der Bindestellen für ein inflammatorisches Zytokin, umfassend ein Protein in gereinigter Form, das unter physiologischen Bedingungen anionisch ist und ein apparentes Molekulargewicht von annähernd 8000 Dalton, wie über SDS-PAGE bestimmt, hat, und das in der Lage ist, an Heparin zu binden, in gereinigter Form umfasst, welches, wenn es subkutan verabreicht wird, eine lokale Entzündung, die durch die Infiltration polymorphkerniger Zellen gekennzeichnet ist, induziert und das in vitro eine Chemokinese polymorphkerniger Zellen induziert, wobei die Fähigkeit fehlt, die Aktivität des anabolischen Enzyms Lipoproteinlipase zu supprimieren, die Zytotoxizität von Cachectin/TNF-empfindlichen Zellen zu verursachen, die Blastogenese von Endotoxin-resistenten C3H/HeJ Thymocyten zu stimulieren oder die Herstellung von Cachectin/TNF durch primäre Thioglycolat-induzierte Mausmakrophagenzellen zu induzieren, wobei die Bindestellen für das inflammatorische Zytokin bestimmt werden durch:

A. Herstellen wenigstens einer Probe des inflammatorischen Zytokins aus einer entsprechenden Anzahl von bestimmten bekannten invasiven Stimuli;

B. Anbringen einer nachweisbaren Markierung an der inflammatorischen Zytokinprobe,

C. Anbringen der markierten inflammatorischen Zytokinprobe in Kontakt mit einer biologischen Probe aus einem Säugetier, in der Bindestellen für das Zytokin vermutet werden; und

D. Untersuchen der biologischen Probe in Bindungsstudien auf das Vorhandensein der markierten inflammatorischen Zytokinprobe.

18. Das Verfahren von Anspruch 16, das ein Verfahren zum Bestimmen des Vorhandenseins eines inflammatorischen Zytokins, das mit einem gegebenen invasiven Stimulus in Säugetieren verbunden ist, umfaßt.

19. Das Verfahren von Anspruch 16, das ein Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins von invasiven oder idiopathischen Stimuli in Säugetieren umfaßt.

20. Das Verfahren von Anspruch 16, wobei der invasive Stimulus eine Infektion ist.

21. Das Verfahren von Anspruch 16, wobei der invasive Stimulus ausgewählt wird aus der Gruppe, die aus bakterieller Infektion, viraler Infektion, protozoaler Infektion, tumorösen Säugetierzellen und Toxinen besteht.

22. Das Verfahren von Anspruch 16, wobei das inflammatorische Zytokin hergestellt wird durch:

A. Isolieren einer Kolonie von Säugetierzellen;

B. Inkubieren der Zellen mit dem Stimulatormaterial über einen Zeitraum, der für das Stimulatormaterial ausreichend ist, um die Zellen zu stimulieren, daß sie inflammatorisches Zytokin herstellen; und

C. Isolieren des inflammatorischen Zytokins von den Zellen.

23. Das Verfahren von Anspruch 22, wobei das Stimulatormaterial ein Endotoxin umfaßt.

24. Das Verfahren von Anspruch 23, wobei das Endotoxin Lipopolysaccharid umfaßt.

25. Ein Verfahren zur Untersuchung der Fähigkeit einer Droge, die Herstellung und/oder Aktivität eines inflammatorischen Zytokins zu modulieren, umfassend ein Protein in gereinigter Form, das in der Lage ist, mit einem Rezeptor für das inflammatorische Zytokin auf Zellen in einem Säugetierkörper zu reagieren, das umfaßt das Kultivieren einer Kolonie von Testzellen, die den Rezeptor tragen, in einem Wachstumsmedium, das das inflammatorische Zytokin enthält, das Zugeben der Droge im Test und danach das Messen der Reaktivität der Droge mit dem Rezeptor auf der Kolonie der Testzellen, wobei das inflammatorische Zytokin ein Protein, das in der Lage ist, an Heparin zu binden, in gereinigter Form umfasst, welches, wenn es subkutan verabreicht wird, eine lokale Entzündung, die durch die Infiltration polymorphkerniger Zellen gekennzeichnet ist, induziert und das in vitro eine Chemokinese polymorphkerniger Zellen induziert, wobei die Fähigkeit fehlt, die Aktivität des anabolischen Enzyms Lipoproteinlipase zu supprimieren, die Zytotoxizität von Cachectin/TNF-empfindlichen Zellen zu verursachen, die Blastogenese von Endotoxin-resistenten C3H/HeJ Thymocyten zu stimulieren oder die Herstellung von Cachectin/TNF durch primäre Thioglycolat-induzierte Mausmakrophagenzellen zu induzieren, wobei das Protein unter physiologischen Bedingungen anionisch ist und ein apparentes Molekulargewicht von annähernd 8000 Dalton, wie über SDS-PAGE bestimmt, hat.

26. Das Verfahren von Anspruch 25, wobei das inflammatorische Zytokin unter physiologischen Bedingungen anionisch ist und bei hohen Salzkonzentrationen an Heparin bindet, und das dazu neigt, in Puffern mit niedrigem Salzgehalt Aggregate mit einem hohen Molekulargewicht von mehr als ungefähr 10&sup6; Dalton zu bilden.

27. Das Verfahren von Anspruch 25, bei Kaninchen Fieber zu induzieren und bei humanen Neutrophilen in vitro die Superoxidbildung oder einen respiratorischen burst zu induzieren.

28. Das Verfahren von Anspruch 25, wobei das inflammatorische Zytokin von tierischen Zellen, die mit einem stimulatorischen Material, das einen invasiven Stimulus begleiten könnte, inkubiert sein können, erhältlich ist.

29. Das Verfahren von Anspruch 25, wobei das inflammatorische Zytokin von Zellen, die durch klonale Vermehrung gezogen wurden, erhalten wurde.

30. Ein Untersuchungssystem für das Screening von Drogen und anderen Mitteln auf die Fähigkeit, die Herstellung und/oder Aktivität eines inflammatorischen Zytokins zu modulieren, umfassend eine meßbare zelluläre Testkolonie, die mit einem inflammatorischen Zytokin beimpft wurde, das ein Protein in gereinigter Form umfaßt, das in der Lage ist, an Heparin zu binden, welches, wenn es subkutan verabreicht wird, eine lokale Entzündung, die durch die Infiltration polymorphkerniger Zellen gekennzeichnet ist, induziert und das in vitro eine Chemokinese polymorphkerniger Zellen induziert, wobei die Fähigkeit fehlt, die Aktivität des anabolischen Enzyms Lipoproteinlipase zu supprimieren, die Zytotoxizität von Cachectin/TNF-empfindlichen Zellen zu verursachen, die Blastogenese von Endotoxin- resistenten C3H/HeJ Thymocyten zu stimulieren oder die Herstellung von Cachectin/TNF durch primäre Thioglycolat- induzierte Mausmakrophagenzellen zu induzieren, wobei das Protein unter physiologischen Bedingungen anionisch ist und ein apparentes Molekulargewicht von annähernd 8000 Dalton, wie über SDS-PAGE bestimmt, hat.

31. Das Untersuchungssystem von Anspruch 30, wobei das Zytokin unter physiologischen Bedingungen anionisch ist und an Heparin bei hohen Salzkonzentrationen bindet und das dazu neigt, in Puffern mit einem niedrigen Salzgehalt Aggregate mit einem hohen Molekulargewicht von mehr als ungefähr 10&sup6; Dalton zu bilden.

32. Das Untersuchungssystem von Anspruch 30, wobei das Zytokin in der Lage ist, bei Kaninchen Fieber zu induzieren und bei humanen Neutrophilen in vitro die Superoxidbildung oder einen respiratorischen burst zu induzieren.

33. Das Untersuchungssystem von Anspruch 30, wobei das inflammatorische Zytokin von tierischen Zellen, die mit einem stimulatorischen Material, das einen invasiven Stimulus begleiten könnte, inkubiert sein können, erhältlich ist.

34. Das Untersuchungssystem von Anspruch 30, wobei das inflammatorische Zytokin von Zellen, die durch klonale Vermehrung gezogen wurden, erhalten wurde.

35. Ein Testkit für den Nachweis eines inflammatorischen Zytokins in einem Serum oder einem wäßrigen Medium, umfassend:

A. eine vorbestimmte Menge von wenigstens einer markierten immunchemisch reaktiven Komponente, die durch die direkte oder indirekte Anbringung eines inflammatorischen Zytokins oder eines spezifischen Bindepartners dazu an eine nachweisbare Markierung erhalten wird, wobei das inflammatorische Zytokin ein Protein umfaßt, das unter physiologischen Bedingungen anionisch ist und ein apparentes Molekulargewicht von annähernd 8000 Dalton, wie über SDS-PAGE bestimmt, hat, und das in der Lage ist, an Heparin zu binden, welches, wenn es subkutan verabreicht wird, eine lokale Entzündung, die durch die Infiltration polymorphkerniger Zellen gekennzeichnet ist, induziert und das in vitro eine Chemokinese polymorphkerniger Zellen induziert, wobei die Fähigkeit fehlt, die Aktivität des anabolischen Enzyms Lipoproteinlipase zu supprimieren, die Zytotoxizität von Cachectin/TNF-empfindlichen Zellen zu verursachen, die Blastogenese von Endotoxin-resistenten C3H/HeJ Thymocyten zu stimulieren oder die Herstellung von Cachectin/TNF durch primäre Thioglycolat-induzierte Mausmakrophagenzellen zu induzieren,

B. anderen Reagenzien; und

C. Anweisungen für die Verwendung des Kits.

36. Das Testkit von Anspruch 35, wobei das inflammatorische Zytokin unter physiologischen Bedingungen anionisch ist und an Heparin bei hohen Salzkonzentrationen bindet, und das dazu neigt, in Puffern mit niedrigem Salzgehalt Aggregate mit einem hohen Molekulargewicht von mehr als ungefähr 10&sup6; Dalton zu bilden.

37. Das Testkit von Anspruch 35, wobei das inflammatorische Zytokin in der Lage ist, bei Kaninchen Fieber zu induzieren und bei humanen Neutrophilen in vitro die Superoxidbildung oder einen respiratorischen burst zu induzieren.

38. Das Testkit von Anspruch 35, wobei das inflammatorische Zytokin von tierischen Zellen, die mit einem stimulatorischen Material, das einen invasiven Stimulus begleiten könnte, inkubiert sein können, erhältlich ist.

39. Das Testkit von Anspruch 35, wobei das Zytokin von Zellen, die durch klonale Vermehrung gezogen wurden, erhältlich ist.

40. Das Testkit von Anspruch 35, wobei die Markierung ein Enzym ist.

41. Die Verwendung eines Materials für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung von Entzündung und/oder Fieber bei Säugetieren, das ausgewählt wird aus der Gruppe, die besteht aus einem Antikörper gegen ein inflammatorisches Zytokin, umfassend ein Protein in gereinigter Form, einem Mittel, das in der Lage ist, die Herstellung des inflammatorischen Zytokins zu inhibieren, umfassend ein Protein in gereinigter Form, einem Mittel, das kein Antikörper gegen das inflammatorische Zytokin ist, umfassend ein Protein in gereinigter Form, das in der Lage ist, als ein Antagonist gegenüber dem inflammatorischen Zytokin zu wirken, wobei das inflammatorische Zytokin ein Protein in einer gereinigten Form umfaßt, das unter physiologischen Bedingungen anionisch ist und ein apparentes Molekulargewicht von annähernd 8000 Dalton, wie über SDS-PAGE bestimmt, hat, und das in der Lage ist, an Heparin zu binden, welches, wenn es subkutan verabreicht wird, eine lokale Entzündung, die durch die Infiltration polymorphkerniger Zellen gekennzeichnet ist, induziert und das in vitro eine Chemokinese polymorphkerniger Zellen induziert, wobei die Fähigkeit fehlt, die Aktivität des anabolischen Enzyms Lipoproteinlipase zu supprimieren, die Zytotoxizität von Cachectin/TNF-empfindlichen Zellen zu verursachen, die Blastogenese von Endotoxin-resistenten C3H/HeJ Thymocyten zu stimulieren oder die Herstellung von Cachectin/TNF durch primäre Thioglycolat-induzierte Mausmakrophagenzellen zu induzieren.

42. Die Verwendung des Materials wie in Anspruch 41 beansprucht für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung von Entzündung und/oder Fieber bei Säugetieren, gekennzeichnet dadurch, daß das inflammatorische Zytokin bei hohen Salzkonzentrationen an Heparin bindet und daß es dazu neigt, in Puffern mit einem niedrigen Salzgehalt Aggregate mit einem hohen Molekulargewicht von mehr als ungefähr 10&sup6; Dalton zu bilden.

43. Die Verwendung des Materials wie in Anspruch 41 beansprucht für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung von Entzündung und/oder Fieber in Säugetieren, wobei das Zytokin in der Lage ist, bei Kaninchen Fieber zu induzieren und bei humanen Neutrophilen in vitro die Superoxidbildung oder einen respiratorischen burst zu induzieren.

44. Die Verwendung des Materials wie in Anspruch 41 beansprucht für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung von Entzündung und/oder Fieber bei Säugetieren, wobei das inflammatorische Zytokin von tierischen Zellen, die mit einem stimulatorischen Material, das einen invasiven Stimulus begleiten könnte, inkubiert sein können, erhältlich ist.

45. Die Verwendung des Materials wie in Anspruch 41 beansprucht für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung von Entzündung und/oder Fieber in Säugetieren, wobei das inflammatorische Zytokin von Zellen, die durch klonale Vermehrung gezogen wurden, erhalten wurde.

46. Die Verwendung eines Materials für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verhinderung des Auftretens von Entzündung und/oder Fieber bei Säugetieren, das ausgewählt wird aus der Gruppe, die besteht aus einem Antikörper gegen ein inflammatorisches Zytokin, umfassend ein Protein in gereinigter Form, einem Mittel, das in der Lage ist, die Herstellung des inflammatorischen Zytokins zu inhibieren, umfassend ein Protein in gereinigter Form, einem Mittel, das kein Antikörper gegen das inflammatorische Zytokin ist, umfassend ein Protein in gereinigter Form, das in der Lage ist, der Aktivität des inflammatorischen Zytokins entgegenzuwirken, und Mischungen davon, in einer Menge, die wirksam ist, den Beginn der Entzündung und/oder des Fiebers, abzuwenden, wobei das inflammatorische Zytokin ein Protein in einer gereinigten Form umfaßt, das unter physiologischen Bedingungen anionisch ist und ein apparentes Molekulargewicht von annähernd 8000 Dalton, wie über SDS-PAGE bestimmt, hat, und das in der Lage ist, an Heparin zu binden, welches, wenn es subkutan verabreicht wird, eine lokale Entzündung, die durch die Infiltration polymorphkerniger Zellen gekennzeichnet ist, induziert und das in vitro eine Chemokinese polymorphkerniger Zellen induziert, wobei die Fähigkeit fehlt, die Aktivität des anabolischen Enzyms Lipoproteinlipase zu supprimieren, die Zytotoxizität von Cachectin/TNF-empfindlichen Zellen zu verursachen, die Blastogenese von Endotoxin-resistenten C3H/HeJ Thymocyten zu stimulieren oder die Herstellung von Cachectin/TNF durch primäre Thioglycolat-induzierte Mausmakrophagenzellen zu induzieren.

47. Die Verwendung des Materials wie in Anspruch 46 beansprucht für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verhinderung des Auftretens von Entzündung und/oder Fieber bei Säugetieren, wobei das inflammatorische Zytokin unter physiologischen Bedingungen anionisch ist und bei hohen Salzkonzentrationen an Heparin bindet und das dazu neigt, in Puffern mit einem niedrigen Salzgehalt Aggregate mit einem hohen Molekulargewicht von mehr als etwa 10&sup6;dalton zu bilden.

48. Die Verwendung des Materials wie in Anspruch 46 beansprucht für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zum Verhinderung des Auftretens von Entzündung und/oder Fieber bei Säugetieren, wobei das inflammatorische Zytokin in der Lage ist, bei Kaninchen Fieber zu induzieren und bei humanen Neutrophilen in vitro die Superoxidbildung oder einen respiratorischen burst zu induzieren.

49. Die Verwendung des Materials wie in Anspruch 46 beansprucht für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verhinderung des Auftretens von Entzündung und/oder Fieber bei Säugetieren, wobei das inflammatorische Zytokin von Zellen, die durch klonale Vermehrung gezogen wurden, erhalten wurde.

50. Die Verwendung des Materials wie in Anspruch 46 beansprucht für die Herstellung einer pharmzeutischen Zusammensetzung zur Verhinderung des Auftretens von Entzündung und/oder Fieber bei Säugetieren, wobei das inflammatorische Zytokin von tierischen Zellen, die mit einem stimulatorischen Material, das einen invasiven Stimulus begleiten könnte, inkubiert sein können, erhältlich ist.

51. Die Verwendung eines Materials für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zum Behandeln von infektiösen und nichtinfektiösen Erkrankungen bei Säugetieren, das aus der Gruppe, die besteht aus einem inflammatorischen Zytokin, umfassend ein Protein in gereinigter Form, einem Mittel, das in der Lage ist, die Herstellung und/oder Aktivität des inflammatorischen Zytokins, das ein Protein in gereinigter Form umfaßt, zu fördern, einem Mittel, das in der Lage ist, die Aktivität des inflammatorischen Zytokins, das ein Protein in gereinigter Form umfaßt, nachzuahmen, und Mischungen davon, ausgewählt wird, wobei das inflammatorische Zytokin ein Protein in einer gereinigten Form umfaßt, das unter physiologischen Bedingungen anionisch ist und ein apparentes Molekulargewicht von annähernd 8000 Dalton, wie über SDS-PAGE bestimmt, hat, und das in der Lage ist, an Heparin zu binden, welches, wenn es subkutan verabreicht wird, eine lokale Entzündung, die durch die Infiltration polymorphkerniger Zellen gekennzeichnet ist, induziert und das in vitro eine Chemokinese polymorphkerniger Zellen induziert, wobei die Fähigkeit fehlt, die Aktivität des anabolischen Enzyms Lipoproteinlipase zu supprimieren, die Zytotoxizität von Cachectin/TNF-empfindlichen Zellen zu verursachen, die Blastogenese von Endotoxin-resistenten C3H/HeJ Thymocyten zu stimulieren oder die Herstellung von Cachectin/TNF durch primäre Thioglycolat-induzierte Mausmakrophagenzellen zu induzieren.

52. Die Verwendung des Materials wie in Anspruch 51 beansprucht für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zum Behandeln von infektiösen und nichtinfektiösen Erkrankungen bei Säugetieren, wobei das inflammatorische Zytokin unter physiologischen Bedingungen anionisch ist und bei hohen Salzkonzentrationen an Heparin bindet und das dazu neigt, in Puffern mit einem niedrigen Salzgehalt Aggregate mit einem hohen Molekulargewicht von mehr als etwa 10&sup6; Dalton zu bilden.

53. Die Verwendung des Materials wie in Anspruch 51 beansprucht für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung von infektiösen und nichtinfektiösen Erkrankungen bei Säugetieren, wobei das inflammatorische Zytokin in der Lage ist, bei Kaninchen Fieber zu induzieren und bei humanen Neutrophilen in vitro die Superoxidbildung oder einen respiratorischen burst zu induzieren.

54. Die Verwendung des Material wie in Anspruch 51 beansprucht für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung von infektiösen und nichtinfektiösen Erkrankungen bei Säugetieren, wobei das inflammatorische Zytokin von tierischen Zellen, die mit einem stimulatorischen Material, das einen invasiven Stimulus begleiten könnte, inkubiert sein können, erhältlich ist.