DE39743T1 - Rekombinante plasmidringe mit breitem wirtspektrum als klonierungsvektor und ihre herstellung. - Google Patents
Rekombinante plasmidringe mit breitem wirtspektrum als klonierungsvektor und ihre herstellung.Info
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Claims (1)
- Europäische Patentanmeldung 80 103 658.3 Anmelder: MICROLIi1E TECHNICS, INC.Patentansprüche20 1Rekombinanter Desoxyribonukleinsäure-Plasmidring, gekennzeichnet durch ein erstes Plasmidfragment, wobei das erste Plasmid ursprünglich von einer Plasmidaggregation mit dem Plasmid RP1 erhalten wurde und eine molekulare Größe von etwa 2 χ 10 Daltons oder weniger aufweist sowie ein kritisches Restruktionsendonuklease-Bgll-Abbaufragment, dessen molekulare Größe 0.83 x 10 Daltons beträgt und das unentbehrlich für die Replikation ist, und dieses erste Fragment kovalent verbunden ist mit mindestens einem zweiten Desoxyribonukleinsäurefragment, welches ein Restriktionsendonuklease-Abbaufragment ist, das mit dem ersten Plasmid _in vitro verbunden wird oder ein natürlich vorkommendes Fragment ist, das durch ein Bakterium in vivo in das erste Plasmid inseriert wird als ein rekombinanter Plasmidring, der geeignet ist, von Pseudomonas aeruginosa PAO ATCC 15692 getragen zu werden und der einen breiten bakteriellen Wirtsübertragungsbereich aufweist, wobei das zweite Fragment eine geeignete che_mische Eigenschaft für den rekombinanten Plasmidring
beiträgt und der Plasmidring sich selbst durch Desoxyribonukleinsäure-Replikation während der Zellteilung
des Wirtbakteriums klont.2. Plasmid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das zweite Fragment einen phänotypischen Marker enthält, der dem Wirtsbakterium eine ausgewählte Antibiotikumresistenz verleiht.3. Plasmid nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Antibiotikumresistenz eine
solche gegen das Antibiotikum Carbenicillin (carbenicillin) ist und es die Bezeichnung pR01601 trägt.4-. Plasmid nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es in Pseudomonas aeruginosa
NRRL-B-12125 enthalten ist..Plasmid nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Antibiotika Tetracyclin und Carbenicillin sind und es die Bezeichnung pS01614 trägt.6. Plasmid nach Anspruch 5, dadurch gekenn-25zeichnet , daß es in Pseudomonas aeruginosaNRRL-B-12127 enthalten ist.7. Plasmid nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , daß die Resistenz eine solche gegenCarbenicillin ist und die Bezeichnung pRO1613 trägt und in Pseudomonas aeruginosa NRRL-B-12126 enthalten ist.8. Plasmid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das zweite Fragment aus chromosomaler Desoxyribonukleinsäure ist und die Fähigkeit
aufweist, mindestens eine Aminosäure zu produzieren.9- Plasmid nach Anspruch 8, dadurch gekenn-zeichnet, daß die aus den Aminosäuren gewählte Aminosäure L-Methionin ist und das Plasmid die Bezeichnung pR01616 trägt oder die Aminosäuren L-Isoleucin und L-Vaiin sind und das Plasmid die Bezeichnung p301615 trägt.10. Plasmid nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Plasmid das Plasmid pR01616 ist und in KRRL-B-I2148 enthalten ist.11. Plasmid nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Plasmid das Plasmid pR01615 ist und in KRRL-B-1214-9 enthalten ist.12. Bakterielles Präparat, gekenn zeich η etdurch einen Desoxyribonukleinsäure-Plasmidring, der ein erstes Plasmidfragment enthält, wobei das erste Piasaidfragment ursprünglich als eine Plasmidaggregation'mit dem Plasmid RP1 erhalten wurde und eine mo-6lekulare Größe'von etwa 2x10 Daltons oder wenxger aufweist sowie ein kritisches Restrikionsendonuklease-Bgll-Abbaufragment, dessen molekulare Größe 0.83 x 10 Daltons beträgt und das unentbehrlich, für die Repli-kation ist, und dieses erste Fragment kovalent verbun-25den ist mit mindestens einem zweiten Desoxyribonukleinsäurefragment, welches ein Restriktionsendonuklease-Abbaufragment ist, das mit dem ersten Plasmid in vitro verbunden wird oder ein natürlich vorkommendes Fragment ist, das durch ein Bakterium in vivo in das erste Plasmid inseriert wird als ein rekombinanter Plasmidring, der geeignet ist, von Pseudomonas aeruginosa PAO ATCC 15692 getragen zu werden und der einen breiten bakteriellen Wirtsübertragungsbereich aufweist, wobei das zweite Fragment eine geeignete klonierbare Eigenschaft für den rekombinanten Plasmidring beiträgt und der Plasmidring sich selbst durch. Desoxyribonukleinsäure-Replikation während der Zellteilung des Wirtsbakteriums klont sowie ein Virtsbakterium.13- Präparat nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet , daß das Wirtsbakterium aus den Gattungen Pseudomonas, Escherichia, Azotobacter und Klebsieila ausgewählt ist.
514-. Verfahren zum Herstellen eines rekombinanten Desoxyribonukleinsäureplasmids unter Verwendung eines Restriktionsendonukleaseenzyras, um ein erstes Plasmid zu spalten und nachfolgendem Bilden eines rekombinan-■ ten Rings mit einer zweiten Desoxyribonukleinsäurequelle durch Verknüpfen, um ein.rekombinantes Plasmid zu bilden, dadurch gekennzeichnet, daß das erste Plasmid ursprünglich aus einer Plasmidaggregation mit dem Plasmid RP1 erhalten wird und ei-6ne molekulare Größe von etwa 2 χ 10 Daltons oder weniger aufweist sowie ein kritisches Restrikti onsendo-nuklease-Bgll-Abbaufragment hat, das eine molekulare Größe von 0.83 x 106 Daltons ;
lieh für die Replikation ist'.Größe von 0.83 x 10 Daltons aufweist und unentbehr-15· Verfahren nach Anspruch 14·, dadurch gekennzeichnet , daß die zweite Desoxyribonukleinsäurequelle ein Plasmid ist.16. Verfahren nach Anspruch 14-, dadurch gekennzeichnet , daß die zweite Desoxyribonukleinsäürequelle ein Chromosom ist.17· Verfahren nach Anspruch 14,. dadurch g e kennzeichnet , daß die Restriktionsendonuklease Pstl ist und das Verknüpfen unter Verwendung von T4—Ligase öder Derivaten von dieser durchgeführt wird.18. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet , daß weiterhin die rekombinanten Plasmide transformiert werden, wobei ein Bak-_ 5 —terium verwendet wird, das ein Plasmid aufnehmen kann und die rekombinanten Plasmide in dem Bakterium. eine selektive Eigenschaft für das Herstellen einer besonderen chemischen Verbindung aufweisen.19. Verfahren nach Anspruch 14-, dadurch gekennzeichnet , daß das erste Plasmid ausgewählt ist aus den Plasmiden pR01600, pR01601, PROI6I3 und pR0i614.20. Verfahren zum Transportieren von DNA-Plasmiden in bakterielle Wirte jLn_ vivo unter Anwendung des Prozesses der bakteriellen Konjugation, Transformation oder Transduktion dadurch gekennzeich-net, daß ein DNA-Plasmidring transportiert wird, der einen ersten Plasmidring enthält, der ursprünglich als eine Plasmidaggregation mit dem Plasmid RP1 erhalten wurde und eine molekulare Größe von etwa 2 χ 10 Daltons oder weniger aufweist und ein kritisches BgII-Restriktionsendonuklease-Abbaufragment aufweist, daseine molekulare Größe von 0=83 x 10 Daltons hat, wobei dieser Plasmidring entweder alleine transportiert wird odei* mit einem Fragment aus dem ersten Plasmidring, der kovalent verbunden ist mit mindestens einem 25zweiten DNA-Fragment, das ein Restriktionsendonuklease-Abbaufragment ist, das mit dem ersten Plasmid in vitro verbunden wird oder als natürlich vorkommendes Fragment durch ein Bakterium in_ vivo in das erstePlasmid inseriert wurde, um einen rekombinanten Plas-30midring zu bilden, wobei die Plasmide geeignet sind, von Pseudomonas aeruginosa PAO ATCC 15692 getragen zu werden und die Plasmide einen breiten bakteriellen Wirtsbereich aufweisen und das Plasmid sich selbst durch DNA-Replikation während der Zellteilung des Wirtsbakteriums klont.21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet , daß der erste Plasmidring, der mit dem zweiten Fragment kombiniert ist, einenphänotypischen Marker aufweist, der dem Wirtsbakte-5riura ausgewählte Antibiotikumresistenzen verleiht«,22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet , daß die Antibiotikumresistenz eine solche gegen das Antibiotikum Carbenicil-10. lin ist und das Plasmid das Plasmid pR01601 ist,23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet , daß das Plasmid pR01601 inPseudornonas aeruginosa NRRL-B-I2125 enthalten ist. 1524. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet , daß die Resistenz eine solche gegen die Antibiotika Carbenicillin und Tetracyclin ist und das Plasmid die Bezeichnung pRO1614-■ trägt.25» Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet , daß das Plasmid in Pseudomonas aeruginosa WRRL-B-12127 enthalten ist.26» Verfahren nach Anspruch 20,dadurch gekennzeichnet, daß das Plasmid mit der Bezeichnung pRO1613 in Pseudomonas aeruginosa NRRL-B-12126 enthalten ist.27- Verfahren zur bakteriellen Transposition, dadurch gekennzeichnet, daß:a) ein Aggregat eines ersten Plasmids mit einem zwei- __ ten Plasmid zur Verfügung gestellt wird, wobei das zweite Plasmid ein Transposon aufweist und das erste Plasmid ursprünglich als eine Aggregation mit . RP1 erhalten wurde und eine molekulare Größe vonetwa 2 χ 10 Daltons oder weniger aufweist und ein kritisches Bgll-Endonuklease-Abbaufragment aufweist, das eine molekulare Größe von 0.83 x 10 Daltons aufweist und unentbehrlich für die Replikation ist,b) das Plasmidaggregat in einer Bakterienzelle zur Verfügung gestellt wird, die Plasmide aufnehmen kann,^q c) die bakterielle Empfängerzelle mit dem Plasmidaggregat für die zufällige Produktion eines rekombinierten Plasmids in einem Wachstumsmedium gezüchtet wird, wobei das rekombinierte Plasmid das Transposon und das erste Plasmid enthält, und sich das rekombinierte Plasmid bei der Teilung der bakteriellen Zelle repliziert, undd) die bakteriellen Zellen mit dem rekombinierten Plasmid ~it dem Transposon selektiert werden.28. Verfahren zum Herstellen eines rekombinierten Plasmids durch Transposition nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß:a) das Plasmidaggregat EP1/pR0i600 aus einem bakteriellen Donor-Wirt extrahiert wird ^ wobei das Plasmidaggregat ein Transposon in dem RPI-Plasmid aufweist, das eine Antibiotikumresistenz produziert,b) eine für die Aufnahme eines Plasmids empfängliche Bakterienzelle ohne Antibiotikumresistenz zur Verfügung gestellt wird,c) die Empfängerbakterienζeile mit dem Plasmid RPI/pR01600 gezüchtet wird, um die zufällige Produktion eines rekombinierten Plasmids mit pR01600 zu erhalten, das das Transposon für Antibiotikumresistenz durch genetische Transformation aufweist, wo-bei das rekombinierte Plasmid mit der Teilung der bakteriellen Zelle repliziert undd) daß das rekombinierte Plasmid von pR01600, das das 5Transposon aufweist selektiert wird durch selektives Verwenden von Antibiotika, um die Bakterienzellen ohne Antibiotikumresistenz zu töten.29- Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet , daß die Antibiotikumresistenz eine solche gegen Carbenicillin ist und das Transposon die Bezeichnung TnI trägt und das rekombinierte Plasmid das Plasmid pR01601 1st und in Pseudomonas aeruginosa NRRL-B-12125 enthalten ist.30. Desoxyribonukleinsäurefragment, geeignet um ein Plasmid zu bilden, dadurch gekennzeichnet, daß das Fragment aus einem ersten Plasmid ge-2Q bildet ist, das ursprünglich aus einer Plasmidaggre-•gation mit Plasmid RP1 erhalten wurde, das eine molekulare Größe von etwa 2 χ 10 Daltons oder weniger aufweist, wobei das Fragment ein kritisches Sestriktionsendcjnuklease-Bgll-Abbaufragment aufweist, das eine molekulare Größe von 0.83 sr 10 Daltons hat und in einem Plasmid unentbehrlich für die Replikation ist,31. Fragment nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet , daß die Enden des Fragments als Folge einer Bgll-Verdauung die folgende Struktur aufweist:5'-GGCCGAGGCGGCCTCGGCC-3' 3'-CCGGCTCCGCCGGAGCCGG-5'
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