DE3908802C2 - Verfahren zur Gewinnung von PDGF-AA - Google Patents
Verfahren zur Gewinnung von PDGF-AAInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Aufarbeitung
von PDGF-AA.
Platelet Derived Growth Factor (PDGF) ist ein Hauptmitogen
im Serum, das das Wachstum von Fibroblasten und glatten
Muskelzellen in vitro fördert. In vivo wird PDGF in den
alpha-Granula der Thrombozyten gespeichert und nach Stimu
lation der Thrombozyten freigesetzt. Hochgereinigtes PDGF
ist ein basisches Protein, das eine beträchtliche Hetero
genität hinsichtlich seines Molekulargewichts aufweist
(Kb 27 000 bis 31 000 d). Die Gründe für diese Heterogenität
sind Alterung, Prozessierung und die Existenz verschie
dener Isoformen des Typs AA, AB oder BB. Die biologische
Aktivität aller dieser Formen wird durch Reduktion der
Disulfidbrücken zerstört. Human-PDGF aus Thrombozyten be
steht hauptsächlich aus AB-Heterodimeren; vgl. Heldin
1984, Deuel et al. 1985 und Ross et al. 1986).
Aminosäuresequenzierungen in Verbindung mit DNA-Sequen
zierungen der Gene zeigten, daß A und B homolog sind. PDGF-
B ist nahezu identisch mit dem transformierenden Genprodukt
p28vsis des Simian-Sarcoma-Virus (SSV). In SSV-trans
formierten Zellen wurden entsprechende Homodimere des Types
BB nachgewiesen, die ähnliche Eigenschaften wie thrombo
zytäres PDGF zeigten. Allerdings wurden diese BB-Dimeren
nur zum geringen Teil aus den infizierten Zellen sekretiert.
PDGF-AA-Formen werden hingegen effizient von produzierenden
Zellen sekretiert. Es gibt eine zunehmende Zahl von Hin
weisen, daß die drei Isoformen AA, AB und BB unterschied
liche Funktionen wahrnehmen. Für eingehende Untersuchungen
war daher die Entwicklung einer neuen Lehre notwendig,
mit der sich größere Mengen an PDGF-AA gewinnen lassen.
Arch. Imm. Ther. Exp., 32 (1994) 589-598 kann man entnehmen, daß
sich PDGF durch eine Säure/Ethanol-Extraktion eines Platelet-Lysats
isolieren und konzentrieren läßt. Das Konzentrat kann man
einer Ionenaustauschchromatographie an DEAE-Sephadex und an CM-Sephadex
unterwerfen, wonach man die Fraktion aus der CM-Sephadex-Chromatographie
an Glas (CPG-10) adsorbieren kann. Anregungen zur
Aufarbeitung von PDGF aus Expressionskulturen werden nicht
gegeben. Für eine Reinigung von PDGF und verwandten Faktoren aus
Zellkulturüberständen läßt sich wiederum Nature, 319 (1986) 511-514
und J. Biol. Chem. 263 (1988) 16 202-16 208 ein vierstufiges
Chromatographieverfahren entnehmen, dessen Erfolg jedoch noch
verbesserungsbedürftig ist.
Erfindungsgemäß wird nun ein Verfahren zur Aufarbeitung von PDGF-AA
aus Expressionskulturen vorgesehen, das dadurch gekennzeichnet
ist, daß man PDGF-AA aus dem wässerigen Medium der
Expressionskultur an einem keramischen Material adsorbiert.
Vorzugsweise verwendet man Glas als keramisches Material und
insbesondere poröses Glas.
Zusätzlich zur genannten Aufarbeitungsmaßnahme kann man
das adsorbierte PDGF-AA eluieren und danach einer Gelpermeationschromatographie
und/oder einer HPLC-Chromatographie
an einer Umkehrphase unterwerfen.
Nachstehend wird die Erfindung durch experimentelle Daten
und 3 Figuren näher erläutert.
| Verwendetes Lebendmaterial | ||
| Referenz | ||
| SV40-Promotor bzw. Vektor mit SV40-Promotor | ||
| Pharmacia | ||
| pPFa-1=pPFG-1 | FEBS Lett., 223 (1987) 243-246 | |
| pBEH | Gene, 68 (1988) 213-219 | |
| pAG60 @ | AKR-2B | Beispiel für Maus-Fibroblasten |
| BHK 21 | ATCC-CCL 10 | |
| LTK |
Zellkulturen waren von Gibco. Chromatographiematerialien:
poröses Glas PG 120-200, Sigma; Bio-Gel P100, 200-400 mesh,
Bio-Rad; modifiziertes Kiesgelgel 214 TP54, 10 µm (=Vydac C4)
von Vydac (Macherey & Nagel); Harnstoff war von Sigma.
Ethylenglykol und Puffersubstanzen waren von Merck. Restrik
tionsendonukleasen und Ligasen wurden von Boehringer bzw.
BRL bezogen.
Wachstumsfördernde Aktivität wurde nach Shipley et al. (1984)
durch die Bestimmung der [³H]Thymidinrate in dichtearretierte
Maus AKR-2B Fibroblasten ermittelt. Proteingehalt wurde nach
Bradford bestimmt. Aminoterminale Sequenzanalyse wurde mittels
eines Gas-Flüssig-Phasen-Protein-Sequenators (Applied Biosystems)
durchgeführt. PTH Aminosäuren wurden "on line" durch HPLC-
Chromatographie bestimmt. Polyacrylamidgelelektrophorese in
Gegenwart von Natrium Dodecylsulfat wurde wie beschrieben (Hoppe
et al., 1986) durchgeführt. Standard DNA-Techniken wurden nach
Maniatis (1982) durchgeführt.
Ein 712 Basenpaar langes RsaI Fragment aus dem Vektor pPFa-1 (=
pPFG-1) (Hoppe et al., 1987), das den für PDGF-A kodierenden
Bereich enthält, wurde in die SmaI Schnittstelle des SV40 Ex
pressionsvektors pBEH (Artel et al., 1988) integriert und somit
unter die Kontrolle des SV40 Promotors gebracht.
Dieses Plasmid wurde durch Kotransfer mit dem Plasmid pAG60
(Colb´re-Garapin et al., 1988) stabil chromosomal in BHK21-Zellen
integriert. Nach Subklonierung wurde eine Zellinie erhalten, die
bis zu 1 mg/l PDGF-AA/Tag in das Nährmedium sekretierte. Aus
Überständen dieser Zellkulturen konnte PDGF-AA durch ein Drei
stufenverfahren zur Homogenität gereinigt werden. Der erste
Schritt war Adsorption an poröses Glas, der zweite Schritt
Gelpermeations-Chromatographie an Bio-Gel P100. Die Endreinigung
wurde durch Hochdruckflüssigkeits-Chromatographie an reverser
Phase erzielt. Die Ausbeuten waren ca. 0,2 mg PDGF-AA/l
Zellkulturüberstand. Die spezifische Aktivität war 4 ng/ml für
50% Aktivierung des [³H]Thymidineinbaus in Maus AKR-2B Fibro
blasten.
Aus dem 1,2 Kb langen Bam HI Fragment des Plasmides pPFa-1 (Hoppe
et al., 1987), das den vollständigen für PDGF-A kodierenden
Bereich enthält, wurde durch RsaI-Verdau ein 712 Basenpaar langes
Fragment erhalten, das ebenfalls noch den gesamten kodierenden
Bereich beinhaltet. Dieses Fragment wurde in die SmaI
Schnittstelle im Polylinker des Plasmides pBEH integriert. Die
Orientierung wurde durch SalI-Spaltung ermittelt. Ein Plasmid
wurde erhalten, das das PDGF-A-Gen in korrekter Orientierung
unter Kontrolle des SV40 Promoters im Plasmid pBEH enthielt.
Dieses Plasmid wurde pODa genannt.
Die Transfektion von BHK21 Zellen wurde im wesentlichen nach der
Methode von Wigler et al., 1979, durchgeführt. Die zu transfi
zierenden Zellen wurden in der exponentiellen Wachstumsphase vor
Erreichen der Konfluenz abtrypsiniert, gezählt, in einer Zell
dichte von 3×10⁵ Zellen pro Kulturflasche (25 cm² Bodenfläche)
in 5 ml Kulturmedium neu ausgesät und 24 Std. bei 37°C inkubiert.
Am darauffolgenden Tag, 4 Std. vor Zugabe der Präzipitate, wurde
das Medium entfernt und durch frisches Wachstumsmedium ersetzt.
Die Präzipitate wurden wie folgt hergestellt: 5 µg der zu trans
formierenden DNS wurden unter sterilen Bedingungen zusammen mit 5 µg
Träger-DNS aus LTK-Zellen mit 0,5 µg Selektions-DNS (pAG60,
Bam HI geschnitten) in 0,25 ml 250 mM CaCl₂ gelöst. Diese Lösung
wurde langsam, unter ständiger Verwirbelung durch über eine
wattegestopfte Pasteurpipette eingeblasene Luft zu 250 µl 2×HEBS-Puffer
(280 mM NaCl, 50 mM HEPES, 1,5 mM NaH₂PO₄, pH 7,1)
getropft, wodurch sich ein DNS/Kalziumphosphat-Kopräzipitat
ausbildet. Die so hergestellte Lösung wurde zur vollständigen
Ausfällung für eine weitere Stunde bei Raumtemperatur inkubiert
und anschließend den zu transfizierenden Kulturen zugesetzt. Nach
16 Std. wurde das Medium gegen frisches Wachstumsmedium ausge
tauscht. Am zweiten Tag nach Zugabe der Präzipitate begann die
Selektion, in dem das Medium durch frisches Kulturmedium, dem 500 µg/ml
G418 zugesetzt waren, ersetzt wurde. Das Selektionsmedium
wurde alle 2-3 Tage erneuert. Nach 2-4 Wochen waren 2000 Kolonien
erkennbar. Um auf eine stabile Transformation zu
selektionieren, wurden die Zellen zweimal in Selektionsmedium
passagiert. Diese Kolonien wurden vereinigt und durch Grenz
verdünnung rekloniert. Einzelne Klone wurden hinsichtlich ihrer
Produktivität an PDGF-AA untersucht. Ein Hochproduzent (Klon 39)
wurde erhalten.
Zur Gewinnung größerer Mengen an Zellkulturüberständen wurden
Zellen des Klon 39 in 15 Rollerflaschen (600 cm² Oberfläche,
Falcon) in HG-DMEM/10% FCS, 25 mM HEPES, pH 7,4, angezogen
(37°C). Nach Erreichen der Konfluenz wurden die Zellen zweimal
mit HG-DMEM, 25 mM HEPES gewaschen und in diesem Medium 2 Tage
gehalten. Danach wurden sie 12 Stunden in HG-DMEM, 25 mM HEPES,
10% FCS, kultiviert. Diese Prozedur wurden 4 Wochen lang durchge
führt. Insgesamt wurden ca. 25 l Kulturüberstand erhalten.
Proteine aus den vereinigten Überständen wurden quantitativ an
poröses Glas CPG 120-200 absorbiert. Dazu wurde 1% w/v Glas zu
dem Überstand gegeben und 1/2 h inkubiert. CPG-Glas wurde in
einer Säule (5 cm ⌀) gesammelt und die Überstände wurden erneut
über das CPG-Glas filtriert. Danach wurde solange mit 10 mM
Natriumphosphat, 0,5 M NaCl-Puffer, pH 7,2, gewaschen, bis die
OD₂₈₀ (1 cm) unter 0,005 gesunken war. Die Elution von PDGF-AA
wurde durch 0,4 M Glycin/HCl, pH 2,0, 6% Harnstoff, 6% Etylen
glykol, erreicht. Nach der Dialyse PDGF-AA enthaltenden Fraktionen
gegen 10 mM Natriumphosphat, pH 7,5, wurde durch Zugabe von
80% Ammoniumsulfat (Sättigung) ausgefällt. Das Präzipitat wurde im
kleinst möglichen Volumen 10 mM Essigsäure aufgenommen. Portionen
von 10 ml wurden auf eine Säule 2 cm ⌀×140 cm (Bio-Gel P100 in
0,1 M Essigsäure) aufgetragen. Flußrate war ca. 15 ml/h.
Fraktionen von 4 ml wurden gesammelt. Aliquots der Fraktionen
wurden durch SDS-Gelelektrophorese analysiert. PDGF-AA-haltige
Fraktionen wurden vereinigt und auf eine Vydac C4 Säule aufgetragen
(0,8 cm ⌀×25 cm). Flußrate war 1 ml/min. Die Säule war
vorher in 0,1% Trifluoressigsäure äquilibriert. Die Elution
erfolgte durch einen linearen Gradienten von 14% Acetonitril in
0,1% Trifluoressigsäure/H₂O nach 35% Acetonitril in 0,1% Tri
fluoressigsäure/H₂O während 70 min bei einer Flußrate von 0,7 ml/min.
Die Extinktion bei 220 nm wurde kontinuierlich
registriert und Fraktionen von 0,7 ml wurden gesammelt.
PDGF-AA eluierte bei einem Acetonitrilgehalt von 26-27%. Aliquots
der Fraktionen wurden gelelektrophoretisch untersucht und solche
ohne Fremdproteingehalt wurden vereinigt.
Die Transfektion von BHK21 Zellen mit dem Vektor pODa ergab 2000
unabhängige Klone. Durch Reklonierung wurden Stämme erhalten, die
sich stark in der Produktion von PDGF-AA unterschieden. Es wurden
Klone erhalten, die bei optimalen Bedingungen bis zu 1 mg/l PDGF-
AA im Kulturüberstand aufwiesen. Einer dieser Klone (Klon 39)
wurde näher charakterisiert.
Durch eine einfache Kultivierungsprozedur in Rollerflaschen
wurden 25 l Überstand erhalten. Die Adsorption der Proteine am
porösen Glas erwies sich als optimal, sowohl hinsichtlich der
effizienten Reduktion eines großen Volumens von 25 l auf 250 ml
als auch der theoretischen Aktivitätsausbeute. Eine 5fache
Anreicherung konnte erzielt werden. Durch zwei weitere
chromatographische Schritte (Gelpermeationschromatographie und
anschließend Hochdruckflüssigkeitschromatographie an umgekehrter
Phase) konnte PDGF-AA in ca. 50%iger Ausbeute erhalten werden.
Etwa 0,2 mg PDGF-AA wurde aus 1 l Überstand isoliert. Das so
erhaltene Material ist einheitlich in der SDS-gelektrophorese
(Abb. 2) und zeigte in der aminoterminalen Sequenzanalyse nur die
erwartete Sequenz SIEE . . .
Es ist demnach eindeutig als PDGF-AA identifiziert. Dieses
Material stimuliert den [³H]Thymidineinbau in dichtearretierte
Mausfibroblasten AKR-2B halbmaximal bei einer Konzentration von
5 ng/ml.
Literatur
Artelt, P., Morelle, C., Ausmeier, M., Fitzek, M. and Hauser, H.
(1988) Gene 68, 213-219.
Bradford, M. M. (1976) Anal. Biochem. 72, 248-253.
Colb´re-Garapin et al. (1981) J. Mol. Biol. 150, 1-14.
Hoppe, J., Gatti, D., Weber, H. and Sebald, W. (1986) Eur. J. Biochem. 155, 259-264.
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Wigler, M., Sweet, R., Sim, G. K., Wold, B., Pellicer, A., Lacy, E., Maniatis, T., Silverstein, S. und Axel, R. (1979) Cell 16, 777-785.
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Wigler, M., Sweet, R., Sim, G. K., Wold, B., Pellicer, A., Lacy, E., Maniatis, T., Silverstein, S. und Axel, R. (1979) Cell 16, 777-785.
Claims (3)
- 2. Verfahren zur Aufarbeitung von PDGF-AA aus Expressionskulturen, dadurch gekennzeichnet, daß man PDGF-AA aus dem wässerigen Medium der Expressionskultur an einem keramischen Material adsorbiert.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als keramisches Material Glas, insbesondere poröses Glas verwendet.
- 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man zusätzlich das adsorbierte PDGF-AA eluiert und danach einer Gelpermeationschromatographie und/oder einer HPLC-Chromatograhie an einer Umkehrphase unterwirft.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19893908802 DE3908802C2 (de) | 1989-03-17 | 1989-03-17 | Verfahren zur Gewinnung von PDGF-AA |
| PCT/EP1990/000440 WO1990011356A1 (en) | 1989-03-17 | 1990-03-16 | Expression vector, eukaryotic cells and method for the recovery of pdgf-aa |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19893908802 DE3908802C2 (de) | 1989-03-17 | 1989-03-17 | Verfahren zur Gewinnung von PDGF-AA |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE3908802A1 DE3908802A1 (de) | 1990-09-20 |
| DE3908802C2 true DE3908802C2 (de) | 1994-11-24 |
Family
ID=6376589
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE19893908802 Expired - Lifetime DE3908802C2 (de) | 1989-03-17 | 1989-03-17 | Verfahren zur Gewinnung von PDGF-AA |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE3908802C2 (de) |
| WO (1) | WO1990011356A1 (de) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3855504T2 (de) * | 1987-04-22 | 1997-01-23 | Chiron Corp | Rekombinante Herstellung von A-Ketten-Polypeptiden von PDGF |
-
1989
- 1989-03-17 DE DE19893908802 patent/DE3908802C2/de not_active Expired - Lifetime
-
1990
- 1990-03-16 WO PCT/EP1990/000440 patent/WO1990011356A1/en not_active Ceased
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1990011356A1 (en) | 1990-10-04 |
| DE3908802A1 (de) | 1990-09-20 |
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