DE4137220C2 - Verfahren und Mittel zur in vitro-Bestimmung der Toxizität von Substanzen oder Substanzgemischen - Google Patents

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren gemäß Oberbegriff des Anspruchs 1 sowie ein Mittel zur Durchführung dieses Verfahrens gemäß Anspruch 9.

Für die Bewertung der Einwirkung von Einzelchemikalien und/ oder komplexen Substanzgemischen auf biologische Systeme gibt es verschiedene Testmethoden. Als biologische Systeme werden dabei Säugetiere wie Mäuse, Fische wie Goldorfen, als Einzelzelle wachsende Grünalgen, Hefen, immortalisierte Fisch- bzw. Säugetierzellen (Zell-Linien) oder humane Blut­ leukozyten (sogenannte suborganische Testverfahren) her­ angezogen. Bei diesen Methoden wird eine Letalitätsrate von Tieren oder Zellen in einen Zusammenhang zur eingesetzten absoluten oder relativen Substanzkonzentration gesetzt (zum Beispiel LD₅₀, Endpunktkonzentration).

Die Bedeutung von in vitro-Zellkultursystemen zur Bestim­ mung der Toxizität nimmt in jüngster Zeit immer stärker zu. Beschleunigt wird diese Entwicklung durch Tierschutzgeset­ ze, steigende Häufigkeit der Beprobung aufgrund des Chemi­ kaliengesetzes und dem damit verbundenen Kostendruck.

Toxizitätsparameter sind ein unverzichtbarer Bestandteil einer Chemikalienbewertung, insbesondere, wenn analytische Verfahren unzureichend sind. Dies ist regelmäßig dann der Fall, wenn Substanzgemische vorliegen, die analytisch schwer oder gar nicht zugänglich sind wie beispielsweise bei Abwässern von Klärwerken und bei denen sich Aussagen über das integrale Wirken der Stoffe auf Biosysteme nur schwer machen lassen.

Die eingangs erwähnten Testorganismen sind teilweise schon recht lange zur zuverlässigen Bestimmung der Toxizität bzw. Zytotoxizität anerkannt. Die Bestimmung der Toxizität in vitro wird durch verschiedene Test­ systeme mit unterschiedlichen Zelltypen und Nachweis­ systemen durchgeführt. Eine Möglichkeit zur Bestimmung der Zytotoxizität von Abwasser ist die Verwendung von immortalisierten Leberzellen der Regenbogenforelle. An dieser Zell-Linie sind umfangreiche Untersuchungen durchgeführt worden (siehe P.-D. Hansen, I. Schwanz- Pfitzner und G. M. Tillmanns: Ein Fischzellkulturtest als Ergänzungs- oder Ersatzmethode zum Fischtest, Bundesge­ sundheitsblatt 8/89, Seiten 343-346).

Diese Toxizitätsuntersuchungen sind eigens dafür einge­ richteten Laboratorien vorbehalten. Die Standardisierung und Vergleichbarkeit der Testsysteme ist unbefriedigend. Beides sind Ursachen für die geringe Akzeptanz und den noch geringen Verbreitungsgrad von in vitro-Toxizitäts­ tests.

Ein weiterer Nachteil der in vitro-Toxizitätstests beruht auf der aufwendigen Lagerung und Pflege der Zellen. Dazu ist größtenteils eine spezifische Laborausstattung er­ forderlich. Zwar ist die Lagerung eingefrorener Zellen prinzipiell möglich, jedoch ist zur Verwendung von solchem Material eine entsprechende Laborausstattung erforderlich sowie mit der Handhabung von Zellkulturen gut vertrautes Personal.

In Biological Abstract 73 21521; Analytical Biochemistry 113 (1), 1981, Seiten 85 bis 92 wird eine sensitive Methode zum Nachweis der zytolytischen Aktivität von extrem gerin­ gen Gehalten von stabilen oder von sehr instabilen Zytoto­ xinen beschrieben. Dieses Verfahren zur in vitro-Bestimmung der Toxizität von Substanzen und Substanzgemischen ist dadurch gekennzeichnet, daß man die Substanz oder das Sub­ stanzgemisch auf immobilisierte Erythrozyten einwirken läßt und danach zum Nachweis der Erythrozytenzahl den Hämoglo­ bingehalt oder den Gehalt an anderen Zellbestandteilen bestimmt.

In CA 72 (15:) 75628f werden zwei Schnell-Assays beschrie­ ben, die auf der hämolytischen Aktivität und der Fischtoxi­ zität von Alfalfa Saponinen beruht. Bei diesem Untersu­ chungsverfahren wird die Verdünnung der Probe gemessen, bei welcher die komplette Hämolyse eintritt, und zwar in Rea­ genzgläsern, in denen 2% humane Erythrozyten mit variie­ renden Mengen unreinen Saponins enthaltend sind.

Die DE 33 27 691 C2 beschreibt ein Verfahren zur Ermittlung von Umweltschadstoffen, bei dem pflanzliche Zellen einem Schadstoffe enthaltenden Medium ausgesetzt und die Intensi­ tät des Meßsignals von durch die Einwirkung der Schadstoffe veränderten biochemisch-physiologischen Vorgänge der Zellen bestimmt wird. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man als pflanzliche Zellen zur Verzögerung ihrer Se­ neszenz in einer gas- und wasserdurchlässigen Matrix immo­ bilisierte Protoplasten einsetzt.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht also darin, die Nachteile des oben genannten Standes der Technik zu vermeiden und ein einfaches, gut lagerfähiges und repro­ duzierbares Testsystem zu schaffen, welches mit einem Mini­ mum an Laborausstattung und Personal einsetzbar ist und damit die Voraussetzung für eine breite Anwendung bietet.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst durch ein Verfahren gemäß den Merkmalen des Anspruchs 1 sowie ein Mittel zur Durchführung des Verfahrens mit den Merkmalen des Anspruchs 9. Die jeweiligen Unteransprüche betreffen bevorzugte Aus­ führungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens bzw. erfin­ dungsgemäßen Mittels.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren zur in vitro-Bestimmung der Toxizität von Substanzen oder Substanzgemischen durch Messung von Einwirkungen der Substanz oder des Substanz­ gemisches auf Zellen oder Zellorganellen, werden Erythro­ zyten an aktivierten Mikrotitrationsplatten immobilisiert. Die zu untersuchende Probe wird mit den immobilisierten Erythrozyten unter definierten Bedingungen inkubiert. Nach einer bestimmten Inkubationszeit werden die zu prüfenden Lösungen ausgewaschen und danach die Zahl der verbliebenen intakten Erythrozyten über den Proteingehalt photometrisch bestimmt. Der Parameter "intakte Zahlen" wird über den Proteingehalt bestimmt.

Die Erythrozyten werden an herkömmlichen Mikrotitrations­ platten vorzugsweise mit Flachboden immobilisiert. Dies kann in an sich bekannter Weise durch Aktivierung der Pla­ stikoberflächen mittels Alzianblau geschehen. Vorzugsweise bilden die Erythrozyten einen einheitlichen Rasen auf dem Flachboden der Kavität der Mikrotitrationsplatte (sogenann­ ter Monolayer). Es ist dabei möglich, zur Aufbewahrung die Erythrozyten mit autologem Zitratplasma, welches Glukose, Antibiotika und Fungistatika enthält, zu versetzen. So können die so vorbereiteten Platten mehrere Wochen bei er­ niedrigten Temperaturen, vorzugsweise 4°C, gelagert werden. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht in vorteilhafter Weise die parallele Bestimmung von zellmembran- und zell­ plasma-toxischer Substanzen oder Substanzgemischen mit Hilfe der präparierten Mikrotitrationsplatten. Die Bestim­ mung der Toxizitätsparameter erfolgt nach Inkubation der Zellen mit den zu prüfenden Substanzen oder Substanzgemi­ schen.

Dazu wird gegebenenfalls von den Zellen zunächst das Kon­ servierungsmedium entfernt. Die Zellen werden mindestens einmal mit einem verträglichen Medium gewaschen und dann mit Kulturmedium bedeckt. Die Bestimmung der Toxizität der Prüfsubstanzen kann vorzugsweise über eine Verdünnungsreihe erfolgen. Je nach den Erfordernissen kann die Ausgangskon­ zentration gewählt werden. Die Verdünnungsreihe kann vor­ zugsweise so ausgestaltet werden, wie in Tabelle 1 angege­ ben.

Tabelle 1

Beispiel einer Verdünnungsreihe zur Bestimmung der Zytotoxizität

Solche Verdünnungsreihen der zu untersuchenden Substanzen oder Substanzgemische werden in den Kavitäten der Mikro­ titrationsplatte, vorzugsweise in Dreifachbestimmungen oder mindestens Doppelbestimmungen pipettiert. Vorzugsweise beträgt die einzupipettierende Menge 100 µl pro Kavität. Nach einer bestimmten Einwirkungszeit, vorzugsweise 5 Minuten, insbesondere bei Raumtemperatur werden die zu prüfenden Lösungen ausgewaschen. Es werden vorzugsweise zunächst zusätzliche Mengen Kulturmedium hineinpipettiert und danach entfernt. Danach werden Waschschritte je nach Erfordernis mehrfach wiederholt. Zur Bestimmung der Zell­ membrantoxizität können folgende Methoden angewendet wer­ den.

Als Mittel zur Durchführung des erfindungsgemäßen Ver­ fahrens läßt sich in besonders bevorzugter Weise ein Test-Kit bereitstellen. Der Test-Kit enthält trägerge­ bundene Erythrozyten und/oder lyophilisierte Erythro­ zyten, Chemikalien zur Durchführung der Bestimmung des Proteingehaltes der Zellen, zur Bestimmung der Aktivität bestimmter Enzyme sowie Lösungsmittel und Referenzsub­ stanzen. Es ist ebenfalls möglich, den Test-Kit so auszu­ gestalten, daß er unbehandelte Mikrotitrationsplatten oder aktivierte Mikrotitrationsplatten als Erythrozytenträger ent­ hält, wobei die Immobilisierung der Erythrozyten dann beim Anwender selbst erfolgt. Als Referenzproben enthält der Test-Kit vorzugsweise je eine Positivkontrolle für Zellmembrantoxizität bzw. Zellplasmatoxizität, also eine Substanz, die toxisch auf Erythrozyten einwirkt, um ein Maß für den "Cut Off" zu liefern.

Das erfindungsgemäße Mittel ermöglicht sowohl die Be­ stimmung der 50%-igen zytotoxischen Wirkung (ED50) einer Prüfsubstanz als auch eine sogenannte Endpunkt-Bestimmung. Im ersten Fall wird der ED50-Wert aus den Meßwerten der Verdünnungsreihe ermittelt. Dies geschieht vorzugsweise mittels rechnerunterstützten Kurvenanpassungsverfahren. Vor­ teilhaft daran ist, daß die alle Meßpunkte aus den Verdünnungsreihen der zu untersuchenden Substanz in die Auswertung einbezogen werden.

Bei der Endpunktbestimmung wird die erste Verdünnungsstufe oder Molarität angegeben, bei der die Vitalität der Zellen auf entweder < 10% oder 5%, je nach Anforderungen, redu­ ziert ist. Durch die Anwendung des erfindungsgemäßen Mittels wird weniger die Viabilität sondern eher die Mem­ branstabilität der Erythrozyten bei Einwirkung bestimmter zu prüfender Substanzen bestimmt. Die durch eine Noxe nicht geschädigten Erythrozyten werden integral durch die Eiweißbestimmung photometrisch erfaßt.

Die Fig. 1 beschreibt eine Eichkurve für Erythrozyten. Die Bestimmung der Proteinmasse von an die Mikrotitrations­ platte gebundenen Erythrozyten geschieht wie folgt. Die Zellzahlen von 1·10⁵/mm bis 2·10⁶/mm stellen sich als optische Dichte (der Proteinbestimmung) in mOD über 250 bis 1250 dar. Bei logarithmischer Auftragung der Zellzahl gegen die optische Dichte wird für die Gerade regelmäßig ein Regressionskoeffizient von < 0,95 ermittelt. Die Ei­ weißbestimmung erfolgt nach der Originalvorschrift des sogenannten BCA-Proteinnachweises (Firma Pierce, USA) bei Verwendung von einem Reaktionsvolumen von 100 µl/Kavität der Mikrotitrationsplatte.

Die Fig. 2 zeigt nun die Zytotoxizitätskurve eines kom­ plexen Noxengemisches in verschiedenen Konzentrationen. Die Ordinate gibt dabei die Erythrozytenzahl pro ml an, wohingegen die Verdünnungsreihe logarithmisch auf der Abszisse eingetragen ist (Emsal, 1/n).

Der EC50-Wert wird durch ein Kurvenanpassungsprogramm ermittelt und beträgt 98,14 1 < n.

Claims (10)

1. Verfahren zur in vitro-Bestimmung der Toxizität von Substanzen oder Substanzgemischen durch Messung von Einwirkungen der Substanz oder des Substanzgemisches auf Erythrozyten, dadurch gekennzeichnet, daß man Erythrozyten an aktivierten Mikrotitrationsplatten immobilisiert, die Erythrozyten mit der zu untersu­ chenden Probe inkubiert, nach erfolgter Inkubation die zu prüfenden Lösungen ausgewäscht werden und danach die Zahl der verbliebenen intakten Erythrozyten über den Proteingehalt photometrisch bestimmt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Immobilisierung der Erythrozyten an aktivierten Oberflächen erfolgt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und/oder 2, wobei eine par­ allele Bestimmung der Zellmembrantoxizität und Zell­ plasmatoxizität der Probe erfolgt.

4. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Ermittlung der Toxizität der zu untersuchen­ den Probe durch eine Verdünnungsreihe erfolgt.

5. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei zur Messung der Zellmembrantoxizität und Zell­ plasmatoxizität nach Inkubation der Erythrozyten mit der zu untersuchenden Probe, zum Beispiel mit einer photometrischen Messung der optischen Dichte, die Restzellenzahl in der Probe bestimmt wird und an­ schließend die Enzymaktivität des Zellplasmas, unter Verwendung eines digitalen Mikrotitrationsplattenpho­ tometers, gemessen wird.

6. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Bestimmung der Zellplasmatoxizität durch eine Bestimmung der Enzymaktivität vor und nach der Inkubation er­ folgt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei als Enzym zur Aktivi­ tätsbestimmung Esterase herangezogen wird.

8. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Bestimmung der Zellplasmatoxizität einer zu untersuchenden Probe mit dem Esterasetest nach Mossman erfolgt.

9. Mittel zur Durchführung des Verfahrens nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8 mit an aktivierten Mikro­ titrationsplatten gebundenen Erythrozyten und/oder kryokonservierten Erythrozyten, Chemikalien zur Durch­ führung der Bestimmung des Proteingehaltes der Zellen, zur Bestimmung der Aktivität bestimmter Enzyme sowie Lösungsmittel und Referenzsubstanzen.

10. Mittel nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die die Erythrozyten aufnehmenden Träger Mikrotitra­ tionsplatten mit Erythrozyten oder aktivierte Mikroti­ trationsplatten sind.