DE3875752T2

DE3875752T2 - Verfahren zur herstellung von aktivierten toetenden zellen.

Info

Publication number: DE3875752T2
Application number: DE8888101138T
Authority: DE
Inventors: Joseph David Irr
Original assignee: Terumo Corp
Current assignee: Terumo Corp
Priority date: 1987-01-29
Filing date: 1988-01-27
Publication date: 1993-04-22
Anticipated expiration: 2008-01-28
Also published as: EP0280054B1; AU1076188A; JPS63202378A; ES2052611T3; KR880009123A; AU609768B2; IL85238A0; ZA88656B; CA1300058C; DE3875752D1; EP0280054A1; NZ223326A; IL85238A; ATE82319T1; DK42188A; KR900004421B1; JPH06104060B2; IE880224L; DK42188D0

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung bezieht sich auf ein verfahren zur Herstellung aktivierter Killer-Zellen, insbesondere lymphokin-aktivierte Killer- (LAK) Zellen.

Beschreibung der verwandten Technik

Rayner et al., Cancer 55, 1327-1333 (1985) offenbaren, daß lymphokin-aktivierte Killer- (LAK) Zellen durch Inkubieren von Lymphozyten aus frischem peripherem Blut in interleukin-2 gewonnen werden können. Die Autoren offenbaren, daß LAK-Zellen frische autologe und allogene menschliche Tumorzellen in vitro töten. Die LAK-Zellen können aus Lymphozyten aus peripherem Blut normaler Individuen und tumortragender Patienten gewonnen werden. Sie berichten, daß reines, rekombinantes interleukin-2 (rIL-2) LAK-Zellen erzeugt, welche befähigt sind, eine breite Vielfalt von Tumoren einschließlich Sarkome und Darm-, Pankreas-, Nebennierendrüsen- und speiseröhren-Krebs zu töten. Sie berichten, daß die Verwendung von LAK-Zellen, möglicherweise mit der systemischen Verabreichung von rIL-2, einen vielversprechenden zukünftigen Weg zur Immuntherapie menschlichen Krebses darstellt. Die Literaturstelle offenbart die Aktivierung der Lymphozyten aus peripherem Blut in 25 cm²-Kolben mit einer Zellkonzentration von 10&sup6; Zellen/ml über 5 Tage in 5% CO&sub2; bei 37ºC.
Rosenberg et al., The New England Journal of Medicine 313, 1485-1492 (1985), offenbaren vorläufige Ergebnisse der systemischen Verabreichung autologer lymphokin-aktivierter Killer- Zellen und rIL-2 an Patienten mit fortgeschrittenem Krebs. Sie behandelten 25 Patienten mit metastasiertem Krebs, bei welchen eine Standardtherapie versagt hatte. Eine objektive Rückbildung (mehr als 50 Volumenprozent) wurde in 11 der 25 Patienten beobachtet. Eine vollständige Tumorrückbildung trat in einem Patienten mit metastatischem Melanom auf und war bis 10 Monate nach der Therapie aufrecht erhalten worden. Die Literaturstelle offenbart die Aktivierung oder das Kultivieren der Zellen in 2,5 Liter-Rollflaschen mit einer Zellkonzentration von 1,5x10&sup6; Zellen/ml über 3-4 Tage bei 37ºC. Patienten wurden init bis zu etwa 2x10¹¹ LAK-Zellen infundiert.
Rosenberg et al., Science 233, 131B-1321 (1986), offenbaren, daß die angenommene Übertragung in interleukin-2 expandierter tumor-infiltrierender Lymphozyten (TIL) auf Mikrometastasen aus verschiedenen Tumortypen tragende Mäuse zeigte, daß TIL in ihrer therapeutischen Stärke 50 bis 100 mal wirksamer als LAK-Zellen sind. Die TAL wurden hergestellt durch aseptisches Ernten von Tumoren und deren Zerschneiden in 1-2 mm-Stücke, welche darauf in 40 inl einer festgesetzten Kochsalzlösung gerührt wurden, um eine Zellsuspension zu erhalten, welche filtriert, gewaschen und in einem kompletten, rIL-2 enthaltenden Medium suspendiert wurden, bis eine etwa 100-fache Zunahme der ursprünglichen Zellen erhalten wurde.
Das US-Patent 3 928 294, erteilt am 23. Dezember 1975 an Crawford et al., offenbart einen durchlässigkeitsselektiven, bioverträglichen Membranartikel mit hoher Gasdurchlässigkeit, wobei die Membrane aus einem aus der Reihe der C&sub8;-C&sub1;&sub8;-alpha- Olefine und Schwefeldioxid abgeleiteten Poly(alpha-Olefin-Sulfon) besteht, und die Membrane eine Sauerstoffübertragungsrate von etwa 1 bis 4x10&sup4; cc mil/in² yr atm und eine CO&sub2;-Übertragungsrate von etwa 4 bis 17x10&sup4; cc mil/in² yr atm besitzt. Gegenstände, welche aus dem Membranmaterial hergestellt werden können, schließen Blutlagerbeutel ein.
Das belgische Patent 862 772 offenbart eine medizinische Vorrichtung, worin wenigstens der Teil, welcher mit einer Körperflüssigkeit und/oder einem flüssigen Arzneimittel in Berührung kommt, aus einem Copolymer gefertigt wird, welches zu 20 bis 75% durch Bestrahlung vernetzt ist und eine festgesetzte Formel besitzt. Das Copolymer wird durch Polymerisation eines Esters mit einem Acryl-Rest und einer Ethylen-Verbindung, beide mit einer festgesetzten Formel, hergestellt. Eingeschlossen in die offenbarten Vorrichtungen ist eine Blutflasche. Das Patent ist auf Materialien mit niedriger Gasdurchlässigkeit gerichtet.
Die US-Patente 4 496 361 und 4 588 401, erteilt an Kilkson am 29. Januar 1985 beziehungsweise 13. Mai 1986, offenbaren einen aus einem copolymeren Filmmaterial gefertigten Plättchenaufbewahrungsbehälter, welcher bei niedriger Temperatur heißversiegelt werden kann, mit
einer Sauerstoffdurchlässigkeit von etwa 1,8x105 um3 (STP)/(m².s.Pa) [100 cc (STP)/(24 h-atm-100 in²)],
einer Kohlendioxiddurchlässigkeit von etwa 4,4x10&sup5; bis etwa 8,Ox10&sup5; um³ (STP)/(m².s.Pa) [250 bis etwa 450 cc (STP)/(24 h-atm-100 in²)],
einer Zugfestigkeit von wenigstens etwa 8 mPa,
einer Dichtfestigkeit von wenigstens etwa 1000 g/cm,
einer genügend niedrigen Steifheit, so daß der Behälter durch Flüssigkeit bis zu einem Fassungsvermögen von etwa 275 ml erweitert werden kann,
einer genügenden Haltbarkeit, um einen Fallbolzenwert von wenigstens 100 zu liefern, und einer Dicke von etwa 0,08 mm bis etwa 0,23 mm.
Blut wird bei 4ºC gelagert und Blättchen werden bei etwa 22ºC gelagert.
Die GB-Patentanmeldungsveröffentlichung 2 065 067 offenbart einen Beutel zur Verwendung beim Einfrieren physiologischer Lösungen, Nahrungsmittel oder Chemikalien, welcher einen laminierten heißversiegelten Bogen zum Bilden eines Beutels enthält, wobei der Bogen eine innere Schicht aus ungestrecktem Film aus einem ungeordneten Copolymer eines α-Olefins mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht über 1x10&sup4; mit einer Dichte von weniger als 0,936 und mit 4 bis 18 Kohlenstoffatomen und eine äußere Schicht aus einem hitzebeständigen polymerisierten Film, dessen Glasübergangstemperatur über Raumtemperatur liegt, umfaßt. Das α-Olefin kann neben anderen 1-Buten, 4-Methyl-1-penten oder 1-Octen sein und die äußere Schicht kann Materialien wie ein Ethylen-Tetrafluorethylen-Copolymer sein.
Im Bemühen, LAK-Zellen, TIL und rTL-2 als angenommene Immuntherapien bei Krebs weiter zu untersuchen und zu verfeinern, sind Verbesserungen, welche die Aktivierung bei einer höheren Zellenkonzentration gestatten, oder eine auf andere Weise erhöhte Anziehungskraft der Therapien höchst wünschenswert. Zum Beispiel würde das Kultivieren bei einer Konzentration von etwa 1,5x10&sup6; Zellen/ml, wenn etwa 1,8x10¹&sup0; bis 1,8x10¹¹ Zellen benötigt werden, Gesamtkulturvolumina von etwa 12 bis 120 l erfordern. Die Vorteile einer Technik, welche die Verwendung merklich niedriger Volumina erlaubte, sind augenfällig.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung stellt ein verbessertes Verfahren zur Herstellung lymphokin-aktivierter Killer- (LAK) Zellen oder TIL bereit. In einem Verfahren, in dem mononukleäre Zellen aus peripherem Blut oder Lymphozyten aus Tumorgewebe kultiviert werden, um eine Zellpopulation zu erzeugen, welche cytotoxisch für Tumorzellen sind, die gegenüber natürlichen Killerzellen resistent sind, besteht die Verbesserung darin, eine Zellpopulation zu kultivieren, welche aus der aus mononukleären Zellen aus peripherem Blut, daraus resultierenden Lymphozyten aus peripherem Blut und aus Tumorgewebe erhaltenen Lymphozyten bestehenden Gruppe ausgewählt sind, in einem geschlossenen Behälter, welcher aus einem copolymeren Filmmaterial mit einer sauerstoffdurchlässigkeit von wenigstens etwa 1,8x10&sup5; um³ (STP)/(m².s.Pa) und einer Dicke von etwa 0,04 mm bis etwa 0,23 mm hergestellt ist, wobei das Material aus der aus
a) Copolymeren aus Ethylen und einem α-Olef in mit 4 bis 10 Kohlenstoff-Atomen mit einer Dichte von etwa 0,915 bis 0,925 g/cm³;
b) Copolymeren aus Ethylen und Methacrylsäure;
c) Ionomeren; und
d) Laminaten oder Co-Extrudaten eines Ionomer/Polyester-Elastomers und eines Elastomers aus linearem Polyethylen niedriger Dichte
bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Wie hierin verwendet bedeutet "Interleukin-2" (IL-2) menschliches Interleukin-2, welches ein Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von etwa 15 000 Dalton ist und aus einem eine Disulfidbrücke enthaltenden Polypeptid mit 133 Aminosäuren besteht. Der wie hierin gebrauchte Ausdruck schließt natürliches und rekombinantes Interleukin-2 (rIL-2) und deren biologisch gleichwertige funktionellen Äquivalente ein. "Biologisch funktionelle Äquivalente" bedeutet Polypeptide mit derselben oder sehr ähnlichen biologischen Wirksamkeit, wie etwa im US- Patent 4 518 584 beschriebene rIL-2-Muteine und rIL-2-Proteine mit einem das in nativem IL-2 gefundene, NH&sub2;-terminale Alanin ersetzenden Methionin. Die Offenbarung des US-Patents 4 518 584 ist bezüglich rIL-2-Muteine hierin durch Verweis inbegriffen. Diese Muteine sind rIL-2-Moleküle, in welchen das Cystein in Stellung 125, numeriert in Übereinstimmung mit nativem menschlichem IL-2, ausgelassen oder durch eine neutrale Aminosäure ersetzt ist und das Mutein die biologische Wirksamkeit von nativem menschlichem IL-2 zeigt.
"Lymphokin-aktivierte Killer- (LAK) Zellen" bedeutet eine cytotoxische Population von Zellen, welche in der Lage sind, autologe Tumorzellen und gegenüber natürlichen Killer- (NK) Zellen resistente Tumor-Zellinien zu lysieren und welche im allgemeinen durch Kultivieren mononukleärer Zellen aus peripherem Blut mit Interleukin-2 hergestellt werden.
"Lymphozyten aus peripherem Blut" bedeutet mononukleäre Zellen aus peripherem Blut, welche an Monozyten abgereichert worden sind.
"Niederalkyl" bedeutet Alkyl mit 1-4 Kohlenstoff-Atomen.
"Copolymeres Filmmaterial" bedeutet ein Filmmaterial, in welchem jede Schicht aus einem einzigen Copolymer oder Homopolymer hergestellt ist und wenigsten eine Schicht aus einem einzigen Copolymer hergestellt ist.
"STP" bedeutet Standardbedingungen von Temperatur und Druck.
"RMPI 1640" bezieht sich auf ein Kulturmedium, welches in der Technik wohlbekannt ist und dessen Zusammensetzung in "Culture of Animal Cells", Freshney, 72-73, Alan R. Liss, Inc., N.Y. angegeben ist.
Das Verfahren der Erfindung erlaubt die LAK-Zellenaktivierung bei Konzentrationen bis zu etwa 5x10&sup7; Zellen/ml ohne Veränderung des Ausmaßes oder des Bereichs der LAK-Zellaktivität.
Bei diesen Zellkonzentrationen kann die zur angenommenen Immuntherapie erforderliche LAK-Zellenzahl mit Kulturvolumina von etwa 0,2 bis 2 l erhalten werden. Obwohl die Erfindung unter Bezug auf menschliche mononukleäre Zellen aus peripherem Blut genau beschrieben ist, versteht es sich, daß sich die Erfindung auf die entsprechenden Zellen anderer Säuger richtet. Vorzugsweise wird das Verfahren der Erfindung mit menschlichen Zellen angewandt. Das Verfahren der Erfindung ist auch zur TIL-Aktivierung nützlich.
Für das Verfahren der Erfindung benötigte mononukleäre Zellen aus peripherem Blut (PBMC) werden durch wiederholte Leukapherese mittels in der Technik wohlbekannter Verfahren unter Sammeln von bis zu 5x10¹&sup0; mononukleären Zellen erhalten. Im allgemeinen wird Blut einem menschlichen Spender intravenös entnommen und in ein Gerät überführt, welches mononukleäre Zellen von roten Blutzellen, Plättchen und Plasma trennt, wobei letztere Bestandteile dem Spender wieder zurückgegeben werden. Die mononukleären Zellen werden in einem Plastikbeutel gesammelt. Die so erhalten PBMC werden durch eine Ficoll-Hypaque-Dichtegradiententrennung fraktioniert. Die Zellen werden anschliessend mit einer geeigneten Salzlösung, wie etwa Hanks ausgeglichener Salzlösung (HBSS), welche von Gibco, Grand Island, NY, erhältlich ist, gewaschen, und darauf in einem geeigneten Medium resuspendiert, wie etwa RPMI 1640-Medium, welches ebenfalls von Gibco erhältlich ist, das mit 1 mM L-Glutamin-Lösung, 1% Penicillin-Streptomycin-Lösung, 1% Gentamycin-Lösung und 2-10% hitzeinaktiviertem zusammengefaßtem Humanserum (HIS) ergänzt ist (Prozentwerte sind V/V, solange nicht anders angegeben).
Die resuspendierten PBMC werden vorzugsweise vor der Dichtegradiententrennung mit einem L-Aminosäureniederalkylester oder dessen Chlorwasserstoffsalz behandelt. Diese wahlweise Behandlung kann auch nach der Dichtegradiententrennung ausgeführt werden. Geeignete L-Aminosäureniederalkylester sind jene, in
welchen die Aminosäure aus Phenylalanin, Glutaminsäure, Glutamin und Tyrosin ausgewählt ist. Vorzugsweise ist die L-Aminosäure phenylalanin oder Tyrosin und am bevorzugtesten Phenylalanin. Die Niederalkyl-Gruppe kann Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl oder t-Butyl sein, ist aber vorzugsweise Methyl oder Ethyl und am bevorzugtesten Methyl. Die PBMC können in irgendeinem geeigneten Medium, wie etwa serumlosem RPMI 1640 oder HBSS ohne Ca und Mg resuspendiert werden, das letztere ist aber bevorzugt. Vorzugsweise wird das Chlorwasserstoffsalz des L-Aminosäureniederalkylesters in RPMI gelöst und der pH der sich daraus ergebenden Lösung wird vor der Zugabe der sich daraus ergebenden Lösung zur PBMC-Suspension auf etwa 7,4 gestellt. Der Aminosäureniederalkylester liegt in einer Konzentration von etwa 1 mM bis etwa 5 mM (beruhend auf dem Gesamtvolumen der vereinigten PBMC-Suspension und der Aminosäureniederalkylester-Lösung Das Zusammenbringen von PBMC und Ester wird vorzugsweise bei einer Temperatur von 20ºC bis etwa 25ºC durchgeführt. Die Behandlung der PBMC mit dem L-Aminosäureniederalkylester bewirkt eine Abreicherung der Monozyten und verleiht dem LAK-Zellenendprodukt auch eine erhöhte Aktivität nach dem Kultivieren mit IL-2 bei einer höheren Zellkonzentration. Diese Behandlung mit einem L-Aminosäureniederalkylester wird in der korrespondierenden US-Patentanmel dung Seriennummer 868 697, am 30. Mai 1986 angemeldet, des Anmelders weiter beschrieben, welche hierin durch Verweis mit inbegriffen ist. Monozyten können auch von PBMC mittels herkömmlicher Techniken, wie etwa dem Durchlauf der PBMC über Glasperlen abgereichert werden. Die sich daraus ergebenden, auf diese Weise erhaltenen Lymphozyten aus peripherem Blut werden darauf vorzugsweise wie vorstehend angegeben mit dem Aminosäureniederalkylester behandelt.
In dem Verfahren der Erfindung werden die mononukleären Zellen aus peripherem Blut oder die daraus folgenden Lymphozyten aus peripherem Blut mit IL-2 über einen Inkubationszeitraum von etwa 2 bis 7 Tagen, vorzugsweise etwa 3 bis 5 Tage, vorzugsweise bei einer Temperatur von etwa 35ºC bis etwa 39ºC, am bevorzugtesten 37ºC, kultiviert. Das Kultivieren wird in einem geschlossenen, aus einem copolymeren Filmmaterial mit einer Sauerstoffdurchlässigkeit von wenigstens etwa 1,8x10&sup5; um³ (STP)/(m².s.Pa) [100 cc (STP)/(24 h-atm-100 in²)] und einer Dicke von etwa 0,04 mm bis etwa 0,23 mm gefertigten Behälter ausgeführt. Das copolymere Material wird aus der aus
a) Copolymeren aus Ethylen und einem α-Olefin mit 4 bis 10 Kohlenstoff-Atomen mit einer Dichte von etwa 0,915 bis 0,925 g/cm³ (einem sogenannten linearen Polyethylen niedriger Dichte); typische α-Olefine schließen 1-Buten, Hexen, 1-Octen und 1-Decen ein;
b) Copolymeren aus Ethylen und Methacrylsäure Ionomeren, wie etwa mit Natrium oder Zink neutralisierten Copolymeren aus Ethylen und Acryl- oder Methacrylsäure oder deren Derivaten; und
d) Laminaten oder Co-Extrudaten eines Ionomer/Polyester-Elastomers und eines Elastomers aus linearem Polyethylen niedriger Dichte
bestehenden Gruppe ausgewählt. Vorzugsweise ist das copolymere Filmmaterial ein Copolymer aus Ethylen und einem α-Olefin mit 4-10 Kohlenstoff-Atomen mit einer Dichte von etwa 0,915 bis 0,925 g/cm³. Diese Copolymeren aus Ethylen und einem α-Olefin mit 4-10 Kohlenstoff-Atomen besitzen etwa 3-5 Molprozent des letzteren Bestandteils. Vorzugsweise ist das α-Olefin 1-Buten oder 1-Octen, am beorzugtesten 1-Octen. Geeignete copolymere Materialien sollten befähigt sein, bei einer niedrigen Temperatur, d.h. von etwa 125ºC bis etwa 140ºC heißversiegelt zu werden. Die Herstellung von Behältern wird durch Materialien erleichtert, welche diese Erfordernisse erfüllen.
Die Dicke des zur verwendung beim Herstellen des Behälters ausgewählten copolymeren Filmmaterials hängt von der Durchlässigkeit pro Millimeter und der mechanischen Festigkeit des copolymeren Materials ab. Wenn das Material zum Beispiel eine hohe Sauerstoffdurchlässigkeit besitzt, dann kann eine verhältnismäßig große Dicke verwendet werden. Wenn auf der anderen Seite die Sauerstoffdurchlässigkeit des Materials bei einer bestimmten Dicke nur geringfügig niedrig ist, während die mechanische Festigkeit ziemlich hoch ist, dann kann eine niedrigere Dicke eingesetzt werden. Bei einem Copolymer aus Ethylen und 1-Buten oder 1-Octen mit einer Dichte von 0,915 bis 0,925 g/cm³ besitzt das Filmmaterial eine Dicke von etwa 0,04 mm bis etwa 0,14 mm. Das copolymere Filmmaterial sollte genugend mechanisch fest sein, um während des Gebrauchs der Begegnung mit gemäßigten Beanspruchungen zu widerstehen und es ist vorzugsweise lichtdurchlässig. Der Behälter sollte ein ausreichendes Volumen besitzen, um etwa 0,2 bis etwa 5 Liter Zellsuspension zu fassen. Vorzugsweise ist der Behälter ein biegsamer Beutel. Der Behälter ist vorzugsweise mit geeigneten Zugangsöffnungen oder -schläuchen ausgerüstet, welche mittels in der Technik wohlbekannter Methoden, wie etwa durch die Verwendung von Klammern usw. verschlossen werden können, um eine angemessene Schutzhöhe vor Verunreinigung aufrecht zu erhalten. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Schläuche durch Heißversiegeln verschlossen.
Das copolymere Filmmaterial muß auch mit den PBMC oder PBL und dem Kulturmedium verträglich sein. Unter "verträglich" wird verstanden, daß das Material mit den Zellen oder dem Medium nicht in Wechselwirkung tritt oder Chemikalien in sie auslaugt, welche für die Zellen oder den Empfänger schädlich sind.
Bei dem Verfahren der Erfindung werden die PBMC oder Lymphozyten aus peripherem Blut (PBL) in Suspension zusammen mit einem geeigneten Medium und IL-2 in den Behälter verbracht, der Behälter wird verschlossen, um die Sterilität zu wahren und die daraus folgende Suspension wird über den hierin früher vorgeschriebenen Zeitraum inkubiert. Der PBMC oder PBL, das Kulturmedium und IL-2 enthaltende Behälter wird vorzugsweise in Gegenwart einer Atmosphäre von etwa 3 Vol.-% bis etwa 10 Vol.-% CO2, am bevorzugtesten 5 Vol.-% CO² gehalten. Die PBMC oder PBL werden vorzugsweise während des Kultivierens in einer Zellkonzentration von etwa 1,0x10&sup6; bis etwa 5x10&sup7; Zellen/ml, am bevorzugtesten von etwa 5x10&sup6; bis etwa 1,5x10&sup7; Zellen/ml, suspendiert. Geeignete Medien schließen mit Serum oder Humanserumalbumin (HSA) ergänztes RPMI 1640 ein. Vorzugsweise ist das Medium mit HSA ergänztes RPMI, am bevorzugtesten mit in therapeutischer Qualität ergänztem HSA. Vorzugsweise beträgt die IL-2-Konzentration von etwa 5x10² bis etwa 5x10&sup4; pM, am bevorzugtesten von 1000 pM bis etwa 2000 pM. Vorzugsweise ist das IL-2 rIL-2 und am bevorzugtesten ist das rIL-2 eine im wesentlichen aus Wasser, rIL-2 und gegebenenfalls einem Polyol bestehende rIL-2-Zusammensetzung, wobei die Zusammensetzung eine IL-2-spezifische Aktivität von wenigstens etwa 120 000 Einheiten/mg besitzt und die spezifische Aktivität wenigstens 40% derjenigen von Jurkat IL-2 ist. Diese rIL-2-Zusammensetzung ist in der korrespondierenden US-Patentanmeldung Serien- nr. 825 133, angemeldet am 31. Januar 1986 und an E.I. du Pont de Nemours and Company übertragen, beschrieben. Die wesentliche Offenbarung dieser Anmeldung ist hierin durch Verweis inbegriffen. Diese rIL-2-Zusammensetzung wird durch ein Verfahren hergestellt, welches (a) das Mischen mit Wasser unter Erzeugen einer Suspension von rIL-2, welches nach Reinigung durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie lyophylisiert worden ist, und (b) das Erhitzen der daraus folgenden Suspension bei einer Temperatur von etwa 25ºC bis etwa 95ºC über wenigstens etwa zwei Stunden umfaßt.
Bei dem Verfahren der Erfindung wird die Zellsuspension während des Kultivierens in einer Dicke gehalten, welche alle Zellen ausreichend Sauerstoff erreichen läßt. Wenn der Behälter zum Beispiel in Form eines Blutbeutels hergestellt ist, wird der Beutel in einer waagerechten Lage auf einem Gestell aufbewahrt, welche es Gasen erlaubt, in die das Gestell berührende Seite einzudringen. Wenn in diesem Zustand die Zelldichte niedrig ist, kann die suspensionsdicke bis hinauf zu etwa 4 cm betragen, wogegen, falls die Zelldichte hoch ist, die Dicke 0,5 cm oder weniger beträgt.
Hierzuvor wurden die PBMC oder PBL in herkömmlichen festen Behältern, wie etwa Rollkolben, T-Kolben, petrischalen, Mehrfachschalen und polypropylenröhrchen kultiviert. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung hat der zum Kultivieren verwendete Behälter einen oder mehrere Zugangsschläuche, welche vor der Sterilisation des Behälters heißversiegelt werden. Bei dieser Ausführungsform wird durch Verwendung einer sterilen Anschlußvorrichtung, wie etwa derjenigen im US-Patent 4 369 779 beschriebenen, Zugang zum Behälter erhalten. Die PBMC oder PBL, das Kulturmedium und IL-2 werden durch einen Zugangsschlauch in den Behälter verbracht, welcher darauf durch Verendung der sterilen Anschlußvorrichtung hermetisch versiegelt wird. Nach dem Inkubationszeitraum können die LAK-Zellen mittels der sterilen Anschlußvorrichtung unter Verbinden des Zugangsschlauches mit dem gewünschten Transportbehälter entnommen werden. Auf diese Weise kann die Sterilität des Systems aufrechterhalten werden.
Die nach dem Verfahren der Erfindung hergestellten LAK-Zellen können in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, wie etwa Kochsalzlösung, 5% normales Humanserumalbumin enthaltende Kochsalzlösung oder Hanks ausgeglichene Salzlösung suspendiert werden, um eine Zusammensetzung zu liefern, welche in einen tumorbefallenen Patienten infundiert werden kann. Der Patient wird gleichzeitig mit rIL-2 behandelt, wie weiter von Rosenberg et al., The New England Journal of Medicine 313, 1485-1492 (1985) beschrieben wird. Bei dieser Ausführungsart wird das Blut des Patienten entnommen, der Leukapherese unterzogen und die geernteten Zellen werden sofort 3 Tage kultiviert, um LAK-Zellen zu erzeugen. Die LAK-Zellen werden darauf in den Patienten infundiert. Typischerweise werden etwa 3x10¹&sup0; bis 14x10¹&sup0; LAK-Zellen in 4-9 Dosen infundiert. Interleukin-2 wird alle acht Stunden in Dosen wie etwa 10 000, 30 000 oder 100 000 Einheiten je Kilogramm Gewicht verabreicht. Die Behandlung besteht aus einer zweiwöchigen Verordnung von Leukopherese und Reinfusion, wobei die Wiederholung im allgemeinen in der dritten Woche beginnt. Rekombinantes IL-2 kann in die LAK-Zellzusammensetzung einbezogen werden.
Obwohl das Verfahren der Erfindung unter besonderem Bezug auf LAK-Zellen beschrieben worden ist, ist es auch zum Herstellen von TIL nützlich. Diese Zellen können nach dem in Rosenberg et al., Science 233, 1318-1321 (1986) beschriebenen Verfahren erhalten werden. Bei diesem Verfahren wird aus 1- bis 2-mm- Stücken Tumorgewebe eine Zellsuspension erhalten. Diese Zellsuspension kann dann dem Verfahren der Erfindung folgend, aber ohne die wahlweise Behandlung mit einem L-Aminosäureniederalkylester, kultiviert werden.
Die vorliegende Erfindung kann nach den hierin beschriebenen besonderen Ausführungsformen durchgeführt werden, ist aber nicht darauf beschränkt. Die Erfindung wird weiter durch die folgenden Beispiele veranschaulicht, bei welchen, soweit nicht anders angegeben, alle Prozentwerte Volumen und Temperaturen Celsiusgrade sind.

Cytotoxizitätsbestimmung

Solange nicht anders angegeben, wurde eine 4-Stunden-&sup5;¹Cr- Freisetzungsbestimmung verwendet, um die Cytotoxizität der LAK-Zellen für Tumorzellen zu messen. Tumorzellen wurden in einer Konzentration von etwa 2x10&sup6; bis 10x10&sup6; mit 100 uCi Na&sub2;&sup5;¹CrO&sub4; in 0,4 ml Tris-Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung 1 Stunde bei 37ºC inkubiert. Die Zellen wurden 3 Mal mit 5% oder 10% fetales Kälberserum (FCS) enthaltendem RPMI 1640 gewaschen und zu 10&sup5; Zellen/ml in RMPI-20% FCS oder RPMI-10% FCS resuspendiert. Die Effektorzellen (LAK-Zellen) wurden in verschiedenen Konzentration suspendiert und 0,1 ml wurden Näpfchen in Rundbodenmikroliterplatten zugesetzt. Die mit &sup5;¹Cr markierten Zielzellen (0,1 ml) wurden allen Näpfchen zugesetzt und die Platten wurden 5 Minuten bei 200 xg zentrifugiert. Nach 4 Stunden Inkubation bei 37ºC wurden die Platten erneut zentrifugiert und 0,1 ml des daraus folgenden Überstands wurden aus jedem Näpfchen entnommen und in einem Gammazähler gezählt. Die prozentuale Cytotoxizität wird nach der folgenden Formel berechnet:
% Cytotoxizität = experimentelle cpm - spontane cpm/ gesamte cpm - spontane cpm x 100
Jede Variable wurde dreifach geprüft und die sich daraus ergebenden Daten sind in % Cytotoxizität ausgedrückt. Dieser Cytotoxizitätstest wird weiter in "Selected Methods in Cellular Immunology", Mishell and Shiigi, Hrsg., 124-137, W.H. Freeman and Co., San Francisco (1980), beschrieben.
In weiteren Experimenten werden die Ergebnisse der Bestimmungen als "lytische Einheiten" (LU oder LU30) dargestellt, welches die Zahl der Zielzellen je 100 Effektorzellen ist, wenn 30% der Zielzellen getötet werden, wenn LAK-Zellen und Zielzellen zusammen 4 Stunden bei 37ºC inkubiert werden. Die Berechnung der LU beruht auf der Methode von Pross et al., Journal of Immunological Methods 68, 235-249 (1984). Je größer die LU-Zahl ist, desto größer ist die Wirksamkeit des LAK-Zellenpräparats.

BEISPIELE 1-9 und VERGLEICHE A-F

PBMC wurde durch Ficoll-Hypaque-Trennung von ACD-antikoaguliertem, mit Einverständnis zwei gesunden Spendern abgenommenem, venösem Blut erhalten. Die einem Spender entnommenen Zellen wurden mit L-Phenylalaninmethylester behandelt, die Zellen aus dem anderen Spender hingegen nicht. Die Methylesterbehandlung wurde durch dreimal Waschen der Zellen mit HBSS und resuspendieren der sich daraus ergebenden gewaschenen Zellen in mit 1 ml L-Glutamin, 0,1% Gentamycin-Lösung, 10% FCS und 5 mM L-Phenylalaninmethylester ergänztem RPMI 1640-Medium ausgeführt. Die sich daraus ergebende Zellsuspension wurde bei Raumtemperatur (etwa 22ºC) 40 Minuten inkubiert, wonach die Zellen dreimal mit HBSS gewaschen wurden.
Die sich aus der Monozytenabreicherung mit L-Phenylalaninmethylester ergebenden PBMC oder PBL wurden in 10 ml mit 10% FCS ergänztem RPMI 1640 in T-Kolben (T-25) (Vergleiche) oder aus einem Copolymer aus Ethylen (etwa 97 Mol%) und 1-Octen (LLDPE) mit einer Dichte von 0,918 g/cm³ hergestellten geschlossenen Beuteln mit einem Nennvolumen von 200 ml kultiviert. Ein 0,12 mm dickes LLDPE-Material ähnlicher Zusammensetzung ist aus dem US-Patent 4 496 361, Beispiel 5, dafür bekannt, eine Sauerstoffdurchlässigkeit von 2,6x10&sup5; um³ (STP)/m².s.Pa) zu besitzen. Das Kultivieren wurde in einer 5% CO&sub2;-Atmosphäre bei 37ºC in Anwesenheit von 10 Einheiten/ml rIL-2 ausgeführt. Eine Einheit IL-2 ist als diejenige Menge IL-2 definiert, welche benötigt wird, eine 50%ige Aufnahme radiomarkierten (Tritium) Thymidins durch eine maustumorspezifische, cytotoxische T-Zellinie (CTLL) zu stimulieren, welche, wie ausführlicher in Gehmans et al., Journal of Immunological Methods 74, 39-47 (1984), angegeben und hierin durch Verweis inbegriffen, gegen Jurkat IL-2 standardisiert wurde.
Nach dem Kulturzeitraum wurden die sich daraus ergebenden LAKZellen geerntet und in mit 10% FCS ergänztem RPMI für die Cytotoxizitätsbestimmung unter Verwendung von Daudi-Zellen (D) (eine NK-resistente Zellinie), Melanom-Zellen (M) und Lymphom- Zellen (L) als Zielzellen (T) resuspendiert. Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 vorgestellt, worin sich "E" auf "Effektorzellen", d.h. LAK-Zellen, bezieht. Experimente, wo die PBMC mit Phenylalaninmethylester (PME) behandelt wurden, sind so bezeichnet. TABELLE 1 Beispiel Nr. oder Vergleigh Zellkonz. (Zahl/ml) x10&sup6; E:T-Verhältnis %&sup5;¹Cr-Freisetzung

BEISPIEL 10-12 UND VERGLEICH G

PBMC wurde aus gesunden menschlichen Spendern mit Einverständnis entweder mittels Leukapherese oder Gesamtblutproben des Amerikanischen Roten Kreuzes gesammelt. In beiden Fällen wurden die BMC aus venösem Blut erhalten, welches mittels eines ACD-Antikoagulants am Gerinnen gehindert wurde. Die PBMC wurden von anderen Blutbestandteilen durch Ficoll-Hypaque-Dichtegradientenzentrifugation getrennt. Einige der PBMC-Präparate wurden mit L-Phenylalaninmethylester (PME) behandelt, um sie an Monozyten abzureichern. Die Methylesterbehandlung wurde durch dreimaliges Waschen der Zellen mit HBSS und Resuspendieren der daraus folgenden gewaschenen Zellen in mit 1 mM L-Glutamin, 0,1% Gentamycin-Lösung, 10% FCS und 5 mM L-Phenylalaninmethylester ergänztem RPMI 1640-Medium bewerkstelligt. Die auf diese Weise erhaltene Zellsuspension wurde 40 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, wonach die sich daraus ergebenden Zellen dreimal mit HBSS gewaschen und in L-Glutamin, Gentamycin und 10% FCS enthaltendem RPMI 1640-Medium resuspendiert wurden.
Die aus der Monozytenabreicherung mit Methylester folgenden PBNC oder PBL wurden in 10 ml-T-Kolben (Vergleich G) oder in aus einem Copolymerfilm aus Ethylen (etwa 97 Mol%) und 1-Octen (LLDPE) mit einer Dichte von 0,918 g/cm³ und einer Filmdicke von 0,13 mm ( 5 mil) hergestellten geschlossenen Beutein mit einem Nennvolumen von 200 ml kultiviert. Das Kultivieren wurde in einer 5% CO&sub2;-Atmosphäre bei 37ºC in Anwesenheit von 10 Einheiten/ml rIL-2 ausgeführt.
Nach dem Kulturzeitraum wurden die sich daraus ergebenden LAK- Zellen geerntet und für die Cytotoxizitätsbestimmungen in mit 10% FCS ergänztem RPMI 1640 resuspendiert, wobei als Zielzellen die Raji-Zellinie verwendet wurde. Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 vorgestellt, worin "SD" die Standardabweichung ist. Es wird angenommen, daß die hohen Standardabweichungen die Verschiedenheit der Spender widerspiegeln. TABELLE 2 Beispiel Nr. oder Vergleigh Zellkonz. (Zahl/ml) x10&sup6; Zahl der Spender-Proben Lytische Mittel Einheiten SD

BEISPIEL 13

Diese Versuche wurden mittels zu denjenigen in den Beispielen 10-12 angegebenen ähnlicher Verfahren ausgeführt. PBMC von sechs Spendern wurden zur Kultur in T-Kolben (Vergleiche) oder LLDPE-Beuteln hergestellt. Keine der PBMC wurden mit L-Phenylalaninmethylester behandelt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 3 unter Verwenden von durch cytotoxische Bestimmungen mit Raji-Zellen als Ziel gemessenen lytischen Einheiten angegeben. Die Abkürzung "nt" zeigt an, daß die Zellen in der besonderen Vorrichtung nicht getestet wurden. TABELLE 3 Spender Nr. Zellkonz. (Zahl/ml) x10&sup6; Lytische T-Kolben Einheiten Beutel

BEISPIEL 14

Außer wenn anders angegeben, wurden diese Experimente mittels zu denjenigen in den Beispielen 10-12 angegebenen ähnlicher Verfahren ausgeführt. PBMC von vier Spendern wurden in zwei gleiche Teile aufgeteilt. In jedem Fall wurde ein Teil mit L-Phenylalaninmethylester (PME) behandelt und der andere wurde direkt dem Kultivieren unterzogen. Das Kultivieren wurde in geschlossenen LLDPE-Beuteln ausgeführt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 4 vorgestellt. TABELLE 4 Spender Nr. Zellkonz. (Zahl/ml) x 10&sup6; Lytische PME Einheiten unbehandelt

BEISPIEL 15

Außer wenn anders angegeben, wurden diese Experimente mittels zu denjenigen in den Beispielen 10-12 angegebenen ähnlicher Verfahren ausgeführt. PBMC von drei Spendern wurden dazu verwendet, die LAK-Zellenaktivierung in T-Kolben mit der Aktivierung in LLDPE-Beuteln bei verhältnismäßig hohen Zelldichten, z.B. 1x10&sup6; bis 1x10&sup7;, zu vergleichen. Die Ergebnisse werden in Tabelle 5 vorgestellt. TABELLE 5 Spender Nr. Zellkonz. (Zahl/ml) x10&sup6; Lytische T-Kolben Einheiten Beutel

BEISPIELE 16-18 UND VERGLEICH H

Durch Verwenden zu denjenigen in den Beispielen 1-9 angegebenen ähnlicher Verfahren wurde LAK-Zellen durch Kultivieren von PBMC über vier Tage in aus einem Copolymer aus (a) Ethylen (etwa 97 Mol%) und 1-Octen mit einer Dichte von 0,918 g/cm³, (b) Ethylen-Methacrylsäure-Copolymer (Nucrell 0903-Polymer, ein Produkt der Du Pont Company), (c) einem Ionomer (Surlyn- Copolymer, ein Produkt der Du Pont Company) und Polyvinylchlorid (PVC) (Vergleich) hergestellten BeuteIn von etwa 10 in² Größe erzeugt. Die PBMC-Zellen waren in einer Konzentration von 5x10&sup6; Zellen/ml vorhanden und 50 ml Kulturflüssigkeit wurden eingesetzt. Raji-Zellen wurden als Zielzellen verwendet. Die Ergebnisse werden in Tabelle 6 vorgestellt, wo die Cytotoxizität als Zählimpulse je Minute ausgedrückt angegeben wird. TABELLE 6 Beispiel Nr. oder Vergleigh Beuteldicke mm (mil) Material E:T-Verhältnis Zählimpulse je Minute

BEISPIEL 19

Tests in diesen Experimenten wurden in einer Filmtestkammer durchgeführt, welche die Bewertung von Filmen mit unterschiedlichen Zusammensetzungen und Dicken erlaubte. Die Kammer war aus Polycarbonatzylindern mit einem Außendurchmesser von vier Inch, einem Innendurchmesser von zwei Inch und einer Tiefe von zwei Inch aufgebaut. Die Kammer wurde dampfsterilisiert. Als nächstes wurde ein strahlungssterilisierter Testfilm mechanisch über ein Ende aufgespannt und zum Vermeiden eines Flüssigkeitsverlusts druckversiegelt. Mit dem auf die Kammer verbrachten Filmende nach unten wurde eine Suspension aus zu kultivierenden Zellen und Medien zugefügt. Ein zweiter steriler Film derselben Zusammensetzung und Dicke wie der erste wurde darauf über das Oberteil der Kammer gelegt und zum Verhindern eines Lecks straff festgeklemmt. Unter Verwenden zu denjenigen der in den Beispielen 1-9 beschriebenen ähnlicher Verfahren wurden PBL in derartigen Kammern kultiviert.
Tests wurden gefahren, welche zeigten, daß die Kammer einem Durchlauf mit einem Beutel mit demselben Film, Zelldichte und Medientiefe gleichwertig war. In einem typischen Durchlauf ergab mit der Kammer verwendeter LLDPE-Film ein LU30 von 6,5, wogegen ein Beutel derselben Zusammensetzung 5,4 ergab. Die LAK-Aktivierung wurde in diesen Kammern mittels Surlyn 1601- Ionomerfilmen (ein Produkt der Du Pont Company) von 0,05, 0,13, 0,18 und 25 mm (2, 5, 7,5, 10 mil) Dicke ausgeführt. Diese Filme besaßen Durchlässigkeitsraten von etwa 340, 136, 88 beziehungsweise 68 cc/24 h-atm-100 in². Die LU30-Ergebnisse betrugen 15, 11, 7,4 beziehungsweise 3.

Claims

1. Verfahren, in dem mononukleäre Zellen aus peripherein Blut oder Lymphocyten aus Tumor-Gewebe zur Produktion einer Population von Zellen kultiviert werden, die cytotoxisch für solche Tumor-Zellen sind, die gegenüber natürlichen Killer-Zellen resistent sind, umfassend das Kultivieren einer Population von Zellen, die aus der aus mononukleären Zellen aus peripherem Blut, daraus resultierenden Lymphocyten aus peripherern Blut und aus Tumor-Gewebe erhaltenen Lymphocyten bestehenden Gruppe ausgewählt sind, bei einer Zell-Konzentration von wenigstens etwa 1,0 x 10&sup6; Zellen/ml in einem geschlossenen Behälter, der aus einem copolymeren Filmmaterial mit einer Sauerstoff-Permeabilität von wenigstens etwa 1,8 x 10&sup5; um³/m² s Pa (unter Standard-Bedingungen von Druck und Temperatur) und einer Dicke von etwa 0,04 bis etwa 0,023 mm hergestellt ist, wobei das Material aus der aus

a) Copolymeren aus Ethylen und einem α-Olefin mit 4 bis 10 Kohlenstoff-Atomen mit einer Dichte von etwa 0,915 bis 0,925 g/cm³;

b) Copolymeren aus Ethylen und Methacrylsäure;

c) Ionomeren; und

d) Laminaten oder Co-Extrudaten eines Ionomer/Polyester-Elastomers und eines Elastomers aus linearem Polyethylen mit niedriger Dichte bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Population von Zellen, die kultiviert wird, aus mononukleären Zellen aus peripherem Blut und daraus resultierenden Lymphocyten aus peripherem Blut ausgewählt ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, worin die mononukleären Zellen aus peripheren Blut oder die Lymphocyten aus peripheren Blut menschliche Zellen sind.

4. Verfahren nach Anspruch 3, worin die mononukleären Zellen aus peripheren Blut oder die Lymphocyten aus peripherem Blut 2 bis 7 Tage in Gegenwart von rekombiniertein Interleukin-2 in einer Konzentration von etwa 500 pM bis 50 000 pM kultiviert werden.

5. Verfahren nach Anspruch 4, worin die mononukleären Zellen aus Peripherem Blut oder die Lymphocyten aus peripherem Blut bei einer Temperatur von etwa 35 ºC bis etwa 39 ºC kultiviert werden.

6. Verfahren nach Anspruch 5, worin die mononukleären Zellen aus peripherem Blut oder die Lymphocyten aus peripherem Blut in Gegenwart einer Atmosphäre von etwa 3 Vol.-% bis etwa 10 Vol.-% CO&sub2; kultiviert werden.

7. Verfahren nach Anspruch 6, worin Lymphocyten aus peripherem Blut verwendet werden.

3. Verfahren nach Anspruch 7, worin die Konzentration der Lymphocyten aus peripherem Blut etwa 1 x 10&sup6; Zellen/ml bis etwa s x 10&sup7; Zellen/ml beträgt.

9. Verfahren nach Anspruch 8, worin die Lymphocyten aus peripherem Blut 3 bis 5 Tage kultiviert werden.

10. Verfahren nach Anspruch 9, worin die Konzentration des rekombinierten Interleukin-2 etwa 1000 pM bis etwa 2000 pM beträgt.

11. Verfahren nach Anspruch 10, worin das copolymere Filmmaterial im wesentlichen aus einem Copolymer aus Ethylen und einem α-0lefin mit 4 bis 10 Kohlenstoff-Atomen mit einer Dichte von etwa 0,915 bis 0,925 g/cm³ besteht.

12. Verfahren nach Anspruch 11, worin das α-Olefin mit 4 bis 10 Kohlenstoff-Atomen 1-Buten oder 1-Octen ist und das copolymere Filmmaterial eine Dicke von etwa 0,04 mm bis etwa 0,14 mm hat.

13. Verfahren nach Anspruch 12, worin das α-0lefin mit 4 bis 10 Kohlenstoff-Atomen 1-Octen ist.

14. Verfahren nach Anspruch 13, worin der Behälter durch Heißversiegeln verschlossen wird.

15. Verfahren nach Anspruch 14, worin die Konzentration der Lymphocyten aus peripherem Blut etwa 5 x 10&sup6; Zellen/ml bis etwa 1,5 x 10&sup7; Zellen/ml beträgt.

16. Verfahren nach Anspruch 15, worin die Lymphocyten aus peripherem Blut in durch Human-Serumalbumin ergänztem RPMI 1640-Medium kultiviert werden.

17. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 16, worin vor dem Kultivieren die mononukleären Zellen aus peripherem Blut oder die Lymphocyten aus peripherem Blut mit L-Aminosäure-Niederalkylester oder einem Hydrochlorid- Salz desselben in Berührung gebracht werden, wobei die Aminosäure aus der aus Phenylalanin, Glutaminsäure, Glutamin und Tyrosin und deren Mischungen bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

18. Verfahren nach Anspruch 17, worin der L-Aminosäure- Niederalkylester Phenylalaninmethylester ist.