DE3875845T2 - Neues hypoglykaemisches und wachstum anregendes mittel. - Google Patents

Description

• Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Steigerung der pharmakologischen Wirksamkeit des Hormons Insulin.
• Es gibt derzeit eine Reihe von nicht insulinhaltigen hypoglykämischen Mitteln, die unlängst geprüft wurden (Asmal et al, Drugs, 28, 62-78 (1984) und Wolf et al, Diabetologia, 22, 456-463 (1982)). Die Sulfonylharn-Stoff-Mittel stimulieren die Insulinausschüttung aus dem Pankreas und üben andere, bisher unbestimmte, periphere Wirkungen aus; die Biguanide hemmen Glukoneogenese, intestinale Glukoseabsorption sowie mitochondriale Oxidation; 2-Brompalmitat, ω-Methyl-2-Tetradecylglycerat, B807-27 sowie Acyl-Aminokarnitine beeinträchtigen das Carnitin-Palmitoyl-Transferase-I-Enzym, das die Oxidation höherer Fettsäure hemmt.
• Insulin ist ein Polypeptidhormon mit einem Molekulargewicht von 6000 Dalton, das aus dem Pankreas ausgeschüttet wird und bei der Erhaltung der Glucose-Homöostase eine Rolle spielt.
• Diabetiker müssen mit Insulin oder anderen hypoglykämischen Mitteln behandelt werden, wenn Insulin entweder nicht produziert (Diabetes Typ I) oder unangemessen verwertet wird (Diabetes Typ II), um die zahlreichen schädlichen Auswirkungen erhöhter Blutzucker-Spiegel und von Stoffwechselstörungen zurückzuhalten. Man hat eindeutig erkannt, daß eine Vielzahl pathologischer Störungen zum Diabetes führen können. Kürzlich wurde eine Übersicht darüber und über derzeitige Behandlungsstrategien vorgelegt (Diabetes Dialogue, Am.J. Med., 79 (Suppl 2B), 1-44 (1985)).
• Viele Diabetiker benötigen ein- oder mehrmals täglich Insulininjektionen, um ihre Blutzuckerspiegel nach dem Essen im Normal bereich zu halten.
• Da injiziertes Insulin von den Gewebsproteinasen schnell abgebaut wird, hat es bei der Blutzuckersenkung nur eine vorübergehende Wirkung. Der Insulinabbau durch Protease-Insulinase nach der Injektion erfolgt mit einem t1/2 von ungefähr 40 Minuten. Aufgrund dieser kurzen Wirkungsdauer hat man nach Verfahren gesucht, diese proteolytische Inaktivierung des Insulins zu hemmen, um dessen Wirksamkeit zu verlängern. In der Literatur wird berichtet, daß eines dieser Mittel zur Hemmung der Insulinase in vitro das antibiotische Bacitracin ist.
• Bacitracin ist ein Polypeptid-Antibiotikum, es hat sich als geeignetes Antimikrobium beim Menschen und als wachstumsförderndes Mittel bei Tieren herausgestellt. Die antimikrobiellen Eigenschaften von handelsüblichem Bacitracin beruhen hauptsächlich auf einer Fraktion, dem Bacitracin A. Durch Beeinträchtigung der Membranfunktionen, der Zellwandsynthese sowie des Proteinstoffwechsels eignet es sich hervorragend zur Bekämpfung grampositiver Bakterien.
• Die am häufigsten verwendeten Nahrungsmittelzusätze zur Wachstumsförderung sind die Zinkbacitracin- und Bacitracin-Methyldisalicylat-formen dieses Antibiotikums. Während es allgemein anerkannt ist, daß der Zusatz geringer Mengen Antibiotika zum Futter das Wachstum und die Produkte von Tieren verbessern kann, ist deren Wirkungsweise unbekannt (Froyshov, Drugs and Pharmaceutical Science, Chapt. 24, 665-694 (1984)).
• Es ist seit vielen Jahren bekannt, daß das handelsübliche Präparat eine Mischung ist aus wenigstens 20 verschiedenen Verbindungen mit Bacitracinen A und F, die 65-70% bzw. 15-20% des Gesamtgehalts darstellen (Tsuji et al, J. Chromatog., 99, 597-608 (1974)). Zusätzlich zu den antibiotischen Eigenschaften hat man bei einer Reihe von in vitro Versuchssituationen gefunden, daß durch das handelsübliche Bacitracinpräparat der Insulinabbau gehemmt werden kann, z.B. bei isolierten Leber- und Fettzellen von Ratten (Duckworth et al, Endocrinology, 108, 1142-1147 (1981), Roth et al, Biochem. Biophys. Res. Commun., 98, 431-438 (1981) und Peavy et al, Diabetes, 34, 217-221 (1985)). Dadurch wurde gezeigt, daß Bacitracin die Wirkung von Insulin auf die Glucoseverwertung erheblich erhöht.
• Erfindungsgemäß wurde aus handelsüblichem USP [Pharmacopoe der USA] Bacitracin eine Fraktion isoliert, die weniger als etwa 20%, vorzugsweise weniger als etwa 10% und besonders bevorzugt weniger als etwa 5% des Gewichts von Bacitracin enthält. Bezogen auf die Ausgangsmischung des Bacitracins, weist diese Fraktion anscheinend keine antibiotische Wirkung, jedoch eine unverhältnismäßig hohe Anti-Insulinase-Aktivität auf.
• Sie kann für sich verabreicht werden, was bei einigen Diabetes-Typen, bei denen der Körper ausreichend Insulin produziert, allein ausreichend ist. In den meisten Fällen wird dieses Material jedoch zusammen mit Insulin verabreicht, entweder als Beimischung oder covalent daran gebunden. Das Insulin kann vor seiner Beimengung zur oder Reaktion mit der neuen Bacitracin- Fraktion mit anderen Proteasenhemmern vormodifiziert werden.
• Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung kann die neue Bacitracin-Fraktion in Tierfutter und all wachstumsförderndes Mittel eingesetzt werden. Es ist bekannt, daß Bacitracin das Wachstum von Tieren steigern kann, es ist jedoch in allgemeinen Nahrungsmitteln unerwünscht, da der breite Einsatz dazu führt, daß Tiere und diejenigen, die diese verzehren, Bacitracin-resistenten Bakterien ausgesetzt werden. Dieses Problem wird durch den Einsatz der nichtantibiotischen Fraktion gelöst.
• Abgesehen von der Wachstumsförderung ist die wirksame Fraktion selbst hypoglykämisch. Sie hält das Insulin offenbar länger im menschlichen und tierischen Körper, d.h. hemmt dessen Abbau.
• Die Verwendung der wirksamen Insulinasehemmer-Fraktion löst auch die Probleme im Zusammenhang mit der sich gelegentlich bei Individuen entwickelnden Resistenz gegen Antibiotika, wenn diese Nahrung zu sich nehmen, die Spurenmengen Antibiotika enthält.
• Um die gewünschte Polypeptidfraktion zu erhalten, wird Bacitracin auf herkömmliche Weise hergestellt. Die Hauptkomponenten werden Bacitracin A und Bacitracin F genannt, jedoch weisen sie weitgehend keine Anti-Insulinase-Aktivität auf. Daher wird das Bacitracin auf vielfältige Weise fraktioniert, wobei die "Nicht-A-", "Nicht-F-Komponente" das gewünschte Material darstellt, welches weiter fraktioniert und/oder gereinigt werden kann.
• Vorteilhaft umfassen die Fraktionierungen selektive oder bevorzugte Absorption und/oder Elution von herkömmlichen Absorbentien, wie Sepharose, Aktivkohle und Ionenaustauschern, wobei selektive Lösungsmittel, Elutionsmittel und Puffer eingesetzt werden. Somit kann eine Fraktion, die zäher festgehalten wird, durch Wahl der Bedingungen eingestellt werden.
• Die gewonnenen Fraktionen werden isoliert und diejenigen ohne wirkliche Anti-Insulinase-Aktivität werden aussortiert. Es wird angenommen, daß die gewünschte Fraktion ein Molekulargewicht von etwa 1400 aufweist, was etwa dem von Bacitracin A oder F entspricht. Ihre Anti-Insulinase und antibakterielle Aktivität kann auf herkömmliche Weise geprüft werden. So wurde beispielsweise die insulinasehemmende Aktivität nach dem Verfahren von Duckworth et al, Proc. Nat. Acad. Sci., 69, 3698-3702 (1972) und die antibakterielle Aktivität nach dem Verfahren von Patrick et al, Antibiotics and Chemotherapy, 1, 133-137 (1951), gemessen.
• Durch die Verabreichung dieser gereinigten Fraktion wird die Insulinase im Körper eines Probanden bekämpft. Folglich kann bei Patienten, deren Körper genügend Insulin produziert aber übermäße Insulinase aufweist, dieses Material für sich allein ausreichen. Wenn jedoch Insulininjektionen notwendig sind, sollte die gereinigte Fraktion entweder vor oder zusammen mit Insulin verabreicht werden. Je nach Zustand des Patienten kann dies zu verschiedenen Zeiten und mit wechselnden Anteilen erfolgen.
• Die Materialien werden vorteilhaft zusammen verabreicht, noch vorteilhafter werden sie kovalent miteinander verbunden - ohne ihre Wirksamkeit zu zerstören - verabreicht.
• Das Insulin ist vorteilhaft 1 zu 1, vorzugsweise in der 0,2 bis 20-fachen Gewichtsmenge der Polypeptidfraktion vorhanden.
• Vorzugsweise wird die vorstehend beschriebene Zusammensetzung, die Insulin und eine Polypeptidefraktion enthält, hergestellt durch Mischen des Insulins mit der Polypeptidfraktion in einer Menge vom 0,2 bis 20- fachen, bezogen auf das Gewicht des Insulins, und mit einem polyfunktionellen Verkettungsmittel in einer Menge vom 1- bis 3-fachen der Molmenge des Insulins.
• Wenn die covalente Bindung vorhanden ist, kann sie von einer polyvalenten, vorzugsweise bivalenten, Verbindung abgeleitet werden, z.B. einer Dicarbonsäure, einem Diamin, einer Aminocarbonsäure, einem Dialdehyd, einem Diimid, einem Diisocyanat und einem Carbonsäuredihalogenid. Die Kettenlänge kann schwanken, vorteilhaft ist sie jedoch von 4 bis zu 20 Atomen lang. Geeignete Mittel zur Verknüpfung umfassen beispielsweise ε-Aminocapronsäure, Glutaraldehyd, Carbodiimid, Hexamethylendiisocyanat und Phosgen. Es ist bereits über zahlreiche verfügbare Verfahren berichtet worden, die in einigen jüngeren Berichten zusammengetragen wurden (Kennedy et al, Clinica Chem. Acta, 70, 1-31 (1976); Method Enzymology, 112, Pt.A (1985) Ch. 16, 17, 19, 20, 21, 23).
• Die Menge an Verkettungsmitteln kann stark schwanken, sie reicht von Null bis zu 10 oder sogar 20 Gew.-% der kombinierten Insulin- und Polypeptid-Fraktion. Diese Bindung kann auf herkömmliche Weise erfolgen, entweder durch Mischen aller drei Bestandteile in einem Lösungsmittel oder schrittweise, indem man zunächst das Verknüpfungsmittel mit einer Komponente und dann die verknüpfte Zwischenverbindung mit der anderen Komponente reagieren läßt. Anschließend wird das gewünschte Material von Nebenprodukten und/oder Unreinheiten befreit und ist einsatzbereit, entweder allein oder mit herkömmlichen Zusätzen, wie Puffern, Füllstoffen, Lösungsmitteln und Stabilisatoren.
• Die neue Fraktion kann oral, parenteral oder durch irgendein anderes geeignetes Behandlungsmittel verabreicht werden. In jedem Fall kann die Verabreichung sowohl gleichzeitig mit der Insulinbehandlung als auch vor oder nach einer geeigneten Insulingabe erfolgen.
• Die genaue Dosierung hängt vom Zustand und Körpergewicht des Patienten ab. 1 bis 100 Einheiten, vorzugsweise 2 bis 20 Insulineinheiten pro Tag sind für einen Erwachsenen geeignet; es ist jedoch in speziellen Fällen, nach Vorschrift des Arztes, auch möglich, diese zu überschreiten oder zu verringern.
• Wird die Polypeptid-Fraktion als Tierfutterzusatz eingesetzt, kann sie in Gewichtsmengen von l bis 100 ppm, vorzugsweise 3 bis 50 ppm vorhanden sein, sie kann jedoch durch die Tiernahrung auch weiter verdünnt werden. Die verabreichte Menge hängt von dem Tier und dessen Entwicklungsstadium ab.
• Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutert, in denen alle Teile, sofern nicht gegenteilig angegeben, Gewichtsteile sind.
Beispiel 1
• Ein 350 ml-Bettvolumen von CM-Sepharose in einer Füllkörperkolonne (2,8 x 56 cm) wurde mit 0,05 M Ammoniumacetat, pH 4,5, äquilibiert. Ein Gramm handelsübliches Bacitracin, gelöst in 50 ml Puffer, wurde in die gepackte Säule eingebracht. Das Material wurde mit 2 l eines äquilibrierenden Puffers und danach mit 350 ml 1 M Ammoniumacetatpuffer, pH 4,5, eluiert. Es wurden 5 ml Fraktionen gesammelt und bei 252, 280 und 290 nm Absorbanzmessungen vorgenommen. An jedem Peak wurden zusätzlich Messungen der insulinasehemmenden Aktivität durchgeführt. Bacitracine F und A mit geringfügiger insulinasehemmender Aktivität wurden als unterschiedliche Peaks mit dem ersten Puffer eluiert. Die Peaks wurden aufgefangen, gefriergetrocknet, gewogen und in Wasser bei einer Konzentration von 5 mg/ml für Messungen der spezifischen Aktivität gelöst. Das mit dem zweiten Puffer gesammelte Material enthielt 5-10% des Gesamtgewichts des angewandten Materials und 90% der gesamten insulinasehemmenden Kapazität. Die spezifische Aktivität dieses Materials war 10- bis 12-fach so hoch wie die des handelsüblichen Ausgangsmaterials.
• HPLC und Gelfiltrationsuntersuchungen zeigten, daß diese Fraktion mehrere Komponenten schwankender insulinasehemmender Kapazität enthält.
Beispiel 2
• 10 umol (MW etwa 1400) der wirksamen Fraktion aus Beispiel 1 werden in 1 ml trockenem Dimethylformamid (DMF) gelöst. 20 umol 1-Ethyl-3,3-Dimethylaminopropylcarbodiimid (CDI) und 20 umol N-Hydroxysuccinimid werden zugegeben. Man läßt die Masse 2 Stunden bei Raumtemperatur reagieren, anschließend wird das Produkt mit Insulin verknüpft, indem tropfenweise und unter Rühren 1,5 umol Insulin, gelöst in 30 ml einer 0,05 M Natriumacetatlösung, zugesetzt wird. Nach 2 Stunden bei Raumtemperatur wird das Produkt in eine 50 cm Chromatographiesäule, die einen Durchmesser von 3,5 cm aufweist und mit Sephadex LH20 Trägermaterial gefüllt ist, eingebracht. Die Elution kann mit 0,9%iger NaCl- Lösung erfolgen, wobei Fraktionen gesammelt werden. Die Anti-Insulinase-Aktivität aufweisenden Fraktionen können klinisch eingesetzt werden.
Beispiel 3
• a) 10 pmol der wirksamen Fraktion aus Beispiel 1 werden mit 150 nmol N-Hydroxysuccinimid und 500 pmol Carbodiimid sowie 70 umol Diaminobutan behandelt. Man läßt 4 Stunden bei Raumtemperatur reagieren, die Mischung wird wie in Beispiel 2 mit Sephadex chromatographisch getrennt; die verschiedenen Fraktionen werden mit Picrylsulfonsäure auf aminofunktionelle Gruppen geprüft. Die erste aminohaltige Fraktion ist das Diaminobutanderivat von Bacitracin. Diese Fraktion wird gefriergetrocknet.
• b) 10 umol Insulin werden in 0,01M HCl auf eine Konzentration von 0,6 mg/ml gelöst, für eine Konzentration von 0,1 M wird Carbodiimid eingebracht und der pH mit verdünntem NaoH auf 7,0 eingestellt. Das Produkt aus a) wird in 2 ccm Wasser gelöst und tropfenweise zu der Insulinlösung gegeben, wo es 1 Stunde bei pH 7 gehalten wird.
• Die Produkte aus den Beispielen 2 und 3 können durch Sephadex-Chromatographie isoliert und die wirksame Fraktion vor Verabreichung einer geeigneten Menge gefriergetrocknet werden.

Claims (10)

1. Polypeptid-Fraktion, isoliert aus Bacitracin, die auf Gewichtsbasis wenigstens die 5-fache Anti-Insulinase-Aktivität des Bacitracins aufweist.

2. Zusammensetzung, enthaltend Insulin und eine aus Bacitracin isolierte Polypeptidfraktion, die auf Gewichtsbasis wenigstens das 5-fache der Anti-Insulinase-Aktivität des Bacitracins aufweist.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 2, worin das Insulin vom 0,2-fachen bis zum 20-fachen der Gewichtsmenge der Polypeptidfraktion vorhanden ist.

4. Zusammensetzung nach Anspruch 2, worin das Insulin covalent an die Polypeptidfraktion gebunden ist.

5. Zusammensetzung, enthaltend ein Material nach Anspruch 2 und ein pharmazeutisch verträgliches Verdünnungsmittel.

6. Zusammensetzung nach Anspruch 4, worin die covalente Bindung wenigstens ein Mitglied, ausgewählt aus einer Dicarbonsäure, einem Diamin, einer Aminocarbonsäure, einem Dialdehyd, einem Diimid, einem Diisocyanat und einem Carbonsäuredihalogenid umfaßt.

7. Zusammensetzung nach Anspruch 4, worin die kovalente Bindung wenigstens ein Mitglied, ausgewählt aus ε-Aminocapronsäure, Glutaraldehyd, Carbodiimid, Hexamethylendiisocyanat und Phosgen umfaßt.

8. Verfahren zur Herstellung eines Materials nach Anspruch 4, enthaltend das Mischen des Insulins mit der Polypeptidfraktion in einer Menge vom 0,2- bis 20-fachen, bezogen auf das Gewicht des Insulins und mit einem polyfunktionellen Verkettungsmittel in einer Menge vom 1- bis 3-fachen der Molmenge des Insulins.

9. Eine das Tierwachstum fördernde Zusammensetzung, enthaltend ein verzehrbares Basisfutter und eine das Tierwachstum fördernde wirksame Menge der Polypeptidfraktion nach Anspruch 1.

10. Zusammensetzung zur Behandlung von Hyperglykämie, enthaltend eine hyperglykämische wirksame Menge der Polypeptidfraktion nach Anspruch 1.