DE3855899T2

DE3855899T2 - Prozess zur gewinnung von mikrobiell produziertem interleukin-2

Info

Publication number: DE3855899T2
Application number: DE3855899T
Authority: DE
Inventors: Robert Halenbeck; Michael Kunitani; Flint Smith
Original assignee: Chiron Corp
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1987-05-11
Filing date: 1988-03-31
Publication date: 1997-09-18
Anticipated expiration: 2008-04-01
Also published as: ATE152730T1; AU619185B2; IE80433B1; EP0357645A1; DE3855899D1; IL86327A0; CA1335925C; AU1681288A; WO1988008850A1; IL86327A; EP0357645B1; US4931543A; IE881409L

Description

Die Erfindung liegt auf dem Gebiet der Biochemie-Technik. Insbesondere betrifft die Erfindung eine verbesserte biochemische Trennung oder ein Herstellungsverfahren, in dem rekombinantes Interleukin-2 (rIL-2) gewonnen wird in im wesentlichen reiner Form aus transformierten Mikroorganismen, in denen es hergestellt worden ist, und nachfolgender Renaturierung.
IL-2 ist ein Lymphokin, das von normalen peripheren Blutlymphozyten erzeugt wird und induziert die Proliferation von Antigen- oder Mitogen-stimulierten T-Zellen nach Exposition mit Pflanzenlektinen, Antigenen oder anderen Stimuli und wurde zuerst beschrieben von Morgan, D.A., et al., Science (1976), 193:1007-1008. Es wurde aufgrund seiner Fähigkeit, die Proliferation von stimulierten T-Lymphozyten zu induzieren, T-Zell- Wachstumsfaktor genannt. Es ist mittlerweile erkannt worden, daß es zusätzlich zu seinen Wachstumsfaktoreigenschaften eine Vielzahl von Funktionen der Immunsystemzellen in vitro und in vivo modulieren kann und wurde in IL-2 umbenannt. IL-2 ist eines von verschiedenen in Lymphozyten produzierten Boten-regulatorischen Molekülen, das die Immunozyteninteraktionen und -funktionen vermittelt.
IL-2 wurde anfänglich durch Kultivieren von menschlichen peripheren Blutlymphozyten (PBL) oder anderen IL-2-produzierenden Zellinien erzeugt; siehe z.B. US-PS 4,401,756. Die DNA Rekombinationstechnik stellte eine Alternative zu PBLS und Zellinien zur Erzeugung von IL-2 bereit. Taniguchi, T., et al., Nature (1983), 302:305-310 und Devos, R., Nucleic Acids Research (1983) 11:4307-4323 haben über die Klonierung des menschlichen IL-2-Gens und seiner Expression in Mikroorganismen berichtet.
Natürliches menschliches IL-2 ist ein Antigen nicht spezifischer, genetisch nicht eingeschränkter löslicher Faktor, erzeugt durch Erythrozytenrosetten positiven T-Zellen, stimuliert mit Antigenen, Mitogenen oder Alloantigenen. Es ist ein Protein mit einem beschriebenen Molekulargewicht im ungefähren Bereich von 13.000 bis 17.000 Dalton, (S. Gillis und 3. Watson, 3. Exp. Med. (1980), 159:1709) und einem isoelektrischen Punkt im ungefähren Bereich von pH 6-8,5. Menschliches IL-2 besitzt eine Anzahl von in vitro- und in vivo-Wirkungen, einschließlich der Verstärkung der proliferativen Antworten auf menschliche periphere mononukleare Blutzellen oder Mausthymozyten, der Verstärkung der Immunantwort in Menschen und in Tieren gegen bakterielle, parasitäre, flingale, protozoale und virale Infektionen und der Unterstützung des Wachstums von kontinuierlichen T-Zellinien.
rIL-2 wurde aus gentechnisch veränderten E. coli als ein nicht glykosyliertes Protein mit biologischen Aktivitäten ähnlich zu denen von natürlichem, glykosyliertem IL-2 erhalten; vgl. Taniguchi et al., Nature (1983), 11:4307-4323; Rosenberg et al., Science, (1984), 223:1412-1415; Wang et al., Science (1984), 224:1431-1433 und Doyle et al., 3. Biol. Resp. Modifiers (1985), 4:96-109. Rosenberg und seine Mitarbeiter haben gezeigt, daß systemische Verabreichung von rIL-2 in hohen Dosierungen einen Rückgang von etablierten metastasierenden Krebsarten in Mäusen (Rosenberg et al., 3. Exp. Med. (1985), 161:1169-1188) und in Verbindung mit Lymphokin-aktivierten Killerzellen (Rosenberg et al., New Eng. J. Med. (1985), 313:1485-1492) und Tumor-infutrierenden Lymphozyten (Rosenberg et al., Science (1986), 233:1318-1321) in Menschen hervorruft.
In der US-PS 4,518,584 werden Muteine (Analoga) von IL-2 beschrieben, in denen das normalerweise an Position 125 des Wildtyp- oder natürlichen Moleküls vorkommende Cystein mit einer neutralen Aminosäure wie Serin oder Alanin ersetzt wurde. Die EP-OS 200 280 (veröffentlicht am 10. Dezember 1986) beschreibt Muteine von rIL-2, in denen das Methionin an Position 104 durch eine konservative Aminosäure ersetzt wurde.
Mikrobiologisch erzeugtes rIL-2 ist nicht glycosyliert und wird in einem denaturierten Zustand erzeugt. Es ist unlöslich und bei hohen Expressionsraten fällt es intrazellulär in der Form von "refraktilen" oder "Einschluß-"Körpern aus, die als helle Punkte sichtbar innerhalb der Zelle unter einem Phasenkontrastmikroskop bei bis zu 1000fachen Vergrößerungen auftreten.
Die bis jetzt verfügbaren Verfahren zur Wiedergewinnung von mikrobiell erzeugtem rIL- 2 aus dem Organismus, der es erzeugt, sind nachstehend beschrieben.
US-PS 4,569,790 beschreibt ein Verfahren zur Wiedergewinnung von rIL-2 aus einem rIL-2 erzeugenden Mikroorganismus, in dem die Zelle zerstört wird, die nicht rIL-2- Proteine selektiv von den Trümmern mit einer wäßrigen Lösung einer chaotropen Verbindung, wie Harnstoff, extrahiert werden, das rIL-2 mit einem Detergents, z.B. Natriumdodecylsulfat (SDS) aufgelöst wird, eine Lösung mit einer reduzierenden Verbindung hinzugegeben wird, die reduzierende Verbindung aus der Lösung entfernt wird, das rIL- 2 einer kontrollierten Oxidation unterzogen wird und das oxidierte rIL-2 durch eine Kombination von RP-HPLC und Gelfiltrationsschritten gereinigt wird.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung stellt eine Variation des Verfahrens dieses Patents dar und schließt einen Renaturierungsschritt, gefolgt von einem RP-HPLC Reinigungsschritt, ein, um renaturiertes rIL-2 bereitzustellen, das höhere spezifische Aktivität, verbesserte Wasserlöslichkeit und Stabilität hat und das weniger antigen ist relativ zu dem Material, hergestellt durch das patentierte Verfahren.
Die US-Psen 4,530,787 und 4,572,978 beschreiben Verfahren, um den vorstehenden kontrollierten Oxidationsschritt auszuführen. Das erste Patent verwendet o-Iodosobenzoesäure als oxidierende Verbindung und das zweite verwendet Cu&spplus;²-Katiönen als Oxidationspromotor.
Hager & Burgess, Anal. Biochem., 109, 1980, 76-86, beschreiben das Entfernen von SDS von Proteinlösurigen durch Acetonfällung des Proteins. Arakawa et al., Biochemistry 25, 1986, 8274-77, beschreiben einen einzelnen Schritt des Lösens/Entfaltens von IL-2 (Ala-125) mit 5% Essigsäure, 8 M Harnstoff oder 6 M Guanidinhydrochlorid.
Die EP-OS-206,828 (veröffentlicht am 30. Dezember 1986 mit dem Titel "Process for Recovering Refractile Bodies Containing Heterologous Proteins from Microbial Hosts") beschreibt Verfahren zur Wiedergewinnung und Reinigung von refraktilen Körpern von rIL-2 aus E. coli. Um das refraktile Material zu isolieren, enthalten die Prozesse zuerst das Zerstören der Zellwand und Membran der Wirtszelle, das Enfernen von mehr als 99 Gew.-% der Salze vom Aufschluß, das erneute Zerstören des entsalzten Aufschlusses, das Zufügen von Material zum Aufschluß, um einen Dichte- oder Viskositäts-Gradienten in der Flüssigkeit innerhalb des Aufschlusses zu erzeugen und das Trennen des refraktilen Materials von den zellulären Bruchstücken durch Hochgeschwindigkeitszentrifugation. Das rIL-2 wird dann mit einem Solubilisierungsmittel wie SDS gelöst, chromatographiert, um Verunreinigungen mit einem hohen Molekulargewicht zu entfernen, oxidiert und durch die Kombination von HPLC, Ultrafiltration und Gelfiltration gereinigt. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist ebenfalls eine Variation des Verfahrens dieser Patentanmeldungen.
Ein Abstrakt mit dem Titel "Purification and Renaturation of Recombinant Interleukin- 2", vorgestellt auf dem "6. International Symposium on HPLC of Proteins, Peptides and Polynucleotides" in Baden-Baden, Deutschland, im Oktober 1986, beschreibt ein Verfahren, in dem rIL-2 aus Einschlußkörpern mit 6 M Guanidiniumhydrochlorid/10 mM Dithiothreitol (DTT) gelöst wird und in einer reduzierten, denaturierten Form durch FPLC-Gelpermeation gereinigt wird. Die Lösung aus der FPLC-Gelpermeation wird verdünnt, um eine Renaturierung und Autooxidation zu bewirken. In dieser Hinsicht beschreiben US-Psen 4,511,502, 4,511,503, 4,512,922 und 4,518,526 und die EP-OS 114,506 ein ähnliches Verfahren zur Reinigung heterologer Proteine in allgemeiner Form aus refraktilen Körpern. In diesen Verfahren wird die Oxidation und Renaturierung des rekombinanten Proteins in einem einzigen Schritt ausgeführt.
Die EP-OS 145,390 beschreibt ein Verfahren zur Wiedergewinnung von rIL-2 aus E. coli, in dem die Zellen in 7 M Guanidiniumhydrochlorid suspendiert sind, die festen Körper durch Zentrifugation entfernt werden, der rIL-2-enthaltende Überstand dialysiert wird, um das Guanidiniumhydrochlorid zu entfernen und das Dialysat durch Anionenaustausch-Chromatographie, Gelfiltration und RP-HPLC gereinigt wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von rekombinantem Interleukin-2 (rIL-2) aus transformierten Mikroorganismen enthaltend das rIL-2, wobei das rIL-2 getrennt wird von dem Hauptteil der zellulären Komponenten der Mikroorganismen, gelöst wird in einer reduzierten Form mit einer wäßrigen Lösung von Natriumdodecylsulfat (SDS), danach oxidiert wird und danach bis zu einer klinisch verträglichen Reinheit und bis zu einem klinisch verträglichen Endotoxin-Gehalt gereinigt wird und bevorzugt bis zu einem klinisch verträglichen Pyrogen-Gehalt gereinigt wird, das oxidierte, gereinigte rIL-2 durch Einbringen des rIL-2 in eine Lösung einer Guanidiniumchaotropen Verbindung denaturiert wird, das verbleibende SDS als Feststoff aus der Lösung entfernt wird und danach das rIL-2 aus der Lösung renaturiert wird, wodurch ein renaturiertes, oxidiertes, gereinigtes rIL-2 mit verbesserter Stabilität und Löslichkeitseigenschaften in Abwesenheit von Detergentien erhalten wird.
Das Lösen des reduzierten rIL-2 wird vorzugsweise erreicht durch Vermischen des getrennten rIL-2 mit einer wäßrigen Lösung von 0,1 bis 10% (w/v) von SDS.
Die bevorzugte Lösung der chaotropen Verbindung ist eine 4 bis 8 M wäßrige Guanidiniumhydrochloridlösung, gegebenenfalls eine etwa 7 M wäßrige Guanidiniumhydrochloridlösung mit einem pH-Wert im Bereich von 5 bis 9.
Die Konzentration des gereimgten IL-2 in der wäßrigen Guanidiniumlösung ist 0,1 bis 100 mg/ml, vorzugsweise 0,5 bis 60 mg/ml.
Die Denaturierung wird vorzugsweise ausgeführt bei 4 bis 25ºC.
Vorzugsweise wird das Entfernen des Feststoffes aus der Lösung der chaotropen Verbindung, in die das rIL-2 eingebracht wurde, durch Filtration durchgeführt.
In dem Verfahren kann die Renaturierung durchgeführt werden bei einer Proteinkonzentration von 0,1 bis 2,5 mg/ml und/oder kann durch Dialyse der Verdünnung der Lösung mit der chaotropen Verbindung ausgeführt werden.
Das renaturierte, oxidierte, gereimgte rIL-2 kann weiter gereinigt werden durch In-Kontakt-Bringen einer wäßrigen Lösung des renaturierten rIL-2 mit einem Kationenaustauscher bei einem pH-Wert von etwa 6 bis 7,5, Elution der absorbierten Fraktion von dem Kationenaustauscher mit einem Salzgradienten und Gewinnung des weiter gereinigten rIL-2 bei einer Salzkonzentration von etwa 0,1 M.
Das rIL-2 wird vorzugsweise von dem Hauptteil der zellulären Komponenten getrennt durch Aufbrechen der Zellen und Trennen des wasserunlöslichen Materials von dem resultierenden Aufschluß, nachfolgendem Lösen des rIL-2 in einer reduzierten Form durch Mischen des wasserunlöslichen Materials mit einer wäßrigen Lösung von SDS, die eine reduzierende Verbindung enthält, nachfolgendes Entfernen der reduzierenden Verbindung von dem gelösten rIL-2 vor der Oxidation, Durchführen der Oxidation als eine kontrollierte Oxidation unter Verwendung von Cu&spplus;²-Ionen als Oxidationspromotor, und Reinigen des oxidierten rIL-2 bis zu einem klinisch verträglichen Endotoxin-Gehalt durch Umkehrphasen-Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls bereit die Verwendung von renaturiertem, oxidiertem, gereinigtem rIL-2, resultierend aus einem der vorstehend genannten Verfahren zur Herstellung eines Arzneistoffes.
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden spezifischen Ausführungsformen und Beispiele weiter beschrieben.
Figur 1 ist ein Fließschema der bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Figur 2 ist ein RP-HPLC-Chromatogranun des in Beispiel 1 beschriebenen Materials.
Figur 3 ist ein Schnellfließ-CM-Chromatogramm des in Beispiel 1 beschriebenen Materials.
Figur 4 stellt UV-Spektren von Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) von rIL-2 Präparationen dar, die in Beispiel 2 beschrieben sind.
Figur 5 zeigt HPLC-Chromatogranune von den Experimenten zur Bestimmung der molekularen Größe, die in Beispiel 2 beschrieben sind.

A. Definitionen

Die Bezeichnung "rIL-2" bezieht sich auf rekombinantes Interleukin-2 oder Interleukin- 2-ähnliche Polypeptide, erzeugt mit einem transformierten Mikroorganismus, und dessen Aminosäuresequenz gleich oder ähnlich oder im wesentlichen homolog zu der nicht-glykosylierten und/oder glykosylierten natürlichen Form von Interleukin-2 ist. Beispiele solcher IL-25 sind solche, beschrieben in den EP-Osen 91,539, 88,195 und 109,748 wie auch solche beschrieben in US-PS 4,518,584, EP-OS 200,280 und Rinder-IL-2 wie beschrieben von Cerretti et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986), 83:3223-3227.
Die insbesondere hier bevorzugten IL-25 sind solche biologisch aktiven Muteine (Analoga) von menschlichem IL-2, in denen die Aminosäurereste, die für die biologische Aktivität nicht essentiell sind, in einigen Fällen absichtlich deletiert oder mit einer konservativen Aminosäure ersetzt wurden, wie unten aufgeführt. Insbesondere beinhalten bevorzugte IL-25 solche, in denen der Cysteinrest an Position 125 mit einer anderen Aminosäure, vorzugsweise einer neutralen oder konservativen, ausgetauscht ist, um Stellen zur intermolekularen Vernetzung oder des inkorrekten intermolekularen Disulfids zu eliminieren und gegebenenfalls des N-terminalen Alaninrest des natürlichen Gegenstücks zu eliminieren. Solche neutralen oder konservativen Aminosäuren sind Glycin, Serin, Valin, Alanin, Leucin, Isoleucin, Thyrosin und Methionin. Insbesondere sind bevorzugte IL-2-Muteine in den Formulierungen dieser Erfindung solche, in denen (1) der Cysteinrest an Aminosäureposition 125 des nallirlichen Gegenstücks durch einen Serinrest ("ezeichnet IL-2ser125) ersetzt ist oder durch einen Maninrest (bezeichnet IL- 2ala125), oder (2) der erste Maninrest entfernt ist und das Cystein an Position 125 durch Serin ersetzt ist (bezeichnet des-alanyl-IL-2ser125).
Andere besonders bevorzugte IL-25 sind die biologisch aktiven Muteine, beschrieben in EP-OS 200,280, in denen Oxidations-anfällige Methioninreste durch eine neutrale oder konservative Aminosäure ersetzt wurden. Ein bevorzugtes Mutein beinhaltet das Ersetzen des Methionins an Position 104 durch eine konservative Aminosäure wie Alanin. EP 200,280 beschreibt ebenfalls Aminoterminale Deletionen von IL-2, in denen eine oder mehrere der ersten sechs Aminosäuren deletiert sind. Bevorzugte Oxidations-resistentemuteinebeinhalten
Andere Amino-terminale Deletionen von IL-2 sind in Chemical Abstracts (1987), 106:(21): 170236f, einem Abstrakt der JP-OS 61/225199 (veröffentlicht am 6. Oktober 1986), beschrieben, in dem jede der ersten 15 Aminosäuren von IL-2 deletiert ist. PCT/87/04714 (veröffentlicht am 13. August 1987) beschreibt Deletionen oder Austausche von einem oder mehreren der Aminosäurereste an Positionen 2 bis 11 und/oder 128 bis 133 des Amino-terminalen Alanins von IL-2.
Die genaue chemische Struktur des rIL-2-Proteins hängt von einer Anzahl von Faktoren ab. Da ionisierbare Amino- und Carboxylreste in dem Molekül vorliegen, kann ein bestimmtes rIL-2-Protein als ein saures oder basisches Salz oder in neutraler Form erhalten werden. Alle solchen Präparationen, die ihre Aktivität beibehalten, wenn sie in geeigneten Umgebungsbedingungen gehalten werden, sind in der Definition von "rIL-2" eingeschlossen. Weiterhin kann die ursprüngliche Aminosäuresequenz des Proteins durch Derivatisierung mittels Zuckerresten (Glykosylierung) oder durch andere ergänzende Moleküle wie Lipide, Phosphate, Acetylreste und dergleichen, gebräuchlicher durch Konjugation mit Sacchariden, vergrößert werden; Gewisse Aspekte dieser Vergrößerung werden durch posttranslationale Prozessierungssysteme des erzeugenden Wirts ausgeführt, oder solche Modifikationen können in vitro eingeflihrt werden. In jedem Fall sind solche Modifikationen in der Definition von rIL-2 eingeschlossen, solange wie die Aktivität des Proteins, wie oben definiert, nicht zerstört wird. Natürlich wird angenommen, daß solche Modifikationen quantitativ oder qualitativ die biologische Aktivität entweder durch Erhöhen oder Vermindern der Aktivität des Proteins in den verschiedenen Tests bewirken kann.
Der Begriff "transformiert" bei der Beschreibung von Wirtsmikroorganismus-Zellkulturen bezeichnet einen Mikroorganismus, der gentechnisch verändert wurde, um ein rIL- 2-Polypeptid zu erzeugen, das fähig ist, die Aktivität von nativem IL-2 auszubilden. Bakterien sind die bevorzugten Mikroorganismen zur Erzeugung des rIL-2-Proteins. E. coli ist insbesondere bevorzugt.
Die Bezeichnung "chaotrope Verbindung" bezieht sich auf eine Verbindung oder auf Verbindungen, die in wäßriger Lösung und in einer geeigneten Konzentration in der Lage sind, das rIL-2 zu denaturieren Guanidinlumsalze (z.B. Hydrochlorid) und alkalische Metallthiocyanate (z.B. Natriumthiocyanat) mit Konzentrationen im Bereich von etwa 4 bis 8 M, vorzugsweise 7 M, sind Beispiele von chaotropen Verbindungslösungen, die rIL-2 lösen und denaturieren Eine alternative und weniger bevorzugte chaotrope Verbindung ist wäßriger Harnstoff, 4 bis 8 M.
Der Begriff "oxidiert", wie verwendet, um rIL-2 und die Verfahren zur Herstellung von diesem zu charakterisieren, meint IL-2, in dem die Disulfidbindung, die in natürlichem IL-2 vorhanden ist, und Verfahren, die solche Bindungen fördern, ohne Disulfidbindungen zu fördern, die in natürlichem IL-2 nicht vorkommen.

B. Zellwachstum

Die IL-2-erzeugenden transformierten Mikroorganismen werden in einem geeigneten Wachstumsmedium, üblicherweise zu einer optischen Dichte (OD) von mindestens etwa 30 bei 680 nm und vorzugsweise zwischen etwa 20 und 40 bei 680 nm aufgezogen. Die Zusammensetzung des Wachstumsmediums wird von den enthaltenden bestimmten Mikroorganismen abhängen. Das Medium ist ein wäßriges Medium, enthaltend Verbindungen, die die Nährstoffanforderungen des Mikroorganismus erfüllen. Wachstumsmedien enthalten üblicherweise assimilierbare Quellen von Kohlenstoff und Stickstoff, Energiequellen, Magnesium, Kalium und Natriumionen und gegebenenfalls Aminosäuren und Purin und Pyrimidinbasen; vgl. Review of Medical Biology, Lange Medical Publications, 14. Auflage, Seiten 80-85, (1980). Bei Expressionsvektoren, enthaltend den trp-Promotor, wird die Tryptophankonzentration im Medium sorgfältig kontrolliert, um zu dem Zeitpunkt limitierend zu wirken, an dem die Proteinexpression erwünscht ist. Wachstumsmedien für E. coli sind den Fachleuten bekannt.
Nachdem die Zellen von der Kultur gesammelt wurden, können sie, falls nötig, zu etwa 20 bis 150 mg/ml, vorzugsweise 80 bis 100 mg/ml (OD 40 bis 300, vorzugsweise 160 bis 200 bei 680 nm) durch Durchflußfiltration, Zentrifügation oder anderen Standardverfahren konzentriert werden. Vorzugsweise wird eine Verbindung, die auf Menschen nicht toxisch wirkt, wie etwa 1-Octanol, in einer Menge von 1 Gew.-% der Gesamtverbindungen zu dem Fermenter vor oder während der Zellkonzentrierung zugesetzt, um sicherzustellen, daß keine lebensfähigen rekombinanten Organismen übrigbleiben, wenn die Zellmembranen aufgebrochen werden.

C. Zellzerstörung

Nach Konzentration der gesammelten Kultur werden die Zellmembranen der Mikroorganismen zerstört. Zellzerstörungs-Standardverfahren, wie etwa Homogenisation, Ultrabeschallung oder Druckzyklisierung können in diesem Schritt des Verfahrens verwendet werden. Der Endpunkt des Zerstörungsschrittes kann durch Überwachung der optischen Dichte, durch Absorbierung der Suspension bei 260 nm, die üblicherweise mit der Zellyse ansteigt, bestimmt werden. In jedem Fall sollte die Zerstörung im wesentlichen sämtliche Zellen aufbrechen, so daß im wesentlichen keine intakten Zellen durch die nachfolgenden Schritte geführt werden.

D. Behandlung des Aufschlusses zur Isolierung unlöslicher IL-2-Körper

Nach Zerstörung der Zellen wird vorzugsweise deionisiertes Wasser zu dem Aufschluß zugesetzt und mehr als 99 Gew.-% der Salze werden vom Aufschluß entfernt. Die Salze sind wasserlösliche Materialien, zusammengesetzt aus entgegengesetzt geladenen kleinen Ionen mit geringem Molekulargewicht. Die Entfernung dieser Salze zur Verringerung der Ionenstärke des Aufschlusses kann durch Diafiltrierung mit deionisiertem Wasser zur Ausspülung der Ionen oder durch Zentrifugation zur Pelletierung der Feststoffe, gefolgt durch Resuspension in deionisiertem Wasser, ausgeführt werden. Wird Diafiltration verwendet, wird vorzugsweise deionisiertes Wasser fortlaufend zugefügt, so daß das zugefugte Wasser die Filtrationsrate ausgleicht.
Nachdem die Salze im wesentlichen entfernt sind, kann gegebenenfalls eine Verbindung wie 1-Octanol zu dem entsalzten Aufschluß gegeben werden, falls es nicht bereits vorher zugesetzt wurde, um sicherzustellen, daß keine lebensfahigen rekombinanten Organismen übrigbleiben, bevor das zurückgehaltene Material aufgebrochen wird. Der entsalzte Aufschluß wird, wie oben für die erste Zerstörung beschrieben, erneut zerstört.
Nach der erneuten Zerstörung wird die Dichte oder Viskosität ansteigen und/oder ein Gradient während der Zentrifügation in der Flüssigkeit innerhalb des Aufschlusses durch Zufügen eines Materials zum Aufschluß erzeugt. Es gibt verschiedene Vorrichtungen zur Ausführung dieses Zweckes, die sich alle auf die Sedimentationseigenschaften der Teilchen durch Verändern der Dichte und/oder Viskosität der flüssigen Phase beziehen. Eine Vorrichtung zur Ausführung dieses Ziels besteht in der Zugabe eines Materials, das die Dichte der Flüssigkeit zu einem p von etwa 1,1 bis 1,3 g/ml, vorzugsweise 1,13 bis 1,17 giml erhöht.
Materialien, die zur Durchführung des Anstiegs der Dichte verwendet werden können, beinhalten einen Zucker oder eine Zuckermischung, wie z.B. Sucrose, Dextrose, Fructose, Maltose, Maltotriose und andere Mono-, Di- oder Polysaccharide. Insbesondere bevorzugt ist der Zucker Sucrose. Alternativ kann ein Zwei-Phasensystem von Materialien, wie z.B. eine Glycerin/Sucrose-Mischung, verwendet werden, in der sich die aufgeschlossenen Teilchen auf die Interphase zwischen der schweren und leichten Phase verteilen und durch eine Flüssigkeits-/Flüssigkeits-Teilung eluiert werden können.
Zusätzlich kann die Viskosität der flüssigen Phase von 5 bis 10 cps durch jede brauchbare Vorrichtung erhöht werden, wie etwa durch Zufügen einer viskosen Verbindung, wie etwa Sucrose oder Glycerin. Ebenfalls wird ein Gradient erzeugt, wenn z.B. die Teilchen in einer 60%igen wäßrigen Glycerinsuspension vorliegen, während der Zentrifügationsbehälter 80% wäßriges Glycerin enthält.
Die rIL-2-enthaltenden refraktilen Körper werden von den zellulären Bruchstücken durch Hochgeschwindigkeitszentrifugation getrennt. Mit "Hochgeschwindigkeitszentrifugation" ist ein Zentrifugieren der Suspension in einer Zentrifuge bei etwa 10.000- bis 40.000facher Schwerkraft (g), vorzugsweise etwa 10.000-20.000 x g, für eine angemessene Zeitspanne, abhängig vom Volumen, im allgemeinen etwa 10 Minuten bis 72 Stunden, gemeint. Am Ende dieses Schrittes ist der Hauptteil der zellulären Komponenten der Mikroorganismen von dem rIL-2 getrennt. Das Teilchenpellet oder der Teilehenbrei als Ergebnis der Zentrifugation enthält etwa 15-70 Gew.-% IL-2, wie durch den Lowry Nachweis bestimmt; vgl. Lowry et al., 3. Biol. Chem. (1951), 193:265-275.

E. Lösen von rIL-2

Das rIL-2-enthaltende Teilchenpellet oder der Teilchenbrei wird aufgelöst durch Mischen mit einem neutralen wäßrigen Puffer, enthaltend ein Solubilisierungsmittel und eine reduzierende Verbindung. Oberflächen-entspannende Mittel (Detergentien), die eine geeignete hydrophobe-hydrophile Balance haben, um rIL-2 zu lösen, können als Solubilisierungsmittel verwendet werden. Alkalimetallsulfate, enthaltend 10 bis 14 Kohlenstoffatome, und Alkalimetallalkylsarkosinate sind bevorzugte Solubilisierungsmittel, wobei SDS und Sarkosyl besonders bevorzugt werden. Gegebenenfalls kann der wäßrige Puffer auch eine Chelat-bildende Verbindung in einer Konzentration von 3 bis 7 mM enthalten. Besonders bevorzugt als Chelat-bildende Verbindung ist EDTA mit einer Konzentration von 5 mM.
Die Menge des solubilisierenden Mittels, die zur Solubilisierung verwendet wird, hängt von dem einzelnen Mittel ab. Wenn SDS oder Sarkosyl verwendet wird, beträgt die bevorzugte Konzentration (w/v) von SDS/Sarkosyl 0,1 %/10% in einem Puffer wie PBS (50 mM Natriumphosphat, pH 7, 0,9% Natriumchlorid). Bevorzugt beträgt die Konzentration von SDS 2% bis 7%, besonders bevorzugt 5 %. Das Solubilisierungsmedium ent hält ebenfalls eine ausreichende Menge einer reduzierenden Verbindung, um die Oxidation des solubilisierten rIL-2 in einem signifikanten Maß zu verhindern. Protein-reduzierende Mittel, wie DTT und 2-Mercaptoethanol, können für diesen Zweck verwendet werden. Die Konzentration der reduzierenden Verbindung, wie DTT in dem Medium, wird üblicherweise im Bereich zwischen etwa 5 bis 30 mM, vorzugsweise bei etwa 20 mM liegen. Die Solubilisierung wird typischerweise bei Temperaturen im Bereich von 20ºC bis 25ºC unter Mischen ausgeführt. Gegebenenfalls kann ein reduzierender Schritt an dieser Stelle ausgeführt werden. Der pH-Wert kann, fall notwendig, auf einen Bereich von 8 bis 9, besonders bevorzugt etwa 8,5, eingestellt werden. Die Suspension kann für bis 15 Minuten unter Stickstoffatmosphäre auf 50 ± 5ºC erhitzt werden. Das Reaktionsgemisch wird danach auf etwa 25ºC gekühlt.
Die Solubilisierung wird als vollständig angesehen, wenn die Probe für 15 Minuten gestanden hat oder die Lösung lichtdurchlässig erscheint. Gegebenenfalls kann an dieser Stelle das unlösliche Material durch Zentrifugation oder Filtration nach Beendigung der Solubilisierung getrennt werden.

F. Entfernung der reduzierenden Verbindung

Der nächste Schritt in dem Verfahren ist das Entfernen der reduzierenden Verbindung von dem solubilisierten rIL-2, so daß das solubilisierte rIL-2 oxidiert werden kann. Gelfiltration ist der bevorzugte Weg, um die reduzierende Verbindung zu entfernen. Gele, die fähig sind, den Auflösungsgrad bereitzustellen, der für die Trennung der reduzierenden Verbindung von dem solubilisierten rIL-2 erforderlich sind, sind kommerziell erhältlich. Wenn DTT als reduzierende Verbindung verwendet wird, ist Sephacryl S-200 das bevorzugte Gel. Die Gelfiltration wird typischerweise mit gepufferten Lösungen (pH 5,5 bis 7,0), enthaltend etwa 0,1% bis 1 % Solubilisierungsmittel, durchgeführt. Es wird eine Größe der Gelsäule ausgewählt, die eine geeignete Auflösung der Komponenten erlaubt. Diafiltration kann ebenfalls als eine Alternative zur Gelfiltration verwendet werden, um die reduzierende Verbindung zu entfernen.

G. Oxidation von rIL-2

Das rIL-2 wird als nächstes einer kontrollierten Oxidation unterworfen.
Bevorzugte kontrollierte Oxidationsverfahren sind beschrieben in den US-Patenten 4,472,798 (Verwendung eines Oxidationspromotors, enthaltend ein Cu&spplus;²-Kation, wie etwa von CuCl&sub2;, Cu(No&sub3;)&sub2;, usw.) und 4,530,787 (Verwendung von o-Iodosobenzoesäure).
Die Cu&spplus;²-Oxidation umfaßt Reagieren der wäßrigen Lösung des rIL-2 bei einem pH- Wert zwischen etwa 5,5 und 9, vorzugsweise 6 bis 8 und insbesondere bevorzugt etwa 7,5, in Gegenwart von Luft mit mindestens einer wirksamen Menge eines Oxidationspromotors, enthaltend ein Cu&spplus;²-Kation. Kontrollierte Oxidation führt zur Bildung von Disulfidbrücken im rIL-2, die mit den Brücken in natürlichem IL-2 mit keiner oder minimaler Überoxidation und Bildung von nicht-übereinstimmenden Brücken oder Oligomeren übereinstimmt. Diese Oxidation macht die Herstellung von hohen Ausbeuten des rekombinanten IL-2 mit den richtigen Disulfidbrücken möglich.
Die Menge des eingesetzten Oxidationsmittels oder Oxidationspromotors ist mindestens eine wirksame Menge zur Oxidation, d.h. eine Mindestmenge, die notwendig ist, um die Oxidationsreaktion wirksam innerhalb einer angemessenen Zeitspanne durchzuführen. Eine wirksame Menge ist die Menge, ungefähr äquivalent zur Konzentration von freien Sulffiydrylresten im rIL-2, die vorgesehen sind, in der Bildung der gewünschten Disulfidbindungen enthalten zu sein. Vorzugsweise wird die Menge von CuCl&sub2; im Bereich von etwa 5 bis 275 Mikromolar liegen. Im Fall der o-Iodosobenzoesäure wird das molare Verhältnis des Oxidationsmittels zu rIL-2 vorzugsweise im Bereich von etwa 0,05:1 bis etwa 5:1, besonders bevorzugt etwa 0,8:1 bis etwa 2:1 liegen. Die Konzentration von rIL-2 in der Reaktionsmischung wird gering gehalten, d.h. üblicherweise weniger als etwa 5 mg/ml, bevorzugt etwa 0,05 bis etwa 2 mg/ml und insbesondere bevorzugt etwa 0,1 bis etwa 1 mg/ml, um die Wahrscheinlichkeit der Oligomerbildung zu verringern. Der pH-Wert wird zwischen 5,5 und 9, vorzugsweise zwischen 7 und 8 bei der o-Iodosobenzoesäure-Oxidation aufrechterhalten.
Die bei der Oxidation verwendete Temperatur wird üblicherweise zwischen etwa 20ºC und 40ºC, praktischerweise bei Raumtemperatur liegen. Bei der Cu&spplus;²-Oxidation erhöht die Steigerung der Reaktionstemperatur die Reaktionsrate. Die Oxidationsreaktion kann wirksam beendet werden durch z.B. Verringerung des pH-Wertes zu einem Wert, bei dem die Reaktion aufhört, Einfrieren der Lösung oder Zufügen von Chelatbildnern, wie EDTA, zur Reaktionsmischung. Die Oxidationszeit wird üblicherweise im Bereich von 4 Stunden bis etwa 1 Tag liegen.

H. Reinigung des oxidierten rIL-2

Nach der Oxidation wird das rIL-2 gereinigt, um Endotoxine auf einen Wert zu entfernen, der die klinischen Bedingungen erfüllt, d.h. weniger als etwa 0,1 ng Endotoxin pro ml rIL-2. Das IL-2 wird auch vorzugsweise gereinigt, um Pyrogen zu entfernen, so daß es im wesentlichen frei von Pyrogen, gemessen nach dem U.S.P.-Kaninchen-Pyrogentest mit einer Dosierung von 1,0 x 10³ Einheiten/kg, bevorzugt 3,3 x 10&sup5; Einheiten/kg, ist.
RP-HPLC ist ein bevorzugtes Verfahren, um die Reinigung durchzuführen. Träger (stationäre Phasen), die eine gute Auflösung der Proteine bereitstellen, können in der RP-HPLC-Reinigung verwendet werden. C-4, C-8 oder C-18 auf Trägern einer Porengröße von 300 Å sind Beispiele für bevorzugte stationäre Phasen. Die Trennung wird ausgeführt bei einem sauren pH-Wert von weniger als etwa 2,3, gewöhnlich 2,1 bis 2,3. Die Lösung des oxidierten rIL-2 wird auf die RP-HPLC-Säule geladen und an die stationäre Phase absorbiert. Ein Lösungsmittelgradientensystem, umfassend eine organische Säure wie Essigsäure oder Trifluoressigsäure und ein organisches Lösungsmittel wie 2- Propanol oder Acetonitril wird verwendet, um das rIL-2 von der Säule zu eluieren. Essigsäure-Propanol, Trifluoressigsäure-Propanol und Trifluoressigsäure-Acetonitril sind bevorzugte Lösungsmittelsysteme. Die Elutionsbedingungen sind ähnlich zu denen, die in der US-PS 4,569,790 beschrieben sind.

I. Renaturierung des RP-HPLC-gereinigten rIL-2

Der RP-HPLC-Pool kann direkt in dem Renaturierungsschritt verwendet werden oder das rIL-2 kann zunächst als ein "Brei" aus dem Pool wiedergewonnen werden durch Hinzufügen eines neutralen wäßrigen Puffers, wie Phosphatpuffer-Salzlösung (PBS) zu dem Pool, der ein Ausfallen erlaubt, und Wiedergewinnung der Feststoffe durch Zentrifugation.
Der Pool oder die Paste wird vereinigt mit einer wäßrigen Lösung einer chaotropen Verbindung einer Konzentration, die die Denaturierung des rIL-2 bewirkt. Die chaotrope Verbindung liegt vorzugsweise in einem wäßrigen Puffer, bevorzugt PBS, bei einem pH- Wert von etwa 5 bis 9, vorzugsweise etwa 7, vor. Die Einstellung des pH-Wertes, falls notwendig, kann durch die Zugabe einer Base, wie NaOH, ausgeführt werden. Die Menge des Pellets/Breis in der Lösung der chaotropen Verbindung wird normalerweise im Bereich von 0,1 bis 100 mg/ml, vorzugsweise 0,5 bis 60 mg/ml liegen. Der Denaturierungsschritt wird typischerweise bei Temperaturen im Bereich von etwa 4ºC bis etwa 25ºC, bevorzugt 4ºC bis 10ºC unter Mischen ausgeführt. Die Denaturierung ist typischerweise nach etwa 5 bis etwa 15 Minuten des Mischens vollständig abgelaufen. Ein Feststoff, bei dem es sich größtenteils um Reste des solubilisierenden Mittels (SDS) handelt, wird während der Denaturierung gebildet. Dieser Feststoff wird aus der Lösung durch Filtration oder andere konventionelle Fest-Flüssig-Trennungstechniken entfernt. Das rIL-2 wird dann renaturiert aus der gefilterten Lösung der chaotropen Verbindung durch Reduzieren der Konzentration der chaotropen Verbindung und der Proteinkonzentration in der Lösung durch Verdünnen der Lösung mit einem neutralen wäßrigen Puffer oder durch Dialyse oder Diafiltration gegen einen neutralen wäßrigen Puffer. Die Proteinkonzentration wird während der Renaturierung normalerweise im Bereich von 0,1 bis 2,5 mg/ml, bevorzugt 0,5 bis 1,5 mg/ml, liegen.
Falls ein rIL-2 renaturiert wird, bei dem der Cysteinrest an Position 125 nicht mit einer neutralen Aminosäure ersetzt ist (wie rIL-2 mit der Aminosäuresequenz des natürlichen IL-2), ist beobachtet worden, daß eine signifikante Menge des IL-2-Isomers verschiedene Disulfidbindungen hat, als natürliches IL-2. Aus diesem Grund ist es bevorzugt, das Verfahren mit rIL-25 auszuführen, bei denen der Cysteinrest an Position 125 ersetzt ist.
Nach der Renaturierung kann das renaturierte rIL-2 weiter durch Ionenaustauschchromatographie gereinigt werden, um Formen des Proteins zu entfernen, die isoelektrische Punkte haben, die niedriger sind als die von natürlichem IL-2, genauso, wie andere Verunreinigungen. Für diesen Zweck können Kationenaustauscher verwendet werden, die rIL-2 bei einem pH-Wert von etwa 6 bis 7,5 binden. Carboxymethyl-Aggarosesäulen (z.B. Pharmacia Fast-Flow Sepharose CM) sind bevorzugte präparative Kationenaustauscher. Die Lösung mit dem renaturierten rIL-2 wird mit dem Austauscher bei dem angedeuteten pH-Wert in Kontäkt gebracht und das rIL-2 wird mit einem ionischen Gradienten vom Austauscher eluiert. Das gewünschte rIL-2 eluiert bei etwa 0,1 M Salz, wobei die Formen mit einem geringeren isoelektrischen Punkt des Proteins bei geringeren Salzkonzentrationen eluieren.
Das renaturierte, oxidierte rIL-2 ist im wesentlichen rein (d.h. normalerweise mindestens 95%, gewöhnlich mindestens 98%, gemessen durch SDS-PAGE-Analyse), hat einen Endotoxin-Gehalt von weniger als etwa 0,1 ng/mg des rIL-2, ist bevorzugt im wesentlichen frei von Pyrogen, wie mit dem U.S.P.-Kaninchen-Pyrogentest mit einer Dosierung von 1,0 x 10³ Einheiten/kg bestimmt wird. Weiterhin hat es eine Löslichkeit in PBS von mindestens etwa 5 mg/ml. Es ist stabil in dem Sinne, daß es nicht in PBS bei diesen Konzentrationen aggregiert. Es enthält keine nachweisbaren Mengen der solubilisierenden Verbindung (SDS), wie durch den Acridin-Orange-Test und Ionenchromatographie bestimmt wurde. Außerdem zeigt es eine spezifische Aktivität im Bereich von 5 x 10&sup6; bis 2 x 10&sup7; Einheiten/mg.

J. Formulierung

Das gereinigte IL-2 wird in einer wäßrigen Konzentration mit einer Konzentration in einem Bereich von etwa 0,01 bis 2 mg/ml zubereitet. Ein wasserlöslicher Träger wird zum gewünschten Wert zugefügt. Der Träger wird üblicherweise so zugesetzt, daß er in der Lösung mit etwa 1 bis 10 Gew.-%, vorzugsweise etwa 5 Gew.-% vorliegt. Die genaue Menge des zugesetzten Trägers ist nicht kritisch. Herkömmliche feste Fülimittel, die in pharmazeutischen Tablettenformulierungen verwendet werden, können als Träger benutzt werden. Diese Materialien sind wasserlöslich, reagieren nicht mit rIL-2 und sind selbst stabil. Sie sind ebenfalls bevorzugterweise nicht sensitiv gegenüber Wasser (d.h. nicht hygroskopisch). Spezielle Beispiele von Trägern, die zugesetzt werden können, beinhalten Dextrose, Lactose, Mannitol und andere reduzierende Zucker wie Sorbitol, Stärke und Stärkehydrolysate, erhältlich aus Weizen, Mais, Reis und Kartoffel, mikrokristalline Zellulosen und Albumin, wie menschliches Serumalbumin. Mannitol und Dextrose sind bevorzugt.
Der Träger vergrößert das Volumen der Formulierung, so daß, wenn die Dosierungseinheitsmengen der Lösung in Behältern lyophilisiert werden, wie einem sterilen Fläschchen, wird der gefriergetrocknete Rest deutlich wahrnehmbar für das bloße Auge sein wird. In dieser Hinsicht ergibt der bevorzugte Träger Mannitol einen ästhetisch akzeptierbaren (weiß, kristallin) Rest, der gegenüber Wasser nicht sensitiv ist. Die Nicht-Sensitivität von Mannitol gegenüber Wasser kann die Stabiltiät der Formulierung erhöhen.
EP-OS 215 658 (veröffentlicht am 25. März 1987 mit dem Titel "An Improved Formulation for Lipophilic Proteins", Hanisch et al.) gibt einen Überblick über ein verbessertes Verfahren zur Wiedergewinnung und Reinigung lipophiler rekombinanter Proteine, wie rIL-2 aus Mikroorganismen, um eine Proteinpräparation zu erhalten, die zu einer stabilen pharmazeutischen Verbindung formuliert werden kann. Solch eine Verbindung, die eine therapeutisch wirksame Menge des biologisch aktiven rekombinanten lipophilen Proteins, gelöst in einem nicht-toxischen, inerten, therapeutisch kompatiblen, wasserbasierenden Trägermedium bei einem pH von 6,8 bis 7,8 trägt, enthält ebenfalls ein stabilisierendes Mittel für das Protein, wie menschliches Serumalbumin, normales Serumalbumin und menschliche Plasmaproteinfraktion. Die Formulierungsaspekte der EP-OS 215 658 sind ein alternativer Formulierungsweg für gereinigtes IL-2. EP-Veröffentlichung 216 658 gibt einen Überblick über ein Formulierungsverfahren mit einem geringen pH- Wert. US-PS 4,462,940 (Hanisch et al.) gibt einen Überblick über ein Formulierungsverfahren mit hohem pH-Wert, und deren Formulierungsaspekte sind hier ebenfalls als Referenz aufgeführt.
Nach Zufügung des Trägers werden die Dosierungseinheitsmengen (d.h. für rIL-2- Volumen, die 0,01 bis 2 mg, vorzugsweise 0,2 bis 1 mg rIL-2 pro Dosierung zur Verfügung stellen) der Lösung in Behälter verteilt, die Behälter werden mit einem genuteten Verschluß bedeckt und der Inhalt mit üblichen Gefriertrocknungsbedingungen und Vorrichtungen lyophilisiert.
Das lyophilisierte, sterile Produkt besteht aus einer Mischung von (1) rIL-2, (2) Träger (Dextrose oder Mannitol), (3) gegebenenfalls anderen Tr;gersubstanzen, wie menschliches Serumalbumin, Tween 80 und dergleichen, und (4) einer geringen Menge von Puffer, die einen physiologischen pH-Wert bereitstellt, wenn die Mischung wiederhergestellt wird. Das Produkt kann ebenfalls eine geringe Menge eines Konservierungsmittels zur Erhöhung der chemischen Stabilität enthalten. Das rIL-2 wird üblicherweise etwa 0,015 bis 3,85 Gew.-% der Mischung ausmachen, vorzugsweise etwa 0,4% bis 0,6% der Mischung.
Die lyophilisierte Mischung kann durch Injizieren einer üblicher parenteralen wäßrigen Injektion, wie destilliertem Wasser zur Injektion, Ringers-Injektionslösung, Hanks- Injektionslösung, Dextrose-Injektion, Dextrose- und Salz-Injektion, Injektion physiologischer Kochsalzlösung oder dergleichen, in das Fläschchen wiederhergestellt werden. Die Injektion sollte gegen die Seitenwände der Flasche gegeben werden, um ein übermäßiges Schäumen zu verhindern. Die Menge der zu dem Fläschchen zugesetzten Injektion liegt üblicherweise im Bereich von 1 bis 5 ml, bevorzugterweise 1 bis 2 ml.
In einer alternativen Formulierung beschreibt PCT/WO 87/00056 (M. Knauf et al., veröffentlicht am 15. Januar 1987, "Solubilization of Recombinant Proteins for Pharmaceutical Compositions Using Monopolymer Conjugation"), daß das IL-2 mit einem aktivierten Polymer, ausgewählt aus Polyethylenglykol, Homopolymeren und polyoxyethylierten Polyolen, wie polyoxyethyliertem Glycerin, reagieren. Das Polymer hat vorzugsweise ein Molekulargewicht von 300 bis 100.000 Dalton, insbesondere bevorzugt 350 bis 40.000 Dalton. Das Polymer wird durch Konjugation mit einer Kupplungsverbindung mit terminalen Resten aktiviert, die reaktiv sind sowohl mit den freien Amin- oder Thiolresten des Proteins als auch dem Hydroxylrest des Polymers. Beispiele solcher Kupplungsverbindungen beinhalten Hydroxynitrobenzolsulfonsäureester, Cyanursäurechlorid und N-Hydroxysuccinimid. Das rIL-2 wird dann direkt mit dem wasserlöslichen Träger und Puffer wie oben beschrieben formuliert, die Formulierung wird lyophilisiert und die lyophylisierte Mischung kann, wie oben beschrieben, wiederhergestellt werden.
Die wiederhergestellte Formulierung, die wie oben beschrieben präpariert wurde, ist geeignet zur parenteralen und oralen Verabreichung an Menschen oder anderen Saugetieren in therapeutisch wirksamen Mengen (d.h. Mengen, die den pathologischen Zustand des Patienten beseitigen oder verringern), um eine Therapie bereitzustellen. Die rIL-2- Therapie ist für eine Vielzahl von immunmodulatorischen Indikationen, wie T-Zellmutagenese, Induktion von cytotoxischen T-Zellen, Vergrößerung der natürlichen Killerzellaktivität, Induktion von IFN-γ Wiederherstellung und Erhöhung der zellulären Immunität (z.B. Behandlung von Immunmangelzuständen) und Vergrößerung der zellvermittelten Antitumoraktivität verwendbar.
Die erfindungsgemäßen Formulierungen sind nützlich bei parenteralen Verabreichungen, z.B. intravenös, subkutan, intramuskulär, intraorbital, ophthalmisch, intrakapsulär, intraspinal, intrasternal, topikal, intranasalem Aerosol, Skarifikation und ebenfalls für orale Verabreichung. Die bevorzugten Verabreichungsarten sind intramuskulär, subkutan und intravenöse Injektion und topikale Verabreichung. Die Verwendung von nicht-ionischen Detergentien sind insbesondere bevorzugt zur topikalen Verabreichung von Formulierungen, da sie die Fähigkeit besitzen, durch die Hautoberfläche durchzudringen.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung näher. Diese Beispiele beabsichtigen nicht, die Erfindung in irgendeiner Weise einzuschränken. In diesen Beispielen sind die Temperaturen in ºC angegeben, falls nicht anders vermerkt.

Beispiel 1

Dieses Beispiel verdeutlicht ein bevorzugtes Verfahren zur Wiedergewinnung, Reinigung, Renaturierung und Formulierung von rIL-2 aus E.coli.
Des-alanyl-IL-2ser125 wurde aus E. coli wiedergewonnen. Der in diesem Beispiel verwendete E. coli-Stamm (K12/MM294-1), der des-alanyl-IL-2ser125 herstellt, trägt das Plasmid pLW45, das bei der American Type Culture Collection am 4. März 1984 mit der Hinterlegungsnummer 39,626 hinterlegt wurde. Das Analogon und Verfahren zur Herstellung sind in der US-PS 4,518,584 beschrieben.
Die so mit dem Plasmid pLW45 transformierten E. coli wurden in einem 1000 Liter Permenter bei 37ºC angezogen. Der gelöste Sauerstoff wurde mit etwa 40% aufrechterhalten durch, falls notwendig, (1) Erhöhung der Bewegung, (2) Zugabe von Luft und (3) Zugabe von Sauerstoff.
Nachdem der Fermenter mit Wasser auf das Arbeitsvolumen aufgefüllt wurde, wurden die folgenden Spurenelemente zugegeben:
ZuSO&sub4; 7H&sub2;O 30 µM
MnSO&sub4; 4H&sub2;O 30 µM
CuSO&sub4; 5H&sub2;O 3 µM
Na&sub3;-Zitrat 2H&sub2;O 1,5 mM
KH&sub2;PO&sub4; 21 mM
(NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 72 mM
Die Fermenter-Zuführung und die Zugabegefäße wurden dann entsprechend den Standardarbeitsverfahren sterilisiert. Danach wurden die folgenden sterilen Zugaben gemacht:
MgSO&sub4; 7H&sub2;O 3 mM
FeSO&sub4; 7H&sub2;O 72 µM
L-Tryptophan 70 mg/L
Thiamin-HCl 20 mg/L
Glukose 5 g/L
Tetracyclin 5 mg/L
Der Fermenter wurde gekühlt und mit 2 mg/l einer gefrorenen oder angesetzten E. coli- Kultur inokuliert. Eine Glukose-Zuführlung wurde verwendet, um die Glukosekonzentration zwischen 5-10 g/l zu halten. Etwa 15 Stunden nach dem Start der Fermentation wurde begonnen, den pH-Wert mit KOH auf 6,8 einzustellen. Optische Dichte-Messungen und Glukose-Rückstandsmessungen der Proben wurden nach 14 bis 16 Stunden und danach in etwa 1-Stunden-Intervallen abgenommen.
Die Induktion der des-alanyl-IL-2-ser125-Herstellung durch Entzug von L-Tryptophan aus dem Kulturmedium trat bei etwa einer OD&sub6;&sub8;&sub0;= 10, gefolgt von der Zugabe von Casaminosäuren zu einer Endkonzentration von 2% bei OD&sub6;&sub8;&sub0;= 15, auf. Die Kulturen wurden ungefähr 3-5 Stunden später gesammelt.
Die refraktilen Körper, enthaltend das des-alanyl-IL-2ser125 wurden dann isoliert. Das gesammelte Material wurde 5-10fach konzentriert durch Zirkulieren des gesammelten Materials unter Druck mit UF-Durchflußfiltrationspatronen mit einem 100 K Molekulargewichtsausschluß. Die Zellen wurden mit deionisiertem Wasser gewaschen. EDTA wurde zu einer Endkonzentration von 25 mM zugesetzt und die Zellen wurden mittels 3 Passagen durch einen Aufschließer bei etwa 6500 psi (195 atm) zerstört. Die Suspension wurde gegen 5 Volumen deionisiertes Wasser diafiltriert. EDTA wurde dann zu einer Endkonzentration von 5 mM zugesetzt. Octanol wurde zu 1 % (Volumen/Gewicht) zugesetzt, um sämtliche verbleibenden lebenden Bakterien in dem diafiltrierten Produkt abzutöten. Nach einigen Stunden wurde der diafiltrierte Aufschluß erneut mittels Durchführen durch einen Aufschließer zerstört.
Sucrose wurde zu dem erneuten Aufschluß zugegeben, um eine Enddichte Zwischen 1,1 und 1,25 g/ml zu erzeugen. Die Mischung wurde bei 10.000 bis 20.000 x g bei 1-2 lpm zentrifugiert und das Teilchenpellet oder der Teilchenbrei wurde gesammelt. Eine Temperatur von mindestens 20ºC wurde vor und während der Zentrifugation aufrechterhalten.
Der Teilchenbrei wurde dann in PBS mit 5% SDS gelöst. Der gelöste Brei wurde dann bei 25.000-35.000 x g zentrifugiert. Festes DTT und EDTA wurden zu einer Endkonzentration von 50 mM und 2 mM hinzugegeben. Die Suspension wurde auf 50ºC ± 5ºC für 20 Minuten unter Stickstoffatmosphäre bei einem pH-Wert von etwa 8,5 erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde danach auf etwa 25ºC abgekühlt und der pH-Wert des Gemisches wurde auf 5,5 ± 0,1 eingestellt unter Verwendung von Eisessig.
Die chromatographische Trennung von Kontaminanten eines höheren Molekulargewichts wurde erreicht unter Verwendung einer Sephacryl S-200-Säule. Das gelöste und reduzierte rIL-2 wurde auf die Säule geladen und Fraktionen wurden in saubere, depyrogenierte Röhrchen gesammelt unter Verwendung eines Elutionspuffers, enthaltend 50 mM Acetat, pH 5,5, 1 mM EDTA und 0,1% SDS. Peak-Fraktionen (im Bereich von 70% der maximalen Peak-Höhe) wurden zusammengelegt und einer kontrollierten Oxidation, wie nachstehend beschrieben, unterzogen:
Die Oxidation des rIL-2 in dem S-200-Pool wurde durch Zugabe von CuCl&sub2; in einem molekularen Verhältnis von 3:1 (CuCl&sub2; zu rIL-2) eingeleitet. Die Oxidation wurde bei etwa 25ºC in 50 mM Phosphat-gepufferter Salzlösung durchgeführt. Der pH-Wert wurde während der Oxidation bei 7,5 ± 0,2 kontrolliert und 4 mM EDTA wurden nach Vervollständigung der Oxidation zugegeben. Da oxidiertes rIL-2 hydrophiler ist als reduziertes rIL-2, wurde der Vorgang der Oxidationsreaktion durch RP-HPLC überwacht.
Das oxidierte IL-2 wurde danach konzentriert unter Verwendung einer hohlen Fibermembran-Ultrafiltrationseinheit mit einem Aufschluß von 10.000 Dalton. Der pH-Wert des oxidierten Pools wurde dann auf einen Wert von etwa 2 bis etwa 3 eingestellt und durch einen 0,45 µ Nitrolzellulosefilter filtriert.
Eine präparative HPLC unter Verwendung einer Vydac C&sub4;-Silikagelsäule, unterstützt mit zwei Lösungsmitteln, war der nächste Schritt in dem rIL-2-Reimgungsschema. Lösungsmittel 1 bestand aus 6% Essigsäure und 10% 2-Propanol und Lösungsmittel 2 bestand aus 6% Essigsäure und 94% 2-Propanol. Nach 30-minütigem Pumpen des Lösungsmittels 1 wurde das angesäuerte rIL-2 geladen. Die Säule wurde mit einem Gradienten der Lösungsmittel 1 und 2 entwickelt und das Protein, das bei etwa 40% des Lösungsmittels 2 eluiert, wurde in depyrogenierte graduierte Zylinder vereinigt. Phosphatpuffer wurde zu dem Pool hinzugefügt, um einen neutralen pH-Wert zu erzielen, der zur Bildung eines Präzipitats führt ("HPLC-Brei"). Das Präzipitat wurde durch Zentrifugation wiedergewonnen.
Alternativ kann ein Trifluoressigsäure-Acetonitril-Lösungsmittelsystem unter Verwendung eines Acetonitril-Gradienten, wie in der US-PS 4,569,790 beschrieben, für die präparative HPLC verwendet werden.
Die Renaturierung des rIL-2 in kleinem Maßstab von dem HPLC-Brei wurde durch Auflösen des Breis in 7 M Guanidiniumpuffer ausgeführt. Die Lösung wurde durch einen 0,2 Mikron-Filter filtriert und dann dialysiert unter Verwendung eines Zellulosedialyseschlauchs mit einem Aufschluß von 6-8 kd in 20 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,4 oder Tris, pH 8,1.
Die Renaturierung des rIL-2 aus dem Brei wurde in großem Maßstab folgendermaßen durchgeführt. Etwa 1 g des HPLC-Breis wurde gewaschen und wieder zweimal mit 100 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer (pH 6,0) pelletiert. Das Pellet wurde aufgelöst in 100 ml 7 M Guanidinium (10 mM Natriumphosphatpuffer). Feine Teilchen wurden entfernt durch Hinzufügen mehrerer Spateispitzen von Celit und Filtern durch einen 0,2 Mikron- Filter. Zusätzlich wurden 600 ml Guanidiniumpuffer hinzugefügt zu der filtrierten Lösung und sie wurde dann diafiltriert mit einem 1 square foot YM-10 Spiralpatrone (Amicon). Kaltes Natriumphosphat (10 mM, pH 7,0) mit 2,5% Sucrose wurden als Austauschpuffer verwendet. Die Diafiltrationsrate war etwa 2 Volumen-Austausche pro Stunde. Nach 6 Volumen-Austauschen wurde eine trübe Lösung erhalten, die 0,2 Mikron Nalgene flachen Filter mit einem Vorfilter-Insert filtriert wurde. Eine Ausbeute von 80% (800 ml, 1,12 mg/ml) wurde erhalten.
Die präparative Chromatographie des diafiltrierten gelösten HPLC-Breis wurde auf einer Pharmacia Fast-Flow-CM-Sepharose-Säule durchgeführt. Die Puffer für die Gradienten- Elution waren Natriumphosphatpuffer, pH 7,0 und Natriumphosphatpuffer mit Natriumchlorid. rIL-2 wurde bei einer Salzkonzentration von 0,1 M wiedergewonnen.
Bei der Renaturierung im kleinen Maßstab unter Verwendung der Dialyse blieben etwa 85% des beständig in der Lösung nach Entfernen von Guanidinium. Diese Ausbeute blieb konstant über einen Bereich der Protein-Konzentration von 0,3 bis 1,5 mg/ml. Ein Acridinorange-Assay zeigte an, daß im wesentlichen kein SDS zurückblieb nach der Solubilisierung, Filtration und Dialyse des HPLC-Breis. Es stellte sich heraus, daß restliches SDS, das in dem HPLC-Brei vorhanden war, im Anschluß an die Solubilisierung des rIL-2 in Guanidiniumhydrochlorid präzipitierte und durch Filtration entfernt wurde.
Das Protein, das während der Dialyse präzipitierte, konnte mit 7 M Guanidinium wieder gelöst werden und konnte wieder dialysiert werden. Jedoch werden weniger als 15 % des Proteins als ein lösliches Produkt wiedergewonnen. Figur 2 ist ein RP-HPLC-Chromatogramm für diafiltrierten Überstand, diafiltriertes Pellet und ein gegenwärtig klinisches rIL-2-Produkt, das hergestellt wurde durch das Verfahren, beschrieben in den US-PSen 4,569,790 und 4,572,978. Diese Figur zeigt, daß das Material, das nicht renaturiert wird, sehr ähnlich zu dem Protein ist, das nach der Dialyse löslich bleibt. Die Aktivität von beiden, dem renaturierten und dem nicht renaturierbaren Material ist ähnlich. Sie beträgt bei beiden etwa 10&sup7; Einheiten/mg.
Die Dialyse-Renaturierung im kleinen Maßstab konnte sehr gut reproduziert werden mit Diafiltrationsausrüstung und zeigte, daß das Verfahren in großem Maßstab ausgeführt werden kann ohne signifikante Schwierigkeiten. Sucrose wurde zu dem Austauschpuffer hinzugefügt, um die Verhinderung der Prazipitation des rIL-2, die auf die Agitation zurückzuführen ist, zu unterstützen. Die Präzipitation, die wahrend der Diafiltration vorkommt, verursacht keine signifikante Reduktion der Diafiltrationsrate. SDS-Konzentrationen nach der Diafiltration waren wiederum nicht nachweisbar.
Durch die präparative Chromatographie an einer Fast-Flow-CM-Sepharose-Säule (Figur 3) ermöglichte die Trennung einiger kleinerer Formen von IL-2 von dem Haupt-Peak. Bis zu 87% des Materials, das auf die präparative Säule aufgebracht wurde, wurde als llaupt-Peak wiedergewonnen. Um diese hohe Ausbeute zu erhalten, war es notwendig, die anfängliche Salzkonzentration des A-Puffers zu haben. Die Konzentration betrug mindestens 40 bis 50 mM. Niedrigere Salzkonzentrationen verursachten signifikant niedrigere Ausbeuten.

Beispiel 2

Dieses Beispiel beschreibt weiter die Vorteile der Renaturierung von gereinigtem, oxidiertem rIL-2, hergestellt durch bekannte Verfahren.
rIL-2 wurde wie in Beispiel 1 hergestellt, zum Erhalten eines RP-HPLC-Pools. Der Protein-Pool wurde durch langsames Hinzufügen in eine gerührte Pufferlösung, enthaltend 50 mM Natriumacetat, pH 5,5, 1 mM EDTA und 0,1 % SDS, das das 14fache Volumen des HPLC-Pools hatte, verdünnt. Die Verdünnung war wegen der Sensitivität der hohlen Fibermembran-Ultrafiltrationseinheit gegenüber organischem Lösungsmittel, das in dem HPLC-Pool vorhanden ist, und wurde im nächsten Schritt zur Konzentrierung verwendet.
Der verdünnte HPLC-Pool wurde konzentriert unter Verwendung einer hohlen Fibermembran-Ultrafiltrationseinheit mit einem Molekulargewichtsausschluß von 10.000. Die Konzentration wurde gegen 50 mM Acetat, pH 5,5, 1 mM EDTA und 0,1% SDS mit dreimaligem Volumenwechsel diafiltriert.
In dem letzten chromatographischen Schritt in der Reinigung des rIL-2 wurde eine zweite Sephacryl S-200-Säule verwendet. Die Hauptaufgabe dieser Säule war die Trennung des rIL-2 von Oligomeren des Proteins mit höherem Molekulargewicht. Die Säule wurde eluiert mit einem Puffer, enthaltend 50 mM Acetat, pH 5,5, 1 mM EDTA und 0,1 % SDS. Die rIL-2-Fraktionen wurden vereinigt. Das Protein wurde gegen 10 mM Natriumphosphat, pH 7,5, diafiltriert, bis der SDS-Level im Bereich von 100-200 µg/mg Protein war.
8 mg des diafiltrierten IL-2 wurden auf einer C4-Vydac RP-HPLC-Säule gereinigt, mit Acetonitril/TFA und nachfolgendem Hinzufügen von 0,1 % w/v SDS laufengelassen wurde. Der RP-HPLC-Pool wurde mit 7 M Guanidinium dialysiert. Danach wurde er umfassend in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) dialysiert. Eine geringe Menge von Präzipitat, das in dem rIL-2 gebildet wurde, wurde durch Zentrifugation bei 15.000 x g für 10 Minuten entfernt. Die Menge von löslichem rIL-2 war 80% (6,4 mg). Dieses Material wurde weiter analysiert durch 1) Spektral-Test auf Aggregation, 2) Molekulargewichtsbestimmung in Phosphatpuffer und 3) Bioaktivität. Die Ergebnisse sind nachstehend beschrieben.

Spektral-Test

Das UV-Spektrum von rIL-2 verändert sich in Abhängigkeit von dem Zustand der Aggregation des Moleküls. Dieser physikalische Parameter wurde verwendet, um die rIL-2-Formulierungen im Anschluß an eine 5fache Verdünnung in 10 mM Natriumphosphat, 150 mM Natriumchlorid, pH 7,4, zu vergleichen.
Spektral-Scans wurden über eine Zeit von 2 Stunden bei 30-Minuten-Intervallen direkt im Anschluß an die Verdünnung aufgezeichnet. Wie in Figur 4, Panel A, gezeigt, stellt sich heraus, daß das Guanidin-renaturierte rIL-2 unter diesen Bedingungen stabil ist und keine Änderung der Absorption bei 280 nm zeigt. Im Gegensatz dazu aggregiert das dinfiltrierte rIL-2 (Panel B) während des Tests. Dies zeigt seine reduzierte Löslichkeit im Anschluß an eine Abnahme der SDS-Konzentration. Als Kontrolle wurde 0,1 % SDS zum Zeitpunkt t=2 h wieder zu dem diafiltrierten rIL-2 nach Sfacher Verdünnung gegeben. Panel B zeigt (gestrichelte Linie), daß das rIL-2-Spektrum in den normalen Bereich zurückkehrt Dies zeigt, daß die Abwesenheit von SDS die reversible Aggregation verursachte.

Bestimmung der Molekulargröße

Die Wiedergewinnung von SDS-formuliertem rIL-2 im Anschluß an die Bestimmung der molekularen Größe durch HPLC-Analyse ist nicht sehr hoch, vermutlich wegen der Aggregation und dem nachfolgenden Verlust an den Fritten und der Säule. Wenn jedoch das renaturierte rIL-2 durch dieses Verfahren analysiert wurde, war die Wiedergewinnung wesentlich höher. Wie in Figur 5 gezeigt, eluiert das renaturierte rIL-2 als ein großer symmetrischer Peak mit einem apparenten Molekulargewicht von etwa 16 kd. Wenn eine gleiche Menge von diafiltriertem rIL-2 analysiert wurde, wurde ein schmaler asymmetrischer Peak erhalten, der zeigt, daß rIL-2 bei physiologischem Puffer nicht in der Lösung verbleibt.

Biologische Aktivität

Die spezifische Aktivität des renaturierten rIL-2 wurde mit etwa 1,5 x 10&sup7; u/mg, gemessen durch den HT-2 Zellproliferationstest, bestimmt.
Zusätzlich zu dem zuvor beschriebenen Vektorsystem, das den trp-Promotor zur IL-2- Expression verwendet, beinhalten alternative Vektorsysteme die Verwendung des lambda pL-Promotors und/oder eines positiven Retroregulationselements.
Diese Vektorsysteme sind in den US-PSen 4,711,845 und 4,666,848 beschrieben.
Vektorsysteme, beschrieben in den vorhergenannten Psen, wie auch zusätzliche Vektoren, wie oben zur Verfügung gestellt, sind bei der American Type Culture Collection (ATCC) nach dem Budapester Vertrag über die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren und deren Bedingungen hinterlegt und sind so erhalten und entsprechend den Bedingungen des Budapester Vertrages verfügbar gemacht. Die Verfügbarkeit solcher Stämme ist nicht aufzufassen als eine Lizenz zur Durchführung der Erfindung gegen Zuwiderhandlung der erteilten Rechte unter der Autorität irgendeiner Regierung in Übereinstimmung mit seinen Patentgesetzen.
Die hinterlegten Plasmide wurden mit den angegebenen ATTC-Hinterlegungsnummern ausgestattet:

Claims

1. Ein Verfahren zur Gewinnung von rekombinantem Interleukin-2 (rIL-2) aus transformierten Mikroorganismen enthaltend das rIL-2, wobei das rIL-2 getrennt wird von dem Hauptteil der zellulären Komponenten der Mikroorganismen, gelöst wird in einer reduzierten Form mit einer wäßrigen Lösung von Natriumdodecylsulfat (SDS), danach oxidiert wird und danach bis zu einer klinisch verträglichen Reinheit und bis zu einem klinisch verträglichen Endotoxin-Gehalt gereinigt wird und bevorzugt bis zu einem klinisch verträglichen Pyrogen-Gehalt gereinigt wird, das oxidierte, gereinigte rIL-2 durch Einbringen des rIL-2 in eine Lösung einer Guanidinium-chaotropen Verbindung denaturiert wird, das verbleibende SDS als Feststoff aus der Lösung entfernt wird und danach das rIL-2 aus der Lösung renaturiert wird, wodurch ein renaturiertes, oxidiertes, gereinigtes rIL-2 mit verbesserter Stabilität und Löslichkeitseigenschaften in Abwesenheit von Detergentien erhalten wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Lösen des reduzierten rIL-2 durch Vermischen des getrennten rIL-2 mit einer wäßrigen Lösung von 0,1 bis 10% (w/v) von SDS erreicht wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Lösung der chaotropen Verbindung eine 4 bis 8M wäßrige Guanidiniumhydrochloridlösung ist, gegebenenfalls eine etwa 7M wäßrige Guanidiniumhydrochloridlösung und der pH der Lösung 5 bis 9 ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Konzentration des gereinigten IL-2 in der wäßrigen Guanidiniumlösung 0,1 bis 100 mg/ml, vorzugsweise 0,5 bis 60 mg/ml ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Denaturierung ausgeführt wird bei 4 bis 25ºC.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Entfernen des Feststoffes aus der Lösung der chaotropen Verbindung, in die das rIL-2 eingebracht wurde, durch Filtration durchgeführt wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Renaturierung bei einer Proteinkonzentration von 0,1 bis 2,5 mg/ml ausgeführt wird und/oder durch Dialyse der Verdünnung der Losung mit der chaotropen Verbindung ausgeführt wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das renaturierte, oxidierte, gereinigte rIL-2 weiter gereinigt wird durch In-Kontakt-Bringen einer wäßrigen Lösung des renaturierten rIL-2 mit einem Kationen-Austauscher bei einem pH von etwa 6 bis 7,5, Elution der absorbierten Fraktion von dem Kationen-Austauscher mit einem Salzgradienten und Gewinnung des weiter gereinigten rIL-2 bei einer Salzkonzentration von etwa 0,1M.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das rIL-2 getrennt wird von dem Hauptteil der zellulären Komponenten durch Aufbrechen der Zellen und Trennen des wasserunlöslichen Materials von dem resultierenden Aufschluß, das rIL-2 gelöst wird in einer reduzierten Form durch Mischen des wasserunlöslichen Materials mit einer wäßrigen Lösung von SDS, die eine reduzierende Verbindung enthält, die reduzierende Verbindung entfernt wird von dem gelösten rIL-2 vor der Oxidation, die Oxidation eine kontrollierte Oxidation unter Verwendung von Cu&spplus;²-Ionen als Oxidationspromotor ist und das oxidierte rIL-2 bis zu klinisch verträglichen Endotoxin-Gehalten durch Umkehrphasen-Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie gereinigt wird.

10. Verwendung von renaturierten, oxidierten, gereinigtem rIL-2 resultierend aus einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Herstellung eines Arzneistoffes.