JPH06104060B2 - 活性化キラー細胞の製法 - Google Patents
活性化キラー細胞の製法Info
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- JPH06104060B2 JPH06104060B2 JP63017516A JP1751688A JPH06104060B2 JP H06104060 B2 JPH06104060 B2 JP H06104060B2 JP 63017516 A JP63017516 A JP 63017516A JP 1751688 A JP1751688 A JP 1751688A JP H06104060 B2 JPH06104060 B2 JP H06104060B2
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は活性化されたキラー細胞、特にリンホカイン活
性化キラー（LAK）細胞の製法に関する。
性化キラー（LAK）細胞の製法に関する。
Rayner氏他（「Cancer」55、1327〜1333（1985））はリ
ンホカイン‐活性化キラー（LAK）細胞が新鮮な末梢血
液リンパ球をインターロイキン‐２中で培養することに
より生成されうることを開示している。彼らはLAK細胞
がイン・ビトロで新鮮な自己由来のおよび同種ヒト腫瘍
細胞を殺すことを開示している。このLAK細胞は正常な
個体および腫瘍担持患者の末梢血液リンパ球から生成さ
れうる。彼らは、純粋な組換えインターロイキン‐２
（rIL-2）が結腸、膵臓、副腎および食道の肉腫および
癌を含む広い種類の腫瘍を殺しうるLAK細胞を生成する
ことを報告している。彼らは場合によりrIL-2の全身投
与と一緒のLAK細胞の使用がヒトの癌の免疫療法を実現
するための将来有望な方法であると報告している。この
文献では、25cm2のフラスコ中細胞濃度106個/mlで５％C
O2中37℃で５日間末梢血液リンパ球を活性化することが
開示されている。
ンホカイン‐活性化キラー（LAK）細胞が新鮮な末梢血
液リンパ球をインターロイキン‐２中で培養することに
より生成されうることを開示している。彼らはLAK細胞
がイン・ビトロで新鮮な自己由来のおよび同種ヒト腫瘍
細胞を殺すことを開示している。このLAK細胞は正常な
個体および腫瘍担持患者の末梢血液リンパ球から生成さ
れうる。彼らは、純粋な組換えインターロイキン‐２
（rIL-2）が結腸、膵臓、副腎および食道の肉腫および
癌を含む広い種類の腫瘍を殺しうるLAK細胞を生成する
ことを報告している。彼らは場合によりrIL-2の全身投
与と一緒のLAK細胞の使用がヒトの癌の免疫療法を実現
するための将来有望な方法であると報告している。この
文献では、25cm2のフラスコ中細胞濃度106個/mlで５％C
O2中37℃で５日間末梢血液リンパ球を活性化することが
開示されている。
Rosenberg氏他（「The New England Journal of Medici
ne」313、1485〜1492（1985））は自己由来のリンホカ
イン活性化キラー細胞およびrLL-2を進行癌患者に全身
投与した予備結果を開示している。彼らは標準的な治療
がうまくゆかなかつた25人の転移癌患者にこの処置を行
つた。患者25人中の11人に癌の容観的後退（容積の50％
以上）が観察された。転移メラノーマを有する患者１人
で完全なる腫瘍の後退が見られ、処置10か月後まで持続
した。この文献では2.5lのローラービン中細胞濃度1.51
06/mlで37℃で３〜４日間細胞を活性化または培養する
ことを開示している。患者には約２×1011個のLAK細胞
が注入された。
ne」313、1485〜1492（1985））は自己由来のリンホカ
イン活性化キラー細胞およびrLL-2を進行癌患者に全身
投与した予備結果を開示している。彼らは標準的な治療
がうまくゆかなかつた25人の転移癌患者にこの処置を行
つた。患者25人中の11人に癌の容観的後退（容積の50％
以上）が観察された。転移メラノーマを有する患者１人
で完全なる腫瘍の後退が見られ、処置10か月後まで持続
した。この文献では2.5lのローラービン中細胞濃度1.51
06/mlで37℃で３〜４日間細胞を活性化または培養する
ことを開示している。患者には約２×1011個のLAK細胞
が注入された。
Rosenberg氏他（「Science」233、1318〜1321（198
6））は、種々の種類の腫瘍からの微小癌組織転移を有
するマウスにインターロイキン‐２中に拡げられた腫瘍
浸潤性リンパ球（TIL）を養子移入するとTILがLAK細胞
より治療効力が50〜100倍高いことが示されたと開示し
ている。TILは腫瘍を無菌的に収穫しそしてそれらを細
かく刻んで１〜2mmの細片とし次にこれを特定の食塩溶
液40ml中で撹拌して細胞懸濁液を得、これを過し、洗
浄しそしてrIL-2を含有する完全培地中でもとの細胞の
約100倍拡大物が得られるまで懸濁させることにより調
製された。
6））は、種々の種類の腫瘍からの微小癌組織転移を有
するマウスにインターロイキン‐２中に拡げられた腫瘍
浸潤性リンパ球（TIL）を養子移入するとTILがLAK細胞
より治療効力が50〜100倍高いことが示されたと開示し
ている。TILは腫瘍を無菌的に収穫しそしてそれらを細
かく刻んで１〜2mmの細片とし次にこれを特定の食塩溶
液40ml中で撹拌して細胞懸濁液を得、これを過し、洗
浄しそしてrIL-2を含有する完全培地中でもとの細胞の
約100倍拡大物が得られるまで懸濁させることにより調
製された。
米国特許第3,928,294号には、C8〜C18α‐オレフイン系
列物および二酸化硫黄に由来するポリ（α‐オレフイン
‐スルホン）からなり、酸素透過率約１〜４×104ccミ
ル／in2・yr・atmおよびCO2透過率約４〜17×104ccミル
／in2・yr・atmを有する気体透過性の高い選択透過性の
生物学的適合性を有する膜物品が開示されている。この
膜物質から製作されうる物品には血液貯蔵バツグが包含
される。
列物および二酸化硫黄に由来するポリ（α‐オレフイン
‐スルホン）からなり、酸素透過率約１〜４×104ccミ
ル／in2・yr・atmおよびCO2透過率約４〜17×104ccミル
／in2・yr・atmを有する気体透過性の高い選択透過性の
生物学的適合性を有する膜物品が開示されている。この
膜物質から製作されうる物品には血液貯蔵バツグが包含
される。
ベルギー特許第862,772号には、少くとも体液および／
または液体投薬物と接触する部分が、照射により20〜75
％架橋されておりかつ特定の式を有する共重合体から作
られている医療用装置が開示されている。この共重合体
は、いずれも特定の式を有するアクリル基含有エステル
とエチレン化合物の重合により製造されている。そこに
開示される装置には血液用ビンが包含される。この特許
は気体に対する透過性が低い物質に関するものである。
または液体投薬物と接触する部分が、照射により20〜75
％架橋されておりかつ特定の式を有する共重合体から作
られている医療用装置が開示されている。この共重合体
は、いずれも特定の式を有するアクリル基含有エステル
とエチレン化合物の重合により製造されている。そこに
開示される装置には血液用ビンが包含される。この特許
は気体に対する透過性が低い物質に関するものである。
米国特許第4,496,361号および4,588,401号には、 酸素透過性約1.8×105μm3（STP）／（m2・秒・Pa）〔1
00cc（STP）／（24hr-atm-100in2）〕、 二酸化炭素透過性約4.4×105〜約8.0×105μm3（STP）
／（m2・秒・Pa）〔250〜約450cc（STP）／（24hr-atm-
100in2）〕、 引張り強さ少くとも約8mPa、 シール強さ少くとも約1000g/cm、 その容器が約275ml容量まで液体により拡張されうるに
充分に低い剛性、 落槍値少くとも約100を生ずるに充分な耐久性、および 厚さ約0.08mm〜約0.23mm、 を有し、低温でヒートシールされうる共重合体フイルム
物質で作られた血小板貯蔵容器が開示されている。
00cc（STP）／（24hr-atm-100in2）〕、 二酸化炭素透過性約4.4×105〜約8.0×105μm3（STP）
／（m2・秒・Pa）〔250〜約450cc（STP）／（24hr-atm-
100in2）〕、 引張り強さ少くとも約8mPa、 シール強さ少くとも約1000g/cm、 その容器が約275ml容量まで液体により拡張されうるに
充分に低い剛性、 落槍値少くとも約100を生ずるに充分な耐久性、および 厚さ約0.08mm〜約0.23mm、 を有し、低温でヒートシールされうる共重合体フイルム
物質で作られた血小板貯蔵容器が開示されている。
英国特許出願公開第2,065,067号には、 １×104をこえる平均分子量を有しα‐オレフイン１〜2
0モル％を含有し、密度0.936より下、そして４〜18個の
炭素原子を有するα‐オレフインとエチレンとのランダ
ム共重合体の伸張されてないフイルムの内層、および 室温より高いガラス転移温度を有する熱抵抗性重合フイ
ルムの外層 からなる積層シートをヒートシールしてバツグを形成さ
せるものからなる、生理学的溶液、食品または化学薬品
を冷凍するのに使用するためのバツグが開示されてい
る。このα‐オレフインはなかんずく1-ブテン、4-メチ
ル‐1-ペンテンまたは1-オクテンであることができ、そ
して外層はエチレン‐テトラフルオロエチレン共重合体
のような物質であることができる。
0モル％を含有し、密度0.936より下、そして４〜18個の
炭素原子を有するα‐オレフインとエチレンとのランダ
ム共重合体の伸張されてないフイルムの内層、および 室温より高いガラス転移温度を有する熱抵抗性重合フイ
ルムの外層 からなる積層シートをヒートシールしてバツグを形成さ
せるものからなる、生理学的溶液、食品または化学薬品
を冷凍するのに使用するためのバツグが開示されてい
る。このα‐オレフインはなかんずく1-ブテン、4-メチ
ル‐1-ペンテンまたは1-オクテンであることができ、そ
して外層はエチレン‐テトラフルオロエチレン共重合体
のような物質であることができる。
癌の養子免疫療法としてLAK細胞、TILおよびrIL-2をさ
らに調査し精製する研究においては、細胞を高濃度で活
性化せしめるか、さもなくば治療の効果を高めるもので
ある改良を行うのが最も望ましい。例えば、約1.8×10
10〜1.8×1011個の細胞が必要とされる場合に約1.5×10
6個/mlの細胞濃度で培養すると、約12〜120lの総培養容
量を必要としよう。かなり少ない容量で操作できる方法
が有益であることは明らかである。
らに調査し精製する研究においては、細胞を高濃度で活
性化せしめるか、さもなくば治療の効果を高めるもので
ある改良を行うのが最も望ましい。例えば、約1.8×10
10〜1.8×1011個の細胞が必要とされる場合に約1.5×10
6個/mlの細胞濃度で培養すると、約12〜120lの総培養容
量を必要としよう。かなり少ない容量で操作できる方法
が有益であることは明らかである。
本発明はリンホカイン活性化キラー（LAK）細胞またはT
ILの改良された製造法を提供するものである。本発明は
末梢血液単核細胞、または腫瘍組織からのリンパ球を培
養してナチユラルキラー細胞抵抗性の腫瘍細胞に対して
細胞毒性を有する細胞の集団を生成させるに当たり、 （ａ）密度約0.915〜0.925g/cm3を有する、エチレンと
４〜10個の炭素原子を有するα‐オレフインとの共重合
体、 （ｂ）エチレンとメタクリル酸との共重合体、 （ｃ）イオノマー、および （ｄ）イオノマー／ポリエステルエラストマーおよび線
状低密度ポリエチレンエラストマーのラミネートまたは
同時押出し物、 からなる群から選択され、酸素透過性少なくとも約1.8
×105μm3（STP）／（m2・秒・Pa）および厚さ約0.04mm
〜約0.23mmを有する共重合体フイルム物質から作られた
密閉容器中で、末梢血液単核細胞、それから得られる末
梢血液リンパ球および腫瘍組織から得られるリンパ球か
らなる群から選択される細胞の集団を培養することから
なる方法に関する。
ILの改良された製造法を提供するものである。本発明は
末梢血液単核細胞、または腫瘍組織からのリンパ球を培
養してナチユラルキラー細胞抵抗性の腫瘍細胞に対して
細胞毒性を有する細胞の集団を生成させるに当たり、 （ａ）密度約0.915〜0.925g/cm3を有する、エチレンと
４〜10個の炭素原子を有するα‐オレフインとの共重合
体、 （ｂ）エチレンとメタクリル酸との共重合体、 （ｃ）イオノマー、および （ｄ）イオノマー／ポリエステルエラストマーおよび線
状低密度ポリエチレンエラストマーのラミネートまたは
同時押出し物、 からなる群から選択され、酸素透過性少なくとも約1.8
×105μm3（STP）／（m2・秒・Pa）および厚さ約0.04mm
〜約0.23mmを有する共重合体フイルム物質から作られた
密閉容器中で、末梢血液単核細胞、それから得られる末
梢血液リンパ球および腫瘍組織から得られるリンパ球か
らなる群から選択される細胞の集団を培養することから
なる方法に関する。
本発明で用いられる「インターロイキン‐２」（IL-2）
なる用語は分子量約15000ダルトンを有しそしてジスル
フイツド橋を含有する133個のアミノ酸のポリペプチド
からなる糖タンパク質であるヒトインターロイキン‐２
を指す。この用語には天然および組換えインターロイキ
ン‐２（rIL-2）およびそれらの生物学的機能等価物が
包含される。「生物学的機能等価物」とは米国特許第4,
518,584号記載のrIL-2ムテインおよび天然IL-2に見られ
るNH2末端アラニンに代わつてメチオニンを有するrIL-2
タンパク質のような、同一のまたは非常に近似した生物
学的活性を有するポリペプチドを意味する。これらムテ
インは天然のヒトIL-2に従つて番号付けして125位のシ
ステインが欠失するかまたは中性アミノ酸で置換された
rIL-2分子であり、かかるムテインは天然のヒトIL-2の
生物学的活性を示す。
なる用語は分子量約15000ダルトンを有しそしてジスル
フイツド橋を含有する133個のアミノ酸のポリペプチド
からなる糖タンパク質であるヒトインターロイキン‐２
を指す。この用語には天然および組換えインターロイキ
ン‐２（rIL-2）およびそれらの生物学的機能等価物が
包含される。「生物学的機能等価物」とは米国特許第4,
518,584号記載のrIL-2ムテインおよび天然IL-2に見られ
るNH2末端アラニンに代わつてメチオニンを有するrIL-2
タンパク質のような、同一のまたは非常に近似した生物
学的活性を有するポリペプチドを意味する。これらムテ
インは天然のヒトIL-2に従つて番号付けして125位のシ
ステインが欠失するかまたは中性アミノ酸で置換された
rIL-2分子であり、かかるムテインは天然のヒトIL-2の
生物学的活性を示す。
「リンホカイン活性化キラー（LAK）細胞」とは自己由
来の腫瘍細胞およびナチユラルキラー（NK）細胞抵抗性
腫瘍細胞系統を溶解させることができ、一般に末梢血液
単核細胞をインターロイキン‐２と培養することにより
調製される細胞毒性を有する細胞集団である。
来の腫瘍細胞およびナチユラルキラー（NK）細胞抵抗性
腫瘍細胞系統を溶解させることができ、一般に末梢血液
単核細胞をインターロイキン‐２と培養することにより
調製される細胞毒性を有する細胞集団である。
「末梢血液リンパ球」とは単球が欠失した末梢血液単核
細胞を指す。
細胞を指す。
「低級アルキル」とは１〜４個の炭素原子を有するアル
キルを意味する。
キルを意味する。
「共重合体フイルム物質」とはそれぞれの層が単一の共
重合体またはホモポリマーで作られそして少くとも一つ
の層が単一の共重合体で作られているフイルム物質を意
味する。
重合体またはホモポリマーで作られそして少くとも一つ
の層が単一の共重合体で作られているフイルム物質を意
味する。
「STP」とは標準温度および圧力を意味する。
「RPMI 1640」とはその組成が「Culture of Animal Cel
ls」Freshney、72〜73、Alan R.Liss、Inc.、N.Yに記載
されている当業上よく知られた培地を指す。
ls」Freshney、72〜73、Alan R.Liss、Inc.、N.Yに記載
されている当業上よく知られた培地を指す。
本発明方法によりLAK細胞活性の程度または範囲を変え
ることなく細胞約５×107/mlまでの濃度でLAK細胞の活
性化を行うことができる。これらの細胞濃度で、養子免
疫療法に必要なLAK細胞の数は約0.2〜約2lの培養容量を
用いて得ることができる。本発明はヒト末梢血液単核細
胞またはヒト末梢血液リンパ球に関して詳細に記載する
が、本発明は他の哺乳動物の対応する細胞にもあてはま
ることは理解されるべきである。好ましくは、本発明方
法はヒト細胞で行われる。本発明方法はTILの活性化に
も用いられうる。
ることなく細胞約５×107/mlまでの濃度でLAK細胞の活
性化を行うことができる。これらの細胞濃度で、養子免
疫療法に必要なLAK細胞の数は約0.2〜約2lの培養容量を
用いて得ることができる。本発明はヒト末梢血液単核細
胞またはヒト末梢血液リンパ球に関して詳細に記載する
が、本発明は他の哺乳動物の対応する細胞にもあてはま
ることは理解されるべきである。好ましくは、本発明方
法はヒト細胞で行われる。本発明方法はTILの活性化に
も用いられうる。
本発明方法に必要な末梢血液単核細胞（PBMC）は当業上
よく知られた操作を用いて反復して白血球除去血輸血し
て約５×1010個までの単核細胞を収集することにより得
られる。一般に、ヒトの提供者から静脈血液をとり出
し、そして赤血球、血小板および血漿から単核細胞を分
離する器具に通し、前三者成分は提供者に戻される。こ
の単核細胞はプラスチツク製バツグに収集される。かく
して得られたPBMCをFicoll-Hypaque密度勾配分離により
分別する。次に細胞を適当な塩溶液例えばハンクスの平
衡塩類溶液（HBSS）（Gibco製、Grand Island,NY）で洗
いそして次に適当な培地、例えば、これもGibco社から
得られうるRPMI1640培地の中に1mM L-グルタミン溶液、
１％ペニシリン‐ストレプトマイシン溶液、１％ゲンタ
マイシン溶液および２〜10％の熱不活化されたプールさ
れたヒト血清（HIS）（上記％は別に断わりなければV/V
とする）を添加してものの中に再懸濁する。
よく知られた操作を用いて反復して白血球除去血輸血し
て約５×1010個までの単核細胞を収集することにより得
られる。一般に、ヒトの提供者から静脈血液をとり出
し、そして赤血球、血小板および血漿から単核細胞を分
離する器具に通し、前三者成分は提供者に戻される。こ
の単核細胞はプラスチツク製バツグに収集される。かく
して得られたPBMCをFicoll-Hypaque密度勾配分離により
分別する。次に細胞を適当な塩溶液例えばハンクスの平
衡塩類溶液（HBSS）（Gibco製、Grand Island,NY）で洗
いそして次に適当な培地、例えば、これもGibco社から
得られうるRPMI1640培地の中に1mM L-グルタミン溶液、
１％ペニシリン‐ストレプトマイシン溶液、１％ゲンタ
マイシン溶液および２〜10％の熱不活化されたプールさ
れたヒト血清（HIS）（上記％は別に断わりなければV/V
とする）を添加してものの中に再懸濁する。
再懸濁されたPBMCを好ましくは、密度勾配分離前にL-ア
ミノ酸低級アルキルエステルまたはその塩酸塩で処理す
る。このオプシヨン処理は密度勾配分離後に行うことも
できる。適当なL-アミノ酸低級アルキルエステルは、そ
のアミノ酸がフエニルアラニン、グルタミン酸、グルタ
ミンおよびチロシンから選択されるものである。L-アミ
ノ酸はフエニルアラニンまたはチロシンが好ましく、最
も好ましくはフエニルアラニンである。これら低級アル
キル基はメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブ
チル、イソブチルまたは第三ブチルであることができる
が、好ましくはメチルまたはエチルでありそして最も好
ましくはメチルである。PBMCは任意の適当な培地例えば
血清を含まないRPMI1640またはCaおよびMgを添加しない
HBSS中に再懸濁でき後者が好ましい。好ましくは、L-ア
ミノ酸低級アルキルエステルの塩酸塩をRPMI中に溶解さ
せそして生成する溶液をPMBCの懸濁液に添加するに先立
ちpH約7.4に調整する。アミノ酸低級アルキルエステル
は（PBMC懸濁液およびアミノ酸低級アルキルエステル溶
液の合一した総容量に基づき）約1mM〜約5mMの濃度で存
在する。PBMCとエステルとの接触は好ましくは20℃〜約
25℃の温度で実施される。PBMCをL-アミノ酸低級アルキ
ルエステルで処理すると単球の欠失が生じそしてまた比
較的高い細胞濃度でIL-2と培養した後に活性が高められ
た最終的なLAK細胞生成物を生ずる。このL-アミノ酸低
級アルキルエステル処理は米国特許出願第868,697号（1
986年５月30日出願）に詳細に記載されている。単球は
またPBMCをガラスビーズに通すような慣用の方法により
PBMCから欠失されることもできる。この方法で得られた
末梢血液リンパ球を好ましくは次に前記したアミノ酸低
級アルキルエステルで処理する。
ミノ酸低級アルキルエステルまたはその塩酸塩で処理す
る。このオプシヨン処理は密度勾配分離後に行うことも
できる。適当なL-アミノ酸低級アルキルエステルは、そ
のアミノ酸がフエニルアラニン、グルタミン酸、グルタ
ミンおよびチロシンから選択されるものである。L-アミ
ノ酸はフエニルアラニンまたはチロシンが好ましく、最
も好ましくはフエニルアラニンである。これら低級アル
キル基はメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブ
チル、イソブチルまたは第三ブチルであることができる
が、好ましくはメチルまたはエチルでありそして最も好
ましくはメチルである。PBMCは任意の適当な培地例えば
血清を含まないRPMI1640またはCaおよびMgを添加しない
HBSS中に再懸濁でき後者が好ましい。好ましくは、L-ア
ミノ酸低級アルキルエステルの塩酸塩をRPMI中に溶解さ
せそして生成する溶液をPMBCの懸濁液に添加するに先立
ちpH約7.4に調整する。アミノ酸低級アルキルエステル
は（PBMC懸濁液およびアミノ酸低級アルキルエステル溶
液の合一した総容量に基づき）約1mM〜約5mMの濃度で存
在する。PBMCとエステルとの接触は好ましくは20℃〜約
25℃の温度で実施される。PBMCをL-アミノ酸低級アルキ
ルエステルで処理すると単球の欠失が生じそしてまた比
較的高い細胞濃度でIL-2と培養した後に活性が高められ
た最終的なLAK細胞生成物を生ずる。このL-アミノ酸低
級アルキルエステル処理は米国特許出願第868,697号（1
986年５月30日出願）に詳細に記載されている。単球は
またPBMCをガラスビーズに通すような慣用の方法により
PBMCから欠失されることもできる。この方法で得られた
末梢血液リンパ球を好ましくは次に前記したアミノ酸低
級アルキルエステルで処理する。
本発明方法においては、末梢血液単核細胞またはそれか
ら得られる末梢血液リンパ球を好ましくは約35〜約39
℃、最も好ましくは37℃で約２〜７日間IL-2とインキユ
ベーシヨンする。培養は酸素透過性少なくとも約1.8×1
05μm3（STP）／（m2・秒・Pa）〔100cc（STP）／（24h
r-atm-100in2）〕および厚さ約0.04mmから約0.23mmを有
する共重合体フイルム物質から作られた密閉容器中で行
われる。この共重合体物質は （ａ）密度約0.915〜0.925g/cm3を有する、エチレンと
４〜10個の炭素原子を有するα‐オレフインとの共重合
体（いわゆる線状低密度ポリエチレン）、代表的なα‐
オレフインには1-ブテン、ヘキセン、1-オクテンおよび
1-デセンが包含される、 （ｂ）エチレンとメタクリル酸との共重合体、 （ｃ）イオノマー、例えばエチレンとアクリルまたはメ
タクリル酸またはそれらの誘導体との、ナトリウムまた
は亜鉛により中和された共重合体、および （ｄ）イオノマー／ポリエステルエラストマー及び直線
状低密度ポリエチレンエラストマーのラミネートまたは
同時押出し物、 からなる群から選択される。
ら得られる末梢血液リンパ球を好ましくは約35〜約39
℃、最も好ましくは37℃で約２〜７日間IL-2とインキユ
ベーシヨンする。培養は酸素透過性少なくとも約1.8×1
05μm3（STP）／（m2・秒・Pa）〔100cc（STP）／（24h
r-atm-100in2）〕および厚さ約0.04mmから約0.23mmを有
する共重合体フイルム物質から作られた密閉容器中で行
われる。この共重合体物質は （ａ）密度約0.915〜0.925g/cm3を有する、エチレンと
４〜10個の炭素原子を有するα‐オレフインとの共重合
体（いわゆる線状低密度ポリエチレン）、代表的なα‐
オレフインには1-ブテン、ヘキセン、1-オクテンおよび
1-デセンが包含される、 （ｂ）エチレンとメタクリル酸との共重合体、 （ｃ）イオノマー、例えばエチレンとアクリルまたはメ
タクリル酸またはそれらの誘導体との、ナトリウムまた
は亜鉛により中和された共重合体、および （ｄ）イオノマー／ポリエステルエラストマー及び直線
状低密度ポリエチレンエラストマーのラミネートまたは
同時押出し物、 からなる群から選択される。
好ましくは、前記共重合体フイルム物質は密度約0.915
〜0.925g/cm3を有する、エチレンと４〜10個の炭素原子
を有するα‐オレフインとの共重合体である。エチレン
と４〜10個の炭素原子を有するα‐オレフインとのこれ
ら共重合体は後者成分を約３〜５モル％有する。α‐オ
レフインは好ましくは1-ブテンまたは1-オクテン、最も
好ましくは1-オクテンである。適当な共重合体物質は低
温、すなわち約125℃〜約140℃でヒートシールされうる
ものでなければならない。容器の製造はこの要件に合致
する物質により促進される。
〜0.925g/cm3を有する、エチレンと４〜10個の炭素原子
を有するα‐オレフインとの共重合体である。エチレン
と４〜10個の炭素原子を有するα‐オレフインとのこれ
ら共重合体は後者成分を約３〜５モル％有する。α‐オ
レフインは好ましくは1-ブテンまたは1-オクテン、最も
好ましくは1-オクテンである。適当な共重合体物質は低
温、すなわち約125℃〜約140℃でヒートシールされうる
ものでなければならない。容器の製造はこの要件に合致
する物質により促進される。
前記容器の製作に用いるのに選択される共重合体フイル
ム物質の厚さはその共重合体物質の1mm当りの透過性お
よび機械的耐久性の如何によろう。例えば、その物質の
酸素透過性が比較的高いならば、比較的大きい厚みのも
のを使用できる。他方、特定の厚さでその物質の酸素透
過性がわずかに近い一方で機械的耐久性がむしろ高い場
合は、比較的厚みの少ないものを用いることができる。
密度0.915〜0.925g/cm3を有する、エチレンと1-ブテン
または1-オクテンとの共重合体では、そのフイルム物質
は厚さ約0.04mm〜約0.14mmを有しよう。前記共重合体フ
イルム物質は使用中に遭遇する程度のストレスに耐える
に充分に機械的耐久性を有すべきであり、半透明が好ま
しい。容器は約0.2〜約5lの細胞懸濁液を収容するに充
分な容量を有していなければならない。この容器は可撓
性バツグが好ましい。この容器は汚染からの妥当なレベ
ルでの保護を維持するためにクランプの使用等のような
当業上よく知られた方法により密閉されうる適当なアク
セス部またはチユーブを備えていることが好ましい。好
ましい態様においてはチユーブはヒートシートにより密
閉される。
ム物質の厚さはその共重合体物質の1mm当りの透過性お
よび機械的耐久性の如何によろう。例えば、その物質の
酸素透過性が比較的高いならば、比較的大きい厚みのも
のを使用できる。他方、特定の厚さでその物質の酸素透
過性がわずかに近い一方で機械的耐久性がむしろ高い場
合は、比較的厚みの少ないものを用いることができる。
密度0.915〜0.925g/cm3を有する、エチレンと1-ブテン
または1-オクテンとの共重合体では、そのフイルム物質
は厚さ約0.04mm〜約0.14mmを有しよう。前記共重合体フ
イルム物質は使用中に遭遇する程度のストレスに耐える
に充分に機械的耐久性を有すべきであり、半透明が好ま
しい。容器は約0.2〜約5lの細胞懸濁液を収容するに充
分な容量を有していなければならない。この容器は可撓
性バツグが好ましい。この容器は汚染からの妥当なレベ
ルでの保護を維持するためにクランプの使用等のような
当業上よく知られた方法により密閉されうる適当なアク
セス部またはチユーブを備えていることが好ましい。好
ましい態様においてはチユーブはヒートシートにより密
閉される。
これら共重合体物質はまたPBMCまたはPBLおよび培地と
相容性でなければならない。「相容性」とはその物質が
細胞または培地とは相互作用しないか、または細胞ある
いは受容者にとつて有害な化学薬品をその中に浸出させ
ない物質を意味する。
相容性でなければならない。「相容性」とはその物質が
細胞または培地とは相互作用しないか、または細胞ある
いは受容者にとつて有害な化学薬品をその中に浸出させ
ない物質を意味する。
本発明方法においては、懸濁液中におけるPBMCまたは末
梢血液リンパ球（PBL）を適当な培地およびIL-2と一緒
に容器に入れ、その容器を密閉して無菌性を維持し、そ
して得られる懸濁液を本明細書で先に記載した期間イン
キユベーシヨンする。PBMCまたはPBL、培地およびIL-2
を保持する容器を好ましくは約３〜約10容量％のCO2の
存在下、最も好ましくは５％のCO2の存在下に維持す
る。PBMCまたはPBLは培養中好ましくは約1.0×106〜約
５×107/ml、最も好ましくは約５×106〜約1.5×107/ml
の細胞濃度で懸濁される。適当な培地には血清またはヒ
ト血清アルブミン（HSA）が添加されたRPMI1640が包含
される。培地はHSAが添加されたRPMIが好ましく、治療
等級HSAが添加されたRPMIが最も好ましい。IL-2濃度は
約５×102〜約５×104pMが好ましく、最も好ましくは10
00pM〜約2000pMである。IL-2はrIL-2が好ましく、最も
好ましくはそのrIL-2はJurkat IL-2の比活性の少くとも
40％である少くとも約120,000単位/mgのIL-2比活性を有
し、実質的に水、rIL-2および場合によりポリオールか
らなるrIL-2組成物である。このrIL-2組成物は米国特許
出願第825,133号（1986年１月31日出願）に記載されて
いる。このrIL-2組成物は （ａ）高性能液体クロマトグラフイーによる精製後に凍
結乾燥されたrIL-2を水と混合して懸濁液を生成させ、
そして （ｂ）この懸濁液を約25℃〜約95℃で少くとも約２時間
加熱する、 ことからなる工程により製造される。
梢血液リンパ球（PBL）を適当な培地およびIL-2と一緒
に容器に入れ、その容器を密閉して無菌性を維持し、そ
して得られる懸濁液を本明細書で先に記載した期間イン
キユベーシヨンする。PBMCまたはPBL、培地およびIL-2
を保持する容器を好ましくは約３〜約10容量％のCO2の
存在下、最も好ましくは５％のCO2の存在下に維持す
る。PBMCまたはPBLは培養中好ましくは約1.0×106〜約
５×107/ml、最も好ましくは約５×106〜約1.5×107/ml
の細胞濃度で懸濁される。適当な培地には血清またはヒ
ト血清アルブミン（HSA）が添加されたRPMI1640が包含
される。培地はHSAが添加されたRPMIが好ましく、治療
等級HSAが添加されたRPMIが最も好ましい。IL-2濃度は
約５×102〜約５×104pMが好ましく、最も好ましくは10
00pM〜約2000pMである。IL-2はrIL-2が好ましく、最も
好ましくはそのrIL-2はJurkat IL-2の比活性の少くとも
40％である少くとも約120,000単位/mgのIL-2比活性を有
し、実質的に水、rIL-2および場合によりポリオールか
らなるrIL-2組成物である。このrIL-2組成物は米国特許
出願第825,133号（1986年１月31日出願）に記載されて
いる。このrIL-2組成物は （ａ）高性能液体クロマトグラフイーによる精製後に凍
結乾燥されたrIL-2を水と混合して懸濁液を生成させ、
そして （ｂ）この懸濁液を約25℃〜約95℃で少くとも約２時間
加熱する、 ことからなる工程により製造される。
本発明方法においては、培養期間中細胞懸濁液は充分な
酸素をすべての細胞に到達せしめる深さに維持される。
例えば、容器が血液用バツグの形態で製作された場合、
そのバツグは置き台と接触する側面に気体が入りうるよ
うに置き台上水平位置に保持される。この状況におい
て、細胞密度が低ければ懸濁液の深さは約4cmまでとり
うる。一方細胞密度が高い場合は深さは約0.5cmまたは
それ以下であろう。
酸素をすべての細胞に到達せしめる深さに維持される。
例えば、容器が血液用バツグの形態で製作された場合、
そのバツグは置き台と接触する側面に気体が入りうるよ
うに置き台上水平位置に保持される。この状況におい
て、細胞密度が低ければ懸濁液の深さは約4cmまでとり
うる。一方細胞密度が高い場合は深さは約0.5cmまたは
それ以下であろう。
これに先立ち、PBMCまたはPBLは慣用の硬質容器、例え
ばローラービン、T-フラスコ、ペトリ皿、クラスター皿
およびポリプロピレンチユーブ中で培養された。本発明
の好ましい態様においては、培養に用いられる容器は１
個またはそれ以上のアクセスチユーブを有していてこれ
が容器の滅菌に先立ちヒートシートされて閉じられる。
この態様においては、容器へのアクセスは米国特許第4,
369,779号に記載されるような滅菌連結装置を用いて得
ることができる。PBMCまたはPBL、培地およびrIL-2をア
クセスチユーブを通して容器に入れ、次にこのチユーブ
を滅菌連結装置の使用により密封する。インキユベーシ
ヨン期間経過後、滅菌連結装置の使用によりアクセスチ
ユーブを所望の移入容器に接続してLAK細胞をとり出し
うる。この方法でそのシステムの無菌性が維持されう
る。
ばローラービン、T-フラスコ、ペトリ皿、クラスター皿
およびポリプロピレンチユーブ中で培養された。本発明
の好ましい態様においては、培養に用いられる容器は１
個またはそれ以上のアクセスチユーブを有していてこれ
が容器の滅菌に先立ちヒートシートされて閉じられる。
この態様においては、容器へのアクセスは米国特許第4,
369,779号に記載されるような滅菌連結装置を用いて得
ることができる。PBMCまたはPBL、培地およびrIL-2をア
クセスチユーブを通して容器に入れ、次にこのチユーブ
を滅菌連結装置の使用により密封する。インキユベーシ
ヨン期間経過後、滅菌連結装置の使用によりアクセスチ
ユーブを所望の移入容器に接続してLAK細胞をとり出し
うる。この方法でそのシステムの無菌性が維持されう
る。
本発明方法により調製されたLAK細胞を製剤上受容され
うる担体例えば食塩水、５％正常ヒト血清アルブミン含
有食塩水、またはハンクス平衡塩類溶液中に懸濁し、腫
瘍患者に注入できる組成物を得ることができる。患者は
Rosenberg氏他により「The New England Journal of Me
dicine」313、1485〜1492（1985）に記載されるようにr
IL-2と同時治療される。その様式においては、患者の血
液をとり出し、白血球除去血輸血し、そして収穫した細
胞を直ちに３日間培養してLAK細胞を生成させる。次にL
AK細胞を患者に注入する。代表的には、約３×1010〜14
×1010個のLAK細胞を４〜９回注入する。インターロイ
キン‐２は体重1kg当り10,000、30,000または100,000単
位のような量で８時間毎に投与される。この治療は白血
球除去血輸血および再注入の２週間療法からなり、一般
的には第３週に反復回が開始される。組換えIL-2はLAK
細胞組成物中に包含されうる。
うる担体例えば食塩水、５％正常ヒト血清アルブミン含
有食塩水、またはハンクス平衡塩類溶液中に懸濁し、腫
瘍患者に注入できる組成物を得ることができる。患者は
Rosenberg氏他により「The New England Journal of Me
dicine」313、1485〜1492（1985）に記載されるようにr
IL-2と同時治療される。その様式においては、患者の血
液をとり出し、白血球除去血輸血し、そして収穫した細
胞を直ちに３日間培養してLAK細胞を生成させる。次にL
AK細胞を患者に注入する。代表的には、約３×1010〜14
×1010個のLAK細胞を４〜９回注入する。インターロイ
キン‐２は体重1kg当り10,000、30,000または100,000単
位のような量で８時間毎に投与される。この治療は白血
球除去血輸血および再注入の２週間療法からなり、一般
的には第３週に反復回が開始される。組換えIL-2はLAK
細胞組成物中に包含されうる。
本発明方法はLAK細胞に関して詳細に記載されている
が、TILの調製にも用いられうる。これらの細胞はRosen
berg氏他の「Science」233、1318〜1321（1986）記載の
方法により得られうる。この方法においては、細胞懸濁
液は腫瘍組織の１〜2mm片から得られる。この細胞懸濁
液は次に本発明方法に従つてではあるがしかしL-アミン
酸低級アルキルエステルでのオプシヨン処理を行うこと
なく培養されうる。
が、TILの調製にも用いられうる。これらの細胞はRosen
berg氏他の「Science」233、1318〜1321（1986）記載の
方法により得られうる。この方法においては、細胞懸濁
液は腫瘍組織の１〜2mm片から得られる。この細胞懸濁
液は次に本発明方法に従つてではあるがしかしL-アミン
酸低級アルキルエステルでのオプシヨン処理を行うこと
なく培養されうる。
本発明をここに記載の詳細な実施例により説明するが、
本発明はそれらに限定されるものではない。以下の実施
例において別に断わりなければすべての％は容量による
ものとしそして温度は摂氏によるものとする。
本発明はそれらに限定されるものではない。以下の実施
例において別に断わりなければすべての％は容量による
ものとしそして温度は摂氏によるものとする。
細胞毒性の検定 別に断わりなければ、腫瘍細胞に対するLAK細胞の細胞
毒性を測定するために４時間51Cr放出アツセイが用いら
れた。約２×106〜10×106濃度の腫瘍細胞をトリス−燐
酸塩緩衝食塩水0.4ml中の100μCiのNa2 51CrO4と37℃で
１時間インキユベートした。この細胞を５％または10％
ウシ胎児血清（FCS）を含有するRPMI1640を用いて３回
洗い、そしてRMPI-20％FCSまたはRPMI-10％FCS中に細胞
105個/mlに再懸濁させた。エフエクター細胞（LAK細
胞）を種種の濃度に懸濁させ、そして0.1mlを丸底ミク
ロ滴定プレートのウエル中に加えた。全てのウエルに51
Cr標識された標的細胞（0.1ml）を加えそしてこのプレ
ートを200×ｇで５分間遠心分離した。37℃で４時間イ
ンキユベーシヨンしたのち、プレートを再び遠心分離し
そして得られる上澄み液の0.1mlを各ウエルからとり出
してガンマカウンターで計測した。細胞毒性％は下記の
式から計算される。
毒性を測定するために４時間51Cr放出アツセイが用いら
れた。約２×106〜10×106濃度の腫瘍細胞をトリス−燐
酸塩緩衝食塩水0.4ml中の100μCiのNa2 51CrO4と37℃で
１時間インキユベートした。この細胞を５％または10％
ウシ胎児血清（FCS）を含有するRPMI1640を用いて３回
洗い、そしてRMPI-20％FCSまたはRPMI-10％FCS中に細胞
105個/mlに再懸濁させた。エフエクター細胞（LAK細
胞）を種種の濃度に懸濁させ、そして0.1mlを丸底ミク
ロ滴定プレートのウエル中に加えた。全てのウエルに51
Cr標識された標的細胞（0.1ml）を加えそしてこのプレ
ートを200×ｇで５分間遠心分離した。37℃で４時間イ
ンキユベーシヨンしたのち、プレートを再び遠心分離し
そして得られる上澄み液の0.1mlを各ウエルからとり出
してガンマカウンターで計測した。細胞毒性％は下記の
式から計算される。
各変数を３回検査し、そして得られるデータを細胞毒性
％として表示する。この細胞毒性検査は「Selected Met
hods in Cellular Immunology」、MishellおよびShiigi
編、124〜137、W.H.Freeman and Co.、San Francisco
（1980）に詳細に記載されている。
％として表示する。この細胞毒性検査は「Selected Met
hods in Cellular Immunology」、MishellおよびShiigi
編、124〜137、W.H.Freeman and Co.、San Francisco
（1980）に詳細に記載されている。
他の実験においては、アツセイ結果はLAK細胞と標的細
胞を一緒にして37℃で４時間インキユベーシヨンした場
合に標的細胞の30％が殺される場合のエフエクター細胞
100当りの標的細胞数である、「溶解単位」（LUまたはL
U 30）として表わされる。LUの計算はPross氏他の「Jou
rnal of Immunological Methods」68、235〜249（198
4）記載の方法に基づく。LUの数字が大きければ大きい
程、LAK細胞調製物の効力が大きい。
胞を一緒にして37℃で４時間インキユベーシヨンした場
合に標的細胞の30％が殺される場合のエフエクター細胞
100当りの標的細胞数である、「溶解単位」（LUまたはL
U 30）として表わされる。LUの計算はPross氏他の「Jou
rnal of Immunological Methods」68、235〜249（198
4）記載の方法に基づく。LUの数字が大きければ大きい
程、LAK細胞調製物の効力が大きい。
実施例１〜９および比較例Ａ〜Ｆ PBMCは２人の健康な、同意を得たヒト提供者から採取し
たACD-凝固阻止静脈血のFicoll-Hypaque分離により得ら
れた。一方の提供者から得られた細胞はL-フエニルアラ
ニンメチルエステルで処理しもう一方の提供者からの細
胞は処理しなかつた。このメチルエステル処理は細胞を
HBSSで３回洗浄しそして得られる洗浄された細胞を1mM
L-グルタミン、0.1％ゲンタマイシン溶液、10％FCSおよ
び5mM L-フエニルアラニンメチルエステルを添加したRP
MI1640培地中に再懸濁させることにより行われた。得ら
れる細胞懸濁液を周囲温度（約22℃）で40分間インキユ
ベートし、次に細胞をHBSSで３回洗つた。
たACD-凝固阻止静脈血のFicoll-Hypaque分離により得ら
れた。一方の提供者から得られた細胞はL-フエニルアラ
ニンメチルエステルで処理しもう一方の提供者からの細
胞は処理しなかつた。このメチルエステル処理は細胞を
HBSSで３回洗浄しそして得られる洗浄された細胞を1mM
L-グルタミン、0.1％ゲンタマイシン溶液、10％FCSおよ
び5mM L-フエニルアラニンメチルエステルを添加したRP
MI1640培地中に再懸濁させることにより行われた。得ら
れる細胞懸濁液を周囲温度（約22℃）で40分間インキユ
ベートし、次に細胞をHBSSで３回洗つた。
L-フエニルアラニンメチルエステルを用いて単球欠失さ
せることにより得られるPBMCまたはPBLをT-フラスコ（T
-25）（比較物）、または密度0.918g/cm3および名目容
量200mlを有し、エチレン（約97モル％）および1-オク
テンの共重合体から製作された密閉バツグ（LLDPE）中
で10％FCS添加RPMI 1640 10ml中で培養した。同様の組
成をした0.12mmの厚さのLLDPE物質は米国特許第4,496,3
61号実施例５の記載によれば、酸素透過性2.6×105μm3
（STP）／（m2・秒・Pa）を有することが知られてい
る。培養は10単位/mlのrIL-2の存在下に５％CO2中37℃
で行われた。IL-2の１単位はGehmans氏他の「Journal o
f Immunological Methods」74、39〜47（1984）により
詳しく記載されているようにJurkat IL-2に対して標準
化されたマウス腫瘍特異的な細胞毒性T-細胞系統（CTL
L）による、放射性標識（トリチウム）されたチミジン
の50％とり込みを刺激するのに必要なIL-2の量であると
定義される。
せることにより得られるPBMCまたはPBLをT-フラスコ（T
-25）（比較物）、または密度0.918g/cm3および名目容
量200mlを有し、エチレン（約97モル％）および1-オク
テンの共重合体から製作された密閉バツグ（LLDPE）中
で10％FCS添加RPMI 1640 10ml中で培養した。同様の組
成をした0.12mmの厚さのLLDPE物質は米国特許第4,496,3
61号実施例５の記載によれば、酸素透過性2.6×105μm3
（STP）／（m2・秒・Pa）を有することが知られてい
る。培養は10単位/mlのrIL-2の存在下に５％CO2中37℃
で行われた。IL-2の１単位はGehmans氏他の「Journal o
f Immunological Methods」74、39〜47（1984）により
詳しく記載されているようにJurkat IL-2に対して標準
化されたマウス腫瘍特異的な細胞毒性T-細胞系統（CTL
L）による、放射性標識（トリチウム）されたチミジン
の50％とり込みを刺激するのに必要なIL-2の量であると
定義される。
培養終了後、生成するLAK細胞を収穫しそして10％FCS添
加RPMI中に再懸濁して、標的細胞（Ｔ）としてダウデイ
（Daudi）細胞（Ｄ）（NK抵抗性細胞系統）、メラノー
マ細胞（Ｍ）、およびリンパ腫細胞（Ｌ）を用いて細胞
毒性をアツセイした。結果を第１表に示す。表中「Ｅ」
はエフエクター細胞、すなわちLAK細胞を指す。PBMCを
フエニルアラニンメチルエステル（PME）で処理する実
験はそう表示されている。
加RPMI中に再懸濁して、標的細胞（Ｔ）としてダウデイ
（Daudi）細胞（Ｄ）（NK抵抗性細胞系統）、メラノー
マ細胞（Ｍ）、およびリンパ腫細胞（Ｌ）を用いて細胞
毒性をアツセイした。結果を第１表に示す。表中「Ｅ」
はエフエクター細胞、すなわちLAK細胞を指す。PBMCを
フエニルアラニンメチルエステル（PME）で処理する実
験はそう表示されている。
実施例10〜12および比較例Ｇ PBMCは健常な、同意を得たヒト提供者からの白血球除去
血輸血によるか、またはアメリカ赤十字全血検体から集
めた。いずれの場合もPMMCはACD抗凝固剤により凝固阻
止された静脈血から得た。このPBMCをFicoll-Hypaque密
度勾配遠心分離により他の血液成分から分離した。PBMC
調製物のいくつかをL-フエニルアラニンメチルエステル
（PME）で処理して単球を除去した。このメチルエステ
ル処理は細胞をHBSSで３回洗いそして得られる洗浄され
た細胞を1mM L-グルタミン、0.1％ゲンタマイシン溶
液、10％FCSおよび5mM L-フエニルアラニンメチルエス
テルを添加したRPMI 1640培地中に再懸濁させることに
より達成された。かくして得られた細胞懸濁液を周囲温
度で40分間インキユベートし、続いて得られる細胞をHB
SSで３回洗浄しそしてL-グルタミン、ゲンタマイシンお
よび10％FCSを含有するRPMI 1640培地中に再懸濁させ
た。
血輸血によるか、またはアメリカ赤十字全血検体から集
めた。いずれの場合もPMMCはACD抗凝固剤により凝固阻
止された静脈血から得た。このPBMCをFicoll-Hypaque密
度勾配遠心分離により他の血液成分から分離した。PBMC
調製物のいくつかをL-フエニルアラニンメチルエステル
（PME）で処理して単球を除去した。このメチルエステ
ル処理は細胞をHBSSで３回洗いそして得られる洗浄され
た細胞を1mM L-グルタミン、0.1％ゲンタマイシン溶
液、10％FCSおよび5mM L-フエニルアラニンメチルエス
テルを添加したRPMI 1640培地中に再懸濁させることに
より達成された。かくして得られた細胞懸濁液を周囲温
度で40分間インキユベートし、続いて得られる細胞をHB
SSで３回洗浄しそしてL-グルタミン、ゲンタマイシンお
よび10％FCSを含有するRPMI 1640培地中に再懸濁させ
た。
メチルエステルを用いて単球欠失させることにより得ら
れるPBMCまたはPBLをT-フラスコ（比較例Ｇ）中または
密度0.918g/cm3、名目容量200mlおよびフイルム厚さ0.1
3mm（５ミル）を有する、エチレン（約97モル％）およ
び1-オクテンの共重合体のフイルムから製作された密閉
バツグ（LLDPE）中10mlで培養した。培養は10単位/mlの
rIL-2の存在下に５％CO2雰囲気中37℃で行われた。
れるPBMCまたはPBLをT-フラスコ（比較例Ｇ）中または
密度0.918g/cm3、名目容量200mlおよびフイルム厚さ0.1
3mm（５ミル）を有する、エチレン（約97モル％）およ
び1-オクテンの共重合体のフイルムから製作された密閉
バツグ（LLDPE）中10mlで培養した。培養は10単位/mlの
rIL-2の存在下に５％CO2雰囲気中37℃で行われた。
培養終了後、生成するLAK細胞を収穫しそして10％FCSを
添加したRPMI 1640中に再懸濁して、標的細胞（Ｔ）と
してラジ（Raji）細胞系統を用いて細胞毒性についてア
ツセイした。結果を第２表に示す。表中「SD」は標準偏
差を意味する。高い標準偏差は提供者のばらつきを反映
するものと思われる。
添加したRPMI 1640中に再懸濁して、標的細胞（Ｔ）と
してラジ（Raji）細胞系統を用いて細胞毒性についてア
ツセイした。結果を第２表に示す。表中「SD」は標準偏
差を意味する。高い標準偏差は提供者のばらつきを反映
するものと思われる。
実施例13 これらの実験は実施例10〜12に示されると同様の操作を
用いて実施された。６人の提供者からのPBMCを調製して
T-フラスコ（比較物）またはLLDPEバツグ中で培養し
た。PBMCはL-フエニルアラニンメチルエステルでの処理
は何ら行わなかつた。標的としてラジ細胞を用いる細胞
毒性アツセイにより測定した、溶解単位を用いた結果を
第３表に示す。略語「nt」はその細胞を特定の装置で検
査しなかつたことを示す。
用いて実施された。６人の提供者からのPBMCを調製して
T-フラスコ（比較物）またはLLDPEバツグ中で培養し
た。PBMCはL-フエニルアラニンメチルエステルでの処理
は何ら行わなかつた。標的としてラジ細胞を用いる細胞
毒性アツセイにより測定した、溶解単位を用いた結果を
第３表に示す。略語「nt」はその細胞を特定の装置で検
査しなかつたことを示す。
実施例14 別に記載がある以外は実施例10〜12の記載と同様の操作
を用いて実施した。４人の提供者からのPBMCをそれぞれ
２等分した。それぞれの場合に一方の部分をL-フエニル
アラニンメチルエステル（PME）で処理しそしてもう一
方は直接培養にかけた。培養は密閉LLDPEバツグ中で行
われた。結果を第４表に示す。
を用いて実施した。４人の提供者からのPBMCをそれぞれ
２等分した。それぞれの場合に一方の部分をL-フエニル
アラニンメチルエステル（PME）で処理しそしてもう一
方は直接培養にかけた。培養は密閉LLDPEバツグ中で行
われた。結果を第４表に示す。
実施例15 別に記載がある以外は実施例10〜12の記載と同様の操作
を用いて実施した。３人の提供者からのPBMCを、比較的
高い細胞密度、例えば、１×106〜１×107でT-フリラコ
中におけるLAK細胞活性化とLLDPEバツグ中における活性
化とを比較するために用いた。結果を第５表に示す。
を用いて実施した。３人の提供者からのPBMCを、比較的
高い細胞密度、例えば、１×106〜１×107でT-フリラコ
中におけるLAK細胞活性化とLLDPEバツグ中における活性
化とを比較するために用いた。結果を第５表に示す。
実施例16〜18および比較例Ｈ 実施例１〜９記載の方法と同様にして、 （ａ）密度約0.918g/cm3を有する、エチレン（約97モル
％）と1-オクテンとの共重合体、 （ｂ）エチレン‐メタクリル酸共重合体（Nucrell0903
ポリマー、Du Pont社製品）、 （ｃ）イオノマー（サーリン（Surlyn）共重合体、Du P
ont社製品）、および （ｄ）ポリ塩化ビニル（PVC）（比較物） なる共重合体から製作された寸法約10in2のバツグ中で
４日間PBMCを培養することによりLAK細胞を生成させ
る。PBMC細胞は５×106個/mlの濃度で存在しそして培養
液体50mlが用いられた。ラジ細胞が標的細胞として使用
された。結果を第６表に示す。細胞毒性はcpm（１分当
りのカウント）により示される。
％）と1-オクテンとの共重合体、 （ｂ）エチレン‐メタクリル酸共重合体（Nucrell0903
ポリマー、Du Pont社製品）、 （ｃ）イオノマー（サーリン（Surlyn）共重合体、Du P
ont社製品）、および （ｄ）ポリ塩化ビニル（PVC）（比較物） なる共重合体から製作された寸法約10in2のバツグ中で
４日間PBMCを培養することによりLAK細胞を生成させ
る。PBMC細胞は５×106個/mlの濃度で存在しそして培養
液体50mlが用いられた。ラジ細胞が標的細胞として使用
された。結果を第６表に示す。細胞毒性はcpm（１分当
りのカウント）により示される。
実施例19 これらの実験における検査は異なる組成および厚さを有
するフイルムの評価ができるフイルムテスト室で行われ
た。この室は外径４インチ、内径２インチ、深さ２イン
チのポリカーボネート製円筒の上に構成された。この室
を蒸気滅菌した。次に照射滅菌した検査用フイルムを一
方の端に機械的に固定し、圧力シールして液体の損失を
阻止した。フイルム端を下にして室を位置させ、培養す
べき細胞および培地の懸濁液を加えた。次に第１番目と
同じ組成および厚さの第２の滅菌フイルムを室の頂部に
おき、ぴつたり留めて漏出を阻止した。実施例１〜９記
載の操作と同様にして、かかる室内でPBLを培養した。
するフイルムの評価ができるフイルムテスト室で行われ
た。この室は外径４インチ、内径２インチ、深さ２イン
チのポリカーボネート製円筒の上に構成された。この室
を蒸気滅菌した。次に照射滅菌した検査用フイルムを一
方の端に機械的に固定し、圧力シールして液体の損失を
阻止した。フイルム端を下にして室を位置させ、培養す
べき細胞および培地の懸濁液を加えた。次に第１番目と
同じ組成および厚さの第２の滅菌フイルムを室の頂部に
おき、ぴつたり留めて漏出を阻止した。実施例１〜９記
載の操作と同様にして、かかる室内でPBLを培養した。
検査を行つたところ、この室は同じフイルム、細胞密度
および培地深度で行われたバツグと同等であることが示
された。代表的な操作では前記室で用いられたLLDPEフ
イルムはLU 30 6.5を示すが、同じ組成のバツグは5.4で
あつた。これらの室においてLAK活性化は厚さ0.05、0.1
3、0.18および25mm（２、５、7.5、10ミル）を有するサ
ーリン1601イオノマーフイルム（DU Pont社製品）を用
いて行われた。これらのフイルムは透過率それぞれ約34
0、136、88および68cc/24時間・気圧・100in2を有して
いた。LU 30の結果はそれぞれ15、11、7.4および３であ
つた。
および培地深度で行われたバツグと同等であることが示
された。代表的な操作では前記室で用いられたLLDPEフ
イルムはLU 30 6.5を示すが、同じ組成のバツグは5.4で
あつた。これらの室においてLAK活性化は厚さ0.05、0.1
3、0.18および25mm（２、５、7.5、10ミル）を有するサ
ーリン1601イオノマーフイルム（DU Pont社製品）を用
いて行われた。これらのフイルムは透過率それぞれ約34
0、136、88および68cc/24時間・気圧・100in2を有して
いた。LU 30の結果はそれぞれ15、11、7.4および３であ
つた。
以上本発明を詳細に説明したが本発明はさらに次の実施
態様によってこれを要約して示すことができる。
態様によってこれを要約して示すことができる。
１）末梢血液単核細胞、または腫瘍組織からのリンパ球
を培養してナチユラルキラー細胞抵抗性の腫瘍細胞に対
して細胞毒性を有する細胞の集団を生成させるに当た
り、 （ａ）密度約0.915〜0.925g/cm3を有する、エチレンと
４〜10個の炭素原子を有するα−オレフインとの共重合
体、 （ｂ）エチレンとメチクリル酸との共重合体、 （ｃ）イオノマー、および （ｄ）イオノマー／ポリエステルエラストマーおよび線
状低密度ポリエチレンエラストマーのラミネートまたは
同時押出し物、からなる群から選択され、酸素透過性少
なくとも約1.8×105μm3（STP）／（m2・秒・Pa）およ
び厚さ約0.04mm〜約0.23mmを有する共重合体フイルム物
質から作られた密閉容器中で、末梢血液単核細胞、それ
から得られる末梢血液リンパ球および腫瘍組織から得ら
れるリンパ球からなる群から選択される細胞の集団を細
胞濃度少なくとも約1.0×106/mlで培養することからな
る方法。
を培養してナチユラルキラー細胞抵抗性の腫瘍細胞に対
して細胞毒性を有する細胞の集団を生成させるに当た
り、 （ａ）密度約0.915〜0.925g/cm3を有する、エチレンと
４〜10個の炭素原子を有するα−オレフインとの共重合
体、 （ｂ）エチレンとメチクリル酸との共重合体、 （ｃ）イオノマー、および （ｄ）イオノマー／ポリエステルエラストマーおよび線
状低密度ポリエチレンエラストマーのラミネートまたは
同時押出し物、からなる群から選択され、酸素透過性少
なくとも約1.8×105μm3（STP）／（m2・秒・Pa）およ
び厚さ約0.04mm〜約0.23mmを有する共重合体フイルム物
質から作られた密閉容器中で、末梢血液単核細胞、それ
から得られる末梢血液リンパ球および腫瘍組織から得ら
れるリンパ球からなる群から選択される細胞の集団を細
胞濃度少なくとも約1.0×106/mlで培養することからな
る方法。
２）培養される細胞の集団が末梢血液単核細胞およびそ
れから得られる末梢血液リンパ球からなる群から選択さ
れる前項１記載の方法。
れから得られる末梢血液リンパ球からなる群から選択さ
れる前項１記載の方法。
３）前記末梢血液単核細胞または末梢血液リンパ球がヒ
トの細胞である前項２記載の方法。
トの細胞である前項２記載の方法。
４）前記末梢血液単核細胞またはそれから得られる末梢
血液リンパ球が約500pM〜50000pMの濃度の組み換えイン
ターロイキン−２の存在下に２〜７日間培養されること
からなる前項３記載の方法。
血液リンパ球が約500pM〜50000pMの濃度の組み換えイン
ターロイキン−２の存在下に２〜７日間培養されること
からなる前項３記載の方法。
５）前記末梢血液単核細胞または末梢血液リンパ球が約
35〜約39℃の温度で培養される前項４記載の方法。
35〜約39℃の温度で培養される前項４記載の方法。
６）前記末梢血液単核細胞または末梢血液リンパ球が約
３〜約10容量％のCO2の存在下に培養される前項５記載
の方法。
３〜約10容量％のCO2の存在下に培養される前項５記載
の方法。
７）末梢血液リンパ球が用いられる前項６記載の方法。
８）前記末梢血液リンパ球の濃度が細胞約１×106〜約
５×107個/mlである前項７記載の方法。
５×107個/mlである前項７記載の方法。
９）前記末梢血液リンパ球が３〜５日間培養される前項
８記載の方法。
８記載の方法。
10）前記組み換えインターロイキン−２の濃度が約1000
pM〜約2000pMである前項９記載方法。
pM〜約2000pMである前項９記載方法。
11）前記共重合体フイルム物質が密度約0.915〜0.925g/
cm3を有する、エチレンと４〜10個の炭素原子を有する
α−オレフインとの共重合体から本質的になる前項10記
載の方法。
cm3を有する、エチレンと４〜10個の炭素原子を有する
α−オレフインとの共重合体から本質的になる前項10記
載の方法。
12）前記４〜10個の炭素原子を有するα−オレフインが
１−ブテンまたは１−オクテンであり、そして前記共重
合体フイルム物質が厚さ約0.04mm〜約0.14mmを有する前
項11記載の方法。
１−ブテンまたは１−オクテンであり、そして前記共重
合体フイルム物質が厚さ約0.04mm〜約0.14mmを有する前
項11記載の方法。
13）前記４〜10個の炭素原子を有するα−オレフインが
１−オクテンである前項12記載の方法。
１−オクテンである前項12記載の方法。
14）前記容器がヒートシールにより密閉される前項13記
載の方法。
載の方法。
15）前記末梢血液リンパ球の濃度が細胞約５×106〜約
1.5×107/mlである前項14記載の方法。
1.5×107/mlである前項14記載の方法。
16）前記末梢血液リンパ球がヒト血清アルブミンを補充
されたRPMI 1640培地中で培養される前項15記載の方
法。
されたRPMI 1640培地中で培養される前項15記載の方
法。
17）培養に先立ち、前記末梢血液単核細胞または末梢血
液リンパ球を、フエニルアラニン、グルタミン酸、グル
タミンおよびチロシンおよびそれらの混合物からなる群
から選択されるＬ−アミノ酸の低級アルキルエステルま
たはその塩酸塩と接触させる前項１記載の方法。
液リンパ球を、フエニルアラニン、グルタミン酸、グル
タミンおよびチロシンおよびそれらの混合物からなる群
から選択されるＬ−アミノ酸の低級アルキルエステルま
たはその塩酸塩と接触させる前項１記載の方法。
18）培養に先立ち、前記末梢血液単核細胞または末梢血
液リンパ球を、フエニルアラニン、グルタミン酸、グル
タミンおよびチロシンおよびそれらの混合物からなる群
から選択されるＬ−アミノ酸の低級アルキルエステルま
たはその塩酸塩と接触させる前項２記載の方法。
液リンパ球を、フエニルアラニン、グルタミン酸、グル
タミンおよびチロシンおよびそれらの混合物からなる群
から選択されるＬ−アミノ酸の低級アルキルエステルま
たはその塩酸塩と接触させる前項２記載の方法。
19）培養に先立ち、前記末梢血液単核細胞または末梢血
液リンパ球を、フエニルアラニン、グルタミン酸、グル
タミンおよびチロシンおよびそれらの混合物からなる群
から選択されるＬ−アミノ酸の低級アルキルエステルま
たはその塩酸塩と接触させる前項３記載の方法。
液リンパ球を、フエニルアラニン、グルタミン酸、グル
タミンおよびチロシンおよびそれらの混合物からなる群
から選択されるＬ−アミノ酸の低級アルキルエステルま
たはその塩酸塩と接触させる前項３記載の方法。
20）培養に先立ち、前記末梢血液単核細胞または末梢血
液リンパ球を、フエニルアラニン、グルタミン酸、グル
タミンおよびチロシンおよびそれらの混合物からなる群
から選択されるＬ−アミノ酸の低級アルキルエステルま
たはその塩酸塩と接触させる前項４記載の方法。
液リンパ球を、フエニルアラニン、グルタミン酸、グル
タミンおよびチロシンおよびそれらの混合物からなる群
から選択されるＬ−アミノ酸の低級アルキルエステルま
たはその塩酸塩と接触させる前項４記載の方法。
21）培養に先立ち、前記末梢血液単核細胞または末梢血
液リンパ球を、フエニルアラニン、グルタミン酸、グル
タミンおよびチロシンおよびそれらの混合物からなる群
から選択されるＬ−アミノ酸の低級アルキルエステルま
たはその塩酸塩と接触させる前項５記載の方法。
液リンパ球を、フエニルアラニン、グルタミン酸、グル
タミンおよびチロシンおよびそれらの混合物からなる群
から選択されるＬ−アミノ酸の低級アルキルエステルま
たはその塩酸塩と接触させる前項５記載の方法。
22）培養に先立ち、前記末梢血液単核細胞または末梢血
液リンパ球を、フエニルアラニン、グルタミン酸、グル
タミンおよびチロシンおよびそれらの混合物からなる群
から選択されるＬ−アミノ酸の低級アルキルエステルま
たはその塩酸塩と接触させる前項６記載の方法。
液リンパ球を、フエニルアラニン、グルタミン酸、グル
タミンおよびチロシンおよびそれらの混合物からなる群
から選択されるＬ−アミノ酸の低級アルキルエステルま
たはその塩酸塩と接触させる前項６記載の方法。
23）培養に先立ち、前記末梢血液リンパ球を、フエニル
アラニン、グルタミン酸、グルタミンおよびチロシンお
よびそれらの混合物からなる群から選択されるＬ−アミ
ノ酸の低級アルキルエステルまたはその塩酸塩と接触さ
せる前項11記載の方法。
アラニン、グルタミン酸、グルタミンおよびチロシンお
よびそれらの混合物からなる群から選択されるＬ−アミ
ノ酸の低級アルキルエステルまたはその塩酸塩と接触さ
せる前項11記載の方法。
24）培養に先立ち、前記末梢血液リンパ球を、フエニル
アラニン、グルタミン酸、グルタミンおよびチロシンお
よびそれらの混合物からなる群から選択されるＬ−アミ
ノ酸の低級アルキルエステルまたはその塩酸塩と接触さ
せる前項13記載の方法。
アラニン、グルタミン酸、グルタミンおよびチロシンお
よびそれらの混合物からなる群から選択されるＬ−アミ
ノ酸の低級アルキルエステルまたはその塩酸塩と接触さ
せる前項13記載の方法。
25）培養に先立ち、前記末梢血液リンパ球を、フエニル
アラニン、グルタミン酸、グルタミンおよびチロシンお
よびそれらの混合物からなる群から選択されるＬ−アミ
ノ酸の低級アルキルエステルまたはその塩酸塩と接触さ
せる前項16記載の方法。
アラニン、グルタミン酸、グルタミンおよびチロシンお
よびそれらの混合物からなる群から選択されるＬ−アミ
ノ酸の低級アルキルエステルまたはその塩酸塩と接触さ
せる前項16記載の方法。
26）前記Ｌ−アミノ酸低級アルキルエステルがフエニル
アラニンメチルエステルである前項17記載の方法。
アラニンメチルエステルである前項17記載の方法。
27）前記Ｌ−アミノ酸低級アルキルエステルがフエニル
アラニンメチルエステルである前項18記載の方法。
アラニンメチルエステルである前項18記載の方法。
28）前記Ｌ−アミノ酸低級アルキルエステルがフエニル
アラニンメチルエステルである前項19記載の方法。
アラニンメチルエステルである前項19記載の方法。
29）前記Ｌ−アミノ酸低級アルキルエステルがフエニル
アラニンメチルエステルである前項22記載の方法。
アラニンメチルエステルである前項22記載の方法。
30）前記Ｌ−アミノ酸低級アルキルエステルがフエニル
アラニンメチルエステルである前項23記載の方法。
アラニンメチルエステルである前項23記載の方法。
31）前記Ｌ−アミノ酸低級アルキルエステルがフエニル
アラニンメチルエステルである前項25記載の方法。
アラニンメチルエステルである前項25記載の方法。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (6)
- 【請求項１】末梢血液単核細胞、または腫瘍組織からの
リンパ球を培養してナチユラルキラー細胞抵抗性の腫瘍
細胞に対して細胞毒性を有する細胞の集団を生成させる
に当たり、 （ａ）密度約0.915〜0.925g/cm3を有する、エチレンと
４〜10個の炭素原子を有するα−オレフインとの共重合
体、 （ｂ）エチレンとメタクリル酸との共重合体、 （ｃ）イオノマー、および （ｄ）イオノマー／ポリエステルエラストマーおよび線
状低密度ポリエチレンエラストマーのラミネートまたは
同時押出し物 からなる群から選択され、酸素透過性少なくとも約1.8
×105μm3（STP）／（m2・秒・Pa）および厚さ約0.04mm
〜約0.23mmを有する共重合体フイルム物質から作られた
密閉容器中で、末梢血液単核細胞、それから得られる末
梢血液リンパ球および腫瘍組織から得られるリンパ球か
らなる群から選択される細胞の集団を細胞濃度少なくと
も約５×106/mlで培養することからなる方法。 - 【請求項２】ヒトの細胞である前期末梢血液単核細胞ま
たはそれから得られる末梢血液リンパ球が約500pM〜50,
000pMの濃度の組み換えインターロイキン−２の存在下
に２〜７日間培養されることからなる請求項１記載の方
法。 - 【請求項３】前記末梢血液単核細胞または末梢血液リン
パ球が約３〜約10容量％のCO2の存在下約35〜39℃の温
度で培養される請求項２記載の方法。 - 【請求項４】前記４〜10個の炭素原子を有するα−オレ
フインが１−ブテンまたは１−オクテンであり、そして
前記共重合体フイルム物質が厚さ0.04mm〜約0.14mmを有
する請求項１記載の方法。 - 【請求項５】培養に先立ち、前記末梢血液単核細胞また
は末梢血液リンパ球を、フエニルアラニン、グルタミン
酸、グルタミンおよびチロシンおよびそれらの混合物か
らなる群から選択されるＬ−アミノ酸の低級アルキルエ
ステルまたはその塩酸塩と接触させる請求項１記載の方
法。 - 【請求項６】前記Ｌ−アミノ酸低級アルキルエステルが
フエニルアラニンメチルエステルである請求項５記載の
方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US827387A | 1987-01-29 | 1987-01-29 | |
| US8,273 | 1987-01-29 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63202378A JPS63202378A (ja) | 1988-08-22 |
| JPH06104060B2 true JPH06104060B2 (ja) | 1994-12-21 |
Family
ID=21730714
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63017516A Expired - Fee Related JPH06104060B2 (ja) | 1987-01-29 | 1988-01-29 | 活性化キラー細胞の製法 |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0280054B1 (ja) |
| JP (1) | JPH06104060B2 (ja) |
| KR (1) | KR900004421B1 (ja) |
| AT (1) | ATE82319T1 (ja) |
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