DE4135545C2

DE4135545C2 - Kapillargele, die durch eine räumlich fortschreitende Polymerisation unter Verwendung eines wandernden Initiators gebildet werden

Info

Publication number: DE4135545C2
Application number: DE4135545A
Authority: DE
Inventors: Milos V Novotny; Vladislav Dolnik; Kelly A Cobb
Original assignee: Indiana University Foundation
Current assignee: Indiana University Foundation
Priority date: 1990-10-26
Filing date: 1991-10-28
Publication date: 1994-11-03
Anticipated expiration: 2011-10-29
Also published as: NL194562B; IT1249720B; GB9122660D0; JPH05322845A; FR2668604A1; DE4135545A1; GB2249838B; FR2668604B1; AU8590091A; ITRM910812A0; NL194562C; GB9122566D0; JPH0718841B2; AU641607B2; ITRM910812A1; NL9101775A; GB2249838A; US5080771A

Description

Die US-Regierung besitzt eine vollbezahlte Lizenz an dieser Erfindung und das Recht bei begrenzten Sachverhalten vom Patent inhaber zu verlangen anderen unter angemessenen Bedingungen eine Lizenz einzuräumen, wie es durch die Bedingungen des Grant No. PHS R01 GM 24 349 vorgesehen ist, das durch das National Institu te of General Medical Sciences, U.S. Public Health Service ver liehen wurde.

Diese Erfindung liegt auf dem Gebiet der Gelelektrophorese, mit einem Schwerpunkt auf der Verwendung von gelgefüllten Kapillaren für die Kapillarelektrophorese.

Hintergrund der Erfindung

Eine der bedeutsamsten jüngsten Entwicklungen in der Technologie der analytischen Techniken für biologische Gemische ist die Technik der Kapillarelektrophorese. Die Kapillaren liefern deut liche Vorteile bei den Trennungen von solchen Spezien, wie klei ne Peptide, Proteine und Nukleinsäuren, da sie dazu verwendet werden können extrem kleine Proben durch geeigneten on-line spektroskopischen Nachweis zu analysieren, und sie die Verwen dung hoher Spannungen erlauben, wodurch Trennungen mit relativ hoher Geschwindigkeit erreicht werden.

Die Verwendung eines Gels als Trennungsmedium in den Kapillaren kombiniert die Vorteile der Kapillarelektrophosere mit den be kannten Leistungen der Gelelektrophorese. Wegen ihrer einzigartigen Geometrie stellen die Kapillaren jedoch eine klare Herausforderung dar, insbesondere bei der Herstellung des Gels in der Kapillare. Ein mühevoller Punkt ist die Schwierigkeit eine einheitliche Gelkonsistenz und -konzentration durch die Kapillare zu erhalten. Diese sind wichtig um eine Komponenten auflösung und Reproduzierbarkeit zu erreichen, und sie sind des halb wichtige Größen um eine optimale Verwendung der Technik, insbesondere bei Kapillaren mit sehr enger Bohrung zu erreichen. Dies ist schwierig mit Gelen in den Kapillaren zu erreichen, da die Schrumpfung des Gels, die ein inhärentes Ergebnis der Poly merisationsreaktion ist, Lücken in dem Gel verursacht, insbeson dere blasenähnliche offene Räume, allgemein von mikroskopischen Dimensionen, die Abweichungen von der Gleichförmigkeit des Gels verursachen. Dergleichen Unterbrechungen führen zu einem Strom abfall und Zusammenbruch des angelegten elektrischen Feldgra dienten während der Elektrophorese, was der Reihe nach die Wirk samkeit, Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit der Trennung erniedrigt.

Obgleich schon Techniken vorgeschlagen wurden um dieses Problem zu lösen, neigen sie dazu, Materialien, eine Ausrüstung oder Verfahren zu erfordern, die im Zusammenhang mit Kapillaren, der Gelherstellung oder Elektrophorese nicht allgemein verwendet werden und sie ergeben variierende Ergebnisse.

Zu diesem Stand der Technik wird verwiesen auf US-PS Nr. 4 997 537 (Karger, et al.), US-PS Nr. 4 863 647 (Baylor) und US-PS Nr. 4 936 974 (Rose, et al.).

Weiterhin wird zum Stande der Technik verwiesen auf die DE-OS 36 42 551 A1, die ein Verfahren zum Gießen eines Gels in eine vertikale Geleinfassung mit einer unteren Öffnung betrifft, wobei das Benetzen einer benetzbaren Membran, das Andrücken der benetzten Membran an die untere Öffnung, das Füllen der Geleinfassung mit einer zweiten Lösung der gelbildenden Substanz, das Erstarrenlassen der gelbildenden Substanz in einer zweiten Lösung und das Entfernen der Membran von der unteren Öffnung vorgesehen ist. Dieses Verfahren betrifft also nicht das Füllen eines Kapillarrohres.

Die vorliegende Erfindung ist auf diese Notwendigkeit gerichtet in einer einfachen, wirksamen, reproduzierbaren und verläßlichen Weise.

Übersicht über die Erfindung

Es wurde jetzt entdeckt, daß gelgefüllte Kapillaren ohne die Unterbrechnungen, die üblicherweise während des Gelbildungspro zesses entstehen, durch Verwendung eines elektrischen Feldes in einer zu einem elektrophoretischen Verfahren analogen Art herge stellt werden können, um einen geladenen Polymerisationsinitiator in ein Ende der Kapillare einzuführen und ihn kontinuierlich entlang der Länge der Kapillare entlang zu ziehen bis er das ganze innere Volumen der Kapillare durchdrungen hat, wobei die Kapillare mit einer flüssigen Lösung aller gelbildenden Materia lien mit Ausnahme des Initiators vorgefüllt wurde. Der in das Rohr eintretende Initiator wird von einer Front mitgeführt die longitudinal durch die Kapillare mit einer langsamen, im wesent lichen konstanten linearen Geschwindigkeit in der axialen Rich tung wandert. Die Polymerisation des Gels bei einem gegebenen Punkt in der Kapillare beginnt dabei, wenn die Front zuerst diesen Punkt passiert, und die Polymerisation schreitet bis zur Vollständigkeit fort, indem sie kontinuierlich dem Initiator, der sich daran vorbeibewegt, ausgesetzt ist.

In dieser Beschreibung bezieht sich der Ausdruck "Front" auf einen Berührungspunkt, der den Teil des Kapillarinneren, in dem der Initiator vorliegt, von dem Teil trennt, in dem er im we sentlichen nicht vorliegt. Obgleich der Berührungspunkt sich in den meisten Fällen weniger als eine perfekt scharfe Grenze dar stellt, kann eine Verbreiterung oder Verschwommenheit des Berüh rungspunktes durch eine geeignete Kontrolle der Wanderungsge schwindigkeiten in dem gleichen Sinn wie bei elektrophoretischen Trennungen minimiert werden. Die Lokalisierung des Berührungs punktes wird allgemein definiert durch die Tatsache, daß die Polymerisation auf der Initiatorseite auftritt und nicht auf der gegenüberliegenden Seite.

Die Schrumpfung der Gelmaterialien, die als ein Ergebnis der Polymerisationsreaktion auftritt, ist im wesentlichen, wenn nicht völlig auf den Bereich begrenzt, der sich unmittelbar hinter der wandernden Initiatorfront befindet, wobei die bisher unpolymerisierte Flüssigkeit nach hinten auf eine, in eine Rich tung gehende Weise gezogen wird und die Spannung in dem Gel enthaltenden Bereich und die Tendenz Unregelmäßigkeiten oder Unterbrechungen in dem so gebildeten Gel zu bilden, wirksam eliminiert wird. Das Verfahren wird unter Bedingungen durchge führt, die das gelbildende Material in der Kapillare im wesent lichen frei von einem elektroosmotischen Fluß machen. Darüber hinaus dient in bevorzugten Ausführungsformen eine der Komponen ten der gelbildenden Mischung, die eine entgegengesetzte Ladung zu der des Initiators trägt, als Gegenion während der Einführung des Initiators, wobei es in die Kapillare vom anderen Ende ein tritt, als eine Maßnahme die Menge der Komponente durch die ganze Kapillare für die Dauer des Polymerisationsverfahrens aufrecht zu erhalten.

Weitere Merkmale, Aspekte und Ausführungsformen der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung offenbar.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist eine diagrammartige Darstellung, die eine Ausfüh rungsform der Erfindung darstellt, bei der ein Kapillarrohr an geordnet ist, das mit einem gelbildenden Material gefüllt ist, zur Einführung des Polymerisationsinitiators in ein Ende durch Anlegung eines elektrischen Potentials.

Fig. 2 ist ein Linienzug eines Anzeigegeräts einer kapillaren gelelektrophoretischen Trennung von Proteinen in unbehandeltem Mäuseurin unter Verwendung einer gelgefüllten Kapillare, die gemäß der Erfindung hergestellt wurde.

Die Fig. 3a und 3b sind Linienzüge von einem Anzeigegerät einer kapillaren gelelektrophoretischen Trennung von Oligosacchariden, wiederum unter Verwendung einer gelgefüllten Kapillare, die gemäß der Erfindung hergestellt wurde.

Fig. 4 ist ein Linienzug von einem Anzeigegerät einer kapillaren gelelektrophoretischen Trennung von Oligonukleotiden, wiederum unter Verwendung einer gelgefüllten Kapillare, die gemäß der Erfindung hergestellt wurde.

Genaue Beschreibung der Erfindung und ihrer bevorzugten Ausführungsformen

In der Gelelektrophorese verwendet man verschiedene Gele und diese sind für die vorliegende Erfindung verwendbar. Die Wahl des Gels ist für die Erfindung nicht kritisch. Die Gele von primärem Interesse sind jedoch Polyacrylamidgele, angesichts der bekannten Anwendbarkeit dieses Materials für die Größenfraktio nierung von geladenen Macromolekülen, wie z. B. Proteinen und Nukleinsäuren und kleinen Peptiden. Gemische aus Polyacrylamid mit anderen Gelmaterialien, wie z. B. Agarose sind auch von In teresse.

Das gelbildende Material schließt allgemein ein vernetzendes Agens ein. Eine große Variation der vernetzenden Agentien ist bekannt und im Zusammenhang der Erfindung für den Einsatz ge eignet. Beispiele von vernetzenden Agentien, die bei der Acryl amidpolymerisation eingesetzt werden können, sind N,N′-Methylen bisacrylamid, N,N′-(1,2-dihydroxyethylen)bisacrylamid, N,N′- Diallylweinsteindiamid, N,N′-Cystaminbisacrylamid und N-Acrylo yltris(hydroxymethyl)aminomethan. N,N′-Methylenbisacrylamid ist ein bevorzugtes vernetzendes Agens.

Die Konzentrationen des Gelmonomeren und des vernetzenden Agens sind nicht kritisch und können beträchtlich variieren. Die ge eignete und optimale Wahl in jedem besonderen Fall hängt von der Zusammensetzung des Gemisches ab, das durch das fertiggestellte Gel getrennt werden soll, wie auch die Dimensionen der Kapillare und die Bedingungen unter denen die Trennung durchgeführt werden soll. In den meisten Fällen werden die besten Ergebnisse erhal ten unter Verwendung wäßriger Lösungen des gelbildenden Materi als in denen sich die Konzentration des gelbildenden Monomers und des vernetzenden Agens zusammen von etwa 0,05 bis etwa 20 Gew.-%, vorzugsweise von etwa 2 bis etwa 8 Gew.-% bewegte. Das Verhältnis des vernetzenden Agens zu der Kombination aus gelbil dendem Monomer und vernetzendem Agens bewegt sich gleichfalls in den meisten Fällen von etwa 0,5 bis etwa 20 Gew.-%, vorzugsweise von etwa 2 bis etwa 6 Gew.-%. Die zusammengesetzte Konzentration aus Monomer und vernetzendem Agens ist die Variable, die in der Literatur gewöhnlich als "T" bezeichnet wird, während das Ver hältnis des vernetzenden Agens zur Gesamtmenge, die mit "C" be zeichnete Variable ist.

Die Polymerisation wird allgemein in Anwesenheit eines Polymeri sationskatalysators durchgeführt, der im Falle der Polyacryl amidbildung ein Basenkatalysator ist. Die tatsächlich eingesetz te Base ist nicht kritisch und jede von einer Vielzahl als Poly merisationskatalysatoren bekannter Basen kann verwendet werden. Hauptbeispiele für Polyacrylamid sind Aminbasen wie z. B. N,N,N′,N′-Tetramethylethylendiamin, β-Dimethylaminopropionitril und Triethanolamin. Von diesen sind N,N,N′,N′-Tetramethylethy lendiamin ("TEMED" oder "TMEDA") und Triethanolamin bevorzugt. Die Basenmenge kann auch variieren, obwohl in den meisten Fällen die Base allgemein in einer Konzentration von etwa 0,01M bis etwa 1M, vorzugsweise von 0,03M bis etwa 0,3M eingesetzt wird.

Der Polymerisationsinitiator, der in die Kapillare durch Akti vierung unter dem Einfluß des elektrischen Feldes eingeführt wird, ist irgendeine geladene Spezies, die die Polymerisations reaktion initiiert. Weder die chemische Natur noch der Mechanis mus des Initiators sind kritisch. In den meisten Fällen jedoch ist der Initiator ein freier Radikalinitiator. Bevorzugte freie Radikalinitiatoren sind Peroxide, Persulfate und Azoverbindun gen. Beispiele sind Benzoylperoxid, tert-Butylperoxid, tert- Butylhydroperoxid, tert-Butylperbenzoat, Cumylperoxid, Acetyl peroxid, Lauroylperoxid, 2,2′-Azobisisobutyronitril, Phenylazo triphenylmethan und Persulfate, wie z. B. Kaliumpersulfat und Ammoniumpersulfat. Unter diesen sind insbesondere in wäßrigen Systemen die Persulfate, insbesondere Ammoniumpersulfat bevor zugt.

Gemäß der Erfindung wird der Initiator von den Komponenten des gelbildenden Materials in dem Kapillarrohr vor dem Anlegen des elektrischen Feldes weggelassen und statt dessen in Lösung in einem Reservoir gehalten. In das Reservoir tauchen ein offenes Ende der Kapillare und eine Elektrode ein. Die Gegenelektrode und das andere Ende der Kapillare werden in ein zweites Reser voir eingetaucht. Die Konzentration des Initiators in dem ersten Reservoir ist nicht kritisch und kann in weitem Umfang variie ren. Bei den meisten Anwendungen, insbesondere dann, wenn der Initiator ein Persulfation ist, werden die besten Ergebnisse mit einer Konzentration erzielt, die sich von etwa 0,03M bis etwa 2,0M, vorzugsweise von etwa 0,1M bis 1,0M bewegt.

Negativ geladene Initiatoren, wie z. B. das Persulfation werden in das Kathodengefäß gebracht. Ein positiv geladenes Gegenion wird entsprechend in das Anodengefäß zur Wanderung in die ent gegengesetzte Richtung gebracht. Während die Natur und Identität des Gegenions nicht kritisch für die Erfindung sind, ist in bevorzugten Ausführungsformen das Gegenion dieselbe Base, die als Katalysator in der gelbildenden Lösung, die die Kapillare einnimmt, eingeschlossen ist. Da die Base in der Kapillare unter dem Einfluß des elektrischen Feldes in die entgegengesetzte Richtung zu der des Initiators wandert, wird somit die verarmen de Base durch die Base, die kontinuierlich vom Anodengefäß ein geführt wird, ersetzt. Die Konzentration der Base in dem Anoden gefäß ist allgemein höher als die Konzentration der Base die ur sprünglich in der Kapillare war, obgleich die tatsächliche Kon zentration nicht kritisch ist und in einem weiten Bereich vari ieren kann. In bevorzugten Ausführungsformen liegt die Konzen tration der Base im anodischen Gefäß bei etwa 0,1M bis etwa 10M, besonders bevorzugt bei etwa 0,3M bis 3M.

Wie oben angegeben, wird das Gelbildungsverfahren unter Bedin gungen durchgeführt, bei denen im wesentlichen kein elektroosmo tischer Fluß oder eine treibende Kraft auftritt. Somit werden entweder die Kapillare selbst oder die flüssige Spezies, die ihr Inneres einnimmt, so ausgewählt oder behandelt, daß ein geringes oder kein elektrokinetisches Potential vorliegt. Dies kann man durch Verfahren erreichen, die dem Fachmann bekannt sind. Diese Verfahren folgen allgemein einer oder zwei grundlegenden Metho den. Die erste ist eine chemische Bindung eines neutralen Mate rials an die innere Oberfläche der Kapillare um die Oberflächen ladung und Adsorptionsstellen zu eliminieren. Die zweite schließt die Handhabung eines Puffer-pHs und der Ionenstärke ein um den elektrokinetischen Effekt zu reduzieren oder zu eliminie ren.

Für die vorliegende Erfindung wird die erste Methode vorgezogen. Verschiedene neutrale Materialien und Verfahren der Bindung solcher Materialien an die Kapillaroberfläche können verwendet werden. Für Siliziumdioxid enthaltende Oberflächen sind Bei spiele die Bindung von Glycol enthaltenden Materialien, die Bin dung von linearen Polymeren, wie z. B. Methylcellulose und nicht vernetztes Polyacrylamid durch ein Organosilanreagenz, die An wendung einer Polyvinylpyrrolidon-Beschichtung, auch ggf. durch ein Organosilanreagenz und die Verwendung von Polyethylenglycol. Viele dieser Beschichtungstechniken sind in der Literatur doku mentiert und den Fachleuten bekannt.

Die chemische Zusammensetzung und Struktur der Kapillare selbst ist nicht kritisch und kann in einem weiten Bereich variieren. Bevorzugte Kapillaren sind solche aus Siliziumdioxid enthalten den Materialien, wie z. B. Glas, Hartglas und Quarz. Hartglas ist insbesondere geeignet wegen seiner großen Verfügbarkeit und bewährten Leistungsfähigkeit.

Die Dimensionen der Kapillare können auch in einem weiten Be reich variieren. In den meisten Fällen besitzt die Kapillare einen Innendurchmesser von etwa 5 µm bis etwa 250 µm, vorzugsweise von etwa 20 µm bis etwa 100 µm. Die Länge der Kapillare beträgt ebenfalls in den meisten Fällen etwa 5 cm bis etwa 500 cm, vorzugsweise etwa 10 cm bis etwa 100 cm.

Das elektrische Feld wird über die Kapillare durch konventionel le Techniken angelegt. Das Verfahren ist besonders gut angepaßt an solche Techniken, wie sie bei der elektrophoretischen Tren nung selbst verwendet werden. Das schließt allgemein das Ein tauchen der beiden Enden der Kapillare in Lösungen ein, die in Reservoirs gehalten werden, wobei jedes ferner eine oder zwei Elektroden enthält. Das elektrische Potential wird dann zwischen den Elektroden von einer herkömmlichen Stromquelle angelegt. In Fig. 1 wird eine Darstellung dieser Anordnung gezeigt, die das Kapillarrohr 11 mit seinen zwei offenen Enden 12, 13 zeigt, die in getrennten Elektrodenreservoirs 14, 15 eintauchen mit den Elektroden 16, 17, die ebenfalls darin eintauchen. Der Strom wird durch eine Stromquelle 18 an die Elektroden geliefert. Als typisches Beispiel enthält das kathodische Reservoir 14 ein Persulfation und das anodische Reservoir 15 enthält ein Trietha nolammoniumion, während die Kapillare vor dem Anlegen des elek trischen Potentials mit einer Mischung aus Acrylamid, N,N′-Me thylenbisacrylamid und Triethanolaminhydrochlorid gefüllt wird.

Die Größe des elektrischen Potentials ist nicht kritisch. Primär wird die Vermeidung einer übermäßigen Joule-Heizung zu berück sichtigen sein, die in der Kapillare als ein Ergebnis des Stro mes auftritt. Während die Joule-Heizung durch Kühlung durch die Kapillarwände vermindert werden kann, ist es in den meisten Fällen unpraktisch die äußere Kapillaroberfläche mit einem flüs sigen Kühlmedium zu kontaktieren. Entsprechend wird die Joule- Heizung allgemein durch eine Begrenzung der Spannung kontrol liert. In den meisten Fällen liegt das Potential innerhalb des Bereiches von etwa 0,5 V bis etwa 20 V pro Zentimeter Kapillarlän ge, vorzugsweise von 1,0 V bis etwa 10 V pro Zentimeter Kapillar länge.

Es ist ebenfalls von Interesse, daß das Potential nieder genug ist, um für eine langsame und stetige Bewegung der Initiatorfront durch das Kapillareninnere zu sorgen in einer Weise, die die Aufrechterhaltung einer Front fördert, die einen so scharfen Anstieg der Initiatorkonzentration wie möglich darstellt. Der Zweck hiervon ist, zum größtmöglichen Ausmaß sicherzustellen, daß die Polymerisation in bezug auf die liniare Geschwindigkeit der Front schnell geschieht, wodurch die ganze flüssige Bewegung wegen der Schrumpfung zu den nichtpolymerisierten Bereichen vor der Front beschränkt wird. Das optimale Potential und daher die Frontgeschwindigkeit variiert mit dem einzelnen System, ein schließlich der Art des Gelmonomers und des vernetzenden Agens und ihrer Konzentrationen. In den meisten Fällen, erreicht man die besten Ergebnisse mit einer Front, die sich mit einer linea ren Geschwindigkeit von etwa 0,003 cm/min bis bis 0,3 cm/min, vorzugsweise von etwa 0,01 cm/min bis etwa 0,1 cm/min fortbewegt.

Wenn das Gel einmal bis zum gewünschten Ausmaß der Polymerisa tion sich gebildet hat, ist es vorzuziehen alle nicht polymeri sierten Komponenten zu entfernen, die für die Gelbildung ver wendet werden, wie z. B. der Initiator und der Katalysator von dem Gel. Dies wird schnell erreicht durch einen Ersatz der Lö sungen in den Elektrodenreservoirs durch den Grundelektrolyt, der bei den nachfolgenden elektrophoretischen Trennungen eingesetzt werden soll. Dies variiert in Abhängigkeit von der beabsichtigten durchzuführenden Trennung, jedoch ist das Verfah ren Standard und anwendbar auf alle solchen Elektrolyte. Die Spannung wird angelegt um den Elektrolyt durch das Gel zu treiben und dadurch den Initiator und Katalysator zu entfernen. Noch einmal, ist es primär zu berücksichtigen, daß die übermäßi ge Joule-Heizung vermieden wird, die verursachen könnte, daß das Gel sich zersetzt. Dieses Äquilibrierungsverfahren kann durch einen on-line-Detektor, wie z. B. einen UV-Detektor überwacht werden, der eine stabilisierte Grundlinie anzeigt, wenn einmal alle sich bewegenden Grenzen die Kapillare passiert haben.

Kapillargele, die gemäß dieser Erfindung gebildet wurden, sind nützlich bei der Durchführung einer großen Variation von Tren nungen, einschließlich derjenigen, die kürzlich in Kapillarroh ren durchgeführt wurden und derjenigen, die in Gelmedien durch geführt wurden. Solche Trennungen schließen Trennungen von Pro teinen, Peptiden, Oligonukleotiden und Oligosacchariden ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt.

Das folgende Beispiel ist zum Zweck der Illustration dargelegt und es soll die Erfindung weder in irgendeiner Weise genau fest legen noch begrenzen.

BEISPIELE A. Kapillarbeschichtung

Eine Kapillarrohrleitung aus Hartglas mit 40 cm Länge (50 µm In nendurchmesser, 187 µm Außendurchmesser, Polymicro Technologies, Phoenix, Arizona, U.S.A.) wurde nacheinander jeweils für 30 Minuten mit 1M NaOH und destilliertem Wasser gespült. Man füllte die Kapillare mit einer Lösung, die aus 4 µl γ-Methacryloxypro pyltrimethoxysilan in 1 ml 6 mM Essigsäure hergestellt wurde. Nach wenigstens einer Stunde, wurde die Kapillare mit destilliertem Wasser mehrere Minuten lang gespült, anschließend ausgeleert. Anschließend füllte man die Kapillare mit einer entlüfteten Lösung von 2,5% Acrylamid, die 0,1% Ammoniumpersulfat und 0,1% N,N,N′,N′-Tetramethylethylendiamin (TEMED) enhielt. Nach 30 Minuten wurde die Kapillare mit destilliertem Wasser 5 Minuten gespült, anschließend entleert.

B. Gelbildung

Die beschichtete Kapillare wurde mit einer Mischung gefüllt, die 5,8% Acrylamid (T = 6%), 0,18% N,N′-Methylenbisacrylamid (C = 3%) und 100 mM Triethanolaminhydrochlorid enthielt. Ein Kapillar ende stellte man in ein Gefäß, das 10% Ammoniumpersulfat und eine Platindrahtelektrode enthielt. Das andere Kapillarende stellte man in ein Gefäß, das 25% Triethanolamin und eine zweite Platindrahtelektrode enthielt. Die Elektroden wurden mit einer Niederspannungsgleichstromquelle verbunden mit der ersten Elek trode als der Anode und der zweiten als der Kathode. 8 bis 15 Stunden lang wurde ein Potential von 160 V (d. h., 4 V/cm) ange legt.

Die Kathoden- und Anodengefäße wurden anschließend durch Gefäße ersetzt, die den Grundpuffer, der bei der elektrophoretischen Trennung eingesetzt ist, enthielten. Der Puffer umfaßte 100 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethan, 200 mM 2-(N-Morpholino)-ethansul fonsäure und 1% Natriumdodecylsulfat. Dann wurde eine Hochspan nung (500 V) etwa 5 Stunden lang angelegt, darauf folgte ein schrittweiser Anstieg der Spannung so, daß die Joule-Heizung, die in der Kapillare entstand, 0,5 mW/cm nicht überschritt. Diese Äquilibrierung mit Grundpuffer wurde fortgesetzt bis sich der Strom bei einer konstanten Spannung stabilisiert hatte und ein on-line-variabler Wellenlängen-UV-Absorptionsdetektor (UVIDEC 100 IV, Jasco, Tokyo, Japan), der nach einem Bereich der Kapil lare ausgerichtet wurde, von dem die Polymerbeschichtung ent fernt worden war, die ungefähr 15 cm von einem Ende angebracht war, eine stabilisierte Grundlinie ergab, die anzeigte, daß alle wandernden Grenzen hindurchgegangen waren.

C. Verwendung der gelgefüllten Kapillare bei der Trennung von Proteinen

Es wurde eine Elektrophorese einer Probe von unbehandeltem Mäu seurin in einer gelgefüllten Kapillare mit 35 cm Länge des Teils B dieses Beispiels durchgeführt. Die Länge der Kapillare bis zum Detektor betrug 20 cm, und es wurde ein Detektor verwendet wie er aus Teil B zu erkennen ist. Der Grundelektrolyt war mit dem oben beschriebenen identisch, mit 0,1-1,0% Natriumdodecylsulfat. Die Proben wurden durch Elektrowanderung 5-60 Sekunden lang bei 100 V/cm eingeführt. Die erhaltene Nachweisspur zeigt Fig. 2, was sich in Übereinstimmung befindet mit Analysen, die auf andere Weise von der Probe der gleichen Quelle gemacht wurden.

D. Die Verwendung der gelgefüllten Kapillare bei der Trennung von Oligosacchariden

Für die Oligosaccharidtrennung wurde eine Kapillare verwendet, die in analoger Weise hergestellt wurde. Die Kapillare hatte einen Innendurchmesser von 100 µm und eine Länge von 27 cm, von der 19 cm effektive Länge waren. Die Gelmaterialien und das Poly merisationsverfahren waren die gleichen wie die in Teil A und B oben beschriebenen und das fertige Gel wurde durch T = 10%, C = 3% charakterisiert. Der Puffer war 0,1M Tris/0,25M Borat/7M Harnstoff bei pH = 8,33.

Die erste getrennte Probe bestand aus einer Mischung von folgen den Bestandteilen:

1. Glukose,
2. Maltose,
3. Maltotriose,
4. Maltotetraose,
5. Maltopentaose,
6. Maltohexaose,
7. Maltoheptaose.

Jede Spezies wurde reduktiv aminiert und mit einem aminselekti ven fluorerzeugenden Reagens vor der Trennung markiert um eine Bestimmung mittels laserinduzierter Fluoreszenz zu ermöglichen. Die Injektion wurde durch Elektrowanderung bei 3 kV 10 s lang ausgeführt. Zur Trennung betrug die angelegte Spannung 7 kV (264 V/cm) bei 18 µA. Die erhaltene Nachweisspur wird in Fig. 3a gezeigt, in der die Peaks durch die oben aufgeführten Zahlen identifiziert werden.

Die zweite getrennte Probe bestand aus einem Gemisch, das sich aus der partiellen Hydrolyse von Polysaccharidmaltodextrose (Dextrin 15) ergab, die in der gleichen Weise wie die Oligosac charide der ersten Probe aminiert und markiert wurden. Die In jektion wurde durch Elektrowanderung bei 5 kV 30 sec lang durch geführt. Die Trennung wurde mit einer angelegten Spannung von 7 kV (264 V/cm) bei 18 µA durchgeführt. Die sich ergebende Nach weisspur zeigt Fig. 3b, in der die Peaks numeriert werden, um die beobachteten Oligomere darzustellen.

E. Verwendung der gelgefüllten Kapillare bei der Trennung von Oligonukleotiden

Es wurde eine weitere Kapillare, die auf analoge Weise herge stellt wurde, für die Trennung eines Polynukleotidgemisches verwendet, das aus pd(A)_25-30 und pd(A)_40-60 bestand. Die Kapillare hatte einen Innendurchmesser von 75 µm und eine Länge von 27 cm, wovon 20 cm effektive Länge waren. Die Gelmaterialien und das Polymerisationsverfahren waren die gleichen wie die in den Tei len A und B oben beschriebenen und das fertige Gel wurde durch T = 10%, C = 5% charakterisiert. Der Puffer war 0,1M Tris-Bo rat/7M Harnstoff pH = 8,1 und die angelegte Spannung betrug 7,5 kV, 3 µA.

Die Ergebnisse werden in Fig. 4 dargestellt, die zeigt, daß deutliche Trennungen erreicht wurden.

Die vorgenannten Ausführungen sind primär zum Zweck der Darstel lung dargelegt. Für den Fachmann ist es schnell klar, daß eine Vielzahl von Variationen und Substitutionen sowohl hinsichtlich der hier offenbarten Materialien als auch Verfahren durchgeführt werden kann ohne vom Geist und Umfang der Erfindung abzuweichen.

Bei der eingangs erwähnten DE-OS 36 42 551 wird die Einfassung selbst mit der gelbildenden Lösung gefüllt. Diese Verfahren kann erfindungsgemäß nicht angewendet werden, da Kapillarrohre nicht so einfach gefüllt werden können wie der Raum zwischen zwei Platten. Das Innere eines Kapillarrohres ist nämlich wesentlich empfindlicher für die Bildung von Spalten und anderen Ungleichmäßigkeiten während des Polymerisationsprozesses. Die DE-OS 36 42 551 würde deshalb zur Herstellung einer gelgefüllten Kapillarkolonne zum Einsatz in der Kapillarelektrophorese nicht geeignet sein. Sie gibt dem Fachmann auch keinen Hinweis auf die erfindungsgemäße Lösung.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung einer gelgefüllten Kapillarkolon ne zum Einsatz in der Kapillarelektrophorese, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:

a) Füllen eines Kapillarrohres mit ersten und zweiten Enden mit einer Lösung aus einem gelbildenden Material, das befä higt ist, einer gelbildenden Polymerisationsreaktion zu un terliegen, wenn es in Kontakt mit einem Polymerisations initiator gebracht wird,
b) Eintauchen des ersten Endes des Kapillarrohres in eine erste Elektrodenlösung, in der der Polymerisationsinitiator gelöst ist in einer Form, die, wenn sie einem elektrischen Feld ausgesetzt wird, wandern kann, und Eintauchen des zweiten Endes des Kapillarrohres in eine zweite Elektroden lösung, und
c) Anlegen eines elektrischen Potentials zwischen den ersten und zweiten Elektrodenlösungen durch das Kapillarrohr unter Bedingungen, die im wesentlichen frei von einem elektroos motischen Fluß sind, um die Wanderung des Polymerisations initiators in das Kapillarrohr auszulösen, geführt von einer Front des Polymerisationsinitiators, der entlang des Kapillarrohres von dem ersten Ende zu dem zweiten Ende mit einer vorher bestimmten linearen Geschwindigkeit wandert, wodurch die Polymerisationsreaktion entlang der Front aus gelöst wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Polymerisationsinitiator ein freier Radikalinitiator ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem der freie Radikalinitiator ein Persulfation und die Konzentration des Persulfations in der ersten Elektrodenlösung etwa 0,1 bis etwa 1,0 M beträgt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das gelbildende Material von einem Acrylamidmonomer, einem Vernetzungsagens und einer Base umfaßt wird und die zweite Elektrodenlösung eine Lösung dieser Base ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Kapillarrohr eine Hartglas-Kapillare ist, wobei deren innere Oberfläche mit einer die Elektroosmose unterdrüc kenden Substanz beschichtet ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Kapillarrohr einen Innendurchmesser von etwa 20 bis etwa 100 µm hat.

7. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das elektrische Potential der Stufe (c) etwa 1,0 bis etwa 10 V pro cm Länge des Kapillarrohres beträgt.

8. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die vorherbestimmte lineare Geschwindigkeit der Stufe (c) etwa 0,01 bis etwa 0,1 cm/min beträgt.

9. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem die Base ein Amin ist.

10. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem die Base ein Amin ist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus N,N,N′,N′-Tetramethylethylendiamin, β-Dimethylaminopro pionitril und Triethanolamin besteht.