DE3885355T2

DE3885355T2 - Monoklonale Antikörper.

Info

Publication number: DE3885355T2
Application number: DE3885355T
Authority: DE
Inventors: Shuzo Matsushita
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1987-05-29
Filing date: 1988-05-27
Publication date: 1994-06-01
Anticipated expiration: 2008-05-28
Also published as: EP0295803A1; US5827723A; JPS6463393A; DE3885355D1; EP0295803B1; JP2797099B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft monoklonale Antikörper, die in der Lage sind, Human-Immunmangel-Viren zu neutralisieren.
Das Human-Immunmangel-Virus (HIV) ist ein humanes Retrovirus, das einen ätiologischen Faktor für das Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS) und für verwandte Erkrankungen wie den AIDS Related Complex (ARC) darstellt. Heutzutage ist AIDS bekannt als eine weltweite Epidemie, für die bisher keine wirksame Vakzine oder Heilmittel vorgestellt worden ist. Das profundeste hematologische Merkmal, das mit AIDS assoziiert ist, ist die Funktionsschwächung und die quantitative Depletion der Helfer-/Induktor-Untergruppe der T-Lymphocyten, die das CD4-Oberflächenantigen exprimiert. Eine HIV-induzierte Immunosuppression resultiert in einer Reihe von Schwächen des wirts-Abwehrsystems, was den Körper sehr anfällig für opportunistische Infektionen, wie eine Pneumocystis carinii- Pneumonie, und ungewöhnliche Neoplasmen, wie eine Kaposi- Sarcom, macht. Der Immundefekt scheint progressiv und irreversibel zu sein, und resultiert in einer sehr hohen Mortalitätsrate, die sich wahrscheinlich mit der Zeit 100% nähert.
In der ersten Stufe einer HIV-Infektion von T-Zellen erfolgt eine zellfreie Infektion d. h. eine Anheftung von zellfreien Virionen an den Zielrezeptor, das CD4-Antigen. HIV kann sich jedoch auch über eine Zell-Zell-Infektion, d. h. über eine Fusion von infizierten T-Zellen mit nicht-infizierten T- Zellen, ausbreiten, so daß die Bildung von Syncytien (vielkernigen Riesenzellen) in Organen wie dem Gehirn und den Lymphknoten erfolgt. Weiterhin kann die Bildung von Syncytien in einem in vitro-Assay beobachtet werden. Die Depletion von CD4-positiven Zellen kann auftreten, weil die HIV-infizierten T-Zellen empfänglich für die cytopathologischen Effekte von HIV sind.
Es ist bekannt, daß HIV nicht nur die Helfer-/Induktor- Untergruppen von T-Zellen infiziert, sondern auch die Zellen der Monozyten-/Macrophagen-Linie. Es ist weiterhin bekannt, daß die meisten Monocyten/Macrophagen und bestimmte T-Zellen resistent gegen die zytopathologischen Effekte von HIV sind und somit als Reservoir-Zellen der Viren betrachtet werden.
Es ist bekannt, daß ein prototypisches HIV das humane T-Lymphotropie-Virus-Typ -III (HLTV-III) und das Lymphoadenopathie-assoziierte-Virus (LAV) ist.
Es ist weiterhin bekannt, daß polyklonale Antikörper gegen HIV in Seren vorhanden sind, die von HIV-infizierten Menschen erhalten werden, aber daß die neutralisierenden Wirkungen solcher Antikörper im allgemeinen sehr schwach sind [darüber berichten zum Beispiel Weiss R.A. et al., Nature 316, 69-72 (1985)].
Ferner ist die Existenz bestimmter Struktur-Antigene von HIV einschließlich der Kern-(gag)-Antigene und der Hüllen- Antigene bekannt. Die virale Hülle umfaßt ein 160 Kilodalton Vorläufer-Glykoprotein (gp160), das nachfolgend in 120 kd (gp120) und 41 kd (gp41) Glycoproteine gespalten wird, die sich auf dem Virion-Partikel befinden. Das externe Hüllenprotein gp120 von HIV ist das wichtigste Glycoprotein hinsichtlich der folgenden Charakteristika:
(1) Gp120 und/oder bestimmte Fragmente von gp120 sind in der Lage, bei Versuchstieren polyklonale neutralisierende Antikörper zu induzieren. Das bedeutet, daß gp120 wenigstens eines der Zielmoleküle der neutralisierenden Antikörper ist [wie zum Beispiel offenbart in Lasky, L.A. et al., Science 233, 209-212 (1986); Robbey, W.G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 7023-7027 (1986) and Puney, S. D. et al., Science 234, 1392-1395 (1987)].
(2) Die HIV-Infektion wird initiiert durch Bindung von gp120 an das CD4-Rezeptormolekül. Das bedeutet, daß gp120 hinsichtlich der Infektion der Zielzellen ein kritisches Molekül für HIV ist [zum Beispiel offenbart in McDougal, J.S. et al., Science 231, 382-385 (1986)].
(3) Die durch HIV, d. h. durch die Zell-Zell-Infektion von HIV, induzierte Bildung von Syncytien hängt von der direkten Wechselwirkung von gp120 mit CD4-Molekülen auf nichtinfizierten Zellen ab [zum Beispiel offenbart in Lifson, J. d. et al." Nature 323, 725-728 (1986)].
Verschiedene monoklonale Antikörper gegen die Proteinbestandteile des HTLV-III oder des LAV sind bis jetzt vorgeschlagen worden, beispielsweise solche gegen p24, einem der im Inneren der Viren vorhandenen Kernantigene [Veronese, F.D., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 5199-5202 (1985); solche gegen das Produkt des pol-Gens, das in der Lage ist, für die Reverse Transkriptase der Viren zu kodieren [Veronese, F.D., Science 231, 1289-1291 (1986)]; und solche gegen gp41, einem Teil der Hülle [Veronese, F.D. et al., Science 229, 1402-1405 (11985). Jedoch ist keiner dieser Antikörper in der Lage, mit dem gp120-Antigen zu reagieren, was wichtig zur Vorbeugung und Behandlung von AIDS ist. Es ist berichtet worden, daß kein monoklonaler Antikörper, der in der Lage ist, gp120 effektiv zu neutralisieren, bei Immunisierung mit gereinigtem LAV beobachtet worden ist [z. B. Chassagne, J. et al., J. Immunol. 136, 1442-1445 (1986)].
Es sind verschiedene Versuche unternommen worden, monoklonale Antikörper bereitzustellen, die in der Lage sind, effektiv AIDS-Viren zu neutralisieren, und die zur Diagnose und Behandlung von AIDS verwendet werden können.
Kürzlich ist berichtet worden, daß ein monoklonaler Antikörper, der in der Lage ist, mit gp120 zu reagieren, unter Verwendung eines synthetischen Peptides als Immunogen erhalten werden kann [Chanh, T.C. et al., Eur. J. Immunol. 16, 1465-1468 (Dezember 1986)). Das Epitop, das von diesem monoklonalen Antikörper erkannt wird, liegt innerhalb der Aminosäuresequenz 503 bis 532 des HIV-gp160, wobei die Aminosäuresequenz des HIV unter Bezugnahme auf Ratner, L. et al., Nature 313, 277-283 (1985) angegeben ist. Die Bindungsaktivität dieses monoklonalen Antikörpers ist jedoch schwach, wenn sie mittels der Western- Blot-Methode und der Oberflächen-Immunofärbung von HIV- infizierten Zellen bestimmt wird. Weiterhin wird in diesem Bericht kein Beweis für die neutralisierende Aktivität dieses monoklonalen Antikörpers gezeigt.
Die vorliegende Erfindung beruht auf dem Befund, daß die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper in der Lage sind, durch Bindung an ein Epitop der HIV-Hüllenantigene HIV signifikant zu neutralisieren (im folgenden definiert).
Die vorliegende Erfindung richtet sich auf die Bereitstellung von monoklonalen Antikörpern, die in der Lage sind, die HTLV-III und LAV-Viren im wesentlichen zu neutralisieren, und auf Hybridoma zur Herstellung solcher monoklonaler Antikörper.
Der hier verwendete Ausdruck "Neutralisieren" bedeutet die Inhibition einer HIV-Infektion durch zellfreie Virione und/oder die Inhibition einer Zell-Zell-Infektion wie die Bildung von Syncytien durch Fusion von HIV-infizierten Zellen mit nichtinfizierten Zellen, induziert durch Wechselwirkung von gp120 mit CD4-Molekülen.
Gemäß einem erfindungsgemäßen Merkmal wird ein monoklonaler Antikörper oder ein Fragment davon bereitgestellt, der (das) in der Lage ist, spezifisch ein Glycoprotein-Antigen, das ein Molekulargewicht von 120 000 Dalton besitzt und in der Hülle des humanen Immunmangel-Virus 1 (HIV-1) lokalisiert ist, zu binden und:
a) in der Lage ist, im wesentlichen zu neutralisieren:
(i) eine zellfreie Infektion des Virus in vitro und
(ii) eine Zell-Zell-Infektion des Virus in vitro durch Bindung an die Oberfläche einer mit dem HIV-1-Virus infizierten Zelle, wobei die durch infizierte Zellen und nicht-infizierte Ziel-T-Zellen induzierte Bildung von Syncytien, inhibiert wird;
b) zur IgG&sub1;-Klasse gehörig klassifiziert ist;
c) in der Lage ist, an einen Vorläufer eines Glycoprotein-Antigens mit einem Molekulargewicht von 160 000 Dalton zu binden; und
(d) in der Lage ist, an ein Epitop zu binden,. das innerhalb der Aminosäuresequenz 308 bis 331 des HIV gp 160 lokalisiert ist.
In diesem Zusammenhang wird das Charakteristikum (d) unter Bezugnahme auf Ratner, L. et al., Nature 313, 277-284 (1985) angegeben.
Die erfindungsgemäßen Antikörper können durch Immunisierung eines Säugers, zum Beispiel einer Maus, eines Meerschweinchens oder eines Kaninchens, mit einem von HTLV-III- produzierenden Zellen erhältlichen Virusprotein, Fusion der resultierenden Milzzellen mit Myelomazellen eines Säugers, zum Beispiel einer Maus, und Kultivierung der resultierenden Hybridomazellen hergestellt werden.
Obwohl wirklich alle Zellen, die in der Lage sind, durch Kultivierung HIV zu produzieren, für den erfindungsgemäßen Zweck verwendet werden können, ist die Verwendung von H9/HTLV- IIIB bevorzugt, die in der JP-A-500767/86 offenbart ist, und die bei der American Type Culture Collection als ATCC CRL Nr. 8543 hinterlegt worden ist.
Eine Kultivierung von HIV-produzierenden Zellen und die Gewinnung des HIV kann zum Beispiel gemäß der JP-A-286756/86 durchgeführt werden, die die Charakteristika und Reinigungsmethoden für die Proteinbestandteile des HIV, insbesondere der Hüllenproteine, offenbart.
Zum Beispiel kann die Immunisierung einer Maus durch hypoderme, intravenöse oder abdominale Verabreichung von gereinigten HTLV-III-Viren zusammen mit einem geeigneten Adjuvans, zum Beispiel Freund'sches komplettes Adjuvans, einem Aluminiumhydroxidgel oder einer Pertussis-Vakzine bewirkt werden.
HTLV-III kann 3-5 mal mit 0,05 bis 0,1 mg pro Dosis in 1-3-wöchigen Intervallen verabreicht werden. 3-7 Tage nach der letzten Immunisierung wird die Milz der Maus in üblicher Weise entfernt.
Maus-Myeloma-Zellinien können für die Fusion verwendet werden. Zu Beispielen für bevorzugte Zellinien zählen 8- Azaguanin-resistente Nager-Myeloma-Zellinien wie P3-X63-Ag8-U1 (P3-U1) des BALB/c-Stammes [European J. Immunology 6, 511-519 (1976)]: SP2/O-Agl4 (sP-2) [Nature 276, 269-270 (1978)]; P3- X63-Ag8.653 (653) [J. Immunology 123, 1548-1550 (1979)], P3-X63-Ag8 (X63) [Nature 256, 495-497 (1975)] und ähnliche. Die Zellinien können subkultiviert werden, zum Beispiel unter Verwendung eines 8-Azaguanin-Mediums, d. h. einem Medium, das durch Zugabe von 8-Azaguanin (15 ug/ml) zu einem normalen Medium [hergestellt durch Zugabe von Glutamin (1,5 mM), 2-Mercaptoethanol (5 · 10&supmin;&sup5;M), Gentamycin (10 ug/ml) und 10% FKS (fötales Kälberserum: Handelsprodukt von CSL, Australia) zu RPMI-1640-Medium] hergestellt wird.
Die Zellen werden vor der Fusion 3-4 Tage unter Verwendung eines normalen Mediums weiterhin subkultiviert, um zu garantieren, daß die Anzahl der Zellen zum Zeitpunkt der Hybridisierung größer als 2·10&sup7; ist. Die Hybridisierung kann auf übliche Weise wie folgt bewirkt werden:- Die oben erwähnten Myeloma-Zellen und die Milzzellen werden mit MEM-Medium oder mit PBS gut gewaschen und miteinander vermischt, wobei das Verhältnis der Anzahl der Milzzellen zur Anzahl der Myeloma-Zellen vorzugsweise 5-10 : 1 beträgt. Das Gemisch wird dann zentrifugiert (1 200 U.p.M./5 min.), um den Überstand zu entfernen. Die pelletierten Zellen werden gut aufgelockert, und sodann wird ein Lösungsgemisch von Polyethylenglykol 4000 (2 g), MEM-Medium (2 ml) und Dimethylsulfoxid (0,7 ml) in einer Menge von 0,2-1 ml pro 10³ Antikörper-produzierender Zellen bei einer Temperatur von 37ºC unter Rühren zugegeben. MEM-Medium (jeweils 1-2 ml) wird mehrere Male in 1-2-minütigen Intervallen zu der Zellsuspension zugegeben. Danach wird die Zellsuspension durch Zugabe von MEM- Medium auf insgesamt 50 ml gebracht. Der Überstand wird durch Zentrifugation (900 U.p.M./5 min.) von der Kultur entfernt. Die Zellen werden aufgelockert, und normales Medium (100 ml RPMI- 1640, enthaltend 10% FKS) wird zu den Zellen gegeben. Die Zellen werden durch vorsichtiges Pipettieren resuspendiert.
Die Zellsuspension wird in jedes Loch einer 24- Lochkulturschale (1 ml/Loch) zur Inkubation bei einer Temperatur von 37ºC für 24 Stunden in einem Inkubator mit 5% CO&sub2; gegeben. Zu jedem Loch der Platte wird sodann HAT-Medium (1 ml) gegeben [hergestellt durch Zugabe von Hypoxanthin (10&supmin;&sup4; M), Thymidin (1,5 · 10&sup5;M) nach Aminopterin (4 · 10&supmin;&sup7;M), zu dem normalen Medium], worauf die Kultivierung für weitere 24 Stunden fortgesetzt wird. 1 ml des Überstandes wird über zwei Tage in 24-Stunden-Intervallen jedem Loch entnommen und durch die gleiche Menge frischem HAT-Medium ersetzt. Die Kultivierung wird weiter bei einer Temperatur von 37ºC für 10-14 Stunden in einem CO&sub2;-Inkubator fortgesetzt. Wenn die gewachsenen Kolonien der fusionierten Zellen in bestimmten Löchern beobachtet werden, wird 1 ml des Überstandes jedem dieser Löcher entnommen und durch die gleiche Menge frischem HT-Medium [hergestellt ohne Zugabe von Aminopterin aus HAT-Medium] ersetzt. Der Austausch des Mediums durch HT-Medium wird für weitere 2 Tage in 24-stündigen Intervallen fortgesetzt.
Nach weiterer 3-4-tägiger Kultivierung unter Verwendung von HT-Medium wird ein Teil des Überstandes der Kultur entnommen, um den Titer an Antikörpern, die in der Lage sind, an die Oberflächen von H9/HTLV-IIIB-Zellen zu binden, mittels der Fluorescein-Antikörper-Methode wie folgt zu bestimmen:

Fluorescein-Antikörper-Methode:

H9/HTLV-IIIB (H9/IIIB)-Zellen oder nicht-infizierte H9- Zellen (5 · 10&sup5;) werden in dem Überstand der Testkultur suspendiert, um sie für 30 Minuten bei einer Temperatur von 4ºC zu inkubieren. Die Zellen werden zweimal mit PBS gewaschen, das BSA (2%) und Azid (0,1%) enthält (im folgenden als PBS-BSA-Az bezeichnet). Zu den gewaschenen Zellen werden 100 ul Anti-Maus IgG (Sigma) gegeben, wobei der IgG mit FITC (Fluoresceinisothiocyanat) markiert und mit PBS-BSA-Az in einem Verhältnis von 1 : 40 verdünnt worden ist. Das Gemisch wird für 30 Minuten bei einer Temperatur von 4ºC inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBS-BSA-A wird das Reaktionsgemisch unter Verwendung von PBS, das Paraformaldehyd (0,1%) enthält, fixiert.
Die Antikörper-Reaktivität wird unter Verwendung der Laser-Durchfluß-Cytometrie (Spektrum III, Handelsprodukt von Ortho Diagnostics Inc.) unter Bezugnahme auf die Fluoreszenz- Intensität des Fluoresceins bestimmt.
Ein Klon, der das höchste Bindungsvermögen für die Oberfläche von H9/HTLV-III-Zellen zeigte, wird selektiert und subkloniert, was die gewünschten Hybridoma-Zellen ergibt.
Hybridoma 54/CB1, eine Hybridoma-Zelle, die die höchste Produktivität unter den resultierenden Hybridoma-Zellen zeigte, wurde bei der European Collection of Animal Cell Cultures mit Sitz in Portondown, Salisbury, Wilts, England am 14. Mai 1987 mit der Hinterlegungsnummer ECACC Nr. 87051401 hinterlegt.
Die Herstellung von monoklonalen Antikörpern mit Hilfe des Hybridomas kann zum Beispiel wie folgt bewirkt werden:- Pristan [2,6,10,14-Tetramethylpentadecan: 0,5 ml] wird einer Nacktmaus (weiblich; 8-10 Wochen alt) abdominal verabreicht. Zwei Wochen nach der Inokkulation der Pristanbehandelten Maus werden die Hybridoma-Zellen in einer Menge von 2-4 · 10&sup6; Zellen abdominal verabreicht. 10-21 Tage danach wird ein Aszites-Tumor durch die Hybridoma-Zellen induziert. Die Aszites-Flüssigkeit wird der Maus entnommen und zentrifugiert (3000 U.p.M./5 min.), um Feststoffe zu entfernen. Nach Aussalzen mit Ammoniumsulfat (50%) wird die Lösung einer Dialyse gegen eine 0,04 M Phosphat-gepufferte Lösung (pH 8,0), enthaltend 0,03M NaCl, unterzogen. Der resultierende Rückstand wird über eine Säule gegeben, die mit DE52 (Handelsprodukt von Whatman, U.S.A.) gepackt ist, wobei man IgG-Fraktionen sammelt, die als gereinigter monoklonaler Antikörper verwendet werden können. Der Isotyp des monoklonalen Antikörpers kann durch Ouchterlony's Methode (doppelter Diffusions-Test) bestimmt werden [siehe "Menekigaku Jikken Nvumon, Seibuto-kagaku Jikkenho 15, Seite 74 (1981)", publiziert von Gakkai Shuppan Centre, Japan].
Eine quantitative Bestimmung kann mit der Folin-Methode durchgeführt werden und unter Bezugnahme auf eine optische Dichte bei 280 nm [1,4 (OD&sub2;&sub8;&sub0;) = Immunoglobulin 1 mg/m2].
Die Charakteristika des erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpers können mittels der Western-Blotting-Methode, der Radioimmunopräzipitationsmethode, der Kreuz - Präzipitationsmethode und der Detektion des Verdaumusters unter Verwendung von Endoglykosidase bestimmt werden, wie in dem nachfolgenden Beispiel beschrieben.
Es ist bestätigt worden, daß der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper in der Lage ist, sowohl eine Zell-Zell- Infektion, identifizierbar durch Bildung von Syncytien, als auch eine zellfreie Infektion zu inhibieren.
Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper können zur Diagnose, Prävention und Behandlung von AIDS sowie zur Reinigung von AIDS-Virus-Antigenen verwendet werden.
So ist es möglich, unter Verwendung des erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpers das Wachstum der Viren in menschlichen Wirten zu inhibieren, oder eine weitere Infektion durch die Viren zu inhibieren, und weiterhin kann der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper zur Behandlung von AIDS verwendet werden.
In dieser Hinsicht können die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper wegen ihres starken Neutralisierungsvermögens zur Prävention einer HIV-Infektion von nichtinfizierten T4-Zellen wirksam sein.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung weiterhin ein pharmazeutisches Mittel, das, zusätzlich zu einem oder mehreren pharmazeutisch inerten Exzipienten und/oder Trägern, eine wirksame Menge mindestens eines, vorher beschriebenen, monoklonalen Antikörpers umfaßt.
Es ist weiterhin möglich, die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper zur Reinigung von HIV-Hüllenantigenen zu verwenden, zum Beispiel, wenn sie an ein geeignetes Trägermaterial gebunden sind. Daher beinhaltet die Erfindung einen Antikörper-Affinitäts-Träger, wobei ein vorher beschriebener, monoklonaler Antikörper an ein geeignetes Trägermaterial gebunden ist.
Die vorliegenden Beispiele illustrieren detailliert die vorliegende Erfindung, wobei die Behandlungen, wenn nicht anders angegeben, bei Raumtemperatur durchgeführt wurden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen:

Fig. 1 zeigt die Reaktivität des erfindungsgemäßen Antikörpers gegen H9-Zellen oder CEM-Zellen, die mit HTLV-IIIB oder LAV-1 infiziert oder nichtinfiziert sind;
Fig. 2 zeigt das durch Elektrophorese detektierte Muster der erfindungsgemäßen Antikörper. In Fig. 2 zeigt A das Muster, das durch die Western-Blotting-Methode detektiert wird, B zeigt das Muster, das mittels der Radioimmunopräzipitations-Methode erhalten wird, C und D zeigen jeweils die Muster, die durch die Kreuz-Präzipitations-Methode detektiert werden, und E zeigt das Muster eines Verdaus mit Endoglykosidase H;
Fig. 3 zeigt die Bildung von Syncytien; und
Fig. 4 zeigt ein Elutions-Muster, das mit dem vorliegenden Antikörper erhalten wird, wenn er zur Reinigung des Hüllenantigens mit H9/HTLV-IIIB-Ursprung verwendet wird.

Beispiel

1) Herstellung des Antigens:

Mit HTLV-IIIB infizierte H9-Zellen [Science 224, 497-500 (1984)] (im folgenden als H9/HTLVB bezeichnet) wurden unter Verwendung von RPMI 1640-Medium, das 10% FKS enthielt, in einem Inkubator, der 5% CO&sub2; enthielt, bei einer Temperatur von 37ºC für 24 Stunden kultiviert.
Der Überstand des Mediums wurde zur Reinigung der Viren auf ähnliche Weise verwendet, wie in dem oben erwähnten Artikel beschrieben. Die gereinigten Viren wurden durch einstündiges Erhitzen bei einer Temperatur von 56ºC inaktiviert und als Antigen zur primären Immunisierung verwendet.
Eine Glykoprotein-Fraktion der Viren, die auf die folgende Weise hergestellt wurde, wurde als Booster-Dosis zur Verstärkung der Immunisierung verwendet:- Die mittels der oben erwähnten Methode kultivierten H9/HTLV-IIIB-Zellen wurden dreimal mit PBS gewaschen und dann zentrifugiert (2000 U.p.M./5 min), was Zell-Pellets ergab. Die Zellen (2·10&sup8;) wurden dreimal mit PBS-Salzlösung (0,15M) (pH 7,2) gewaschen. Die Zellen wurden durch Zugabe einer Zelllysierenden Pufferlösung [hergestellt ohne Zugabe von Natrium- Desoxycholinsäure aus RIPA-Pufferlösung (5 ml), die 1% Triton- X, 0,5% des Natriumsalzes der Desoxycholinsäure, 0,1% SDS, 0,15M NaCl und 0,05M Tris-HCl enthielt und einen pH-Wert von 7,2 besaß] solubilisiert und für 60 Minuten bei einer Temperatur von 4ºC inkubiert. Das Lysat wurde zentrifugiert (3000 U.p.M./10 min.). Der Überstand wurde gesammelt und für eine Stunde bei einer Temperatur von 56ºC erhitzt. Die resultierende Lösung wurde zu FKS-Sepharose gegeben [hergestellt durch Bindung von fötalem Kälberserum (20 mg/ml) an Sepharose 4B (1 ml)], und reagierte bei einer Temperatur von 4ºC über Nacht (für etwa 12 Stunden). Die Reaktionslösung wurde zentrifugiert (3000 U.p.M./10 min.), was einen Überstand ergab, der dann als Testprobe verwendet wurde.
Die Probenlösung (1 ml) wurde zu ConA-Sepharose (0,5 ml; Handelsprodukt von Sigma) gegeben und bei einer Temperatur von 4ºC über Nacht inkubiert (für etwa 18 Stunden). Die Substanz wurde in eine Säule gegeben und, nach Waschen mit PBS, wurde eine Elution unter Verwendung von α-Methyl-D-glucosid (0,5M; 3 ml) bewirkt. Der Effluent wurde gesammelt und in kleine Fraktionen geteilt (jeweils 0,5 ml).
Seren wurden hämophilen Patienten entnommen, die gesunde Träger des HIV waren. Von den entnommenen Seren wurde das mit dem höchsten Antikörper-Titer gegen die Hülle mittels der Western-Blotting-Methode ausgewählt und gereinigt, was eine IgG-Fraktion ergab. Jedes Lysat wurde zu Sepharose 4B gegeben, die das gereinigte IgG gebunden hatte (5 mg/ml) [im folgenden als anti-HIV-Sepharose bezeichnet] und bei einer Temperatur von 4ºC länger als 4 Stunden inkubiert. Die anti-HIV-Sepharose wurde in eine Säule gegeben, mit PBS gewaschen und mit einer 0,2M Glycin-gepufferten Lösung (pH 2,7) eluiert. Der Eluent, der 0,1 mg/ml des Antigens enthielt, wurde als Booster zur Verstärkung der Immunisierung verwendet.

2) Herstellung der Hybridoma:

Gereinigte Viren wurden durch 1-stündiges Erhitzen bei 56ºC inaktiviert. Die Viren (0,1 ml) wurden mit kompletten Freund'schem Adjuvans (0,1 ml) vermischt und zur primären Immunisierung einer Balb/c-Maus (erhalten von Kuroda Dobutsu K.K., Japan) verwendet. Dann wurde eine gereinigte Antigen- Lösung des Virus-Glykoproteins (jeweils 0,1 ml), vermischt mit inkomplettem Freund'schem Adjuvans (jeweils 0,1 ml), als Booster-Dosis verwendet, und dem Tier 3-mal in 2-wöchigen Intervallen intraperitoneal verabreicht. 3 Tage nach der abschließenden Immunisierung wurden der Maus die Milzzellen auf übliche Weise entnommen. Die Milzzellen wurde mit P3-X63-Ag8 (X63) [Nature 256, 495-497 (1975)] vermischt, wobei das Verhältnis der Anzahl der Milzzellen zur Anzahl der Myeloma- Zellen 1 : 5 betrug. Das Gemisch wurde zentrifugiert (1200 U.p.M./5 min.), wonach der Überstand entfernt wurde. Die pelletierten Zellen wurden gut aufgelockert, und ein Lösungsgemisch (0,2-1 ml/10³ Antikörper-produzierende Zellen) von Polyethylenglykol 4000 (PEG-4000; 2 g), MEM (2 ml) und Dimethylsulfoxid (0,7 ml) wurde unter Rühren zu den Antikörperproduzierenden Zellen gegeben. Danach wurde MEM in 1-2 minütigen Intervallen mehrere Male zu dem Gemisch gegeben, jedesmal (1-2 ml), gefolgt von Zugabe von MEM, was insgesamt 50 ml ergab. Die Zell-Suspension wurde zentrifugiert, um den Überstand zu entfernen. Die Zell-Pellets wurden aufgelockert und ein normales Medium [100 ml: hergestellt durch Zugabe von 10% FKS zu RPMI - 1640] wurde zugegeben. Die Zellen wurden durch vorsichtiges Pipettieren aufgelockert.
Die Zell-Suspension wurde in jedes Loch einer 24- Lochkulturschale in einer Menge von 1 ml pro Loch gegeben, gefolgt von einer 24-stündigen Inkubation bei einer Temperatur von 37ºC unter Verwendung eines CO&sub2;-Inkubators. Nach Zugabe eines HAT-Mediums [hergestellt durch Zugabe von Hypoxanthin (10&supmin;&sup4; M), Thymidin (1,5 · 10&supmin;&sup5; M) und Aminopterin (4 · 10&supmin;&sup7; M) zu einem normalen Medium] zu der Kulturschale, wurde die Kultivierung weitere 24 Stunden durchgeführt. Danach wurde für 2 Tage der Überstand (1 ml) entfernt, und die gleiche Menge frisches HT-Medium wurde in einem 24-stündigen Intervall zu jedem Loch zugegeben. Die Kultivierung wurde für weitere 10- bis 14 Tage bei einer Temperatur von 37ºC unter Verwendung eines CO&sub2;-Inkubators durchgeführt.
Als das Auftreten von fusionierten Zellen (etwa 300), die in Form von Kolonien in bestimmten Löchern gewachsen waren, festgestellt wurde, wurde jeweils der Überstand (1 ml) aus dem Loch entfernt und durch frisches HT-Medium (1 ml: hergestellt ohne Zugabe von Aminopterin aus dem HAT-Medium) ersetzt. Dieser Ersatz durch HT-Medium wurde in einem 24-stündigen Intervall für weitere 2 Tage fortgeführt.
Nach einer 3-4-tägigen Kultivierung unter Verwendung von HT-Medium wurde ein Teil des Überstandes jeder der oben erwähnten Kulturen entnommen, um mittels der oben erwähnten Fluorescein-Antikörper-Methode ihre Fähigkeit zu untersuchen, an die Oberflächen von H9-Zellen, die mit HTLV-IIIB infiziert waren, zu binden. Ein Klon, der die höchste Bindungsaktivität zeigte, wurde als 54'C bezeichnet, und weiterhin einer Subklonierung unterzogen, um einen als 54'CBl bezeichneten Subklon auszuwählen, der so stark wuchs, daß er die höchste Produktivität an Antikörper zeigte.

3) Herstellung von monoklonalen Antikörpern unter Verwendung von 54'CBl:

Hybridomazellen von 54'CBl, hergestellt nach der Methode (2), wurden abdominal in einer Menge von 4·10&sup6; Zellen/Maus Balb/c-Mäusen [Pristan-behandelt; 8 Wochen alt] verabreicht.
10-21 Tage danach wurde ein Ascites-Tumor durch die Hybridoma- Zellen induziert. Von den Wirtsmäusen des Ascites-Tumors wurde die Ascites-Flüssigkeit in einer Menge von 5-10 ml/Maus entnommen. Nach Entfernung der Feststoffe aus dem Ascites durch Zentrifugation (3000 U.p.M./5 min.) wurde ein Aussalzen des Überstandes unter Verwendung von Ammoniumsulfat (40%) bewirkt. Die Lösung wurde gegen 0,04M Phosphat-gepufferter Lösung, die NaCL (0,03M) enthielt und einen pH-Wert von 8,0 besaß, dialysiert. Der Rückstand wurde über eine mit DE52 (Bettvolumen 50 ml; Handelsprodukt von Whatman) gepackten Säule bei einer Flußrate von 20-30 ml pro Stunde gegeben, um IgG-Fraktionen zu sammeln, die als gereinigter monoklonaler Antikörper verwendet wurden (bezeichnet als 0.5β-Antikörper).

4) Oberflächen-Reaktivität des 0.5β-Antikörpers

Die Reaktivität des resultierenden Antikörpers mit der Oberfläche von H9- oder CEM-Zellen, die mit HTLV-IIIB oder LAV-1 infiziert waren, wurde mittels der oben erwähnten Fluorescein-Antikörper-Methode ermittelt, was die in Fig. 1 gezeigten Resultate ergab. Der vorliegende Antikörper ist reaktiv mit den Oberflächen von H9- oder CEM-Zellen, die mit HTLV-IIIB oder LAV-1 infiziert waren, aber er ist nicht reaktiv mit nichtinfizierten Zellen.

5) Bindungs-Charakteristika des 0.5β-Antikörpers:

Der erfindungsgemäße Antikörper wurde mittels der Western- Blotting-Methode (siehe Fig. 2A), der Radioimmunopräzipitations-Methode (siehe Fig. 2B), der Kreuz- Präzipitations-Methode (siehe Fig. 2C und 2D) und mittels des Verdau-Musters, das unter Verwendung von Endoglykosidase H erhalten wurde, (siehe Fig. 2E) untersucht. Als Ergebnis hat man gefunden, daß der vorliegende Antikörper in der Lage ist, spezifisch an gp120 des Hüllenproteins, das an der HIV-Hülle lokalisiert ist, zu binden.

A. Western-Blotting-Methode:

Unter Bezugnahme auf Towbin, H., Stachelin, T. und Gordon, J. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350-4354 (1979)] wurde die Western-Blotting-Methode auf folgende Weise durchgeführt:- Gereinigte HTLV-IIIB-Viren [hergestellt mittels der in Science 224, 497-500 (1984)] offenbarten Methode] wurden einer Elektrophorese unter Verwendung einer 12% SDS-PAGE unterzogen [offenbart in Nature 227, 680-685 (1970)]. Das Gel wurde auf eine Nitrocellulose-Membran gelegt, um die Viren auf die Membranoberfläche zu transferieren. Die Membran wurde in Streifen geschnitten, die eine Breite von 0,4-0,6 cm besaßen. Die Streifen wurden jeweils in eine der folgenden Antikörper- Lösungen (a)-(f) für eine 4-stündige Inkubation bei Raumtemperatur gelegt :(a) Serum, erhalten von einem hämophilen Patienten, der eine positive Aktivität gegen anti-HIV-Antikörper besitzt,
(b) humanes Serum (Kontrolle),
(c) 0.5 β-Antikörper;
(d) VAK5 (anti-p24) monoklonaler Antikörper, (produziert von den Hybridoma, die durch Immunisierung von Mäusen mit p24, einem gag Antigen von HTLV-IIIB, erhältlich sind, der in der Lage ist, p24 und seinen Vorläufer zu erkennen (Jpn. J. Cancer Res. (Gann) 78, 235-241 (1987)];
(e) 52E5 (anti-p17) monoklonaler Antikörper (monklonale Antikörper, produziert von den Hybridoma, die durch Immunisierung mit HTLV-IIIB erhältlich sind, der in der Lage ist, P17 und seinen Vorläufer zu erkennen, wobei P17 eines der gag-Proteine des HLTV-III ist]; und
(f) Maus-IgG&sub1;-Antikörper (MOPC21) als Kontrolle [Litton Biogenetics Inc. Katalog-Nr. 8401-03].
Die Proben (a) und (b) wurden mit PBS-BSA-Az (1 : 50) verdünnt und die Proben (d)-(f) wurden mit Ascites-Flüssigkeit (1 : 500) verdünnt und auf folgende Weise bei Raumtemperatur behandelt, wenn nicht anders angegeben.
Die inkubierten Streifen wurden dreimal mit PBS gewaschen und für 2 Stunden in eine verdünnte Lösung (1 : 750) von Biotinkonjugiertem Anti-Human oder Anti-Maus IgG-Antiserum (Handelsprodukt von TAGO) inkubiert. Die Streifen wurden dreimal mit PBS gewaschen und in eine verdünnte Lösung (1 : 1000) von mit Meerrettich-Peroxidase konjugiertem Avidin (Handelsprodukt von Sigma) für eine einstündige Inkubation eingetaucht. Danach wurde die Substanz dreimal mit PBS gewaschen und mit einem Reagens zur Farbentwicklung behandelt, das 4-chlor-1-naphthol (Handelsprodukt von BioRad) enthielt. Die Ergebnisse sind in Fig. 2A gezeigt, in der (a)-(f) jeweils den oben erwähnten Antikörpern entsprechen. Fig. 2A zeigt, daß der 0.5 ß-Antikörper in der Lage ist, das Hüllenprotein des HTLV-IIIB mit einem Molekulargewicht von 120 Kd zu erkennen.

B. Radioimmunopräzipitations-Methode:

H9/HTLV-IIIB (2·10&sup7; Zellen) wurde mit ³&sup5;S-Cystein durch eine 4-stündige Inkubation in einer Lösung, die ³&sup5;S-Cystein (100 uCi/ml) enthielt, markiert. Nach Waschen mit PBS wurden die Zellen in eine RIPA-Pufferlösung (0,5 ml) gegeben. Lösliche Zellysate wurden hergestellt, indem die Zellmembran unter Verwendung eines Vortex aufgebrochen wurden, gefolgt von einer Zentrifugation (10000 U.p.M./1 Stunde).
Das Lysat wurde einer 18-stündigen Reaktion mit normalem humanem IgG (500 ug) unterzogen [gereinigt unter Verwendung von Protein A-Sepharose, unter Bezugnahme auf ein Handbuch über Affinitäts-Chromatographie (Principles & Methods, p48-52, herausgegeben von Pharmacia Fine Chemicals AB.)]. Die Reaktionslösung wurde zentrifugiert (10000 U.p.M./10 min.) um den Überstand zu sammeln, der als Probenlösung verwendet wurde. Die Probenlösung (40 ul) wurde mit Immuno-Perlen vermischt [hergestellt durch Bindung von jeweils 40 ug von einem der folgenden Antikörper (a)-(e) mit 20 ul Sepharose 4B], und für 4 Stunden bei einer Temperatur von 4ºC inkubiert.
(a) Serum, das von einem Patienten erhalten wurde, der eine positive Aktivität gegen anti-HIV-Antikörper (Kontrolle) besaß;
(b) humanes Serum (Kontrolle);
(c) 0.5β-Antikörper;
(d) VAK5 (anti-p24);
(e) MOPC21 (Kontrolle).
Nach 4-maligem Waschen mit PBS wurden die Perlen in einem Probenpuffer (50 ul) suspendiert, und unter Rückfluß 2 Minuten erhitzt, um das gebundene Protein zu eluieren. Der Überstand wurde jeweils einer Elektrophorese unter Verwendung einer 12% SDS-PAGE unterzogen und mittels Autoradiographie auf übliche Weise untersucht. Die in Fig. 2B gezeigten Resultate zeigen, daß der 0.5β-Antikörper in der Lage ist, sowohl gp120, das ein reifes Protein ist, als auch gp160, das ein Vorläufer von gp120 ist, zu erkennen.
In diesem Fall wurde ein Gemisch von 0,75M Tris-HCl- Pufferlösung (8,3 ml; pH 6,8), 10% SDS (20 ml), Glycerin (10 ml), 2-Mercaptoethanol (5,0 ml), H&sub2;O (6,7 ml) und Bromphenolblau (1 mg) als Probenpufferlösung (X2) [Laemmli, U.K., Nature 227, 680-685 (1970)) verwendet.

C. Kreuz-Präzipitations-Methode:

HTLV-IIIB wurde mittels Saccharose-Dichtegradienten- Ultrazentrifugation gereinigt, wobei die aktiven Fraktionen mit einem spezifischen Gewicht von etwa 1,16 gesammelt wurden, und durch 1-stündiges Erhitzen bei einer Temperatur von 56ºC inaktiviert, gefolgt von einem Aufschluß mit 0,5% NP40, wobei man gereinigte Viren erhielt. Die gereinigten Viren (10 ul) wurden in RIPA-Pufferlösung (40 ul) aufgenommen und zusammen mit Separose 4B, die an den 0.5 β-Antikörper gebunden war, oder SEPAROSE 4B, die an MOPC21 gebunden war (hergestellt auf ähnliche Weise wie oben beschrieben) bei einer Temperatur von 4ºC über Nacht (für etwa 18 Stunden) inkubiert. Die Reaktionslösung wurde zentrifugiert (5000 U.p.M./5 min), was einen Überstand ergab, aus dem die folgenden Testproben präpariert wurden:
(b) Überstand, vorbehandelt mit 0.5 β-Sepharose;
(c) Überstand, vorhandelt mit MOPC21-Sepharose, verwendet als Kontrolle; und
(a) unbehandelt.
Die Probe wurde jeweils einer Elektrophorese unter Verwendung einer 12% SDS-PAGE unterzogen und auf eine Nitrocellulose-Membran geblottet. Die Membran wurde einer Reaktion mit dein Serum eines gesunden Wirts des HIV (100-fach verdünnt) unterzogen. Die Farbe des Reaktionsproduktes wurde mittels des Verfahrens von 2-A unter Verwendung von Biotin- Avidin-Peroxidase entwickelt. Es ist beobachtet worden, daß durch Behandlung mit dem 0.5 β-Antikörper die Reaktivität des Hüllenproteins gp120 mit dem Patientenserum abnahm, während sich die Reaktivität der Kontrollproben nicht wesentlich änderte. In Hinsicht auf die Reaktivität mit anderen Proteinen wurde kein Unterschied zwischen der Probe, die mit 0.5 β- Antikörper behandelt worden war, und der Kontrollprobe festgestellt.

D. Kreuz-Präzipitations-Methode:

Ein Verfahren, ähnlich zu dem oben in C beschriebenen, wurde unter Verwendung eines Lysates von H9/HTLV-IIIB, das mit ³&sup5;S-Cystein markiert worden war, anstelle von gereinigten Viren auf die folgende Weise durchgeführt:- Ein Teil des Überstandes des H9/HTLV-IIIB-Lysates, markiert mit ³&sup5;S-Cystein wurde zusammen mit Sepharose 4B, die an den 0.5 β-Antikörper gebunden war, oder mit Sepharose 4B, die an MOCP21 gebunden war, hergestellt auf ähnliche Weise zu der oben beschriebenen, bei einer Temperatur von 4ºC über Nacht (für etwa 18 Stunden) inkubiert. Das Gemisch wurde zentrifugiert (5000 U.p.M./5 min), was einen Überstand ergab, der als einmal behandelte Probe bezeichnet wurde. In ähnlicher Weise wurde diese Probe 4 Stunden inkubiert und zentrifugiert, was eine zweimal behandelte Testprobe ergab.
Der Überstand eines Teils der einmal oder zweimal behandelten Probe des Lysates oder der Überstand eines Teils der unbehandelten Probe wurde jeweils einer Reaktion mit anti- HIV-IgG-Sepharose [Sepharose, die an IgG mit Anti-HIV- Antikörperaktivität gebunden war] bei einer Temperatur von 4ºC für 4 Stunden unterzogen. Das Reaktionsgemisch wurde mit einer RIPA-gepufferten Lösung 4 mal gewaschen, unter Verwendung einer Probenpufferlösung eluiert, mit 12% SDS-PAGE behandelt und mittels üblicher Autoradiographie auf eine Weise, ähnlich zu der vorher in 2-B beschriebenen, behandelt.
Die Ergebnisse sind in Fig. 2D gezeigt, die folgendes erkennen läßt :- (b) Nach einmaliger Behandlung der Probe mit Sepharose 4B, an die der 0.5 β-Antikörper gebunden war, bemerkte man eine signifikante Abnahme des gp 120; und
- (c) nach zweimaliger Behandlung waren gp 120 und gp 160 fast nicht mehr nachzuweisen.
- (d) Andererseits war nach zweimaliger Behandlung des Lysates mit dem Kontroll-IgG&sub1; keine Abnahme sowohl von gp120 als auch von gp160 zu bemerken.
Das Ergebnis bei der nichtbehandelten Probe (Kontrolle) ist ferner in (a) gezeigt.

E. Verdau-Muster unter Verwendung von Endoglykosidase:

0,5% NP40 wurde zu gereinigtem HTLV-IIIB (10 ul) gegeben. Das Gemisch wurde bei einer Temperatur von 4ºC für 24 Stunden inkubiert, um die Zellen aufzubrechen, gefolgt von einer Dialyse gegen 0,1M Natriumcitrat (pH 5,5). Endoglykosidase H (Handelsprodukt von NEN; 0,25 U) wurde zu den aufgebrochenen Viren gegeben, die dann bei einer Temperatur von 37ºC für 3 Stunden inkubiert wurden, um die Viren zu verdauen.
Eine Probe von (b) verdautem HTLV-IIIB und (a) HTLV-IIIB, die mit Pufferlösung behandelt worden waren, wurden jeweils einer Elektrophorese unter Verwendung einer 12% SDS-PAGE unterzogen und auf eine Nitrocellulose-Membran geblottet. Die Farbe wurde unter Verwendung des 0.5 β-Antikörpers auf eine ähnliche Weise wie vorher in A beschrieben, auf den Streifen der Nitrocellulose-Membran entwickelt. Die Resultate sind in Fig. 2E dargestellt, die zeigen, daß der 0.5 β-Antikörper auch mit einem Teil des Proteins (70-84Kb) reagiert, von welchem die Zuckerketten durch die Endoglykosidase abgetrennt worden waren.

6) Inhibierende Wirkung des 0.5 8-Antikörpers gegen die Bildung von Syncytien durch Reaktion mit HTLV-IIIB

H9/HTLV-IIIB (2,5 · 10&sup4; Zellen) wurden zusammen mit 50 ug/ml MCOP 21 Ascites (Fig. 3A-c, B-c), 50 ug/ml 0.5 β- Ascites (Fig. 3A-d, B-d) oder 5 ug/ml 0.5 β-Ascites (Fig. 3A-e, B-e) bei Raumtemperatur für 30 Minuten in RPMI-1640-Medium (100 ul), das 10% FKS enthielt, inkubiert, wozu sodann 5 · 10&sup4; CEM-Zellen (50 ul) zur Kultivierung bei einer Temperatur von 37ºC für 18 Stunden unter Verwendung eines Inkubators, der 5% CO&sub2; enthielt, gegeben wurden. Entsprechend wurden jeweils CEM (Fig. 3A-a, B-b) und H9/HTLV-IIIB (Fig. 3A-b, B-b) kultiviert und als Kontrolle verwendet. Nach der Kultivierung wurde ein Umkehr-Mikroskop verwendet, um Fotografien aufzunehmen. Die Reihen A (150-fach) und B (60-fach) wurde nach 18-stündiger Kultivierung bzw. einer weiteren 3-tägigen Kultivierung aufgenommen. Es wurde gefunden, daß die Bildung von Syncytien (Fig. 3A-c) und die Bildung von Zell-Klumpen (Fig. 3B-c) bei den Kontrollproben in Gegenwart von 50 ug/ml 0.5 β-Antikörper (Fig. 3A-d, B-d) vollständig inhibiert wurden. Die Bildung einer kleineren Anzahl an Syncytien (Fig. 3A-e) und die Bildung kleinerer Zell-Klumpen (Fig. 3B-c) wurden in Gegenwart von verdünntem 0.5 β-Antikörper (5 ug/ml) beobachtet. In diesem Fall wurde beobachtet, daß die Zellen keine größeren Klumpen bildeten und um die Syncytien und die Zellklumpen herum streuten. Ausgehend von dieser Tatsache scheint es, daß die Verwendung von 50 ug/ml des 0.5 β-Antikörpers eine Infektion zwischen den Zellen effektiv inhibiert, während die Verwendung von 5 ug/ml des 0.5 β-Antikörpers eine partielle Inhibition ergab. Der Ascites wurde vor der Verwendung jeweils für eine Stunde bei 56ºC inkubiert.

7) Neutralisierende Wirkung des 0.5 β-Antikörpers:

Ähnlich zu der in den JP-A-500767/86 und JP-A-28756/86, offenbarten Weise wurden HTLV-IIIB-Viren (2-5 · 10&sup8;/ml) durch Ultrazentrifugation (32 000 · g, 3 Stunden) des Überstandes einer Kultur von H9/HTLV-IIIB gesammelt. Die Viren (20 ul) und der 0.5 β-Antikörper (20 ul) wurden jeweils in verschiedenen Verdünnungsverhältnissen in ein Loch einer 96-Lochkulturschale mit rundem Boden für eine 1-stündige Inkubation bei einer Temperatur von 4ºC gegeben, gefolgt von einer weiteren, 15-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur.
H9-Zellen (4 · 10&sup4;) wurden unter Verwendung von Polyburen (2 ug/ml) 20 Minuten bei Raumtemperatur behandelt und mit RPMI- 1640-Medium gewaschen. Die Zellen wurden sodann in ein anderes RPMI-1640-Medium (200 ul), das 20% FKS, Penicillin (50 U/ml) und Streptomycin (50 ug/ml) enthielt, für eine 5-6-tägige Inkubation bei einer Temperatur von 37ºC transferiert.
Das Auftreten des HTLV-IIIB p24-Antigens in H9-Zellen wurde mittels der Fluorescein-Antikörper-Methode untersucht, um den Titer der neutralisierenden Antikörper zu berechnen [Nature 316, 72-74 (1985)].
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. In dieser Tabelle ist die neutralisierende Wirkung der Antikörper als ng/ml des gereinigten IgG oder als reziproker Wert des Verdünnungsverhältnisses des Serums und des Ascites ausgedrückt. TABELLE 1 Titer des neutralisierenden Antikörpers Gereinigter 0.5β 0.5βAscites Humanes Serum (positiv)
Der erfindungsgemäße 0.5β-Antikörper zeigt eine neutralisierende Wirkung bei niedrigen Konzentrationen, wie 100 ng/ml des gereinigten Antikörpers. In Form von Ascites wurde eine 100%-ige neutralisierende Wirkung bei einem Verdünnungsverhältnis von 1 : 6250 beobachtet.

8) Reinigung des Hüllenantigens von H9/HTLV- IIIB-Zellen:

H9/HTLV-IIIB wurde ähnlich zu der oben in (1) beschriebenen Weise kultiviert und behandelt, was ein Pellet ergab. Das Pellet (5 · 10&sup7; Zellen) wurde in RIPA-Puffer (2,5 ml) suspendiert und bei einer Temperatur von 4ºC für 60 Minuten inkubiert, was ein Zell-Lysat ergab. Das Zell-Lysat wurde zentrifugiert (3000 U.p.M./10 min.), um Feststoffe zu entfernen. Der Überstand wurde 1 Stunde bei einer Temperatur von 56ºC erhitzt, um HTLV-IIIB zu inaktivieren. Die inaktivierten Zellen wurden einer Reaktion mit etwa 0,5 ml FKS- Perlen [Sepharose 4B, gebunden an 10% FKS] bei einer Temperatur von 4ºC für 18 Stunden unterzogen und zentrifugiert (5000 U.p.M./5 min.).
Unspezifische Adsorbate wurden an FKS-Perlen adsorbiert. Der Überstand wurde mit an 0.5β-Antikörper-gebundenen Sepharose 4B-Perlen (200 ul) vermischt und bei einer Temperatur von 4ºC für 4 Stunden inkubiert. Nach Abschluß der Reaktion wurden die Perlen in eine Säule gepackt und mit 4 ml PBS (pH 7,2) und 2 ml HSB [0.02M Phosphat-gepufferte Lösung, enthaltend 0,5M NaCl; pH 7,2)] gewaschen. Die Elution wurde unter Verwendung von Glycin-HCl (4 ml; pH 2,7), die 0,15M NaCl enthielt, bewirkt. Sofort danach wurde das Eluat mit Tris-HCl (pH 10) neutralisiert. Von jeder Fraktion (0,5 ml), wurden 10 ul gesammelt und in 2 Löcher einer ELISA-Schale Imuron I (Handelsprodukt von Dynatech Laboratory) aufgetragen. Die Probe wurde bei einer Temperatur von 4ºC über Nacht in 0,09 ml einer 0,1 M Carbonsäure-Pufferlösung (pH 9,8) inkubiert.
Die ELISA-Methode wurde über Nacht durchgeführt, wobei eine Reaktion mit 0.5β-Antikörper (1500-fach) erfolgte, gefolgt von einer Reaktion mit Alkalischer Phosphatase-Konjugiertem Anti-Maus IgG, um die Farbe zu entwickeln.
In Fig. 4 ist das gereinigte Antigen als einzelner Peak gezeigt.

Claims

1. Monoklonaler Antikörper oder ein Fragment davon, der oder das in der Lage ist, spezifisch ein Glykoprotein-Antigen, das ein Molekulargewicht von 120 000 Dalton besitzt und in der Hülle des humanen immunmangel-Virus Typ 1 (HIV-1) lokalisiert ist, zu binden und:

a) in der Lage ist, im wesentlichen zu neutralisieren:

(i) eine zellfreie Infektion des Virus in vitro und

(ii) eine Zell-Zell-Infektion des Virus in vitro durch Binden an die Oberfläche einer mit dem HIV-1-Virus infizierten Zelle, wobei die durch infizierte Zellen und nichtinfizierte Ziel-T- Zellen induzierte Bildung von Synzytien, inhibiert wird;

b) zur IgG&sub1;-Klasse gehörig klassifiziert ist;

c) in der Lage ist, an einen Vorläufer eines Glykoprotein-Antigens mit einem Molekulargewicht von 160 000 Dalton zu binden; und

d) in der Lage ist, an ein Epitop zu binden, das innerhalb der Aminosäuresequenz 308-331 des HIV gp 160 lokalisiert ist.

2. Hybridom oder ein Subklon davon, das oder der in der Lage ist, einen monoklonalen Antikörper gemäß Anspruch 1 zu produzieren.

3. Hybridom gemäß Anspruch 2, hinterlegt als ECACC Nr. 87051401 oder ein Subklon davon.

4. Pharmazeutisches Mittel, umfassend, zusätzlich zu einem oder mehreren pharmazeutisch inerten Excipienten und/oder Trägern, eine wirksame Menge mindestens eines monoklonalen Antikörpers gemäß Anspruch 1.

5. Antikörper-Affinitäts-Träger, wobei ein monoklonaler Antikörper gemäß Anspruch 1 an einen geeigneten Träger gebunden ist.

6. Verwendung eines monoklonalen Antikörpers gemäß Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikamentes zur therapeutischen oder prophylaktischen Behandlung einer HIV-Infektion beim Menschen.