DE3856592T2

DE3856592T2 - Adhäsionsvarianten

Info

Publication number: DE3856592T2
Application number: DE3856592T
Authority: DE
Inventors: Daniel J. San Mateo Capon; Timothy J. Hillsborough Gregory
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1987-10-02
Filing date: 1988-10-03
Publication date: 2007-10-04
Anticipated expiration: 2008-10-04
Also published as: EP0832971B1; DE3856592D1; ATE335817T1; ZA887365B; EP0832971A1

Description

Hintergrund der Erfindung
Diese Anmeldung betrifft Zusammensetzungen für antivirale oder immunmodulatorische Therapieverfahren. Im Besonderen betrifft sie Zusammensetzungen, die bei der Behandlung von Infektionen mit dem „Human Immunodeficiency Virus" (HIV) nützlich sind.
Die immunologische Hauptanomalie, die aus einer Infektion mit HIV resultiert, ist die progressive Verarmung und funktionelle Schädigung der das CD4-Zelloberflächen-Glykoprotein exprimierenden T-Lymphozyten (H. Lane et al., Ann. Rev. Immunol. 3, 477 [1985]). CD4 ist ein nicht polymorphes Glykoprotein mit einer Homologie mit der Immunglobulingenüberfamilie (P. Maddon et al., Cell 42, 93 [1985]). Zusammen mit dem CD8-Oberflächen-Antigen definiert CD4 zwei verschiedene Untergruppen reifer peripherer T-Zellen (E. Reinherz et al., Cell 19, 821 [1980]), die sich jeweils durch ihre Fähigkeit, mit nominellen Antigen-Targets wechselzuwirken, im Kontext der Klasse-I- bzw. Klasse-II-Haupthistokompatibilitätskomplex-(MHC-) Antigene unterscheiden (S. Swain, Proc. Natl. Acad. Sci. 78, 7101 [1981]; E. Engleman et al., J. Immunol. 127, 2124 [1981]; H. Spitz et al., J. Immunol. 129; 1563 [1982]; W. Biddison et al., J. Exp. Med. 156, 1065 [1982], und D. Wilde et al., J. Immunol. 131, 2178 [1983]). Größtenteils weisen CD4-T-Zellen den Helfer/Induktor-T-Zellen-Phänotyp auf (E. Reinherz, s.o.), obwohl als cytotoxische/Suppressor-T-Zellen identifizierte CD4-T-Zellen ebenso identifiziert wurden (Y. Thomas et al., J. Exp. Med. 154, 459 [1981]; S. Meuer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 4395 [1982], und A. Krensky et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 2365 [1982]). Der Verlust von CD4-Helfer/Induktor-T-Zellfunktionen liegt wahrscheinlich den tiefgreifenden Defekten der zellulären und humoralen Immunität zugrunde, die zu den opportunistischen Infektionen und Malignomen führen, die für das Erworbene Immundefektsyndrom (AIDS) charakteristisch sind (H. Lane, s.o.).
Studien über eine HIV-I-Infektion fraktionierter CD4- und CD8-T-Zellen von normalen Spendern und AIDS-Patienten haben gezeigt, dass die Verarmung der CD4-T-Zellen das Resultat der Fähigkeit von HIV-I ist, diese T-Lymphozyten-Untergruppe selektiv zu infizieren, in diesen zu replizieren und sie schließlich zu zerstören (D. Klatzmann et al., Science 225, 59 [1984]). Auf die Möglichkeit, dass CD4 selbst eine essentielle Komponente des zellulären Rezeptors für HIV-I ist, wurde erstmals durch die Beobachtung, dass monoklonale, gegen CD4 gerichtete Antikörper eine HIV-I-Infektion und Synzytiainduktion blockieren, hingewiesen (A. Dalgleish et al., Nature 312, 767 [London] [1984]; J. McDougal et al., J. Immunol. 135, 3151 [1985]). Diese Hypothese wurde durch die Demonstration der Bildung eines Molekularkomplexes zwischen CD4 und gp120, dem Haupt-Hüllglykoprotein von HIV-I, bestätigt (J. McDougal et al., Science 231, 382 [1986]) sowie durch die Entdeckung, dass HIV-I-Tropismus nach der stabilen Expression einer CD4-cDNA auf normale, nichtpermissive menschliche Zellen übertragen werden kann (P. Maddon et al., Cell 47, 333 [1986]). Weiters scheinen die neurotropen Eigenschaften von HIV-I, die sich im häufigen Auftreten von Dysfunktionen des Zentralnervensystems bei HIV-I-infizierten Individuen widerspiegeln (W. Snider et al., Ann. Neurol. 14, 403 [1983]), und die Fähigkeit, HIV-I im Gewebe des Gehirns sowie in der Zerebrospinalflüssigkeit von AIDS-Patienten nachzuweisen (G. Shaw et al., Science 227, 177 [1985]; L. Epstein, AIDS Res. 1, 447 [1985]; S. Koenig, Science 233, 1089 [1986]; D. Ho et al., N. Engl. J. Med. 313, 1498 [1985]; J. Levy et al., Lancet II, 586 [1985]), ihre Erklärung in der Expression von CD4 in Neuronen-, Glia- und Monozyten-/Makrophagen-Zellen zu haben (P. Maddon, Cell 47, 444 [1986]; I. Funke et al., J. Exp. Med. 165, 1230 [1986]; B. Tourvieille et al., Science 234, 610 [1986]).
Zusätzlich zur Bestimmung der Anfälligkeit für eine HIV-I-Infektion scheint das Auftreten von zytopathischen Wirkungen im infizierten Wirt CD4 zu involvieren. Von Antikörpern für CD4 wurde herausgefunden, dass sie in vitro die Fusion uninfizierter CD4-T-Zellen mit HIV-I-infizierten Zellen hemmten; weiters sterben die großen vielkernigen Zellen, die durch dieses Vorkommnis entstehen, kurz nach ihrer Entstehung, was zu einer Verarmung der Population von CD4-Zellen führt (J. Lifson et al., Science 232, 1123 [1986]). Die Bildung von Synzytien erfordert ebenso eine gp120-Expression und kann durch Co-Kultivieren von CD4-positiven Zelllinien mit Zelllinien, die das HIV-I-env-Gen in Abwesenheit anderer viraler struktureller oder regulatorischer Proteine exprimieren, ausgelöst werden (J. Sodroski et al., Nature 322, 470 [1986]; J. Lifson et al., Nature 323, 725 [1986]). Beim Vermitteln zwischen der initialen Infektion durch HIV-I und einem schlussendlichen Zelltod stellt die Wechselwirkung zwischen gp120 und CD4 einen von mehreren kritischen Eintrittspunkten im viralen Lebenszyklus dar, der sich für therapeutisches Einschreiten eignet (H. Mitsuya et al., Nature 325, 773 [1987]).
Die bekannte Sequenz des CD4-Vorläufers prognostiziert ein hydrophobes Signalpeptid, eine extrazelluläre Region von etwa 370 Aminosäuren, einen hochgradig hydrophoben Abschnitt mit einer signifikanten Identität mit der membrandurchdringenden Domäne der Klasse-II-MHC-β-Kette sowie eine stark geladene intrazelluläre Sequenz von 40 Resten (P. Madden, Cell 42, 93 [1985]). Die extrazelluläre Domäne von CD4 besteht aus vier zusammenhängenden Regionen, die jede eine Aminosäuren- und strukturelle Ähnlichkeit mit den variablen und den Verbindungs-(V-J-) Domänen der Immunglobulin-Leichtketten aufweisen sowie aus verwandten Regionen in anderen Mitgliedern der Immunglobulingenüberfamilie (eine Unterklasse, die hierin durch den Begriff "Adhesone" definiert wird). Diese strukturell ähnlichen Regionen von CD4 werden die V1-, V2-, V3- und V4-Domänen genannt (in 3 mit 1-4 nummeriert).
Eine erfolgreiche Strategie in der Entwicklung von Arzneimitteln für die Behandlung vieler rezeptorvermittelter Anomalien war die Identifikation von Antagonisten, welche die Bindung des natürlichen Liganden blockieren. Da das CD4-Adheson normalerweise an die Erkennungsstellen der HIV-Hülle bindet, scheint es ein Kandidat für das therapeutische Maskieren dieser HIV-Stellen zu sein, wodurch die virale Infektiosität blockiert wird. CD4 voller Länge und andere Adhesone sind jedoch Zellmembranproteine, die in der Lipiddoppelschicht der Zellen verankert sind. Die Gegenwart von Membrankomponenten ist vom Standpunkt der Herstellung und der Reinigung unerwünscht. Zusätzlich wäre es wünschenswert, Adhesone in einer Form zu produzieren, die in der Zirkulation stabiler ist, da diese normalerweise nur auf Zelloberflächen vorhanden sind. Weiters kann lösliches CD4-Adheson, sogar in trunkierter Form, (im Allgemeinen als CD4T bekannt) als Therapeutikum nicht optimal wirksam sein, da es eine relativ kurze biologische Halbwertszeit aufweist, an HIV nicht besser als Zell oberflächen-CD4 bindet, die Plazentabarriere oder andere biologische Barrieren nicht überschreiten kann und da es die HIV-Erkennungsstellen lediglich maskiert, ohne selbst eine Funktion zum Töten von infizierten Zellen oder zum Töten von Viren in sich zu tragen.
Dementsprechend ist es ein Ziel dieser Erfindung, lösliche, sekretierte Adhesone zu produzieren. Ein weiteres Ziel ist es, CD4-Derivate herzustellen, die bei der Behandlung von AIDS und verwandten Erkrankungen nützlich sind und im Wesentlichen vom extrem Ausmaß der genetischen Variation, die unter verschiedenen HIV-I-Isolaten und ihren jeweiligen env-Polypeptiden beobachtet wurde, unbeeinflusst bleiben (J. Coffin, Cell 46, 1 [1986]). Wiederum ein anderes Ziel ist es, an andere Polypeptide fusionierte Adhesone herzustellen, um Moleküle mit neuen Funktionalitäten, wie z.B. jene, die oben stehend für therapeutische Zwecke beschrieben wurden, oder aber diagnostische Reagenzien für den In-Vitro-Test für Adhesone oder ihre Liganden bereitzustellen. Im Besonderen ist es ein Ziel, Moleküle herzustellen, um Toxine oder Effektormoleküle (z.B. die Fc-Domäne eines Immunglobulins) zu Zellen zu dirigieren, die Rezeptoren für die Adhesone in sich tragen, z.B. HIV-gp120 im Fall von CD4, sowie zur Verwendung bei der Vereinfachung der Reinigung der Adhesone. Ein weiteres Ziel ist es, stabile hochgereinigte Adheson-Präparate herzustellen.
Zusammenfassung
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Immunglobulinschwerkettendimer, in dem die extrazelluläre Domänensequenz eines Zelloberflächenmitglieds der Immunglobulingenüberfamilie, deren Mitglied der Genüberfamilie kein Klasse-I- oder Klasse-II-Haupthistokompatibilitäts-Antigen, ein Immunglobulin oder eine T-Zellen-Rezeptor-α-, -β-, -γ- oder -δ-Kette ist, anstelle der variablen Region einer Immunglobulin-Schwerkette substituiert wird, wobei das Dimer ein Polypeptid umfasst, das die extrazelluläre Domäne umfasst, die an eine konstante Region einer Immunglobulin-Schwerkette fusioniert ist, und wobei in diesem Dimer die extrazelluläre Domäne einen Liganden des Mitglieds der Immunglobulingenüberfamilie bindet, zur Verwendung in einem therapeutischen Behandlungsverfahren eines Patienten bereitgestellt.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Polypeptid, das eine gp120-bindende Domäne des CD4-Adhesons umfasst, an seinem C-Terminus an eine konstante Domäne eines Immunglobulins fusioniert.
Die hierin bereitgestellten CD4-Adheson-Varianten werden gereinigt und in pharmakologisch akzeptablen Trägermitteln zur Verabreichung an Patienten formuliert, die eine antivirale, neuromodulatorische oder immunmodulatorische Therapie benötigen, insbesondere Patienten, die mit HIV infiziert sind, sowie zur Verwendung in der Modulierung der Zelladhäsion.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
Die 1a-1c stellen die Aminosäure- und Nucleotidsequenz einer sekretierten Form des CD4-Adhesons dar. Die Signalbearbeitungsstelle ist mit einem Pfeil markiert.
Die 2a-2c stellen die Aminosäure- und Nucleotidsequenz einer Fusion des Herpes-gD-Leaders und die 27 N-terminalen Reste bis zum mutmaßlichen reifen N-Terminus von CD4T dar.
3 stellt die strukturellen Elemente des nativen und löslichen CD4-Adhesons, die native Human-IgG₁-(γ₁-)Schwerkette und zwei Schwerketten-CD4-Chimären als Beispiel dar.
Die 4a-4b zeigen eine Karte des gebundenen Human-IgG₁-(γ₁-)Kettenfragments, das bei der Herstellung von CD4-Fusionen verwendet wird. Insertionsstellen sind mit γ1 und Fc gekennzeichnet.
5 zeigt eine Karte des menschlichen κ-Leichtkettenfragments, das für CD4-Fusionen an dem von VκJκ (leicht, variabel und bindend) und Cκ (leicht, konstant) flankierten Pfeil nützlich ist.
Ausführliche Beschreibung
Adhesone sind Zelloberflächen-Polypeptide mit einer extrazellulären Domäne, welche die Sequenz eines Mitglieds der Immunglobulingenüberfamilie aufweist, jedoch unter Ausschluss hochgradig polymorpher Mitglieder dieser Überfamilie, die aus der Gruppe der Klasse-I- und Klasse-II-Haupthistokompatibilitäts-Antigene, Immunglobuline und T-Zelllen-Rezeptor-α-, -β-, -γ- oder -δ-Kette ausgewählt wurden. Beispiele für Adhesone umfassen CD1, CD2, CD4, CD8, CD28, die γ-, δ- und ε-Ketten von CD3, OX-2, Thy-1, die intrazellulären oder neuralen Zelladhäsionsmoleküle (I-CAM oder N-CAM), das lymphozytenfunktionsassoziierte Antigen-3 (LFA-3), das neurocytoplasmatische Protein (NCP-3), den poly-Ig-Rezeptor, das myelinassoziierte Glykoprotein (MAG), den Hochaffinitäts-IgE-Rezeptor, das Hauptglykoprotein von peripherem Myelin (Po), den Rezeptor des aus Blutplättchen gewonnenen Wachstumsfaktors, den Rezeptor des das Koloniewachstum stimulierenden Faktors 1, den Makrophagen-Fc-Rezeptor, Fc-Gamma-Rezeptoren und das karzinoembryonale Antigen. Bevorzugte Adhesone sind CD4, CD8 und der Hochaffinitäts-IgE-Fc-Rezeptor.
Hierin werden Aminosäuresequenzvarianten von Adhesonen beschrieben. Aminosäuresequenzvarianten von Adhesonen werden mit dem Gedanken an verschiedene Ziele hergestellt, dazu gehören unter anderem eine Erhöhung der Affinität des Adhesons für seinen Bindungspartner, eine erleichterte Stabilität, Reinigung und Herstellung des Adhesons, eine Erhöhung seiner Plasmahalbwertszeit, eine Verbesserung der therapeutischen Wirksamkeit, wie oben im Abschnitt "Hintergrund" beschrieben, das Einführen zusätzlicher Funktionalitäten sowie eine Verringerung des Schweregrads oder des Auftretens von Nebenwirkungen während der therapeutischen Verwendung des Adhesons. Aminosäuresequenzvarianten von Adhesonen sind einer oder einer Kombination der folgenden Klassen zuzuordnen: Insertionsvarianten, Substitutionsvarianten oder Deletionsvarianten.
Insertionsaminosäuresequenzvarianten sind jene, bei denen ein oder mehrere Aminosäurerest(e), der/die dem Adheson fremd ist/sind, an einer vorweg festgelegten Stelle in das die C- oder N-Termini umfassende Adheson eingeführt wird/werden. Solche Varianten werden als Fusionen des Adhesons und eines anderen Polypeptids bezeichnet. Diese anderen Polypeptide enthalten andere Sequenzen als die, die normalerweise in dem Adheson an der insertierten Position zu finden sind. Es werden mehrere Gruppen von Fusionen beschrieben. Immunologisch aktive Adheson-Fusionen umfassen ein Adheson und ein Polypeptid, das ein nichtadhesonartiges Epitop umfasst. Das nichtadhesonartige Epitop ist ein immunologisch kompetentes Polyeptid, d.h. ein beliebiges Polypeptid, das fähig ist, eine Immunantwort in dem Tier auszulösen, dem die Fusion verabreicht werden soll, oder das fähig ist, sich durch einen Antikörper, der gegen das nichtadhesonartige Polypeptid hervorgebracht wurde, binden zu lassen. Typische nichtadhesonartige Epitope sind jene, die von Allergenen, Autoimmun-Epitopen oder anderen wirksamen Immunogenen oder Antigenen in sich getragen werden, die von bereits existierenden Antikörpern im Fusionsrezipienten erkannt werden, unter anderem bakterielle Polypeptide, wie etwa trpLE, β-Galactosidase, virale Polypeptide, wie etwa Herpes-gD-Protein, und dergleichen. Immunogene Fusionen werden in vitro durch Vernetzung oder durch mit DNA, die für ein immunogenes Polypeptid kodiert, transformierter rekombinanter Zellkultur hergestellt. Vorzugsweise ist die immunogene Fusion eine, in der die immunogene Sequenz an das Adheson-Antigen oder ein Fragment davon durch eine/mehrere Peptidbindung(en) bindet oder in dieses insertiert wird. Diese Produkte bestehen daher aus einer linearen Polypeptidkette, die Adheson-Epitope und zumindest ein dem Adheson fremdes Epitop enthält. Solche Fusionen sind in rekombinanten Wirtszellen oder unter Verwendung bifunktioneller Vernetzungsmittel leicht herzustellen. Die Verwendung eines Vernetzungsmittels, um das Adheson an das immunogene Polypeptid zu fusionieren, ist als lineare Fusion nicht erwünscht, da die vernetzten Produkte in einer strukturell homogenen Form nicht so leicht zu synthetisieren sind.
Diese immunogenen Insertionen sind besonders nützlich, wenn sie in einen pharmakologisch annehmbaren Träger formuliert und einem Subjekt verabreicht werden, um Antikörper gegen das Adheson zu erzeugen, die wiederum in der Diagnostik oder bei der Reinigung von Adhesonen durch per se bekannte Immunaffinitätsverfahren nützlich sind. Alternativ dazu werden bei der Reinigung von Adhesonen Bindungspartner für das fusionierte nichtadhesonartige Polypeptid, z.B. Antikörper, Rezeptoren oder Liganden, verwendet, um die Fusion aus unreinen Beimengungen zu adsorbieren, wonach die Fusion eluiert wird und das Adheson, falls gewünscht, aus der Fusion gewonnen wird, z.B. durch enzymatische Spaltung.
Andere Fusionen, die ebenso immunologisch aktiv sein können oder auch nicht, umfassen Fusionen der Adhesonsequenz mit einer Signalsequenz, die mit dem Adheson heterolog ist, Fusionen transmembranmodifizierter CD4-Adhesone, z.B. an Polypeptide mit einer verbesserten Plasmahalbwertszeit (normalerweise > etwa 20 Stunden), wie etwa Immunglobulinketten oder Fragmente davon, sowie Fusionen mit cytotoxischen Funktionalitäten. Signalsequenzfusionen werden verwendet, um die Sekretion des Adhesons schneller zu steuern. Das heterologe Signal ersetzt das native Adhesonsignal, und wenn die resultierende Fusion erkannt, d.h. von der Wirtszelle bearbeitet und gespalten wird, wird das Adheson sekretiert. Signale werden basierend auf der intendierten Wirtszelle ausgewählt und können bakterielle Hefe-, Säugetier- und virale Sequenzen umfassen. Das Herpes-gD-Glykoprotein-Signal ist zur Verwendung in Säugetierexpressionssystemen geeignet.
Plasmaproteine, die eine verlängerte Plasmahalbwertszeit haben, die länger als die von transmembranmodifiziertem CD4 ist, umfassen Serumalbumin, Immunglobuline, Apolipoproteine und Transferrin. Vorzugsweise ist die Adheson-Plasma-Proteinfusion in dem Tier, in dem sie verwendet wird, nicht signifikant immunogen, und das Plasmaprotein führt in Patienten durch seine normale biologische Aktivität nicht zu unerwünschten Nebenwirkungen.
In einer speziellen Ausführungsform wird die extrazelluläre Domäne des Adhesons mit einer konstanten Region einer Immunglobulinsequenz verbunden. Die daraus resultierenden Produkte werden hierin als Immunoadhesone bezeichnet. Immunglobuline und gewisse Varianten davon sind bekannt, und es wurden viele in rekombinanter Zellkultur hergestellt. Siehe z.B. U.S.-Patent 4.745.055; EP 256.654 ; Faulkner et al., Nature 298, 286 (1982); EP 120.694 ; EP 125.023 ; Morrison, J. Immun. 123, 793 (1979); Köhler et al., P.N.A.S. USA 77, 2197 (1980); Raso et al., Cancer Res. 41, 2073 (1981); Morrison et al., Ann. Rev. Immunol. 2, 239 (1984); Morrison, Science 229, 1202 (1985); Morrison et al., P.N.A.S. USA 81, 6851 (1984); EP 255.694 ; EP 266.663 ; und WO 88/03559. Neuangeordnete Immunglobulinketten sind ebenso bekannt. Siehe z.B. U.S.-Patent 4.444.878, WO 88/03565 und EP 68.763 und die darin zitierten Verweise.
Normalerweise sind die Domänen von Adhesonen, die homolog zu Immunglobulinen und extrazellulär in ihrem nativen Umfeld sind, C-terminal an den N-Terminus der konstanten Region der Immunglobuline anstelle der variablen Region(en) dieser fusioniert, wodurch zumindest funktionell aktive Gelenk-CH2- und CH3-Domänen der konstanten Region einer Immunglobulin-Schwerkette beibehalten werden. Dies wird normalerweise durch Konstruieren der geeigneten DNA-Sequenz und durch deren Expression in Rekombinationszellkultur erreicht. Immunglobuline und andere Polypeptide mit erhöhter Plasmahalbwertszeit werden auf dieselbe Art und Weise an die extrazellulären oder ligandenbindenden Domänen anderer Adhesone fusioniert.
Die Grenzdomänen für die CD4-V-artigen Regionen (V1-V4) sind etwa 100-109, etwa 175-184, etwa 289-298 bzw. etwa 360-369 (basierend auf der Vorläufer-CD4-Aminosäuresequenz, in der das initiierende Met-25 ist; 1a). CD4-Sequenzen, die eine beliebige der CD4-V-Domänen enthalten, werden an die Immunglobulinsequenz fusioniert. Vorzugsweise wird die V1-Domäne von CD4 oder CD4, dem die Transmembran- und zytoplasmatischen Domänen fehlen, an ihren C-Termini an die konstante Region des Immunglobulins fusioniert. Die genaue Stelle, an der die Fusion durchgeführt wird, ist nicht entscheidend; die hierin erwähnten Grenzdomänen dienen lediglich der Führung, es können andere Stellen, die an die V-Regionen angrenzen oder sich in ihnen befinden, ausgewählt werden, um die Sekretions- oder Bindungscharakteristika der CD4 zu optimieren. Die optimale Stelle wird durch Routineexperimente bestimmt werden. Im Allgemeinen wurde herausgefunden, dass die Fusionen intrazellulär exprimiert werden, man fand jedoch ein großes Ausmaß an Variation beim Ausmaß der Sekretion der Fusionen aus rekombinanten Wirten. Die folgende Tabelle zeigt z.B. die verschiedenen Immunglobulinfusionen, die durch das Verfahren dieser Erfindung erhalten wurden. In allen Beispielen für CD4- Immunadhesone wurde das CD4-Signal verwendet, um die Sekretion aus 293-Zellen zu leiten. Ein klein geschriebenes m zeigt einen murinen Ursprung an, während ein klein geschriebenes h für einen menschlichen Ursprung steht. V und C sind Abkürzungen für variable bzw. konstante Domänen von Immunglobulin. Die numerischen tiefgestellten Indices zeigen die Anzahl der eingeklammerten Einheiten an, die im kreierten Dimer zu finden sind. Es ist klar, dass von den Ketten der Multimere angenommen wird, dass sie auf dieselbe Art und Weise wie native Immunglobuline über Disulfidbindung gebunden sind. Die CD4-Immunadhesone enthielten typischerweise entweder die ersten 366 N-terminalen Reste von CD4 (CD4₄) oder die ersten 180 N-terminalen Reste von CD4 (CD4₂), gebunden an seinem C-Terminus an die konstante Region (γ1) der κ-(Leicht-) Kette oder der igG1-Schwerkette. Tabelle 1

* ND = nicht nachgewiesen

Aus dieser Tabelle geht interessanterweise hervor, dass das menschliche CD4-Schwerketten-Immunadheson als ein Dimer sekretiert wurde, während die analoge murine Konstruktion nicht nachgewiesen wurde (was jedoch nicht die extrazelluläre Akkumulation des Proteins ausschließt). Die Fähigkeit der hCD4-hCγ1-Transformanten, ein Schwerkettendimer zu produzieren, kam unerwartet, da vorausgegangene Arbeiten nahe gelegt hatten, Immunglobulin-Schwerketten würden nicht sekretiert, es sei denn, die Wirte werden mit sowohl für Schwer- als auch für Leichtketten kodierender Nucleinsäure co-transformiert (Valle et al., Nature 241, 338 [1981]). Gemäß dieser Erfindung werden CD4-IgG-Immunadheson-Chimären leicht sekretiert, worin das CD4-Epitop in Schwerkettendimeren, Leichtkettenmonomeren oder – dimeren und Schwer- und Leichtkettenheterotetrameren vorhanden ist, worin das CD4-Epitop in einer an eine oder mehrere Leicht- oder Schwerketten fusionierten Form, umfassend Heterotetramere, in denen bis zu und einschließlich alle vier Analoga der variablen Region von CD4 abstammen, vorhanden ist. Wo eine variable nicht-CD4-Leicht-Schwerketten-Domäne vorhanden ist, wird ein heterofunktioneller Antikörper bereitgestellt.
Geeignete Begleit-Immunglobulin-Kombinationsstellen und Fusionspartner werden aus IgG-1-, -2-, -3- oder -4-Subtypen, IgA, IgE, IgD oder IgM, jedoch vorzugsweise IgG-1, erhalten.
Eine bevorzugte Ausführungsform ist eine Fusion eines N-terminalen Abschnitts von CD4, der die Bindungsstelle für das gp120-Hüllprotein von HIV enthält, an den C-terminalen Fc-Abschnitt eines Antikörpers, der die Effektorfunktionen des Immunglobulins G₁ enthält. Von dieser Art gibt es zwei bevorzugte Ausführungsformen; in einer ist die gesamte konstante Region der schweren Kette an einen Abschnitt von CD4 fusioniert; in einer anderen ist eine Sequenz, die in der Gelenkregion unmittelbar stromauf der Papain-Spaltstelle beginnt, die IgG-Fc chemisch definiert (Rest 216, wobei 114 als erster Rest der konstanten Region der schweren Kette angenommen wird [Kobat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4. Auflage (1987)], oder analoge Stellen anderer Immunglobuline), an einen Abschnitt von CD4 fusioniert. Diese Ausführungsformen werden in den Beispielen beschrieben.
Im Besonderen wird von jenen Varianten, in denen die variable Region einer Immunglobulinkette durch eine oder mehrere immunglobulinähnliche Domänen eines Adhesons substituiert sind, angenommen, sie hätten in vivo eine verbesserte Plasmahalbwertszeit. Diese Chimären sind auf eine ähnliche Art und Weise wie chimäre Antikörper aufgebaut, in denen die variable Domäne eines Antikörpers einer Spezies für eine variable Domäne einer anderen Spezies substituiert wird. Siehe z.B EP 0 125 023 ; Munro, Nature 312 (13. Dezember 1984); Neuberger et al., Nature 312 (13. Dezember 1984); Sharon et al., Nature 309 (24. Mai 1984); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851-6855 (1984); Morrison et al., Science 229, 1202-1207 (1985), und Boulianne et al., Nature 312, 643-646 (13. Dezember 1984). Die für die immunglobulinähnliche(n) Domäne(n) des Adhesons kodierende DNA wird von einem Restriktionsenzym am oder proximal zum 3'-Ende der für die immunglobulinähnliche(n) Domäne(n) kodierenden DNA sowie an einem Punkt an oder in der Nähe der für das N-Terminal-Ende des reifen Adheson-Polypeptids kodierenden DNA (wo die Verwendung eines anderen Leaders erwogen wird) oder an der oder proximal zu der für den N-terminal kodierenden Region für das Adheson (wo das native Adhesonsignal verwendet wird) gespalten. Dieses DNA-Fragment wird dann leicht in für eine konstante Region einer Immunglobulin-Leicht- oder -Schwerkette kodierende DNA insertiert und, falls notwendig, durch Deletionsmutagenese zugeschnitten. Vorzugs weise handelt es sich dabei um ein menschliches Immunglobulin, falls die Variante zur In-vivo-Therapie von Menschen gedacht ist. DNA, die für konstante Regionen einer Immunglobulin-Leicht- oder -Schwerkette kodiert, ist bekannt oder leicht aus cDNA-Bibliotheken erhältlich oder wird synthetisiert. Siehe z.B. Adams et al., Biochemistry 19, 2711-2719 (1980); Gough et al., Biochemistry 19, 2702-2710 (1980); Dolby et al., P.N.A.S. USA 77, 6027-6031 (1980); Rice et al., P.N.A.S. USA 79, 7862-7865 (1982); Falkner et al., Nature 298, 286-288 (1982), und Morrison et al., Ann. Rev. Immunol. 2, 239-256 (1984).
Für die chimäre(n) Kette(n) des Immunglobulins oder Immunadhesons kodierende DNA wird zur Expression in eine Wirtszelle transfiziert. Falls die Wirtszelle vor der Transfektion ein Immunglobulin produziert, so muss nur mit dem an Leicht- oder Schwerketten fusionierten Adheson transfiziert werden, um einen Heteroantikörper herzustellen. Die zuvor erwähnten Immunglobuline, die einen oder mehrere Arme aufweisen, die Adhesondomänen tragen, und einen oder mehrere Arme aufweisen, die variable Begleiterregionen tragen, führen zu einer dualen Spezifität für den Adheson-Liganden und für ein Antigen. Sie werden durch die oben beschriebenen Rekombinationsverfahren oder durch In-vitro-Verfahren hergestellt. In letzterem Fall werden z.B. F(ab')₂-Fragmente einer Adheson-Fusion und ein Immunglobulin hergestellt, die F(ab')2-Fragmente werden durch Reduktion unter milden Reduktionsbedingungen in Fab'-Fragmente konvertiert und dann jeweils in Gegenwart des anderen unter sauren Bedingungen gemäß per se bekannter Verfahren reoxidiert. Siehe auch U.S.-Patent 4.444.878.
Zusätzlich sind Verfahren zur Herstellung intakter Heteroantikörper aus Immunglobulinen mit verschiedenen Spezifitäten bekannt. Diese Verfahren werden zur In-vitro-Herstellung von heterochimären Antikörpern durch einfaches Substituieren eines der zuvor verwendeten Immunglobuline durch die Immunadhesonketten verwendet.
In einem alternativen Verfahren zur Herstellung eines heterofunktionellen Antikörpers werden Wirtszellen, die eine Adheson-Immunglobulinfusion produzieren, z.B. transfizierte Myelome, ebenso mit B-Zellen oder Hybridomen fusioniert, die Antikörper sekretieren, welche die gewünschte Begleitspezifität für ein Antigen aufweisen. Heterobifunktionelle Antikörper werden aus dem Kulturmedium solcher Hybridome gewonnen und sind daher etwas leichter zu produzieren als durch herkömmliche In-vitro-Anwendungsverfahren ( EP 68.763 ).
Eine weitere Gruppe an Fusionen sind jene, in denen ein Adheson mit einer toxischen Substanz, z.B. einem Polpypeptid, wie etwa Ricin (umfassend eine deglykosylierte Ricin-A-Kette), Diphtherietoxin A oder ein nichtpeptidylartiges Zytotoxin, konjugiert ist. Wenn es sich bei dem Toxin um ein Polypeptid handelt, ist es zweckdienlich, das Polypeptid durch herkömmliche In-vitro-Proteinvernetzungsmittel mit dem Adheson oder seiner transmembrandeletierten Variante zu vernetzen (für geeignete Verfahren zur Bindung einer Ricin-A-Kette oder einer deglykosylierten A-Kette an CD4 siehe z.B. Duncan et al., Analy. Biochem. 132, 68-73 [1983]; Thorpe et al., Cancer Res. 47, 5924 [1987], und Ghotie et al., Cancer Res. 48, 2610 [1988]) oder aber dies durch Rekombinationssynthese als Fusion zu tun (siehe z.B. U.S.-Patent 4.765.382). Alternativ dazu werden in Fällen, in denen Begleitantikörper variable Immunglobulindomänen von Anti-Ricin-Antikörpern sind, solche Immunglobulin-Heteroantikörper verwendet, um, gemäß dem allgemeinen Verfahren von Raso et al., Cancer Research 41, 2073 (1981), Ricin an HIV-infizierte Zellen zu liefern.
Eine weitere Klasse von Adhesonvarianten sind Deletionsvarianten. Deletionen sind durch das Entfernen von einem oder mehreren Aminosäurerest(en) aus einer Adhesonsequenz charakterisiert. Typischerweise sind die Transmembran- und die zytoplasmatischen Domänen von Adhesonen deletiert. Im Fall von CD4 sind zumindest die Reste 368 bis 395 (die Transmembranregion) und normalerweise ebenso 396-433 (die zytoplasmatische Domäne) deletiert, um sekretierte Formen dieses Adhesons zu erhalten. Ebenso ist anzumerken, dass die Aminosäurereste den Nummern folgen, die für reifes CD4 gegeben werden, wie dies z.B. in den 1a-1c dargestellt ist. CD4T-Moleküle werden daher im Allgemeinen ungefähr in der Nähe der Reste 366-368 enden oder an einer beliebigen anderen geeigneten Stelle, die sich N-terminal dazu befindet, die die gp120-Bindungsfähigkeit der CD4-Variante erhält.
Substitutionsvarianten sind jene, in denen zumindest ein Rest in der Adhesonsequenz entfernt wurde und ein anderer Rest stattdessen insertiert wurde. Der native N-terminale Rest für reifes CD4 ist, wie nun bekannt ist, Lysin. Die in 1 gezeigte Sequenz mit einem N-terminalen Asparagin ist daher eine Aminosäuresequenzvariante des nativen reifen CD4. In der unten stehenden Tabelle 2 werden Substitutionen beschrieben, die im Allgemeinen zu einer Feinmodulation der Eigenschaften des CD-Antigens führen. Tabelle 2
Substantielle Veränderungen der Funktion oder der immunologischen Identität werden durch Auswählen von Substitutionen erreicht, die weniger konservativ als die in Tabelle 2 angeführten sind, d.h. durch Auswählen von Resten, die sich auf signifikantere Art und Weise in ihrer Wirkung auf den Erhalt von (a) der Struktur der Polypeptidhauptkette im Bereich der Substitution, z.B. als Faltblatt oder Helixkonformation, (b) der Ladung oder der Hydrophobizität des Moleküls an der Targetstelle oder (c) der Sperrigkeit der Seitenkette unterscheiden. Die Substitutionen, von denen im Allgemeinen erwartet wird, dass sie die größten Veränderungen der Adhesoneigenschaften hervorrufen, sind jene, in denen (a) ein hydrophiler Rest, z.B. Seryl oder Threonyl, für (oder durch) einen hydrophoben Rest, z.B. Leucyl, Isoleucyl, Phenylalanyl, Valyl oder Alanyl, substituiert wird; (b) ein Cysteinyl oder Prolyl für (oder durch) einen beliebigen anderen Rest substituiert wird; (c) ein Rest mit einer elektropositiven Seitenkette, z.B. Lysyl, Arginyl oder Histidyl, für (oder durch) einen elektronegativen Rest, z.B. Glutamyl oder Aspartyl, substituiert wird oder (d) ein Rest mit einer sperrigen Seitenkette, z.B. Phenylalanyl, für (oder durch) einen Rest ohne Seitenkette, z.B. Glycyl, substituiert wird.
Eine bevorzugte Klasse von Substitutions- oder Deletionsvarianten sind jene, die die Transmembranregion des Adhesons involvieren. Die Transmembranregion des Adhesons ist eine hochgradig hydrophobe oder lipophile Domäne, die die richtige Größe aufweist, um die Lipiddoppelschicht der Zellmembran zu umspannen. Es wird angenommen, sie würde das Adehson in der Zellmembran verankern.
Eine Deletion oder Substitution der Transmembrandomäne erleichtert die Gewinnung und stellt durch die Reduktion ihrer Zell- oder Membranlipidaffinität und die Verbesserung ihrer Wasserlöslichkeit eine lösliche Form des Adhesons bereit. Falls die Transmembran- und die zytoplasmatischen Domänen deletiert werden, wird die Einführung von potentiell immunogenen Epitopen vermieden, entweder durch die Exposition von andernfalls intrazellulären Polypeptiden, die vom Körper als fremdartig erkannt werden könnten, oder durch Einführung heterologer Polypeptide, die potentiell immunogen sind. Ein Hauptvorteil des transmembrandeletierten Adhesons ist die Tatsache, dass es in das Kulturmedium rekombinanter Wirte sekretiert wird. Diese Variante ist wasserlöslich und besitzt keine nennenswerte Affinität zu Zellmembranlipiden, was ihre Gewinnung aus der Rekombinationszellkultur bedeutend vereinfacht.
Aus der vorhergehenden Diskussion wird klar und deutlich ersichtlich, dass Substitutionen, Deletionen, Insertionen oder eine beliebige Kombination dieser eingeführt werden, um ein Endkonstrukt zu erhalten. Als allgemeine Behauptung werden alle Varianten keine funktionelle Transmembrandomäne und vorzugsweise keine funktionelle zytoplasmatische Sequenz aufweisen. Dies wird im Allgemeinen durch Deletion der relevanten Domäne erreicht, obwohl adäquate Insertions- oder Substitutionsmutagene zu diesem Zweck ebenso wirksam sein können. Die Transmembrandomäne wird z.B. durch eine beliebige Aminosäuresequenz, z.B. eine Zufalls- oder Homopolynucleinsequenz von etwa 5 bis 50 Serin-, Threonin-, Lysin-, Arginin-, Glutamin-, Asparaginsäure- und ähnlichen hydrophilen Resten, die insgesamt ein hydrophiles Hydropathie-Diagramm aufweisen, ersetzt, sodass sie in das Kulturmedium rekombinanter Wirte sekretiert wird. Diese Variante sollte ebenso als Adhesonvariante angesehen werden.
Diese Varianten werden normalerweise durch stellenspezifische Mutagenese von Nucleotiden in der für das Adheson kodierenden DNA hergestellt, wodurch für die Variante kodierende DNA produziert wird und wonach die DNA in Rekombinationszellkultur exprimiert wird. Variantenadhesone werden jedoch auch durch In-vitro-Synthese hergestellt. Natürlich dürfen Variationen in der für die Variantenadhesone kodierenden DNA die Sequenz nicht außerhalb des Leserasters platzieren und erzeugen vorzugsweise keine komplementären Regionen, die sekundäre mRNA-Strukturen produzieren könnten, die für die Expression schädlich sind ( EP 75.444A ). Die CD4-Varianten weisen normalerweise dieselbe gp120-Bindungsaktivität wie der natürlich vorkommende Prototyp auf, obwohl Varianten ebenso ausgewählt werden, um die Merkmale des CD4-Adhesons wie oben angegeben zu modifizieren.
Während die Stelle zur Einführung einer Aminosäuresequenzvariation im Vorhinein festgelegt ist, muss die Mutation per se nicht im Vorhinein festgelegt sein. Um z.B. die Leistung einer Mutation an einer bestimmten Stelle zu optimieren, kann eine Zu fallsmutagenese am Target-Codon oder der Target-Region durchgeführt werden, und die exprimierten Adhesonvarianten können auf die optimale Kombination der gewünschten Aktivitäten gescreent werden. Verfahren zur Herstellung von Substitutionsmutationen an im Vorhinein festgelegten Stellen in DNA mit einer bekannten Sequenz sind wohlbekannt, z.B. M13-Primer-Mutagenese.
Adhesonvarianten, die nicht fähig sind, HIV-gp120 zu binden, sind trotzdem als Immunogene zur Produktion von Antikörpern gegen das Adheson oder als Immuntest-Set-Komponenten von Nutzen (markiert als kompetitives Reagens für den gp120-Test oder unmarkiert als Standard für einen Adhesontest), solange zumindest ein Adheson-Epitop aktiv bleibt.
Die für Adhesone kodierende DNA wird durch bekannte Verfahren erhalten. Siehe Williams, Immunol. Today 8, 298-303 (1987), und die darin enthaltenen Zitate. Im Allgemeinen werden Prakaryoten zum Klonieren von DNA-Sequenzen von CD4-Varianten verwendet. So sind z.B. der E.-coli-Stamm SR101 (zum Vermehren von m13-Phagen, einem λ-resistenten Stamm von JM 101; Messing et al., Nucl. Acids. Res. 9(2), 309-321 [1981]) und der E.-coli-K12-Stamm 294 (ATCC Nr. 31446) besonders nützlich. Andere Mikrobenstämme, die verwendet werden können, umfassen E. coli B, UM101 und E.coli _X1776 (ATCC Nr. 31537). Diese Beispiele dienen der Veranschaulichung und sollen keine Einschränkung darstellen.
Für die Variantenadhesone kodierende DNA wird zur Expression in Vektoren eingeführt, die Promotoren und Kontrollsequenzen enthalten, die von mit der beabsichtigten Wirtszelle kompatiblen Spezies abstammen. Der Vektor trägt normalerweise, muss dies jedoch nicht tun, eine Replikationsstelle sowie eine oder mehrere Markersequenzen in sich, die fähig sind, in transformierten Zellen für eine phänotypische Selektion zu sorgen. E. coli wird z.B. typischerweise unter Verwendung eines Derivats von pBR322, einem von einer E.-coli-Spezies abstammenden Plasmid, transformiert (Bolivar et al., Gene 2, 95 [1977]). pBR322 enthält Gene für Ampicillin- und Tetracyclinresistenz und stellt daher ein einfaches Mittel zur Identifikation transfor mierter Zellen bereit. Das pBR322-Plasmid oder ein anderes Mikrobenplasmid muss ebenso Promotoren und andere Kontrollelemente, die in rekombinanten DNA-Konstruktionen häufig verwendet werden, umfassen oder es muss modifiziert werden, um diese zu enthalten.
Für die Verwendung mit prokaryotischen Wirten geeignete Promotoren umfassen veranschaulichenderweise die β-Lactamase- und Lactose-Promotor-Systeme (Chang et al., Nature 275, 615 [1978]; und Goeddel et al., Nature 281, 544 [1979]), alkalische Phosphatase, das Tryptophan-(trp-) Promotor-System (Goeddel, Nucleic Acids Res. 8, 4057 [1980], und EPO Appln. Publ. Nr. 36.776) und Hybridpromotoren, wie etwa den tac-Promotor (H. de Boer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 21-25 [1983]). Andere funktionelle bakterielle Promotoren sind jedoch ebenso geeignet. Ihre Nucleotidsequenzen sind im Allgemeinen bekannt, wodurch ein Fachmann sie unter Verwendung von Linkern oder Apatoren operabel an für die Adhesonvariante kodierende DNA ligieren kann, um jegliche erforderliche Restriktionsstelle bereitzustellen (Siebenlist et al., Cell 20, 269 [1980]). Promotoren zur Verwendung in bakteriellen Systemen umfassen ebenso eine Shine-Dalgarno-(S.D.-) Sequenz, die an die für das Antigen kodierende DNA operabel gebunden ist.
Zusätzlich zu Prokaryoten sind eukaryotische Mikroben, wie z.B. Hefekulturen, ebenso als Klonierungs- oder Expressionswirte nützlich. Saccharomyces cerevisiae oder Gemeine Bäckerhefe ist der am häufigsten verwendete eukaryotische Mikroorganismus, obwohl eine Reihe anderer Stämme leicht erhältlich sind. Zur Expression in Saccharomyces wird z.B. das Plasmid YRp7 (Stinchcomb et al., Nature 282, 39 [1979]; Kingsman et al., Gene 7, 141 [1979]; Tschemper et al., Gene 10, 157 [1980]) häufig verwendet. Dieses Plasmid umfasst bereits das trp1-Gen, das einen Selektionsmarker für einen mutierten Hefestamm bereitstellt, dem die Fähigkeit, in Tryptophan zu wachsen, fehlt, z.B. ATCC Nr. 44076 oder PEP4-1 (Jones, Genetics 85, 12 [977]). Die Gegenwart der trp1-Läsion als Merkmal des Hefewirtszellengenoms stellt dann ein wirksames Mittel der Selektion durch Wachstum in Abwesenheit von Tryptophan bereit.
Geeignete Promotorsequenzen zur Verwendung mit Hefewirten umfassen die Promotoren für 3-Phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255, 2073 [1980]) oder andere glykolytische Enzyme (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7, 149 [1968]; und Holland, Biochemistry 17, 4900 [1978]), wie z.B. Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphatisomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase und Glucokinase.
Weitere Hefepromotoren, die induzierbare Promotoren mit dem zusätzlichen Vorteil einer von Wachstumsbedingungen kontrollierten Transkription sind, umfassen die Promotorregionen für Alkoholdehydrogenase 2, Isocytochrom C, saure Phosphatase, abbauende Enzyme, die mit dem Stickstoffstoffwechsel assoziiert sind, Metallothionein, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase sowie Enzyme, die für die Maltose- und Galactoseverwertung verantwortlich sind. Geeignete Vektoren und Promotoren für die Verwendung in der Hefeexpression werden weiter in R. Hitzeman et al., EP-Veröffentlichung Nr. 73.657A, beschrieben. Hefe-Enhancer werden ebenso mit Hefepromotoren vorteilhaft verwendet.
Promotoren, um die Transkription aus Vektoren in Säugetierwirtszellen zu kontrollieren, können aus verschiedenen Quellen erhalten werden, z.B. den Genomen von Viren, wie z.B.: Polyoma, Simian-Virus 40 (SV40), Adenovirus, Retroviren, Hepatitis-B-Virus und insbesondere Zytomegalievirus, oder aus heterologen Säugetierpromotoren, z.B. dem β-Actin-Promotor. Die frühen und späten Promotoren des SV40-Virus sind leicht als ein SV40-Restriktionsfragment zu erhalten, das auch den viralen SV40-Replikationsstartpunkt umfasst. Fiers et al., Nature 273, 113 (1978). Der unmittelbare frühe Promotor des menschlichen Zytomegalievirus ist leicht als ein HindIII-E-Restriktionsfragment zu erhalten. P.J. Greenaway et al., Gene 18, 355-360 (1982). Natürlich sind auch Promotoren aus der Wirtszelle oder verwandten Spezies hierin von Nutzen.
Die DNA-Transkription in höheren Eukaryoten wird durch Insertieren einer Enhancer-Sequenz in den Vektor verstärkt. Enhancer sind cis-wirkende DNA-Elemente, norma lerweise von etwa 10 bis 300 bp, die die Transkriptionsinitiationsfähigkeit eines Promotors verstärken. Enhancer sind relativ orientierungs- und positionsunabhängig, da sie 5' (L. Laimins et al., Proc. Natl. Acad. Sci 78, 993 [1981]) und 3' (M.L. Lusky et al., Mol. Cell Bio. 3, 1108 [1983]) zu der Transkriptionseinheit gefunden wurden, in einem Intron (J.L. Banerji et al., Cell 33, 729 [1983]) sowie in der kodierenden Sequenz selbst (T.F. Osborne et a., Mol. Cell Bio. 4, 1293 [1984]). Viele Enhancer-Sequenzen von Säugetiergenen sind nun bekannt (Globin, Elastase, Albumin, α-Fötoprotein und Insulin). Typischerweise wird jedoch ein Enhancer aus einem eukaryotischen Zellvirus verwendet. Beispiele umfassen den SV40-Enhancer auf der späten Seite des Replikationsstartpunktes (bp 100-270), den Enhancer des frühen Promotors des Zytomegalievirus, den Polyoma-Enhancer auf der späten Seite des Replikationsstartpunkts und Adenovirus-Enhancer.
Expressionsvektoren, die in eukaryotischen Wirtszellen (Hefe-, Pilz-, Insekten-, Pflanzen-, Tier-, menschliche oder kernhaltige Zellen) verwendet werden, können ebenso Sequenzen umfassen, die für die Termination der Transkription erforderlich sind und die die mRNA-Expression beeinflussen können. Diese Regionen werden als polyadenylierte Segmente im untranslatierten Teil der für das Adheson kodierenden mRNA transkribiert.
Expressionsvektorsysteme umfassen im Allgemeinen ein Selektionsgen, auch selektierbarer Marker genannt. Beispiele für geeignete selektierbare Marker für Säugetierzellen sind Dihydrofolatreduktase (DHFR), Thymidinkinase oder Neomycin. Werden diese selektierbaren Marker erfolgreich in eine Säugetierwirtszelle transferiert, so kann die transformierte Säugetierwirtszelle überleben, wenn sie Selektionsdruck ausgesetzt wird. Es gibt zwei weit verbreitete, verschiedene Kategorien von Selektionsegimen. Die erste Kategorie basiert auf dem Stoffwechsel einer Zelle und der Verwendung einer mutierten Zelllinie, der die Fähigkeit fehlt, unabhängig von einem angereichertem Medium zu wachsen. Zwei Beispiele sind CHO-DHFR^--Zellen sowie Maus-LTK^--Zellen. Diesen Zellen fehlt die Fähigkeit, ohne den Zusatz solcher Nährstoffe wie Thymidin oder Hypoxanthin zu wachsen. Da diesen Zellen gewisse, für einen vollständigen Nucleotidsyntheseweg notwendige Gene fehlen, können sie nicht überleben, wenn die fehlenden Nucleotide nicht in einem angereicherten Medium bereitgestellt werden. Eine Alternative zum Anreichern des Mediums ist die Einführung eines intakten DHFR- oder TK-Gens in jene Zellen, denen die entsprechenden Gene fehlen, wodurch ihre Wachstumsbedingungen verändert werden. Einzelne Zellen, die nicht mit dem DHFR- oder TK-Gen transformiert wurden, sind nicht fähig, in einem nichtangereicherten Medium zu überleben.
Die zweite Kategorie ist die der dominanten Selektion, die sich auf ein Selektionsschema bezieht, das in jedem beliebigen Zelltyp verwendet wird und nicht die Verwendung einer mutierten Zelllinie erforderlich macht. Diese Schemen verwenden typischerweise ein Arzneimittel, um das Wachstum einer Wirtszelle zum Stillstand zu bringen. Jene Zellen, die ein neues Gen aufweisen, würden ein Protein exprimieren, das eine Arzneimittelresistenz verleiht, und würden die Selektion überleben. In Beispielen für diese dominante Selektion werden die Wirkstoffe Neomycin, P. Southern & P. Berg, J. Molec. Appl. Genet. 1, 327 (1982), Mycophenolsäure, R.C. Mulligan & P. Berg, Science 209, 1422 (1980), oder Hygromycin, B. Sugden et al., Mol. Cell. Biol. 5, 410-413 (1985), verwendet. Die drei oben angeführten Beispiele verwenden bakterielle Gene unter eukaryotischer Kontrolle, um eine Resistenz gegen den jeweiligen Wirkstoff G418 oder Neomycin (Geneticin), Xgpt (Mycophenolsäure) bzw. Hygromycin zu verleihen.
"Amplifikation" bezieht sich auf die Verstärkung oder Replikation einer isolierten Region in der chomosomalen DNA einer Zelle. Die Amplifikation wird unter Verwendung eines Selektionsmittels, z.B. Methotrexat (MTX), das DHFR deaktiviert, erreicht. Die Amplifikation oder die Herstellung von aufeinander folgenden Kopien des DHFR-Gens führt angesichts größerer Mengen von MTX zu einer Produktion von größeren Mengen von DHFR. Der Amplifikationsdruck wird trotz der Gegenwart endogener DHFR durch Zusatz von noch größeren Mengen an MTX zu dem Medium angewandt. Die Amplifikation eines gewünschten Gens kann durch Co-Transfektion einer Säugetierwirtszelle mit einem Plasmid mit einer für ein gewünschtes Protein kodierenden DNA und dem DHFR- oder Amplifikationsgen, das die Co-Integration ermöglicht, erreicht werden. Es wird sichergestellt, dass die Zelle mehr DHFR benötigt, ei ne Anforderung, der durch Replikation des Selektionsgens nachgekommen wird, indem nur nach Zellen selektiert wird, die in Gegenwart von ansteigenden MTX-Konzentrationen wachsen können. So lange das für ein gewünschtes heterologes Protein kodierende Gen mit dem Selektionsgen cointegriert hat, führt die Replikation dieses Gens zur Replikation des für das gewünschte Protein kodierenden Gens. Das Ergebnis ist, dass mehr Kopien des Gens, d.h. ein amplifiziertes Gen, das für das gewünschte heterologe Protein kodiert, mehr des gewünschten heterologen Proteins exprimieren.
Bevorzugte Wirtszellen zur Expression der CD-Antigenvarianten dieser Erfindung sind Säugetierzelllinien, wobei die Beispiele folgende umfassen: Affennierenlinie CV1, transformiert durch SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); menschliche embryonale Nierenlinie (293, F.L. Graham et al., J. Gen Virol 36, 59 [1977], und 293S-Zellen [293-Subklone, die aufgrund von besserem Suspensionswachstum ausgewählt wurden]); Babyhamster-Nierenzellen (BHK, ATCC CCL 10); Chinahamster-Eierstockzellen-DHFR (CHO, Urlaub & Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77, 4216 [1980]); Maus-Sertoli-Zellen (TM4, J.P. Mather, Biol. Reprod. 23, 243-251 [1980]); Affennierenzellen (CV1 ATCC CCL 70); AGMK-Zellen (VERO-76, ATCC CRL-1587); menschliche Zervixkarzinomzellen (HELA, ATCC CCL 2); Hundenierenzellen (MDCK, ATCC 34); Büffelratten-Leberzellen (BRL 3A, ATCC CRL 1442), menschliche Lungenzellen (W138, ATCC CCL 75); menschliche Leberzellen (Hep G2, HB 8065); Maus-Mammatumor (MMT 060562, ATCC CCL51-Zellen); und TRI-Zellen (J.P. Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383, 44-68 [1982]).
"Transformation" bedeutet das Einführen von DNA in einen Organismus, sodass die DNA entweder als extrachomosomales Element oder durch chromosomale Integration replizierbar ist. Ein Verfahren, das zur Transformation der Wirtszellen geeignet ist, ist jenes von F. Graham und A. van der Eb, Virology 52, 456-457 (1973). Es können jedoch auch andere Verfahren zum Einführen von DNA in Zellen verwendet werden, z.B. durch Kerninjektion oder durch Protoplastenfusion. Falls prokaryotische Zellen oder Zellen, die substantielle Zellwände enthalten, als Wirte verwendet werden, so ist Calciumbehandlung unter Verwendung von Calciumchlorid, wie von F.N. Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 69, 2110 (1972), beschrieben, das bevorzugte Transfektionsverfahren.
Die Konstruktion geeigneter Vektoren, die die gewünschten kodierenden und Kontrollsequenzen enthalten, erfolgt unter Anwendung von Standard- und Manipulations-Ligationsverfahren. Isolierte Plasmide oder DNA-Fragmente werden gespalten, nach Maß zusammengeschnitten und in der gewünschten Form erneut ligiert, um die geforderten Plasmide zu bilden. Geeignete Verfahren sind für die hierin beschriebene Konstruktion wohlbekannt. Siehe z.B. T. Maniatis et al., Molecular Cloning, 133-134, Cold Spring Harbor [1982]; Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates & Wiley-Interscience, Ausubel et al. (Hrsg.) [1987].
Korrekte Plasmidsequenzen werden durch Transformieren des E.-coli-K12-Stamms 294 (ATCC 31446) mit Ligationsgemischen bestätigt, erfolgreiche Transformanten werden durch Ampicillin- oder Tetracyclin-Resistenz ausgewählt, wo dies angebracht ist, danach werden Plasmide der Transformaten hergestellt und durch Restriktionsenzymverdau analysiert und/oder durch das Verfahren von Messing et al., Nucleic Acids Res. 9, 309 (1981), oder das Verfahren von Maxam et al., Methods in Enzymology 65, 499 (1980), sequenziert.
Die Wirtszellen werden mit den Expressionsvektoren transformiert. Danach werden sie in geeignetem Kulturmedium, z.B. umfassend Substanzen zur Induktion von Promotoren, zur Selektion von Transformanten oder zur Amplifikation von Genen, kultiviert. Die Kulturbedingungen, wie z.B. Temperatur, pH und dergleichen, sind jene, die zuvor für die zur Expression ausgewählte Wirtszelle verwendet wurden, und sind dem durchschnittlichen Fachmann bekannt.
Die sekretierten Adhesonvarianten werden gewonnen und von den Kulturüberständen oder Lysaten rekombinanter Wirte gereinigt. Typischerweise werden die Überstände durch Ultrafiltration eingeengt, mit einer Ligandaffinitäts- oder Immunaffinitätsmatrix kontaktiert, sodass die Adhesonvariante adsorbiert wird, und aus der Mat rix eluiert. Gegebenenfalls wird das Adheson durch Ionenaustauschchromatographie gereinigt.
Überraschenderweise war die Reinigung von löslichem CD4-Adheson aus dem Kulturmedium unerwartet schwierig. Trotz der Deletion der hydrophoben Transmembranregion des Antigens wies das Antigen eine starke Tendenz auf, Aggregate zu bilden, die aus der Suspension leicht durch Zentrifugieren bei 1000 × g zu entfernen waren und die Oberflächen, wie z.B. Ultrafiltrationsmembranen, schnell beschichteten. Dies scheint das Resultat der Reduktion der Albuminkonzentration oder der Konzentration anderer Serumproteine (die normalerweise im Präparat im Rohzustand vorhanden sind) auf ein bestimmtes Niveau zu sein, unter dem das trunkierte Antigen nicht mehr löslich bleibt. Dieses Phänomen scheint durch eine Exposition des CD4-Adhesons gegenüber niedrigen pH-Werten (< etwa pH 4) verstärkt zu werden. Als ein Ergebnis sollten Trennungsverfahren (besonders jene, die eine Säureelution verwenden, wie z.B. Immunaffinität) modifiziert werden, sodass das Eluat neutral gehalten wird oder sofort wieder neutral gemacht wird. Weiters sollte ein Tensid, z.B. ein Detergens wie etwa Tween 80, mit dem Antigen während des Trennungsverfahrens inkludiert werden. Das gereinigte Endprodukt wird mit einem vorher festgelegten Protein, wie z.B. Albumin, und/oder einem Detergens stabilisiert.
Das gereinigte Adheson wird in herkömmliche, pharmakologisch annehmbare Arzneimittelträger formuliert.
Es wird Patienten mit einer HIV-Infektion in einer Dosis verabreicht, durch die eine höhere Konzentration als etwa 100 ng lösliches CD4-Adheson/ml Plasma beibehalten werden kann. Für CD4-Adhesonvarianten mit unterschiedlichem Molekulargewicht werden anfänglich etwa 2 Picomol löslicher Rezeptor pro ml Plasma klinisch evaluiert, um ein stöchiometrisches Gleichgewicht mit nativem (membrangebundenem) und löslichem Rezeptor zu schaffen. Die normale Dosis von löslichem CD4 liegt bei 100 μg/kg Körpergewicht des Patienten pro Tag.
Die therapeutischen CD4-Varianten werden mit anderen Therapien und Agenzien zur Behandlung von AIDS, unter anderem AZT, neutralisierende Antikörper und Immuncytotoxine, gp120-Fragmente und Vakzinen, verwendet.
Um das Verständnis der folgenden Beispiele zu erleichtern, werden einige, häufig verwendete Verfahren und/oder Begriffe beschrieben.
"Plasmide" werden durch ein klein geschriebenes p mit vorangehenden und/oder darauf folgenden Großbuchstaben und/oder Nummern bezeichnet. Die hierin genannten Startplasmide sind entweder im Handel erhältlich, öffentlich auf unangeschränkter Basis erhältlich oder können gemäß veröffentlichter Verfahren aus erhältlichen Plasmiden konstruiert werden. Zusätzlich sind nach dem Stand der Technik Plasmide bekannt, die mit den beschriebenen äquivalent und dem durchschnittlichen Fachmann bekannt sind.
"Verdau" von DNA bezieht sich auf die katalytische Spaltung von DNA mit einem Restriktionsenzym, das lediglich an bestimmten Sequenzen in der DNA agiert. Die verschiedenen hierin verwendeten Restriktionsenzyme sind im Handel erhältlich, und ihre Reaktionsbedingungen, Co-Faktoren und anderen Bedingungen wurden so angewandt, wie dies dem durchschnittlichen Fachmann nach dem Stand der Technik bekannt wäre. Für Analysezwecke wird typischerweise 1 μg Plasmid- oder DNA-Fragment mit etwa 2 Enzymeinheiten in etwa 20 μl Pufferlösung verwendet. Um DNA-Fragmente für die Plasmidkonstruktion zu isolieren, werden typischerweise 5 bis 50 μg DNA mit 20 bis 250 Enzymeinheiten in einer größeren Menge verdaut. Geeignete Puffer- und Substratmengen für bestimmte Restriktionsenzyme werden von Hersteller spezifiziert. Normalerweise werden Inkubationszeiten von etwa 1 Stunde bei 37 °C angewandt, können jedoch gemäß den Anweisungen des Herstellers variieren. Nach dem Verdau wird die Reaktion direkt auf einem Polyacrylamidgel der Elektrophorese unterzogen, um das gewünschte Fragment zu isolieren.
"Gewinnung" oder "Isolierung" eines bestimmten DNA-Fragments aus einem Restriktionsverdau bedeutet eine Trennung des Verdaus auf Polyacrylamid- oder Agarosegel durch Elektrophorese, Identifikation des Fragments von Interesse durch Vergleich seiner Mobilität in Gegenüberstellung mit jener der Marker-DNA-Fragmente mit bekanntem Molekulargewicht, Entfernen der Gelsektion, die das gewünschte Fragment enthält, und Trennung des Gels von der DNA. Dieses Verfahren ist allgemein bekannt (R. Lawn et al., Nucleic Acids Res. 9, 6103-6114 [1981], und D. Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8, 4057 [1980]).
"Dephosphorylierung" bezieht such auf die Entfernung der terminalen 5'-Phosphate durch Behandlung mit bakterieller alkalischer Phosphatase (BAP). Dieses Verfahren verhindert, dass die zwei durch Restriktionsverdau gespaltene Enden eines DNA-Fragments "zirkularisieren" oder eine geschlossene Schleife bilden, die die Insertion eines anderen DNA-Fragments an der Restriktionsstelle verhindern würde. Verfahren und Reagenzien zur Dephosphorylierung sowie andere rekombinante Manipulationen sind die herkömmlichen. Reaktionen unter Verwendung von BAP werden in 50 mM Tris bei 68 °C durchgeführt, um die Aktivität jeglicher Exonucleasen zu unterdrücken, die in den Enzympräparaten vorhanden sein können. Die Reaktionen wurden 1 Stunde lang laufen gelassen. Nach der Reaktion wird das DNA-Fragment gelgereinigt.
"Ligation" bezieht sich auf den Prozess der Bildung von Phosphodiesterbindungen zwischen zwei doppelsträngigen Nucleinsäurefragmenten (T. Maniatis et al., id. auf 146). Falls nicht anders bereitgestellt, kann die Ligation unter Verwendung bekannter Puffer und Bedingungen mit 10 Einheiten T4-DNA-Ligase ("Ligase") pro 0,5 μg an ungefähr äquimolaren Mengen der zu ligierenden DNA-Fragmente durchgeführt werden.
"Auffüllen" oder "Abstumpfen" bezieht sich auf die Verfahren, durch die das einzelsträngige Ende im Kohäsionsterminus einer durch ein Restriktionsenzym gespaltenen Nucleinsäure in einen Doppelstrang konvertiert wird. Dadurch wird der Kohäsionsterminus eliminiert und ein stumpfes Ende gebildet. Dieses Verfahren ist ein viel seitig verwendbares Werkzeug, um ein restriktionsgeschnittenes Ende, das mit den von lediglich einem oder einigen anderen Restriktionsenzymen geschaffenen Enden kohäsiv sein kann, in einen Terminus zu konvertieren, der mit jeder stumpfschneidenden Restriktions-Endonuclease oder anderen gefüllten Kohäsionstermini kompatibel ist. Typischerweise wird das Abstumpfen durch Inkubieren von 2-15 μg der Target-DNA in 10 mM MgCl₂, 1 mM Dithiothreit, 50 mM NaCl, 10 Mm Tris-Puffer (pH 7,5) bei etwa 37 °C in Gegenwart von 8 Einheiten des Klenow-Fragments von DNA-Polymerase I und 250 μM von jedem der vier Desoxynucleosidtriphosphate erreicht. Die Inkubation ist im Allgemeinen nach 30 Minuten Phenol- und Chloroformextraktion und Ethanolfällung beendet.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen lediglich die besten, zur Zeit zur praktischen Umsetzung der Erfindung in Betracht gezogenen Ausführungsart, sollten aber nicht als Einschränkung der Erfindung interpretiert werden.
Beispiel 1
Konstruktion von Vektoren zur Expression von nativem CD4 und sekretierten Derivaten
Abschnitt 1
Das für die rekombinante Synthese von menschlichem CD4 verwendete Plasmid war pSVeCD4DHFR. Das Plasmid wurde wie folgt konstruiert:
λCD4P1, das die meisten der kodierenden Sequenzen von menschlichem CD4 enthielt (aus einer menschlichen Plazenta-cDNA-Bibliothek unter Verwendung von Oligonucleotid-Sonden auf Basis der veröffentlichten Sequenz erhalten [Maddon et al. 1985]), wurde mit EcoRI verdaut, um das cDNA-Insert herzustellen. Dieses Fragment wurde mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese gewonnen (Fragment 1).
pUC18 wurde mit EcoRI verdaut, und das Einzelfragment wurde mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese (Fragment 2) gewonnen. Fragment 1 wurde an Fragment 2 ligiert, und das Ligationsgemisch wurde in den E.-coli-Stamm 294 transformiert. Die transformierte Kultur wurde auf Ampicillin-Mediumplatten ausplattiert, und es wurden die resistenten Kolonien ausgewählt. Plasmid-DNA wurde aus Transformanten hergestellt und mittels Restriktionsanalyse auf die Gegenwart der korrekten DNA-Fragmente untersucht. Dieses Plasmid wird als pUCCD4 bezeichnet.
pSVeE'DHFR (Muesing et al., Cell 48, 691-701 [1987]) wurde mit KpnI und BamHI verdaut und mit E.-coli-DNA-Polymerase-I (Klenow-Fragment) und den vier dNTPs abgestumpft. Fragment 3, das die pML-Amp^r-Region, den frühen SV40-Promotor, den HIV-LTR und das Maus-DHFR-Gen enthielt, wurde mittels Gelelektrophorese gewonnen, ligiert, und das Ligationsgemisch wurde in den E.-coli-Stamm 294 transformiert. Die transformierte Kultur wurde auf Ampicillin-Mediumplatten ausplattiert, und danach wurden die resistenten Kolonien auswählt. Aus Transformanten wird Plasmid-DNA hergestellt und mittels Restriktionsanalyse auf die Gegenwart der BamHI-Restriktionsstelle und die Abwesenheit der KpnI-Restriktionsstelle untersucht. Dieses Plasmid wird pSVeΔBKDHFR genannt und ermöglicht nach der Transfektion in eine geeignete Zelllinie die Insertion von EcoRI-BamHI-Fragmenten nach dem frühen SV40-Promotor sowie eine Transkription unter seiner Kontrolle.
Synthetische Oligonucleotide (Adaptoren 1-8, unten stehend) wurden so behandelt, dass sie sich nun vom 76 bp 5' zum Initiationscodon der CD4-Translation bis zur RsaI-Restriktionsstelle bei 121 bp 3' zum Initiator erstrecken, wobei die Sequenz AATT am 5'-Ende des kodierenden Strangs ein Ende generiert, das an ein Eco-RI-Restriktionsfragment ligieren konnte. Diese Oligonucleotide wurden ligiert, und das 204-bp-Fragment, das die gesamte Sequenz enthielt, wurde mittels Gelelektrophorese gewonnen (Fragment 4).
pUCCD4 wurde mit RsaI und SstI verdaut, und das 401-bp-Fragment, das einen Teil der CD4-Kodiersequenz enthielt, wurde mittels Gelelektrophorese gewonnen (Fragment 5). pUC18 wurde mit EcoRI und SstI verdaut, und das Fragment, das den Hauptteil des Plasmids umfasste, wurde mittels Gelelektrophorese gewonnen (Fragment 6). Die Fragmente 4 und 5 wurden an Fragment 6 ligiert, und das Ligationsgemisch wurde in den E.-coli-Stamm 294 transformiert. Die transformierte Kultur wurde auf Ampicillin-Mediumplatten ausplattiert, und es wurden die resistenten Kolonien ausgewählt. Aus Transformanten wurde Plasmid-DNA hergestellt und mittels Restriktionsanalyse auf die Gegenwart des korrekten Fragments untersucht. Die Sequenz der insertierten synthetischen DNA wurde durch Herausschneiden der 605-bp-EcoRI-SstI-Fragmente aus mehreren Transformanten und Ligieren dieser an M13mp19, das mit den selben Enzymen verdaut wurde, überprüft. Nach der Transformation in den E.-coli-Stamm JM101 wurde einzelsträngige DNA hergestellt und sequenziert. Ein Plasmid, das die korrekte Sequenz enthielt, wurde ausgewählt und wird als pCD4int bezeichnet.
pCD4int wurde mit EcoRI und SstI verdaut, und das Fragment 7, das das 5'-Ende der CD4-Kodierregion enthielt, wurde mittels Gelelektrophorese gewonnen. pUCCD4 wurde mit SstI und BamHI verdaut, und das 1139-bp-Fragment, das den Rest der CD4-Kodierregion enthielt (Fragment 8), wurde mittels Gelelektrophorese gewonnen.
pSVeΔBKDHFR wurde mit EcoRI und BamHI verdaut, und Fragment 9, das den Hauptteil des Plasmids umfasste, wurde isoliert. Die Fragmente 7, 8 und 9 wurden ligiert, und das Ligationsgemisch wurde in den E.-coli-Stamm 294 transformiert. Die transformierte Kultur wurde auf Ampicillin-Mediumplatten ausplattiert, und es wurden die resistenten Kolonien ausgewählt. Aus Transformanten wurde Plasmid-DNA hergestellt und mittels Restriktionsanalyse auf die Gegenwart des korrekten Fragments untersucht. Dieses Plasmid wird als pSVeCD4DHFR bezeichnet und wurde für die Steuerung der Synthese rekombinanter intakter CD4 verwendet.
Abschnitt 2
Es wurde ein Plasmid konstruiert, um die Synthese eines CD4-Derivats zu steuern, dem die mutmaßliche Transmembrandomäne und der Großteil der mutmaßlichen zytoplasmatischen Domäne fehlt (Madden et al.). Dies wurde mit der Intention getan, eine sekretierte Form von CD4 zu schaffen, basierend auf der Annahme, dass diese Domänen das CD4-Glykoprotein an der Zellmembran verankern und dass ihre Deletion zu der Sekretion des Produkts führen würde. Dieses Plasmid wird als pSVeCD4ΔNIaDHFR bezeichnet und wurde wie folgt konstruiert:
pUCCD4 wurde mit SstI und TaqI verdaut, und das 531-bp-Fragment wurde gewonnen (Fragment 10). pUCCD4 wurde mit NlaIII und TaqI verdaut, und das 112-bp-Fragment wurde gewonnen (Fragment 11). pUCCD4 wurde mit BamHI und NIaIII verdaut, und das 301-bp-Fragment wurde gewonnen (Fragment 12). pCD4int wurde mit SstI und BamHI verdaut, und Fragment 13, das den Hauptteil des Plasmids umfasst, wurde gewonnen. Die Fragmente 10, 11 und 12 wurden zusammen mit Fragment 13 ligiert, und das Ligationsgemisch wurde in den E.-coli-Stamm 294 transformiert. Die transformierte Kultur wurde auf Ampicillin-Mediumplatten ausplattiert, und es wurden die resistenten Kolonien ausgewählt. Aus Transformanten wurde Plasmid-DNA hergestellt und mittels Restriktionsanalyse auf die Gegenwart des korrekten Fragments untersucht. Plasmid-DNA aus mehreren Transformanten wurde sequenziert, um sicherzustellen, dass das 195-bp-NIaIII-Fragment deletiert wurde und dass der korrekte Leseraster wiederhergestellt wurde. Das daraus resultierende Plasmid wird als pCD4ΔNIa bezeichnet.
pCD4ΔNIa wurde mit EcoRI und BamHI verdaut, und das 1541-bp-Fragment, das die Sequenz eines CD4-Derivats enthielt, dem die Transmembran- und die zytoplasmati schen Domänen fehlten, wurde gewonnen (Fragment 14) und an Fragment 9 ligiert, und das Ligationsgemisch wurde dann in den E.-coli-Stamm 294 transformiert. Die transformierte Kultur wurde auf Ampicillin-Mediumplatten ausplattiert, und es wurden resistente Kolonien ausgewählt. Aus Transformanten wurde Plasmid-DNA hergestellt und mittels Restriktionsanalyse auf die Gegenwart des korrekten Fragments untersucht. Dieses Plasmid wird als pSVeCD4ΔNIaDHFR bezeichnet.
Sowohl pSVeCD4DHFR als auch pSVeCD4ΔNIaDHFR wurden mittels desselben Verfahrens, das verwendet wurde, um Zelllinien zu schaffen, die HIV-I-Polypeptide stabil exprimieren, in CHO-Zellen transfiziert (Muesing, Smith & Capon, Cell 48, 6910701 [1987]). Diese Zellen wurden mittels Radioimmunfällung wie unten stehend beschrieben auf ihre Produktion getestet. Während in den anfänglichen Experimenten keine Produkte nachgewiesen wurden, zeigten darauf folgende Experimente, dass das oben beschriebene kodierende Segment tatsächlich die Synthese einer löslichen CD4-Adhesonvariante sowohl in CHO- als auch in 293-Zellen steuern konnte.
Abschnitt 3
Ein anderes Expressionssystem wurde anfänglich für die Synthese und die Expression einer CD4-Variante verwendet, der die zytoplasmatischen und Transmembrandomänen vollständig fehlten. Dieses System verwendet den Zytomegalieviruspromotor und kann in kultivierten Zellen menschlichen Ursprungs verwendet werden. Das erste zur Verwendung in diesem System konstruierte Plasmid enthielt die gesamte kodierende Region für CD4 und war als Kontrolle in den folgenden Studien gedacht. Es wird als pRKCD4 bezeichnet und wurde wie folgt konstruiert:
pSVeCD4DHFR wurde mit EcoRI und BamHI verdaut, und das Fragment 15, das die gesamte CD4-kodierende Region enthielt, wurde isoliert. pRK5 (U.S.S.N. 97.472, eingereicht am 11. September 1987) wurde mit EcoRI und BamHI verdaut, und das Fragment 16, das den Hauptteil des mittels Gelelektrophorese gewonnenen Plasmids enthielt, wurde an Fragment 15 ligiert, und das Ligationsgemisch wurde in den E.-coli-Stamm 294 transformiert. Die transformierte Kultur wurde auf Ampicillin- Mediumplatten ausplattiert, und es wurden resistente Kolonien ausgewählt. Aus Transformanten wurde Plasmid-DNA hergestellt und mittels Restriktionsanalyse auf die Gegenwart des korrekten Fragments untersucht. Dieses Plasmid wird als pRKCD4 bezeichnet.
Abschnitt 4
Das nächste konstruierte Plasmid wurde geschaffen, um die Expression des oben angeführten (Abschnitt 3) sekretierten Derivats von CD4 zu steuern. Die kodierende Region von CD4 wurde nach dem Aminosäurerest 368 des reifen CD4 an eine Sequenz von pBR322 fusioniert, die für 9 weitere Reste vor einem Translationsterminationscodon kodiert. Dadurch werden die mutmaßlichen Transmembran- und zytoplasmatischen Domänen von CD4, von denen angenommen wird, sie würden CD4 an der Zelloberfläche verankern, entfernt. Dieses Plasmid wird als pRKCD4T bezeichnet (und produziert ein Protein, das CD4T genannt wird) und wurde wie folgt konstruiert:
pSVeCD4DHFR wurde mit HpaII verdaut, mit dem Klenow-Fragment und den vier dNTPs abgestumpft und mit BstEII verdaut. Das 382-bp-Fragment (Fragment 17), das einen Teil der CD4-Kodiersequenz enthielt, wurde mittels Gelelektrophorese gewonnen. pSVeCD4DHFR wurde mit EcoRI und BstEII verdaut, und das 874-bp-Fragment (Fragment 18) wurde gewonnen. pBR322 wurde mit HindIII verdaut, mit dem Klenow-Fragment und den vier dNTPs abgestumpft und mit EcoRI verdaut. Fragment 19, das den Hauptteil des Plasmids enthielt, wurde isoliert und an die Fragmente 17 und 18 ligiert, und das Ligationsgemisch wurde in den E.-coli-Stamm 294 transformiert. Die transformierte Kultur wurde auf Ampicillin-Mediumplatten ausplattiert, und es wurden resistente Kolonien ausgewählt. Aus Transformanten wurde Plasmid-DNA hergestellt und mittels Restriktionsanalyse auf die Gegenwart des korrekten Fragments untersucht. Dieses Plasmid wird als pCD4Tint bezeichnet.
pRK5 wurde mit EcoRI und SmaI verdaut, und das Fragment 20, das den Hauptteil des Plasmids enthielt, wurde isoliert. pCD4Tint wurde mit EcoRI und EcoRV verdaut, und das 1410-bp-Fragment, das die CD4-Kodiersequenz bis zu der HpaII-Stelle bei 1176 bp 3' zum Initiationscodon enthielt, sowie das 154-bp-HindIII-EcoRV-Fragment von pBR322 wurden gewonnen (Fragment 21). Die Fragmente 20 und 21 wurden ligiert, und das Ligationsgemisch wurde in den E.-coli-Stamm 294 transformiert. Die transformierte Kultur wurde auf Ampicillin-Mediumplatten ausplattiert, und es wurden resistente Kolonien ausgewählt. Aus Transformanten wurde Plasmid-DNA hergestellt und mittels Restriktionsanalyse auf die Gegenwart des korrekten Fragments untersucht. Dieses Plasmid wird als pRKCD4T bezeichnet.
Abschnitt 5a
Um eine sekretierte Form von CD4 zu schaffen, die mit einem auf das Typ-I-Glykoprotein-D des Herpes-Virus gerichteten Antikörper gereinigt werden konnte, wurde ein Plasmid konstruiert, um ein Derivat von CD4T zu exprimieren, in dem die für das reife, aufbereitete CD4T-Polypeptid kodierende Region an eine Sequenz fusioniert war, die für das Signalpeptid und die ersten 27 Reste des reifen Typ-I-gD-Glykoproteins des Herpes-Simplex-Virus kodiert. Dieses Plasmid wird als pRKGDCD4T bezeichnet und wurde wie folgt konstruiert:
pgDTrunc.DHFR wurde mit EcoRI und PvuII verdaut, und das Fragment, das die kodierende Region für das Signalpeptid und die ersten 27 Reste des reifen HSV-I-gD-Glykoproteins enthielt, wurde isoliert (Fragment 22). pRKCD4T wurde mit EcoRI und BstEII verdaut, und das Fragment 23, das das 3'-Ende der CD4-Kodiersequenz und die pRK5-Region enthielt, wurde isoliert.
Die synthetischen Oligonucleotide GD (Adaptoren 1-2, unten), die die kodierende Sequenz von CD4 vom Codon für den aminoterminalen Rest des reifen CD4 bis zur Rsa-Stelle bei 121 bp 3' zu der Translationsinitiation sowie die Sequenz CTGCTCGAG am 5'-Ende des kodierenden Strangs enthielten, wurden hergestellt (Fragment 24). pRKCD4 wurde mit RsaI und BstEII verdaut, und das 665-bp-Fragment, das einen Teil der kodierenden Region für CD4 enthielt, wurde gewonnen (Fragment 25) und an Fragment 24 ligiert. Nach dem Verdau mit BstEII wurde, um sicherzustellen, dass nur monomere Fragmente vorhanden waren, das 724-bp-Fragment, das beide Sequenzen enthielt, mittels Gelelektrophorese gewonnen (Fragment 26).
Die Fragmente 22, 23 und 26 wurden ligiert, und das Ligationsgemisch wurde in den E.-coli-Stamm 294 transformiert. Die transformierte Kultur wurde auf Ampicillin-Mediumplatten ausplattiert, und es wurden resistente Kolonien ausgewählt. Aus Transformanten wurde Plasmid-DNA hergestellt und mittels Restriktionsanalyse auf die Gegenwart des korrekten Fragments untersucht. Die Sequenz einiger Transformanten wurde untersucht, um sicherzustellen, dass das synthetische Insert korrekt war und dass der Leseraster erhalten blieb. Dieses Plasmid wird als pRKGDCD4T bezeichnet.
Diese von pRK5 abstammenden Plasmide wurden für eine stabile Expression gemäß Muesing et al., Cell 48, 691 (1987), vorzugsweise in 293S-Zellen transfiziert, jedoch mit der Ausnahme, dass zusätzlich zu dem Plasmid von Interesse ein das Neomycin-Resistenzgen pRSV neo exprimierendes Plasmid (Gorman et al., Science 221, 553-555 (1985)) co-transfiziert wurde. 293-Zellen werden ebenfalls zufriedenstellend als Wirtszellen verwendet. 2 Tage nach der Transfektion wurden die Zellen mit 0,5 mg/ml G418 (Genticinsulfat; Gibco) zur Selektion von stabilen Zelllinien in ein Standardmedium (1:1 F12/DME, ergänzt mit L-Glutamin, Penicillin-Streptomycin und 10 FBS) passagiert, anstatt in ein methotrexathältiges Medium, wie dies von Muesing et al. gezeigt wurde. Zellen wurden mittels Radioimmunfällung auf die Produktion von CD4 oder CD4-Analoga getestet. In Bindungsstudien (Abschnitt 5c) wurden konditionierte Überstände dieser Zellen in dem 1:1-F12/DME-Medium verwendet. Materialien, die in Infektiositätstests (Abschnitt 5b) verwendet wurden, wurden wie unten stehend in Abschnitt 8 beschrieben erhalten.
gDCD4-Adaptor 1:
CTGCTCGAGCAGGGAAACAAAGTGGTGCTGGGCAAAAAAGGGGATACAGTGGAACTGAC
gDCD4-Adaptor 2:
pACAGGTCAGTTCCACTGTATCCCCTTTTTTGCCCAGCACCACTTTGTTTCCCTGCTCGA
Abschnitt 5b
Im Folgenden wird eine Studie über die Neutralisierung der HIV-I-Infektiosität durch lösliche CD4-Analoga dargelegt. Darauf folgte eine Modifikation des Neutralisierungsverfahrens von Robert-Guroff et al., Nature 316, 72 (1985). Gleiche Volumina an Inhibitorüberstand und Virus (60 Mikroliter) wurden bei 4 °C 1 Stunde lang inkubiert, dann wurde dasselbe Volumen H9 (Gallo et al., Science 224, 500 (1984)) bei 5 × 106/ml hinzugefügt, und die Inkubation wurde bei 37 °C 1 Stunde lang fortgesetzt. Nach der Absorption wurden 2,5 × 10⁵ Zellen in 150 Mikroliter in 2 ml Inkubationsmedium transferiert. Nach 4 Tagen bei 37 °C wurden die Kulturen 1:2 mit frischem Medium geteilt und für 3 weitere Tage inkubiert. Die Kulturen wurden geerntet, die Aktivität der reversen Transkriptase wurde gemessen (Groopman et al., AIDS Research and Human Retroviruses 3,71 (1987)), und die Immunfluoreszenzreaktivität mit HIV-1-positivem Serum wurde wie beschrieben nachgewiesen (Poiesz et al., Proc. Acad. Nat. Sci. USA 77, 7415 (1980)).
Inhibitorüberstände wurden aus konfluenten Plattenkulturen von 293S/CDT4-, 293S/gDCD4T-Zellen oder nicht transfizierten 293S-Zellen erhalten, und zwar durch Ersetzen der Wachstumsmedium-Inkubationsmedien sowie durch Ernten der Überstände 24 Stunden später. Der Inhibitorüberstand ersetzte einen Teil des Inkubationsmediums oder das gesamte Inkubationsmedium während der ersten drei Kulturtage, wie dies in der zweiten Spalte von Tabelle 3 angegeben ist. Die Challenge-Dosis des Virus lag bei 100 TCID₅₀ (Groopman et al., s.o.) des HIV-1-Stamms HTLV-IIIB, der in H9-Zellen kultiviert wurde, die im selben System getestet wurden. Das Inkubationsmedium bestand aus einem RPMI-1640-Medium, das 2 mM L-Glutamin, 100 Einheiten/ml Penicillin, 100 Mikrogramm/ml Streptomycin, 2 Mikrogramm/ml Polybren und 20 % fötales Kälberserum (M.A. Bioproducts) enthielt. Tabelle 3
Beide Formen des löslichen CD4 brachten bei einer Inkubation mit virusinfizierten Zellen ohne vorherige Verdünnung das Wachstum von HIV-1 beinahe zum Stillstand (Tabelle 2). Bei einer Verdünnung von 1:4 waren die löslichen CD4-Präparate lediglich teilweise wirksam bei der Inhibierung des Viruswachstums, die Menge an fluoreszenz-positiven Zellen und reverser Transkriptase war jedoch immer noch signifikant geringer als bei Kulturen, die mock-transfizierte Zellüberstände erhielten (Tabelle 2). Da es beim Viruswachstum keinen signifikanten Unterschied zwischen verdünnten und unverdünnten Kontrollüberständen gegeben hat und keiner der Überstände das Wachstum der nicht infizierten H9-Zellen (Daten nicht dargestellt) beeinflusst hat, wurde angenommen, die in diesen Überständen vorhandenen löslichen CD4-Proteine wären für die Neutralisierung der HIV-1-Infektion der H9-Zellen verantwortlich.
Abschnitt 5c
Um die Affinitätskonstante für Wechselwirkungen zwischen gp120 und CD4 oder CD4-Varianten zu bestimmen, wurde eine Sättigungs-Bindungsanalyse mit löslichem CD4 (s.o.) durchgeführt, und ein Detergens solubilisierte intaktes CD4 (Lasky et al., Cell 50, 957 [1987]) unter Verwendung von radioiodiertem gp120, das mit Lactoperoxidase markiert war. Die Bindungsreaktionen bestanden aus ¹²⁵I-gp120 (3 ng bis 670 ng, 2,9 nCi/ng), das 1 Stunde lang bei 0 °C mit Zelllysaten, die intaktes CD4 enthiel ten (Lasky et al., s.o.), oder mit Zellüberständen, die unmarkiertes CD4T oder gDCD4T enthielten, das wie in Abschnitt 5a beschrieben hergestellt wurde, inkubiert wurde. Die Reaktionen (0,2 ml) besaßen eine Endzusammensetzung von 0,5X McDougal-Lysepuffer (McDLB) (1 × McDLB enthält 0,5 % Nonidet NP-40, 0,2 % Na-Desoxycholat, 0,12 M NaCl, 0,02 M Tris-HCl, pH 8,0) und wurden zweifach durchgeführt, beide in Gegenwart oder in Abwesenheit von 50 Mikrogramm unmarkiertem gereinigtem gp120 (74facher oder größerer Überschuss). Nach der Inkubation wurde das gebundene gp120 mittels Immunfällung quantifiziert und in einem Gammazähler gezählt. Für die Immunfällung wurden Bindungsreaktionslösungen mit 5 Mikrolitern normalem Kaninchenserum 1 Stunde lang bei 0 °C präabsorbiert und mit 40 Mikrolitern Pansorbin (10 % (Gew./Vol.), Calbiochem) 30 Minuten lang bei 0 °C geklärt. Die Proben wurden dann über Nacht bei 0 °C mit 2 Mikrolitern normalem Serum oder 5 Mikrolitern (0,25 Mikrogramm) monoklonalem OKT4-Antikörper (Ortho) inkubiert, gefolgt vom Sammeln der Immunkomplexe mit 10 Mikrolitern Pansorbin. Die Präzipitate wurden zwei Mal in 1X McDLB und einmal in Wasser gewaschen, danach durch Eluieren bei 100 °C 2 Minuten lang in Probenpuffer (0,12 M Tris-HCl, pH 6,8, 4 % SDS, 0,7 M Mercaptoethanol, 20 % Glycerin und 0,1 % Bromphenolblau) eluiert. Die CD4-Moleküle wurden durch gp120 sättigungsgebunden und ergaben eine einfache Massenwirkungsbindungskurve.
Die Überstände von mock-transfizierten Zellen ergaben eine Menge an spezifisch gebundenem gp120, die unter 1 % jenes Wertes lag, der für lösliches CD4 enthaltende Überstände gefunden wurde. Die Scatchard-Analyse ergab eine einzige Klasse an Bindungsstellen auf jedem Molekül, mit erkennbaren Dissoziationskonstanten (Kd) von 1,3 × 10^-9 M, 0,83 × 10^-9 M und 0,72 × 10^-9 M für intaktes CD4, CD4T bzw. gDCD4T. Die Werte, die für eine CD4-gp120-Bindung in einer Lösung erhalten wurden, sind mit der zuvor für eine gp120-Bindung an CD4 auf ganzen Zellen (Kd=4,0 × 10^-9, M. Lasky, Cell, s.o.) gemessenen Affinität vergleichbar.
Abschnitt 6
Um sekretierte Derivate von CD4 zu produzieren, die frei von fremden Aminosäureresten sind, wurden zwei Plasmide für die Expression in 293-Zellen konstruiert. Die Plasmide enthalten CD4-Gene, die trunkiert wurden ohne das Hinzufügen von zusätzlichen Resten und pRKCD4ΔNIa und pRKCD4TP genannt werden (und Proteine, die CD4TP und CD4ΔNIa genannt werden, produzieren), und wurden wie folgt konstruiert:
Das Fragment 14, das das CD4-Gen mit dem deletierten 195-bp-NIaIII-Restriktionsfragment enthielt, wurde an Fragment 16 ligiert, das mit EcoRI und BamHI verdautes pRK5 ist. Das Ligationsgemisch wurde in den E.-coli-Stamm 294 transformiert, die transformierte Kultur wurde auf Ampicillin-Mediumplatten ausplattiert, und es wurden resistente Kolonien ausgewählt. Aus Transformanten wurde Plasmid-DNA hergestellt und mittels Restriktionsanalyse auf die Gegenwart des korrekten Fragments untersucht. Das resultierende Plasmid wird als pRKCD4ΔNIa bezeichnet.
Synthetische DNA (5' CGT GAT AGA AGC TTT CTA GAG 3') wurde so bearbeitet, dass sie an die HpaII-Stelle bei 1176 bp bindet und bei einer solchen Bindung die Translation nach dem Aminosäurerest 368 des reifen CD4 (Fragment 27) zu Ende bringen würde. Das andere Ende dieses Fragments wurde so geschaffen, dass es an BamHI-Restriktionsfragmente ligiert. pUCCD4 wurde mit BstEII und HpaII verdaut, und das 382-bp-Fragment, das einen Teil des CD4-Gens enthielt, wurde gewonnen (Fragment 28). Die Fragmente 27 und 28 wurden ligiert und danach mit BstEII verdaut, um dimerisierte Fragmente zu Monomeren zu reduzieren, und das resultierende 401-bp-Fragment wurde gewonnen (Fragment 29).
pRKCD4 wurde mit BstII und BamHI verdaut, und das Fragment, das den Großteil des Plasmids (Fragment 30) umfasste, wurde isoliert und an Fragment 29 ligiert. Das Ligationsgemisch wurde in den E.-coli-Stamm 294 transformiert, die transformierte Kultur wurde auf Ampicillin-Mediumplatten ausplattiert, und es wurden resistente Kolonien ausgewählt. Aus Transformanten wurde Plasmid-DNA hergestellt und mittels Restriktionsanalyse auf die Gegenwart des korrekten Fragments untersucht. Das resultierende Plasmid wird als pRKCD4TP bezeichnet. Beide Plasmide werden in 293-Zellen transfiziert, um, wie oben beschrieben, stabile, Varianten-CD4-exprimierende Zelllinien zu generieren.
Abschnitt 7
Es wurden zwei Plasmide konstruiert, um die Expression von sekretiertem CD4, dem fremde Aminosäurereste fehlten, in CHO-Zellen zu steuern. Diese werden als pSVeCD4ΔNIaSVDHFR und pSVeCD4TPSVDHFR bezeichnet (und kodieren für Proteine, die die Hauptsequenz von CD4ΔNIa und CD4TP aufweisen) und wurden wie folgt konstruiert:
pE348HBV.E400D22 wurde mit PvuI und EcoRI verdaut, und das Fragment, das den frühen Promotor von SV40 und einen Teil des β-Lactamase-Gens enthielt, wurde gewonnen (Fragment 31). pE348HBV.E400D22 wurde mit PvuI und BamHI verdaut, und das große Fragment, das den Rest des β-Lactamase-Gens sowie den frühen Promotor von SV40 und das DHFR-Gen enthielt, wurde isoliert (Fragment 32).
Die Fragmente 31 und 32 wurden zusammen mit dem Fragment 14 ligiert und in den E.-coli-Stamm 294 transformiert. Die transformierte Kultur wurde auf Ampicillin-Mediumplatten ausplattiert, und es wurden resistente Kolonien ausgewählt. Aus Transformanten wurde Plasmid-DNA hergestellt und mittels Restriktionsanalyse auf die Gegenwart des korrekten Fragments untersucht.
Das resultierende Plasmid wird als pSVECD4ΔNIaSVDHFR bezeichnet. Dieses Plasmid enthält dasselbe DNA-Fragment, das für das lösliche CD4-Molekül kodiert, das im oben genannten Plasmid pSVeCD4ΔNIaDHFR zu finden ist (Abschnitt 2).
pRKCD4TP wurde mit EcoRI und BamHI verdaut, und das Fragment, das die trunkierte kodierende Region von CD4 enthielt, wurde isoliert und an die Fragmente 31 und 32 ligiert. Das Ligationsgemisch wurde in den E.-coli-Stamm 294 transformiert, die transformierte Kultur wurde auf Ampicillin-Mediumplatten ausplattiert, und es wurden resistente Kolonien ausgewählt. Aus Transformanten wurde Plasmid-DNA hergestellt und mittels Restriktionsanalyse auf die Gegenwart des korrekten Fragments untersucht. Das resultierende Plasmid wird als pSVeCD4TPSVDHFR bezeichnet. Beide dieser Plasmide werden in CHO-Zellen transfiziert, und amplifizierte Transfektanten werden durch Methotrexat unter Verwendung herkömmlicher Verfahren ausgewählt.
Beispiel 2
Fusionen der V-Region des CD4-Gens, das zu der variablen Region von Immunglobulin-Genen homolog ist (siehe Maddon et al. (1985)), mit der konstanten (C-) Region von menschlichen Immunglobulin-κ- und -γ2-Ketten werden wie folgt konstruiert:
Synthetische DNA wird, basierend auf der von Morin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82, 7025-7029, publizierten Sequenz so behandelt, dass sie für die C-Region einer menschlichen κ-Kette (Reste 109-214) kodiert, mit der Addition am 5'-Ende des kodierenden Strangs der Sequenz GGGG, was eine Ligation dieses Fragments an die BspMI-Stelle am Ende der mutmaßlichen V-artigen Region von CD4 ermöglicht. Am 3'-Ende der kodierenden Region wird ein Translationsstopcodon sowie eine Sequenz, die eine Ligation dieses Endes an BamHI-Restriktionsfragmente ermöglicht, addiert. Die synthetische DNA wird in 8 Fragmenten hergestellt, 4 für jeden Strang, 70-90 Basen lang. Diesen wird dann die Möglichkeit zum Annealing gegeben, und sie werden vor der Isolation auf einem Polyacrylamidgel ligiert (Fragment 33).
pRKCD4 wird mit EcoRI und BspMI verdaut, und das 478-bp-Fragment, das die für die mutmaßliche V-artige Domäne von CD4 kodiert, wird gewonnen (Fragment 34). Die Fragmente 33 und 34 werden mit Fragment 16 (aus dem Expressionsvektor pRK5) zusammen ligiert. Das Ligationsgemisch wird in den E.-coli-Stamm 294 transformiert, die transformierte Kultur wurde auf Ampicillin-Mediumplatten ausplattiert, und es wurden resistente Kolonien ausgewählt. Aus Transformanten wird Plasmid-DNA hergestellt und mittels Restriktionsanalyse auf die Gegenwart des korrekten Fragments untersucht. Das resultierende Plasmid wird als pRKCD4Ck bezeichnet.
Ein Plasmid, das für eine Fusion der V-artigen Domäne von CD4 mit der menschlichen Immunglobulin-Cγ2-Region kodiert, wird auf eine ähnliche Art und Weise konstruiert und wird als pRKCD4Cγ2 bezeichnet. Beide dieser Plasmide werden in 293-Zellen, Myelomzellen oder andere kompetente Zellen transfiziert, um Zelllinien zu erhalten, die, wie oben beschrieben, unterschiedliche CD4-Moleküle exprimieren.
Beispiel 3
Das durch das Verfahren aus Beispiel 1 sekretierte gDCD4T wurde vom Zellkulturfluid, das entweder 10 % FBS (Fetales Rinderserum) oder kein zugesetztes FBS enthielt, gereinigt. Das konditionierte Zellkulturfluid wurde erst durch Ultrafiltration eingeengt und dann mittels Immunaffinitätschromatographie gereinigt. Die Immunaffinitätssäule wurde durch Binden monoklonaler muriner Antikörper 5B6 (deren Epitop sich auf dem HSV-1-gD-Teil des gDCD4T-Moleküls befindet) an glycerylbeschichtetes Glas mit definierter Porengröße mittels des Verfahrens von Roy et al. (1984) hergestellt. Das konzentrierte Zellkulturfluid wird direkt auf die Säule aufgebracht, und die verunreinigenden Proteine werden mit einem neutralen pH-Puffer weggewaschen. Die Säule wird dann mit neutralem Puffer, der Tetramethylammoniumchlorid enthält, gewaschen, gefolgt von einem neutralen Puffer, der Tween 80 enthält. Das gebundene gDCD4T wird aus der Säule mit einem Puffer bei einem pH von 3, der Tween 80 enthält (0,1 % (Gew./Vol.)), eluiert und wird sofort nach dem Eluieren neutralisiert. Das eluierte, neutralisierte gDCD4T wird dann durch Ultrafiltration konzentriert und dialysiert/diafiltriert, um den Puffer gegen eine physiologische Salzlösung, die Tween 80 zu etwa 0,1 % (Gew./Vol.) enthält, auszutauschen.
Falls das Detergens nicht vorhanden ist, bildet das gDCD4T Aggregate, wie dies durch die Fähigkeit der Zentrifugierung bei etwa 10.000 × g 2 Minuten lang gezeigt wird, um das gDCD4T aus der Lösung zu entfernen. Eine Inkubation von gDCD4T bei 4 °C in 0,1 M Natriumacetat, 0,5 M NaCl und 0,25 M Tris bei einem pH von 7 zusammen mit BSA, Tween 80 oder Glycerin als Kandidatenstabilisatoren zeigte, dass gDCD4T in Abwesenheit eines Stabilisators über einen Zeitraum von 12 Tagen nach und nach bis zu dem Punkt aggregierte, an dem lediglich etwa 60-70 % des Proteins löslich waren. Die Verwendung von 0,1 % (Gew./Vol.) Tween 80 oder 0,5 mg/ml BSA stellte jedoch sicher, dass etwa 100 % bzw. 80 % des gDCD4T über diesen Zeitraum löslich blieben. Überraschenderweise war Glycerin als Stabilisator nicht wirksam und ergab sogar schlechtere Resultate als die Kontrollgruppe – nach 8 Tagen waren etwa 80 % des gDCD4T aggregiert, wenn dieses in Gegenwart von Glycerin aufgewahrt wurde.
Beispiel 4
Es wurden Plasmide konstruiert, um die Expression von Proteinen zu steuern, die verschiedene Längen der extrazellulären aminoterminalen Domäne von CD4 enthielten, die an die konstante Region von menschlichem Immunglobulin γ1 fusioniert war. Diese Plasmide werden als pRKCD4₂γ₁, pRKCD4_e4γ₁, pRKCD4₂γ₁, pRKCD4_e2γ₁, pRKCD4₁γ₁ und pRKCD4_e1γ₁ bezeichnet.
Das Plasmid pRKCD4₄γ₁ enthält den Teil des CD4-Gens vom Initiationscodon bis zur Fusionsstelle nach dem Codon für den Serin-Rest 366 des reifen CD4-Polypeptids, unmittelbar gefolgt von der für die konstante Region des menschlichen Immunglobulins γ₁ kodierenden Sequenz, beginnend beim Codon für den Serin-Rest 114 des reifen menschlichen Immunglobulins γ₁ (Kabat et al.).
Das Plasmid pRKCD4_e4γ₁ enthält den Teil des CD4-Gens vom Initiationscodon bis zur Fusionsstelle nach dem Codon für den Lysin-Rest 360 des reifen CD4-Polypeptids, unmittelbar gefolgt von der für die konstante Region des menschlichen Immunglobulins γ₁ kodierenden Sequenz, beginnend beim Codon für den Serin-Rest 114 des reifen menschlichen Immunglobulins γ₁ (Kabat et al.).
Das Plasmid pRKCD4₂γ₁ enthält den Teil des CD4-Gens vom Initiationscodon bis zur Fusionsstelle nach dem Codon für den Glutamin-Rest 180 des reifen CD4-Polypeptids, unmittelbar gefolgt von der für die konstante Region des menschlichen Immunglobulins γ₁ kodierenden Sequenz, beginnend beim Codon für den Serin-Rest 114 des reifen menschlichen Immunglobulins γ₁ (Kabat et al.).
Das Plasmid pRKCD4_e2γ₁ enthält den Teil des CD4-Gens vom Initiationscodon bis zur Fusionsstelle nach dem Codon für den Leucin-Rest 177 des reifen CD4-Polypeptids, unmittelbar gefolgt von der für die konstante Region des menschlichen Immunglobulins γ₁ kodierenden Sequenz, beginnend beim Codon für den Serin-Rest 114 des reifen menschlichen Immunglobulins γ₁ (Kabat et al.).
Das Plasmid pRKCD4₁γ₁ enthält den Teil des CD4-Gens vom Initiationscodon bis zur Fusionsstelle nach dem Codon für den Asparaginsäure-Rest 105 des reifen CD4-Polypeptids, unmittelbar gefolgt von der für die konstante Region des menschlichen Immunglobulins γ₁ kodierenden Sequenz, beginnend beim Codon für den Serin-Rest 114 des reifen menschlichen Immunglobulins γ₁ (Kabat et al.).
Das Plasmid pRKCD4_e1γ₁ enthält den Teil des CD4-Gens vom Initiationscodon bis zur Fusionsstelle nach dem Codon für den Leucin-Rest 100 des reifen CD4-Polypeptids, unmittelbar gefolgt von der für die konstante Region des menschlichen Immunglobulins γ₁ kodierenden Sequenz, beginnend beim Codon für den Serin-Rest 114 des reifen menschlichen Immunglobulins γ₁ (Kabat et al.).
Die Konstruktion dieser Plasmide erforderte die vorausgehende Konstruktion des Plasmids pRKCD4TP/γ1. Dieses wurde wie folgt konstruiert:
Ein cDNA-Klon, der für das menschliche Immunglobulin γ1 kodiert, wurde aus einer menschlichen Milz-cDNA-Bibliothek (Clontech Laboratories, Inc.) unter Verwendung von Oligonucleotiden erhalten, die auf der veröffentlichten Sequenz basierten (Ellison et al., Nucl. Acids Res. 10, 4071-4079 [1982]), und ein EcoRI-EagI-Fragment (die EcoRI-Stelle wurde von einem Linker beigesteuert; siehe 4a, b), das einen Teil der variablen und die gesamte konstante Region enthielt, wurde erhalten. Dieses Fragment wurde mit einem Klenow-Fragment abgestumpft und mittels Gelelektrophorese (Fragment a1) gewonnen.
Das Plasmid pRKCD4TP-kk, das für eine Substitutionsvariante eines löslichen CD4 (Reste 1-368) kodiert, das einen Lysin-Rest anstelle eines Asparagins an Position 1 des reifen Polypeptids trägt, wurde mittels ortspezifischer Mutagenese aus dem Plasmid pRKCD4TP konstruiert. Ein synthetisches Oligonucleotid wurde als ein Primer für eine Mutagenesereaktion hergestellt, um die gewünschte kodierende Sequenz zu erhalten. Diese wurde als ein 51-mer synthetisiert, das zwei stille Mutationen aus der natürlichen Sequenz zusätzlich zu der Substitutionsmutation sowie 21 Basen auf jeder Seite der mutierten Codons enthielt:
5'-CCC TTT TTT GCC CAG CAC CAC CTT CTT GCC CTG-
AGT GGC TGC TGG GAG GAG-3'
Das Plasmid pRKCD4TP wurde in den E.-coli-Stamm SR101 transformiert, und die transformierten Kolonien wurden auf Ampicillin-Mediumplatten ausplattiert. Es wurden resistente Kolonien ausgewählt und in Gegenwart von m13K07-Helfer-Bakteriophagen kultiviert, um sekretierte, enkapsidierte, einzelsträngige Matrizen von pRKCD4TP zu erhalten. Die einzelsträngige Plasmid-DNA wurde isoliert und mit den oben beschriebenen synthetischen Oligonucleotiden als Primer als Matrize für Mutagenesereaktionen verwendet. Die Mutagenesereaktion wurde in E. coli SR101 transformiert, und die transformierte Kultur wurde auf Ampicillin-Mediumplatten ausplattiert. Die Transformanten wurden mittels Koloniehybridisierung (siehe Grunstein-Hogness) unter Verwendung des folgenden 16-mers als Sonde auf die Gegenwart der geeigneten Sequenz gescreent.
5'-C CAC CTT CTT GCC CTG-3'
Die ausgewählten Hybridisierungsbedingungen waren stringent genug, sodass die Sonde lediglich das korrekt fusionierte Produkt nachweist. Als positiv identifizierte Kolonien wurden ausgewählt, und die Plasmid-DNA wurde isoliert und in den E.-coli-Stamm SR101 transformiert. Die transformierten Kulturen wurden auf Ampicillin-Mediumplatten ausplattiert, und es wurden resistente Kolonien ausgewählt und in Gegenwart von m13K07-Bakteriophagen kultiviert. Matrizen wurden wie oben beschrieben hergestellt und mittels Sequenzierung gescreent.
Das Plasmid pRKCD4TP-kk wurde mit Xbal verdaut und mit dem Klenow-Enzym behandelt, und das Fragment a2, das das linearisierte Plasmid enthielt, wurde mittels Gelelektrophorese gewonnen und mit dem Fragment a1 ligiert. Das Ligationsgemisch wurde in den E.-coli-Stamm 294 transformiert, die transformierte Kultur wurde auf Ampicillin-Mediumplatten ausplattiert, und es wurden resistente Kolonien ausgewählt. Aus den Transformanten wurde Plasmid-DNA hergestellt und mittels Restriktionsanalyse auf die Gegenwart des korrekten Fragments in der korrekten Ausrichtung (d.h. die kodierende Region des Immunglobulins in der gleichen Ausrichtung wie die kodierende Region von CD4 sowie am 3'-Ende der kodierenden Region von CD4) untersucht. Dieses Plasmid wird als pRKCD4TP/γ1 bezeichnet.
Synthetische Oligonucleotide wurden als Primer für Deletionsmutagenesereaktionen hergestellt, um die geeigneten kodierenden Sequenzen von IgG1 und CD4 wie oben beschrieben zu fusionieren. Diese wurden als 48-mere, die 24 Nucleotide auf jeder Seite der gewünschten Fusionsstelle umfassen (d.h. entsprechend den 8 COOH-terminalen Resten der gewünschten CD4-Gruppierung sowie den 8 NH₂-terminalen Resten der gewünschten Immunglobulin-Gruppierung), synthetisiert. Das Plasmid pRKCD4TP/γ1 wurde in den E.-coli-Stamm SR101 transformiert, und die transformierten Kulturen wurden auf Ampicillin-Mediumplatten ausplattiert. Es wurden resistente Kolonien ausgewählt und in Gegenwart von m13K07-Helfer-Bakteriophagen kultiviert, um sekretierte, enkapsidierte, einzelsträngige Matrizen von pRKCD4TP/γ1 zu erhalten. Die einzelsträngige Plasmid-DNA wurde isoliert und mit den oben beschriebenen synthetischen Oligonucleotiden als Primer als Matrize für Mutagenesereaktionen verwendet. Die Mutagenesereaktionen wurden in E. coli SR101 transformiert, und die transformierte Kultur wurde auf Ampicillin-Mediumplatten ausplattiert.
Die Transformanten wurden mittels Koloniehybridisierung (siehe Grunstein-Hogness) unter Verwendung von 16-meren als Sonden auf die Gegenwart der geeigneten Fusionsstelle gescreent. Die 16-mere umfassen 8 Basen an jeder Seite der Fusionsstelle, und die ausgewählten Hybridisierungsbedingungen waren stringent genug, sodass die Sonden lediglich das korrekt fusionierte Produkt nachweisen. Als positiv identifizierte Kolonien wurden ausgewählt, und die Plasmid-DNA wurde isoliert und in den E.-coli-Stamm SR101 transformiert. Die transformierten Kulturen wurden auf Ampicillin-Mediumplatten ausplattiert, und es wurden resistente Kolonien ausgewählt und in Gegenwart von m13K07-Bakteriophagen kultiviert. Matrizen wurden wie oben beschrieben hergestellt und mittels Sequenzierung gescreent.
Die Plasmide wurden unter Verwendung von Standardverfahren in 293-Zellen transfiziert und wie oben beschrieben auf Expression und Produktion getestet.
Es wurden ebenfalls Plasmide konstruiert, um die Expression von Fusionsproteinen zu steuern, die verschiedene Längen der aminoterminalen extrazellulären Domäne von CD4 enthielten, die an den trunkierten Teil der konstanten Region des menschlichen Immunglobulins γ1 fusioniert sind, und lediglich die Gelenkregion und die konstanten Domänen CH₂ und CH₃ umfassen.
Synthetische Oligonucleotide wurden als Primer für Mutagenesereaktionen hergestellt, um die Immunglobulinsequenz von Ser114 bis Cys215 (inklusive) zu deletieren (Kabat et al.). Diese wurden als 48-mere, die 24 Nucleotide auf jeder Seite der ge wünschten Fusionsstelle umfassen (d.h. entsprechend den 8 COOH-terminalen Resten der gewünschten CD4-Gruppierung sowie den 8 NH₂-terminalen Resten der gewünschten Immunglobulin-Gruppierung), synthetisiert. Die Plasmide pRKCD4₄γ₁, pRKCD4₂γ₁ und pRKCD4₁γ₁ wurden getrennt voneinander in den E.-coli-Stamm SR101 transformiert, und die transformierte Kultur wurde auf Ampicillin-Mediumplatten ausplattiert. Es wurden resistente Kolonien ausgewählt und in Gegenwart von m13K07-Helfer-Bakteriophagen kultiviert, um sekretierte, enkapsidierte, einzelsträngige Matrizen dieser Plasmide zu erhalten. Die einzelsträngige Plasmid-DNA wurde isoliert und mit den oben beschriebenen synthetischen Oligonucleotiden als Primer als Matrize für Mutagenesereaktionen verwendet. Die Mutagenesereaktionen wurden in E. coli SR101 transformiert, und die transformierte Kultur wurde auf Ampicillin-Mediumplatten ausplattiert. Die Transformanten wurden mittels Koloniehybridisierung (Grunstein-Hogness) unter Verwendung von 16-meren als Sonden auf die Gegenwart der geeigneten Fusionsstelle gescreent. Diese 16-mere umfassen 8 Basen an jeder Seite der Fusionsstelle, und die ausgewählten Hybridisierungsbedingungen waren stringent genug, sodass die Sonden lediglich das korrekt fusionierte Produkt nachweisen. Als positiv identifizierte Kolonien wurden ausgewählt, und die Plasmid-DNA wurde isoliert und in den E.-coli-Stamm SR101 transformiert. Die transformierten Kulturen wurden auf Ampicillin-Mediumplatten ausplattiert, und es wurden resistente Kolonien ausgewählt und in Gegenwart von m13K07-Bakteriophagen kultiviert. Matrizen wurden wie oben beschrieben hergestellt und mittels Sequenzierung gescreent.
Das vom Plasmid pRKCD4₄γ₁ abstammende Plasmid wird als pRKCD4_4Fc1 bezeichnet, jenes, das vom Plasmid pRKCD4_2γ1 abstammt, wird als pRKCD4_2Fc1 bezeichnet und jenes, das vom Plasmid pRKCD4_1γ1 abstammt, wird als pRKCD4_1Fc1 bezeichnet.
pRKCD4_2Fc1, pRKCD4_1Fc1 und pRKCD4_4Fc1 werden auf dieselbe Art und Weise wie oben beschrieben kultiviert, und die CH1-deletierten CD4-Immunadhesone werden wie hierin anderorts beschrieben gewonnen.
Leichtkettenfusionen
Es wurden Plasmide konstruiert, um die Expression von Proteinen zu steuern, die verschiedene Längen der aminoterminalen extrazellulären Domäne von CD4 enthielten, die an die konstante Region des menschlichen Immunglobulins κ fusioniert ist. Diese Plasmide werden als pRKCD4₄κ und pRKCD4_e4κ bezeichnet.
Das Plasmid pRKCD4₄κ enthält den Abschnitt des CD4-Gens vom Initiationscodon bis zur Fusionsstelle nach dem Codon für den Serin-Rest 366 des reifen CD4-Polypeptids, unmittelbar gefolgt von der Sequenz für die konstante Region des menschlichen Immunglobulins κ, beginnend beim Codon für den Threonin-Rest 109 des reifen menschlichen Immunglobulins κ (Kabat et al.).
Das Plasmid pRKCD4_e4κ enthält den Teil des CD4-Gens vom Initiationscodon bis zur Fusionsstelle nach dem Codon für den Lysin-Rest 360 des reifen CD4-Polypeptids, unmittelbar gefolgt von der Sequenz für die konstante Region des menschlichen Immunglobulins κ, beginnend beim Codon für den Threonin-Rest 109 des reifen menschlichen Immunglobulins κ (Kabat et al.).
Diese Plasmide wurden analog zu den oben beschriebenen Plasmiden pRKCD4₄γ₁ und pRKCD4_e4γ₁ konstruiert, jedoch mit folgender Ausnahme:
Die kodierende Sequenz des menschlichen Immunglobulins κ (5) wurde aus einer menschlichen Milz-cDNA-Bibliothek (Clontech Laboratories, Inc.) unter Verwendung von Oligonucleotiden erhalten, die auf der veröffentlichten Sequenz basierten (P.A. Hieter et al., Cell 22, 197-207 [1980]), und ein EcoRI-BspMI-Fragment, das einen Teil der variablen Region und die gesamte konstante Region enthielt, wurde erhalten (siehe 5). Dieses Fragment wurde mit einem Klenow-Fragment und den vier dNTPs abgestumpft. Dieses Fragment wurde anstelle des Fragments a1 verwendet und wurde benutzt, um das Plasmid pRKCD4TP/hκ zu erhalten.
Expression in CHO-Zellen
Plasmide wurden oder werden konstruiert, um die Expression der oben beschriebenen Immunadhesone in CHO-Zellen zu steuern. Sie werden als pSVeCD4₄γ₁SVDHFR, pSVeCD4₂γ₁SVDHFR, pSVeCD4₁γ₁SVDHFR, pSVeCD4_e4γ₁SVDHFR, pSVeCD4_e2γ₁SVDHFR, pSVeCD4_e1γ₁SVDHFR, pSVeCD4_4Fc1SVDHFR, pSVeCD4_2Fc1SVDHFR, pSVeCD4_1Fc1SVDHFR, pSVeCD4₄κSVDHFR und pSVeCD4₂κSVDHFR bezeichnet.
Fragment 31 wurde wie oben beschrieben hergestellt. Fragment 32a wurde durch den Verdau des Plasmids pE348HBV.E400 D22 mit BamHI, Abstumpfen mit dem Klenow-Fragment und den vier dNTPs und darauf folgendem Verdau mit PvuI und Isolation des großen Fragments hergestellt, das den Rest des β-Lactamase-Gens und den frühen Promotor von SV40 sowie das DHFR-Gen enthielt. Die Plasmide pRKCD4₄γ₁, pRKCD4₂γ₁, pRKCD4₁γ₁, pRKCD4_e4γ₁, pRKCD4_e2γ₁, pRKCD4_e1γ₁, pRKCD4_4Fc1, pRKCD4_2Fc1, pRKCD4_1Fc1, pRKCD4_4κ und pRKCD4_2κ wurden getrennt voneinander mit HindIII verdaut, mit dem Klenow-Fragment und den vier dNTPs abgestumpft, dann mit EcoRI verdaut, und die für das CD4-Ig-Fusionsprotein kodierenden Fragmente wurden isoliert. Die resultierenden DNA-Fragmente wurden mit den Fragmenten 31 und 32a zusammen ligiert und in den E.-coli-Stamm 294 transformiert. Kolonien wurden ausgewählt und wie oben auf die Gegenwart des korrekten Plasmids untersucht, dann in CHO-Zellen transfiziert und durch Methotrexatselektion unter Verwendung konventioneller Verfahren amplifiziert.
Beispiel 5
Kultivierung, Reinigung und Formulierung von CD4-Varianten
Für lösliche CD4-Adhesone, wie z.B. CD4T, CD4TP, oder lösliche CD4-Immunadhesone kodierende Plasmide wurden in CHO-DP7 (eine proinsulintransformierte, autokrine Wirtszelle, die von CHO abstammt; U.S.S.N. 97.472) calci umphosphat-transfiziert, und die Transformanten wurden in selektivem Medium (1:1 HAM F12/DMEM GHT^-, das 1–10 % diafiltriertes oder dialysiertes Rinderserum enthielt) kultiviert. Andere geeignete Wirtszellen sind CHO-Zellen oder menschliche embryonale 293S-Nierenzellen. Die Transformanten wurden durch Methotrexatselektion im selben Medium, das jedoch 500 nm Methotrexat enthielt, amplifiziert. Es wurde ein Subklon ausgewählt, der fähig war, CD4TP, CD4tp 500 b zu sekretieren. CD4tp 500 b wird in einem DMEM/HAM-F12-Medium bei etwa 37 °C kultiviert, bis das CD4TP in der Kultur akkumuliert, wonach das Medium von den Zellen und von unlöslichen Stoffen durch Zentrifugieren getrennt wird.
Kulturfluid von CD4TP-Transformanten wurde konzentriert und diafiltriert, um die Ionenstärke zu reduzieren. Das Konzentrat wurde durch eine große Menge an Q-Sepharose-Anionenaustauschharz (zuvor mit 25 mM NaCl, pH 8,5, äquilibriert) laufen gelassen, um verunreinigende Stoffe aus der Kulturflüssigkeit zu adsorbieren. Der isoelektrische Punkt von CD4TP liegt bei etwa 9,5, was eine Unterscheidung zwischen den trunkierten Formen von CD4 und den meisten Verunreinigungen aufgrund von unterschiedlicher Adsorption auf einem Kationenaustauschharz, wie z.B. Carboxymethyl- oder Sulfonylsepharose, bzw. einem Anionenaustauschharz, wie z.B. quaternäre Ammoniumsepharose, ermöglicht. Zusätzlich wird, da hochgradig elektropositive Domänen im extrazellulären Segment von CD4 vorhanden sind, jede CD4-haltige Variante auf dieselbe Art und Weise wie CD4TP gereinigt. Die nicht adsorbierte Kulturflüssigkeit aus dem Anionenaustauschharz involvierenden Schritt wurde dann durch ein Kationenaustauschharz (zuvor mit 25 mM NaCl, pH 8,5, äquilibriert) laufen gelassen, wodurch CD4TP an das Harz adsorbiert wurde. Das CD4TP wurde mit einem NaCl-Gradienten bei einem pH von 8,5 eluiert, wobei diese CD4-Variante bei etwa 0,2 M NaCl eluiert. Ammoniumsulfat wurde zu dem Eluat bis zu einer Konzentration von 1,7 M hinzugefügt, und die Lösung wurde durch eine Säule aus hydrophobem Wechselwirkungschromatographieharz (Phenyl- oder Butylsepharose) laufen gelassen. Das CD4TP wurde aus der hydrophoben Wechselwirkungssäule mit einem Gradienten aus Ammoniumsulfat eluiert, wobei das CD4TP bei etwa 0,7 M Ammoniumsulfat austrat. Das Eluat wurde konzentriert, und der Puffer wurde auf einer G-25-Säule unter Verwendung von phosphatgepufferter Salzlösung, die 0,02 % (Gew./Vol.) Tween 20 oder Tween 80 enthielt, ausgetauscht. Das CD4TP war löslich und stabil in dieser Lösung, die sterilfiltriert war und als wässrige Formulierung in Phiolen gefüllt wurde. Andere polymere, nichtionische Tenside werden geeigneterweise mit den CD4-Formulierungen verwendet, unter anderem Pluronic-Block-Copolymere oder Polyethylenglykol.
Es ist ebenso möglich, eine Immunaffinitätsreinigung von löslichem CD4 durchzuführen, wobei das CD4 an einen immobilisierten Antikörper gegen CD4 adsorbiert wird. Dieses Verfahren leidet unter dem Nachteil, dass eine Elution des löslichen CD4 unter sauren Bedingungen zu einer Proteinaggregation führt, die lediglich bei relativ hohen Tensidmengen weitgehend zurückgeht. Das vorhergehende Verfahren ermöglicht die Verwendung von viel geringeren Tensidmengen, etwa von 0,01 bis 0,10 (Gew./Vol.) Tensid.
Das angewandte Verfahren für die Reinigung von CD4-Fusionen mit Immunglobulin-Schwerketten bestand in der Konzentration rekombinanter Überstände mittels Ultrafiltration und darauf folgender Adsorption der Fusion an harz-immobilisiertem Staphylokokken-Protein A. Die Fusion wurde mit 0,1 M Citratpuffer mit einem pH von 3 ohne Salz oder Detergens eluiert. Dieses Präparat wird in Tris-Puffer bei einem pH von 7,5 gepuffert. Die Immunglobulin-Fusionen mit V1-V4 von CD4 werden gegebenenfalls durch das oben für nicht fusionierte CD4-Varianten beschriebene Verfahren weiter gereinigt. CD4-Immunglobulin-Fusionen mit V1-V4 von CD4 können ebenfalls durch das oben beschriebene Verfahren gereinigt werden, jedoch mit der Ausnahme, dass nicht erwartet wird, dass der isoelektrische Punkt dieser Molekülklasse so alkalisch ist wie jener der Arten, die alle vier V-Regionen von CD4 enthalten.
Beispiel 6
Es wurden die Merkmale mehrerer Adhesonvarianten bestimmt. Wie in Tabelle 4 gezeigt wird, zeigen die Immunadhesone CD4₄γ₁ und CD4₂γ₁ eine verbesserte Plasmahalbwertszeit in Kaninchen, gekoppelt mit hochaffiner gp120-Bindung und einer Affi nität zum Fcγ-Rezeptor (bestimmt durch U937-Zellen), die mit der des Hauptteils des menschlichen IgG1 vergleichbar ist. Tabelle 4

* in Menschen bestimmt
+ KD wurde durch das Verfahren von Anderson et al., J. Immunol. 125, 2735-2741 (1980), bestimmt.
# durch das Verfahren von Smith et al., Science 238, 1704-07 (1987), bestimmt.
§ nur Reste 1-368
++ Die Adhesonvariante wurde Kaninchen intravenös injiziert, und es wurden in regelmäßigen Abständen Blutproben genommen und auf die Gegenwart der Adhesonvariante getestet.
** nicht durchgeführt

Claims

Immunglobulinschwerkettendimer, in dem die Sequenz der extrazellulären Domäne eines Zelloberflächenelements der Immunglobulin-Genüberfamilie, wobei das Überfamilienelement kein Klasse-I- oder Klasse-II-Haupthistokompatibilitäts-Antigen, Immunglobulin oder T-Zell-Rezeptor-α-, -β-, y- oder δ-Kette ist, anstelle der variablen Region einer Immunglobulinschwerkette ersetzt ist, wobei das Dimer ein Polypeptid umfasst, das die extrazelluläre Domäne, fusioniert an eine konstante Immunglobulinschwerkettenregion umfasst, und wobei die extrazelluläre Domäne in diesem Dimer einen Liganden des obigen Elements der Immunglobulingen-Überfamilie bindet, zur Verwendung in einem therapeutischen Verfahren zur Behandlung eines Patienten.
Immunglobulinschwerkettendimer nach Anspruch 1, das für den Liganden bivalent ist.
Immunglobulinschwerkettendimer nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin die Immunglobulinsequenz aus IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgD oder IgM erhalten ist.
Immunglobulinschwerkettendimer nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin das Überfamilienelement CD1, CD2, CD3, CD4, CD8, CD8, OX-2, Thy-1, ein interzelluläres oder neuronales Adhäsionsmolekül, Poly-Ig-Rezeptor, myelinassoziiertes Glykoprotein, hochaffiner IgE-Rezeptor, von Blutplättchen stammender Wachstumsfaktorrezeptor, Koloniewachstum stimulierender Faktor-1-Rezeptor, Fc-γ-Rezeptor oder das karzinoembryonale Antigen ist.
Immunglobulinschwerkettendimer nach Anspruch 4, worin das Überfamilienelement CD2, CD4, CD8, CD28, die γ-, δ- oder ε-Kette von CD3 oder der hochaffine IgE-Rezeptor ist.
Immunglobulinschwerkettendimer nach Anspruch 5, worin die Überfamilie CD4 ist.
Immunglobulinschwerkettendimer nach Anspruch 1, worin die V₁-Domäne von CD4 oder CD4, dem die Transmembrandomäne und zytoplasmatische Domäne fehlt, an ihrem/seinem C-Terminus an die konstante Region fusioniert ist.