DE4207358A1

DE4207358A1 - Expressionskassette und plasmide zur schliesszellenspezifischen expression und ihre verwendung zur herstellung transgener pflanzenzellen und pflanzen

Info

Publication number: DE4207358A1
Application number: DE4207358A
Authority: DE
Inventors: Bernd Mueller-Roeber; Uwe Dr Sonnewald; Lothar Prof Dr Willmitzer
Original assignee: Institut fuer Genbiologische Forschung Berlin GmbH
Current assignee: Bayer CropScience AG
Priority date: 1992-03-04
Filing date: 1992-03-04
Publication date: 1993-09-09
Also published as: WO1993018169A2; WO1993018169A3; IL104933A0; EP0584324B1; AU3630493A; DE69333079T2; HUT67084A; US5538879A; US20020090726A1; DE69333079D1; AU671099B2; HU9303138D0; ATE244764T1; EP0584324A1; ES2197148T3; CA2112800A1; US20030093839A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Expressionskassette und Plasmide enthaltend diese Expressionskassette. Die DNA- Sequenz der Expressionskassette enthält eine transkriptional regulatorische Starter-Region, die eine spezifische Genexpression in den Schließzellen der Blätter von Pflanzen sicherstellt, und keine Expression in Mesophyllzellen oder epidermalen Zellen der Blätter vermittelt. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzenzellen, die Sequenzen der Expressionskassette enthalten, sowie die Verwendung der Plasmide, enthaltend die Expressionskassette, zur Herstellung transgener Pflanzen.

Bedingt durch den kontinuierlich steigenden Nahrungsmittel- und Rohstoffbedarf, der aus dem stetigen Wachstum der Weltbevölkerung resultiert, ist es in zunehmendem Maße Aufgabe der biotechnologischen Forschung, sich wegen der langfristig abzusehenden Limitation von Anbauflächen um die Produktion ertragreicher, ökologisch unbedenklicher Nutzpflanzen zu bemühen. Hierzu muß der Metabolismus der Pflanze manipuliert werden. Dies kann u. a. durch die Veränderung der im Zellkern enthaltenen Desoxyribonukleinsäure (DNA) hervorgerufen werden.

Es sind bereits Verfahren zur genetischen Modifikation dikotyler und monokotyler Pflanzen bekannt (vgl. u. a. Gasser, C.S., Fraley,R.T. (1989) Sience 244: 1293-1299; Potrykus (1991) Ann Rev Plant Mol Biol Plant Physiol 42: 205-225).

Mit der vorliegenden Erfindung ist es möglich, die Transpirationsvorgänge und den Gasaustausch einer Pflanze im Hinblick auf eine Ertragssteigerung durch Manipulation von Genen, die spezifisch in Schließzellen exprimiert werden, zu beeinflussen. Dies ist unter Ausnutzung bekannter Expressionssysteme wegen der weitreichenden Konsequenzen einer nicht schließzellenspezifischen Genexpression für den Gesamtstoffwechsel der Pflanze nicht praktikabel. Eine Steigerung des Ertrags von Nutzpflanzen kann dadurch erreicht werden, daß die Photosyntheseleistung von Pflanzen verändert wird, oder der Wasserverbrauch verringert wird. Hierfür sind die Schließzellen der Epidermis von Blattgeweben ein günstiger Ansatzpunkt.

Schließzellen sind spezifische, bohnenförmige Zellen der Epidermen der oberirdischen, von Luft umgebenen grünen Teile höherer Pflanzen, die paarweise angeordnet sind und zwischen einander eine Lücke (Spalt) freilassen. Der Spalt unterbricht die sonst lückenlose Schicht der Epidermiszellen und stellt auf diese Weise die Verbindung zwischen der Außenluft und dem Intercellularensystem her. Bei den meisten Pflanzen nimmt das Porenareal bei geöffneten Spalten etwa 0,5 bis 1,5% der Blattfläche ein. Infolge ihres besonderen Baus können Schließzellen ihre Gestalt durch aktive Turgoränderungen so regulieren, daß sich der Spalt zwischen ihnen schließt oder öffnet. Die Spaltöffnungen sind also Regulatoren des Gaswechsels, insbesondere der Transpiration. Die Schließzellen haben somit die Aufgabe, den Diffusionswiderstand so zu regulieren, daß der Wasserverlust durch die Transpiration und die CO₂-Aufnahme für die photosynthetische oder die Dunkel-CO₂- Fixierung in einem den jeweiligen Bedürfnissen angepaßten Verhältnis stehen. Das Öffnen oder Schließen der Schließzellen ist auf eine Veränderung des Turgors in den Schließzellen selbst und damit auf den Aufbau einer Differenz des Turgors in den Schließzellen zu den angrenzenden Epidermiszellen (Nebenzellen) zurückzuführen.

Schließzellen regulieren über den Gasaustausch Kohlendioxidaufnahme und Transpiration (Abgabe von Wasserdampf). Bestandteil des Regelkreises ist neben der Kohlendioxidkonzentration und den Phytohormonen die Konzentration an gelösten Stoffen, da diese über Turgoränderungen zum Öffnen bzw. Schließen der Spalte führen. Da Veränderungen der Konzentration an gelösten Stoffen weitreichende Konsequenzen für den Metabolismus der Pflanze haben, wenn sie in allen Geweben oder Zellen geschehen, ist es wünschenswert, diese Veränderungen nur in Teilbereichen der Pflanze oder während eines bestimmten Zeitabschnitts im Pflanzenwachstumszyklus zu erlauben. Insbesondere sollte eine den Gasaustausch beeinflussende Veränderung des Kohlendioxid- oder auch des Gehalts an osmotisch aktiven Substanzen von Schließzellen unabhängig von der Konzentration dieser Substanzen in Mesophyllzellen möglich sein.

Daher besteht ein großes Interesse an der Identifikation und der wirtschaftlichen Nutzbarkeit der für die spezifische Transkription in Schließzellen verantwortlichen regulatorischen DNA-Sequenzen des Pflanzengenoms.

Mit Hilfe schließzellenspezifischer regulatorischer Sequenzen kann durch Expression geeigneter, neu eingeführter Gene oder durch Modulation endogener Genprodukte ein permanentes Öffnen oder Schließen bzw. eine Verlängerung oder Verkürzung der Öffnungsperioden von Schließzellen herbeigeführt werden.

Die vorliegende Erfindung stellt ein schließzellenspezifisches Expressionssystem zur Verfügung, mit dem derartige Eingriffe möglich sind.

Dauerndes Offenhalten der Schließzellen sollte wegen einer vermehrten Transpiration zu einem hohen Wasserverlust bei den Pflanzen führen, kann aber beispielsweise in späten Phasen des Wachstumszyklus′ zur Beschleunigung des Abreifens von Kulturpflanzen wünschenswert sein. Darüberhinaus kann an die Produktion stark transpirationsaktiver Pflanzen zum Zwecke einer kontrollierten Trockenlegung von Böden gedacht werden. Oberflächlich wurzelnde Pflanzen können dabei über eine Absenkung der Wärmekapazität des Bodens eine jahreszeitlich frühere Erwärmung der Nutzflächen bewirken und so eine frühere Aussaat von temperaturempfindlichen Kulturpflanzen wie z. B. der Zuckerrübe ermöglichen. Da die zunächst eingebrachten genetisch veränderten Hilfspflanzen in den weiteren Phasen des Wachstumszyklus benachteiligt sind, führen sie nicht zu einer Behinderung der Entwicklung der Nutzpflanzen, sondern im Gegenteil durch eine Ausdehnung der Vegetationsphase zu einer Ertragssteigerung.

Ein weitgehendes Geschlossenhalten der Spaltöffnungen würde durch einen verminderten Gasaustausch ein verlangsamtes Wachstum und infolgedessen eine zeitliche Ausdehnung der Vegetationsphase bewirken. Dies kann bei Zierpflanzen von Interesse sein. Weiterhin können landwirtschaftliche Hilfspflanzen produziert werden, die als transpirationsschwache Bodendecker eine Erosion der Nutzflächen in Ruhephasen oder zu Beginn der Vegetationsphase von Kulturpflanzen verhindern.

Eine Veränderung der Öffnungsperioden der Spalte erweist sich bei Kulturpflanzen als günstig. Beispielsweise kann bei grün geernteten Arten, insbesondere bei Futterpflanzen, durch Rückhalten des Wassers die Austrocknung älteren Blattmaterials verhindert und so der Ertrag gesteigert werden. Ferner ist an eine Adaption an Standorte mit erhöhter atmosphärischer Kohlendioxidkonzentration (z. B. CO₂-Begasung in Gewächshäusern) zu denken. Durch ein künstliches Verlängern der Öffnungsperiode können Effekte wie Mineralstoffunterversorgung bei reduziertem Transpirationsstrom infolge hoher Kohlendioxid-Partialdrücke in der Pflanze kompensiert werden.

Durch Kombination schließzellenspezifischer Regulatorelemente mit anderen Regelkreisen können weitere Anwendungsmöglichkeiten entstehen. Beispielsweise kann durch eine Koppelung an chemische Sensoren ein von außen induziertes Schließen der Spaltöffnungen bewirkt und so z. B. ein Wachstumsstop von bestimmten Nutzpflanzen, den sogenannten "landwirtschaftlichen Hilfspflanzen", zu jedem gewünschten Zeitpunkt ausgelöst werden.

Um regulatorische DNA-Sequenzen zu bestimmen, muß man zunächst nach Produkten suchen, die nur zu einer bestimmten Zeit im Zellwachstumszyklus oder in einem bestimmten Teil der Pflanze, wie hier in den Schließzellen, erscheinen. Hat man die dazugehörigen Gene identifiziert und isoliert, ist eine gründliche Untersuchung der Sequenz - und vor allem die Identifikation und Isolation der gewünschten transkriptional regulatorischen Regionen erforderlich. Anschließend müssen geeignete Modelle erstellt werden, deren Validität durch Versuche nachgewiesen werden muß.

Es wird nun eine Expressionskassette bereit gestellt, deren DNA-Sequenz mit einer transkriptional regulatorischen Starter- Region für schließzellenspezifische Genexpression ausgestattet ist, die keine Expression in Mesophyllzellen oder Epidermiszellen der Blätter vermittelt. Mit der Expressionskassette wird eine Genmanipulation von Pflanzen möglich, die ein permanentes Öffnen oder Schließen oder eine Verlängerung oder Verkürzung der Öffnungsperiode der Schließzellen bewirkt.

Die DNA-Sequenz der Expressionskassette enthält die transkriptional regulatorische Starter-Region für eine schließzellenspezifische Genexpression.

Pflanzenzellen, die eine regulatorische Region für eine schließzellenspezifische Genexpression enthalten, können nach folgendem Verfahren hergestellt werden:

a) Isolation des Klons GS 6-11 wie im Ausführungsbeispiel 1 und 2 beschrieben. Der Klon enthält ein etwa 12kb großes DNA- Fragment, das ein schließzellenspezifisches Regulatorelement enthält (vgl. Fig. 1).
b) Herstellung des Plasmids pSF-6 entsprechend Ausführungsbeispiel 3 unter Verwendung des etwa 12 kb großen SalI-Fragments des Klons GS 6-11.
c) Herstellung des Plasmids pH 6-1 unter Verwendung eines etwa 5,3 kb großen HincII-Fragments des Plasmids pSF-6 entsprechend Ausführungsbeispiel 3.
d) Herstellung des Plasmids pAS (DSM 6906) oder pAS-GUS (DSM 6907) unter Verwendung des etwa 3,2 kb großen HincII/BglII- Fragments des regulatorischen Starter-Bereichs des ADP- Glucose-Pyrophosphorylase-Gens aus Solanum tuberosum aus dem Plasmid pH 6-1 (Ausführungsbeispiel 3). Das Plasmid pAS-GUS enthält zusätzlich zur Sequenz des Plasmids pAS die kodierende Region des β-Glucuronidase-Gens.
e) Transfer der T-DNA des Plasmids pAS (DSM 6906) bzw. pAS-GUS (DSM 6907) in eine Pflanzenzelle.

Für die Einführung von DNA in eine pflanzliche Wirtszelle stehen eine Vielzahl von Techniken zur Verfügung. Diese Techniken umfassen die Transformation mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes als Transformationsmittel, die Fusion von Protoplasten, die Injektion oder die Elektroporation von DNA sowie weitere Möglichkeiten. Werden für die Transformation Agrobakterien verwendet, muß die einzuführende DNA in spezielle Plasmide kloniert werden, und zwar entweder in einen intermediären Vektor oder einen binären Vektor. Die intermediären Vektoren können aufgrund von Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA sind, durch homologe Rekombination in das Ti- oder Ri-Plasmid integriert werden. Dieses enthält außerdem die für den Transfer der T-DNA notwendige vir-Region. Intermediäre Vektoren können nicht in Agrobakterien replizieren. Mittels eines Helferplasmids kann der intermediäre Vektor auf Agrobacterium tumefaciens übertragen werden (Konjugation). Binäre Vektoren können sowohl in E. coli als auch in Agrobakterien replizieren. Sie enthalten ein Selektionsmarker-Gen und einen linker oder polylinker, welche von der rechten und linken T-DNA Grenzregion eingerahmt werden. Sie können direkt in die Agrobakterien transformiert werden (Holsters et al. (1978) Mol Gen Genet 163: 181-187). Das als Wirtszelle dienende Agrobakterium soll ein Plasmid, das eine vir-Region trägt, enthalten. Die vir-Region ist für den Transfer der T-DNA in die Pflanzenzelle notwendig. Zusätzliche T-DNA kann enthalten sein. Das so transformierte Bakterium wird zur Transformation von Pflanzenzellen benutzt.

Für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle können Pflanzen- Explantate zweckmäßigerweise mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes kokultiviert werden. Aus dem infizierten Pflanzenmaterial (z. B. Blattstücke, Stengelsegmente, Wurzeln aber auch Protoplasten oder Suspensions-kultivierte Zellen) können dann in einem geeigneten Medium, welches Antibiotika oder Biozide zur Selektion enthalten kann, wieder ganze Pflanzen regeneriert werden. Die so erhaltenen Pflanzen können dann auf Anwesenheit der eingeführten DNA getestet werden. Bei der Injektion und Elektroporation sind an sich keine speziellen Anforderungen an die Plasmide gestellt. Es können einfache Plasmide wie z. B. pUC-Derivate verwendet werden. Sollen aber aus derartig transformierten Zellen ganze Pflanzen regeneriert werden, ist die Anwesenheit eines selektierbaren Markergens notwendig.

Die Plasmide pAS und pAS-GUS haben eine Größe von etwa 13,3 bzw. etwa 15,2 kb und enthalten das etwa 2,0 kb große Kanamycinresistenz-Gen, das etwa 3,2 kb große HincII/BgIII- Promotorfragment des regulatorischen Starter-Bereichs des ADP- Glucose-Pyrophosphorylase-Gens GS6-11 aus Solanum tuberosum, einen linker und einen Transkriptions-Terminator des Nopalin- Synthase-Gens. Das Plasmid pAS-GUS enthält zusätzlich das etwa 2 kb große β-Glucuronidase-Gen.

Zur Vorbereitung der Einführung fremder Gene in höhere Pflanzen sind eine große Anzahl Klonierungsvektoren verfügbar, die ein Replikationssignal für E. coli und einen Marker beinhalten, der eine Selektion der transformierten Zellen erlaubt. Beispiele für Vektoren sind pBR 332, pUC-Serien, M13 mp-Serien, pACYC 184 usw. Die gewünschte Sequenz kann an einer passenden Restriktionsstelle in den Vektor eingeführt werden. Das erhaltene Plasmid wird für die Transformation in E. coli verwendet. Die E. coli-Zellen werden in einem geeigneten Nährmedium gezüchtet, anschließend geerntet und lysiert. Das Plasmid wird wiedergewonnen. Als Analysemethode werden im allgemeinen eine Sequenzanalyse, eine Restriktionsanalyse, Elektrophoresen und weitere biochemisch-molekularbiologische Methoden durchgeführt. Nach jeder Manipulation kann die verwendete DNA-Sequenz gespalten und mit einer anderen DNA- Sequenz verbunden werden. Jede Plasmid-Sequenz kann in den gleichen oder anderen Plasmiden kloniert werden. Je nach Einführungsmethode gewünschter Gene in die Pflanze können weitere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Werden z. B. für die Transformation der Pflanzenzelle das Ti- oder Ri-Plasmid verwendet, so muß mindestens die rechte Begrenzung, häufig jedoch die rechte und die linke Begrenzung der Ti- und Ri- Plasmid T-DNA, als Flankenbereich den einzuführenden Genen verbunden werden.

Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzellen ist intensiv untersucht und ausreichend in EP 120 516; Hoekema, In: The Binary Plant Vektor System Offset drukkerÿ Kanters B.V., Alblasserdam, (1985), Chapter V; Fraley, et al., Crit. Rev. Plant Sci., 4:1-46 und An et al.(1985) EMBO J. 4: 277-287 beschrieben worden.

Ist die eingeführte DNA einmal im Genom integriert, so ist sie dort in der Regel stabil und bleibt auch in den Nachkommen der ursprünglich transformierten Zelle erhalten. Sie enthält normalerweise einen Selektionsmarker, der den transformierten Pflanzenzellen Resistenz gegenüber einem Biozid oder einem Antibiotikum wie Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin oder Phosphinotricin u. a. vermittelt. Der individuell verwendete Marker sollte daher die Selektion transformierter Zellen gegenüber Zellen, denen die eingefügte DNA fehlt, gestatten.

Die transformierten Zellen wachsen innerhalb der Pflanzen in der üblichen Weise (siehe auch McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5: 81-84). Diese Pflanzen können normal angezogen werden und mit Pflanzen, die die gleiche transformierte Erbanlage oder andere Erbanlagen besitzen, gekreuzt werden. Die daraus entstehenden hybriden Individuen haben die entsprechenden phänotypischen Eigenschaften.

Es sollten zwei oder mehrere Generationen angezogen werden, um sicherzustellen, daß das phänotypische Merkmal stabil beibehalten und vererbt wird. Auch sollten Samen geerntet werden, um sicherzustellen, daß der entsprechende Phänotyp oder andere Eigenarten erhalten geblieben sind. Als Wirtspflanze für die schließzellenspezifische Expression sind alle Pflanzenspezies, insbesondere Kulturpflanzenspezies, geeignet.

Unter Kulturpflanzenspezies sind z. B. Kartoffel, Tabak, Tomate und Zuckerrübe zu verstehen, aber auch Spezies, die als landwirtschaftliche Hilfspflanzen verwendbar sind.

Der in der erfindungsgemäßen Expressionskassette enthaltenen DNA-Sequenz können weitere DNA-Sequenzen nachgeschaltet werden, die die Information für die Bildung und mengenmäßige Verteilung endogener Produkte oder die Bildung heterologer Expressionsprodukte in Kulturpflanzen enthalten.

Endogene Expressionsprodukte sind z. B. Phytohormone, Kohlenhydrate oder andere Metabolite.

Heterologe Produkte sind z. B. in Pflanzen natürlicherweise nicht gebildete Kohlenhydrate oder Enzyme zur Freisetzung von Substanzen mit Phytohormonwirkung aus Vorstufen, die in Pflanzen natürlicherweise nicht in Phytohormone umgesetzt werden.

Die DNA-Sequenzen, die der regulatorischen Sequenz der Expressionskassette nachgeschaltet werden können, dürfen alle möglichen offenen Leseraster für ein beliebiges Peptid sowie ein oder mehrere Introns enthalten. Als Beispiele seien genannt: Sequenzen für Enzyme; Sequenzen, die komplementär a) zu einer Genomsequenz sind, wobei die Genomsequenz ein offenes Leseraster sein darf; b) zu einem Intron; c) zu einer nicht kodierenden Leitsequenz; d) zu jeder Sequenz, die - komplementär in das Genom integriert - die Transkription, mRNA-Verarbeitungen (z. B. splicing) oder die Translation inhibiert.

Die gewünschte DNA-Sequenz kann synthetisch hergestellt oder natürlich gewonnen sein oder eine Mischung aus synthetischen und natürlichen DNA-Bestandteilen enthalten. Im allgemeinen werden synthetische DNA-Sequenzen mit Codons erzeugt, die von Pflanzen bevorzugt werden. Diese von Pflanzen bevorzugten Codons können aus Codons mit der höchsten Proteinhäufigkeit bestimmt werden, die in den meisten interessanten Pflanzenspezies exprimiert werden. Bei der Präparation einer Expressionskassette können verschiedene DNA-Fragmente manipuliert werden, um eine DNA- Sequenz zu erhalten, die zweckmäßigerweise in der korrekten Richtung liest und die mit einem korrekten Leseraster ausgestattet ist. Für die Verbindung der DNA-Fragmente miteinander können an die Fragmente Adaptoren oder linker angesetzt werden.

Zweckmäßigerweise sollten die Transkriptionsstart- und Terminations-Regionen in Transkriptionsrichtung durch einen linker oder polylinker, der eine oder mehrere Restriktionsstellen für die Insertion dieser Sequenz enthält, versehen werden. In der Regel hat der linker 1 bis 10, meistens 1 bis 8, vorzugsweise 2 bis 6 Restriktionsstellen. Im allgemeinen hat der linker innerhalb der regulatorischen Bereiche eine Größe von weniger als 100 bp, häufig weniger als 60 bp, mindestens jedoch 5 bp. Der transkriptionale Startbereich kann sowohl nativ bzw. homolog als auch fremdartig bzw. heterolog zur Wirtspflanze sein. Die Expressionskassette beinhaltet in der 5′-3′-Transkriptionsrichtung eine für die Pflanze repräsentative Region für die Transkriptionsinitiation, eine beliebige Sequenz und eine Region für die transkriptionale Termination. Verschiedene Terminationsbereiche sind gegeneinander beliebig austauschbar.

Ferner können Manipulationen, die passende Restriktionsschnittstellen bereitstellen oder die überflüssige DNA oder Restriktionsschnittstellen entfernen, eingesetzt werden. Wo Insertionen, Deletionen oder Substitutionen wie z. B. Transitionen und Transversionen in Frage kommen, können in vitro-Mutagenese, "primerrepair", Restriktion oder Ligation verwendet werden. Bei geeigneten Manipulationen wie z. B. Restriktion, "chewing-back" oder Auffüllen von Überhängen für "blunt-ends" können komplementäre Enden der Fragmente für die Ligation zur Verfügung gestellt werden. Zur Durchführung der verschiedenen Stufen ist für eine Vergrößerung der DNA-Menge und für die DNA-Analyse, die der Sicherstellung der erwarteten Erfolge der Eingriffe dient, eine Klonierung erforderlich.

Für die Einführung fremder Gene in die Pflanze, unter Ausnutzung der schließzellenspezifischen regulatorischen Sequenz, steht eine Vielzahl von Möglichkeiten offen, besonders interessant ist jedoch die Expression von Genen, die die Regulation der Schließzellen in Bezug auf den Gasaustausch sowie die Abgabe von Wasserdampf (Transpiration) verändern.

Für die Expression derartiger Gene ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Expressionskassette besonders günstig.

Eine Modifikation der Schließzellen mit Auswirkungen auf den Öffnungszustand der Stomata läßt sich auf zwei Wegen erreichen: durch eine Modulation des Gehalts an endogenen, in den Schließzellen vorhandenen Proteinen, Enzymen, carriern, oder "Pumpen", die Metabolite durch Membranen transportieren; oder durch Transfer und Expression von Genen homologen oder heterologen oder synthetischen Ursprungs, die Proteine, Enzyme, carrier oder "Pumpen", kodieren, die nicht zur normalen Ausstattung einer Schließzelle gehören, aber deren Aktivität oder Vorhandensein den Zustand der Zelle bezüglich der Öffnung der Stomata beeinflussen.

An der Regulation der Transpiration sind drei Sensorsysteme beteiligt Sensoren zur Messung der Kohlendioxidkonzentration, Phytohormonsensoren und ein Meßsystem für Turgorgradienten zwischen Schließzellen und angrenzenden Epidermiszellen. Turgoränderungen sind beispielsweise durch Beeinflussung der Aktivität von Enzymen oder Transportsystemen des Kohlenhydratmetabolismus möglich. Neben einer direkten Veränderung der Konzentration osmotisch aktiver Kohlenhydrate, z. B. mittels cytosolischer oder vakuolärer Invertasen oder des chloroplastidären Triosephosphattranslokators, sind Konsequenzen für die Osmoregulation zu erwarten durch eine Anreicherung oder Reduktion von Vorläufern osmotisch aktiver Substanzen. Beispielsweise mit einer Modifikation der ADP-Glucose- Pyrophosphorylaseaktivität kann die Stärkesynthese beeinflußt und so die Menge an Substraten für Glykolyse und Citratzyklus verändert werden, wodurch letzlich die Konzentration des Malats, einer bezüglich des Zellturgors besonders wichtigen Substanz, betroffen wird. Eine Steigerung der apoplastischen Invertaseaktivität bei Schließzellen könnte über eine vermehrte Aufnahme von Hexosen die Stärkekonzentration erhöhen. Ein derartiger Eingriff muß schließzellenspezifisch erfolgen, da eine Erhöhung apoplastischer Invertaseaktivität in den stark photosyntheseaktiven Mesophyllzellen zu einer Reduktion des Assimilattransports und damit zu einer hohen osmotischen Belastung des Gewebes führt (v Schaewen et al. (1990) EMBO J 9: 3033-3044). Ferner kann an die Steigerung der Expression oder die Expression einer veränderten Phosphoenolpyruvatcarboxylase gedacht werden. Das Enzym katalysiert die Reaktion von Phosphoenolpyruvat zu Oxalacetat, das wiederum ein Vorläufer für Malat ist. Außerdem können Protonenpumpen (Protonen-ATPasen), die über die Bereitstellung elektrochemischer Gradienten Ionentransportprozesse ermöglichen, zu einer Veränderung des osmotischen Potentials beitragen.

Weitere Zugriffsmöglichkeiten ergeben sich bei der Aktivität der Carbonat-Dehydratase, die das Gleichgewicht zwischen gelöstem Kohlendioxid und Karbonat einstellt, insofern also die zelluläre Kohlendioxidkonzentration beeinflußt; aber auch beispielsweise bei der Fruktosebisphosphatase, die als Enzym aus dem regenerativen Abschnitt des Calvinzyklus an der Fixierung des Kohlendioxids beteiligt ist.

Die erfindungsgemäße Expressionskassette läßt sich auch zur schließzellenspezifischen Expression von Genen nutzen, die den Phytohormonspiegel der Pflanze regulieren.

Lokale Änderungen des Phytohormonspiegels sind zur Beeinflussung der Eigenschaften von Schließzellen besonders interessant: während z. B. Auxine ein Öffnen der Spalte bewirken, führt Applikation von Abscisinsäure zu einem raschen Spaltenschluß. Zahlreiche Gene, deren Produkte in den Hormonhaushalt der Pflanze eingreifen, sind bereits kloniert worden (vgl. u. a. Klee, H. & Estelle, M. (1991) Ann Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 42: 529-551) Die Gene 1 und 2 der T-DNA von Agrobakterium tumefaciens kodieren für Auxinsynthese-Enzyme, während die Indolacetat-Lysin-Synthetase (Romano et al. (1991) Genes & Development 5: 438-446) die Inaktivierung von Auxinen katalysiert. Cytokinine werden durch eine vom rol c Gen der T- DNA von Agrobakterium rhizogenes kodierte Glukosidase freigesetzt (Estruch et al. (1991) EMBO J 10: 3125-3128); das Genprodukt des T-DNA Gens 6b von A. tumefaciens reduziert Cytokininaktivität (Spanier et al. (1989) Mol Gen Genet 219: 209-216). Ethylenproduktion kann in Pflanzen durch Expression der Aminocyclopropancarboxylat-Synthase angeregt werden (Huang et al. (1991) Proc Nat Acad Sience 88: 7021-7025); eine Inhibition der Aminocyclopropancarboxylat-Oxidase durch Expression von antisense-RNA senkt dagegen die Ethylenfreisetzung.

Wegen der weitreichenden Konsequenzen der Hormonwirkungen für die Pflanze ist eine Beeinflussung der Schließzellentätigkeit auf dem beschriebenen Weg nur unter Verwendung der erfindungsgemäßen Expressionskassette für eine schließzellenspezifische Genexpression durchführbar.

Verfahren zur Verringerung der Aktivität bzw. der Menge eines bestimmten Enzyms sind gängiger Stand der Technik. Hierzu wird ein in der Regel chimäres Gen in die Pflanze eingeführt. Es besteht aus einem in der Pflanze aktiven Promotor, einer in der antisense-Richtung an den Promotor angehefteten kodierenden Sequenz des Enzyms, dessen Aktivität zu verringern ist, (3′-Ende der kodierenden Sequenz am 3′-Ende des Promotors) und einem in Pflanzen funktionalen Terminationssignal für die Transcription. Zur Einführung derartiger Gene in Pflanzenzellen stehen verschiedene Verfahren zur Verfügung. Aus den transformierten Zellen können intakte transgene Pflanzen regeneriert werden, unter denen solche mit dem gewünschten Phänotyp (Verringerung der Aktivität des Zielenzyms) ermittelt werden müssen.

Die Identifikation brauchbarer transkriptionaler Startbereiche kann auf einer Vielzahl von Wegen erreicht werden. Man bedient sich hier in der Regel der mRNA, die aus bestimmten Teilen der Pflanze (hier Schließzellen) isoliert worden ist (s. auch Ausführungsbeispiel 1). Zur zusätzlichen Konzentrationssteigerung der für das Gewebe oder den pflanzlichen Zustand charakteristischen mRNA kann cDNA präpariert werden, wobei unspezifische cDNA an der mRNA oder der DNA aus anderen Geweben (Mesophyllzellen) oder Pflanzenzuständen abgezogen werden kann. Die restliche cDNA kann dann für die Sondierung des Genoms der Komplementärsequenzen, unter Benutzung einer geeigneten Pflanzen-DNA-Bibliothek, verwendet werden.

Wo ein in spezifischen Zell- oder Gewebetypen auftretendes Protein isoliert ist oder isoliert wird, kann es partiell sequenziert werden, so daß eine Sonde zur direkten Identifikation der entsprechenden Sequenzen in einer Pflanzen- DNA-Bibliothek hergestellt werden kann (vgl. Ausführungsbeispiel 2). Anschließend können die Sequenzen, die mit der Sonde hybridisieren, isoliert und manipuliert werden. Ferner kann der nicht translatierte 5′-Bereich, der mit dem kodierenden Bereich assoziiert ist, isoliert und in Expressionskassetten auf transkriptionale Aktivität hin untersucht werden.

Die gewonnenen Expressionskassetten, die die nicht übersetzte 5′-Region verwenden, können in Pflanzen transformiert werden (s. o.), wo ihre Funktionalität als transcriptionale Regulatoren in Verbindung mit einem heterologen Strukturgen (anders als das offene Leseraster des Wildtypgens, das mit der nicht übersetzten 5′-Region assoziiert ist), sowie die Schließzellenspezifität geprüft werden kann. Auf diese Weise können Sequenzen, die für die schließzellenspezifische Transkription notwendig sind, identifiziert werden.

Am 13. 02. 1992 wurden bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM) in Braunschweig, Bundesrepublik Deutschland, folgende Plasmide hinterlegt (Hinterlegungsnummer):
Plasmid pAS (DSM 6906);
Plasmid pAS-GUS (DSM 6907).

Beschreibung der Abbildungen

Fig. 1 zeigt die Restriktionskarte des genomischen Klons GS6- 11, der die S-Untereinheit der ADP-Glucose- Pyrophosphorylase aus Solanum tuberosum kodiert. Über der Restriktionskarte sind die Bezeichnungen der Gene des Phagen Lambda angegeben sowie ein Maßstab zur Beurteilung der Länge der DNA-Sequenz in Kilo-Basen (kb).

Fig. 2 zeigt die Promotor-GUS-Fusion des Plasmids pAS-GUS, das die Nukleinsäuresequenz eines Teils der für die transcriptionale Regulation wichtigen Bereiche des ADP- Glucose-Pyrophosphorylase-Gens GS6-11 enthält, die auch im Plasmid pAS enthalten ist. ATG bezeichnet den Translationsstart für die β-Glucuronidase. Die Bgl II Schnittstelle, an der der Klon pH6-1 gespalten und mit dem an der SmaI Schnittstelle linearisierten Plasmid puc 19 verbunden wurde, ist angegeben. Die Sequenz bis zur BamHI Schnittstelle stammt aus dem polylinker von puc 19, die folgenden Nukleotide aus dem Plasmid pBI101.1 (Jefferson et al.(1987) Plant Mol Biol Rep 5: 387-405). Hervorgehoben ist der mit der cDNA korrespondierende Bereich (fett). Die beiden ersten Codons der β-Glucuronidase sind eingerahmt. Eine Sequenz, die möglicherweise eine Hogness-Box darstellt, ist unterstrichen.

Fig. 3 zeigt das etwa 13,2 kb große Plasmid pAS. Es enthält das etwa 2,0 kb große Kanamycin-Resistenz-Gen als Bestandteil des Ausgangsvektors pBIN 19 (Bevan, M.(1984) Nucl Acids Res 12: 8711-8721), den etwa 3,2 kb großen regulatorischen Bereich für eine schließzellenspezifische Genexpression aus dem ADP- Glucose-Pyrophosphorylase-Gen von Solanum tuberosum aus dem Klon GS6-11 (A), insertiert zwischen Nukleotidposition (nt) 2525 und 2544 von pBIN 19 sowie den Transkriptionsterminator aus dem Nopalinsynthase- Gen (C), insertiert bei nt 2494 von pBIN 19.
A=Fragment A (etwa 3,2 kb): enthält:
nt 400-414 aus pUC 19
etwa 3,2 kb aus GS6-11
nt 415-421 aus pUC 19
C=Fragment C (192 bp): enthält nt 11749-11939 aus pTiACH5 (Gielen et al. (1984) EMBO J 3: 835-846);

Fig. 4 zeigt das etwa 15,2 kb große Plasmid pAS-GUS, das ein Derivat von pBI101.1 (Jefferson et al.(1987) Plant Mol Biol Rep 5: 387-405) ist. Das Plasmid pBI101.1 wiederum ist ein Derivat von pBIN 19, das an nt 2534 eine Insertion von 1,87 kb der kodierenden Region der β-Glucuronidase enthält (B). Plasmid pAS-GUS unterscheidet sich von pAS durch eben diese Insertion.Im einzelnen enthält pAS-GUS folgende Fragmente:
A=Fragment A (etwa 3,2 kb): enthält:
nt 400-414 aus pUC 19
etwa 3,2 kb aus GS6-11
nt 415-421 aus puc 19
B=Fragment B (1,87 kb): kodierende Region der β-Glucuronidase.
C=Fragment C (192 bp): enthält nt 11749-11939 aus pT1ACH5 (Gielen et al. (1984) EMBO J 3: 835-[46);

Fig. 5 zeigt die Expression der β-Glucuronidase im Blatt von mit dem Plasmid pAS-GUS transformierten transgenen Kartoffelpflanzen. Es ist eindeutig zu ersehen, daß keine Expression in den Mesophyllzellen und den Epidermiszellen nachweisbar ist, aber eine spezifische Expression in den Schließzellen.

Zum besseren Verständnis der dieser Erfindung zugrundeliegenden Ausführungsbeispiele wird vorab eine Aufstellung aller für die Versuche notwendigen und an sich bekannten Verfahren gegeben.

1. Klonierungsverfahren

Zur Klonierung wurden die Vektoren pUC 18/19 und M13mp10 Serien (Yanisch-Perron et al. (1985) Gene 33: 103-119) verwendet, sowie der Vektor EMBL 3 (Frischauf et al. (1983) J Mol Biol 170: 827-842).

Für die Pflanzentransformation wurden die Genkonstruktionen in den binären Vektor BIN 19 (Bevan (1984) Nucl. Acids Res 12: 8711-8720) kloniert.

2. Bakterienstämme

Für die pUC- und M13mp-Vektoren wurden die E. coli-Stämme BMH71-18 (Messing et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci 24: 6342-6346) oder TB1 benutzt.

Für den Vektor BIN 19 wurde ausschließlich der E. coli-Stamm TB1 benutzt. TB1 ist ein rekombinations-negatives, Tetracyclin resistentes Derivat des Stammes JM101 (Yanisch-Perron et al. (1985) Gene 33: 103-119). Der Genotyp des TB1-Stammes ist (Bart Barrel, persönliche Mitteilung): F′(traD36, proAB, LacI, LacZ8M15), δ(lac, pro), SupE, thiS, recA, Sr1::Tn10(TcR).

Die Transformation der Plasmide in die Kartoffelpflanze wurde mit Hilfe des Agrobacterium tumefaciens-Stammes LBA4404 (Bevan (1984) Nucl. Acids Res 12: 8711-8720) durchgeführt.

3. Transformation von Agrobakterium tumefaciens

Bei BIN 19 Derivaten erfolgt der Transfer der DNA in die Agrobacterien durch direkte Transformation nach der Methode von Holsters et al. (1978) (Mol Gen Genet 163: 181-187). Die Plasmid-DNA transformierter Agrobakterien wurde nach der Methode von Birnboim & Doly (1979) (Nucl Acids Res 7: 1513-1523) isoliert und nach geeigneter Restriktionsspaltung gelelektrophoretisch analysiert.

4. Pflanzentransformation

Zehn kleine, mit einem Skalpell verwundete Blätter einer Kartoffel-Sterilkultur wurden in 10ml MS-Medium mit 2% Saccharose gelegt, welches 30-50 µl einer unter Selektion gewachsenen Agrobakterium tumefaciens-Übernachtkultur enthielt. Nach 3-5 minütigem, leichtem Schütteln wurden die Blätter auf MS-Medium mit 1,6% Glucose, 2mg/l Zeatinribose, 0,02mg/l Naphthylessigsäure, 0,02mg/l Giberellinsäure, 500mg/l Claforan, 50mg/l Kanamycin und 0,8% Bacto Agar ausgelegt. Nach einwöchiger Inkubation bei 25°C und 3000 Lux wurde die Claforankonzentration im Medium um die Hälfte reduziert.

5. Analyse genomischer DNA aus transgenen Kartoffelpflanzen

Die Isolation genomischer Pflanzen-DNA erfolgte nach Rogers & Bendich (1985) Plant Mol Biol 5: 69-76. Mit Hilfe von "Southern blot"-Analysen wurden 10-20 µg DNA nach geeigneter Restriktionsspaltung auf Integration der einzuführenden DNA- Sequenzen hin untersucht.

6. β-Glucuronidase-Aktivitätstest (GUS-Assay)

Die β-Glucuronidase ist ein bakterielles Enzym, das β-Glukuronide hydrolysiert und sowohl quantitativen als auch histochemischen Aktivitätsbestimmungen zugänglich ist. Aktivitätsmessungen wurden nach Jefferson et al. (1987) EMBO J 6: 3901-3907 durchgeführt. Gewebeproben wurden in 1mM X-Gluc, 50 mM Na-Phosphat pH 7,0 und 0,1% Tween 20 bis zu gewünschten Intensität der Blaufärbung inkubiert.

Die nachfolgenden Ausführungsbeispiele erläutern die Herstellung der Expressionskassette, deren DNA-Sequenz eine regulatorische Sequenz für eine Schließzellenspezifische Genexpression enthält. Ferner wird die Einführung der Sequenz in ein Plasmid erläutert, mit dem eine Transformation von Pflanzenzellen möglich ist, sowie die Transformation von Pflanzenzellen, die Regeneration von transgenen Pflanzen und die Untersuchung der Funktion der Expressionskassette in transgenen Pflanzen.

Ausführungsbeispiel 1 Klonierung und Strukturanalyse eines ADP-Glucose- Pyrophosphorylase-Gens aus Solanum tuberosum

cDNA-Klone, die für die S-Untereinheit der ADP-Glucose- Pyrophosphorylase der Kartoffel kodieren, wurden aus der Kartoffel-Varietät "Desiree" isoliert und sequenziert (Müller- Röber et al.(1990) Mol Gen Genet 224:136-146; EP 4 55 316). Diese cDNA-Klone dienten dazu, einen homologen, genomischen ADP- Glucose-Pyrophosphorylase-Klon aus der Kartoffel-Varietät AM 80/5793 (Max-Planck-Institut für Züchtungsforschung, Köln) zu isolieren.

Ausführungsbeispiel 2 Klonierung, Identifikation und Primärstruktur eines ADP- Glucose-Pyrophosphorylase-Gens als Fragment genomischer DNA von Solanum tuberosum

Eine genomische Bibliothek der nukleären DNA aus der Kartoffel-Varietät AM 80/5793, die im vom Lambda-Phagen abgeleiteten Vektor EMBL 3 etabliert worden war, wurde mit Hilfe der ADP-Glucose-Pyrophosphorylase cDNA S25-1 (vgl. Ausführungsbeispiel 1) sondiert. Mehrere unabhängige Klone wurden erhalten, von denen der Klon GS6-11 für die weiteren Arbeiten verwendet wurde. Die Restriktionskarte des Klons GS6-11 ist in Fig. 1 wiedergegeben. Ein Teil des Gens wurde sequenziert, die Sequenz ist in Fig. 2 wiedergegeben.

Ausführungsbeispiel 3 Identifikation der für die schließzellenspezifische Expression des ADP-Glucose-Pyrophosphorylase-Gens verantwortlichen regulatorischen Bereiche

Die mehr als 12 kbp große Sal I Insertion des genomischen Klons GS6-11 wurde in die Sal I-Schnittstelle des Vektors pUC 19 kloniert und ergab das Plasmid SF-6. Ein etwa 5,3 kbp langes HincII-Fragment des Plasmids SF-6 wurde in die HincII- Schnittstelle des Vektors pUC 19 subkloniert und ergab das Plasmid pH6-1. Das etwa 3,2 kbp lange HincII/Bgl II des Plasmids pH6-1 wurde nach Auffüllen der Bgl II-Schnittstelle in die SmaI- Schnittstelle des Vektors pUC 19 kloniert. Dabei wurde das 5′- Ende zur EcoRI-Schnittstelle des polylinkers hin orientiert, wobei das Plasmid pSA erhalten wurde. Anschließend wurde das EcoRI/BamHI Fragment aus dem pUC 19 Derivat pSA heraus geschnitten und nach Auffüllen der EcoRI-Schnittstelle in den Vektor pBI101.1 (Jefferson et al.(1987) Plant Mol Biol Rep 5: 387-405) gesetzt, wobei pAS-GUS erhalten wurde (vgl. Fig. 4). Der Vektor pBI101.1 war vorher mit HindIII/BamH I geschnitten und die HindIII-Schnittstelle aufgefüllt worden. Der Vektor pBI101.1 enthält die kodierende Region des β-Glucuronidase-Gens als Reportergen. Die β-Glucuronidase ist einer histologischen Bestimmung ihrer Aktivität zugänglich und kann daher zur Analyse der Zellspezifität einer zu prüfenden regulatorischen Region eines Expressionssystems eingesetzt werden. Parallel zur Klonierung von pAS-GUS wurde der Expressionsvektor pAS hergestellt, der zwischen dem Promotorfragment der ADP-Glucose- Pyrophosphorylase und dem Terminator des Octopinsynthase-Gens einen polylinker enthält (vgl. Fig. 3). Mit Hilfe dieses Plasmids ist eine Expression von beliebigen Genen unter der Kontrolle des ADP-Glucose-Pyrophosphorylase-Promotors möglich.

Das Konstrukt pAS-GUS mit der kodierenden Region der β-Glucuronidase als Reportergen wurde in den Agrobacterienstamm LBA 4404 (Bevan, M.(1984) Nucl Acids Res 12: 8711-8721) transferiert, und die das chimäre ADP-Glucose- Pyrophosphorylase/β-Glucuronidase-Gen enthaltenden Agrobacterien zur Transformation von Kartoffel- und Tabakblättern eingesetzt.

Von zehn unabhängig erhaltenen Transformanden, in denen die Präsenz des intakten, nicht rearrangierten chimären ADP-Glucose- Pyrophosphorylase/β-Glucuronidase-Gens mit Hilfe von Southern blot Analysen nachgewiesen worden war, wurden Blatt, Stamm, Knollen und Wurzeln auf die Aktivität der β-Glucuronidase hin untersucht. Die Ergebnisse sind in Fig. 5 wiedergegeben. Aus diesen Daten ergibt sich eindeutig, daß das HincII-Fragment des ADP-Glucose-Pyrophosphorylase-Gens GS6-11, welches mit dem β- Glucuronidase-Gen fusioniert worden war, im Blatt eine schließzellenspezifische Aktivität der β-Glucuronidase bewirkt. Diese Aktivität ist nicht nachweisbar in den Mesophyll- und Epidermiszellen.

Claims

1. Expressionskassette, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine DNA-Sequenz mit einer transkriptional regulatorischen Starter-Region, die eine schließzellenspezifische Genexpression in den Schließzellen der Blätter von Pflanzen sicherstellt und keine Expression in Mesophyllzellen oder epidermalen Zellen der Blätter vermittelt.

2. Expressionskassette gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß auf der DNA-Sequenz das etwa 3,2 kb große HincII/BglII-Promotorfragment des ADP-Glucose- Pyrophosphorylase-Gens GS6-11 oder ein Teil davon enthalten ist.

3. Expressionskassette gemäß den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die darin enthaltene DNA-Sequenz pflanzliche Schließzellen dahingehend verändert, daß ein permanentes Öffnen oder Schließen oder eine Verlängerung oder Verkürzung der Öffnungsperioden dieser Zellen möglich wird.

4. Expressionskassette gemäß den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der mit einer transkriptional regulatorischen Starter-Region für eine schließzellenspezifische Genexpression versehenen DNA- Sequenz eine weitere DNA-Sequenz nachgeschaltet werden kann, die die Information für die Bildung und mengenmäßige Verteilung endogener Produkte oder die Bildung heterologer Expressionsprodukte in Kulturpflanzen enthält.

5. Plasmide enthaltend eine Expressionskassette gemäß den Ansprüchen 1 bis 4.

6. Plasmid pAS (DSM 6906), bestehend aus einer etwa 13,2 kb großen DNA-Sequenz, in der ein etwa 2,0 kb großes Kanamycin- Resistenzgen, ein etwa 3,2 kb großes HincII/BglII- Promotorfragment des regulatorischen Starter-Bereichs des ADP-Glucose-Pyrophosphorylase-Gens GS6-11 aus Solanum tuberosum, ein polylinker und der Transkriptionsterminator des Nopalinsynthasegens enthalten sind.

7. Plasmid pAS-GUS (DSM 6907), bestehend aus einer etwa 15,2 kb großen DNA-Sequenz, in der ein etwa 2,0 kb großes Kanamycin- Resistenzgen, ein etwa 3,2 kb großes HincII/BglII- Promotorfragment des regulatorischen Starter-Bereichs des ADP-Glucose-Pyrophosphorylase-Gens GS6-11 aus Solanum tuberosum, die etwa 2 kb große kodierende Region β-Glucuronidase und der Transkriptionsterminator des Nopalinsynthasegens enthalten sind.

8. Verfahren zur genetischen Veränderung einer Pflanzenzelle, enthaltend eine Expressionskassette mit einer DNA-Sequenz zur schließzellenspezifischen Genexpression, das folgende Schritte beinhaltet:

a) Isolation des Klons GS6-11.
b) Herstellung des Plasmids pSF-6, unter Verwendung des etwa 12 kb großen SalI-Fragments aus dem Klon GS6-11.
c) Herstellung des Plasmids pH6-1 unter Verwendung eines etwa 5,3 kb großen HincII-Fragments aus dem Plasmid pSF- 6.
d) Herstellung der Plasmide pAS (DSM 6906) und pAS-GUS (DSM 6907) unter Verwendung des etwa 3,2 kb großen HincII/BglII-Fragments des regulatorischen Starter- Bereichs des ADP-Glucose-Pyrophosphorylase-Gens aus Solanum tuberosum aus dem Plasmid pH 6-1.
e) Transfer des Plasmids pAS (DSM6906) bzw. pAS-GUS (DSM6907) in eine Pflanzenzelle.

9. Eine Pflanzenzelle hergestellt nach dem Verfahren des Anspruchs 8.

10. Eine Pflanze oder pflanzliches Gewebe, regeneriert aus einer Pflanzenzelle gemäß Anspruch 9.

11. Eine Pflanzenzelle, enthaltend eine Expressionskassette gemäß den Ansprüchen 1 bis 4.

12. Verwendung einer Expressionskassette gemäß den Ansprüchen 1 bis 4 zur Expression von Genen in Schließzellen, die die Regulation von Gasaustausch und Transpiration verändern.

13. Verwendung einer Expressionskassette gemäß den Ansprüchen 1 bis 4 zur Expression homologer oder heterologer Gene in Schließzellen transformierter Pflanzen.

14. Verwendung einer Expressionskassette gemäß den Ansprüchen 1 bis 4 zur Expression von Genen in Schließzellen, die eine lokale Änderung des Phytohormonspiegels bewirken.

15. Verwendung der Plasmide pAS oder pAS-GUS oder Derivate davon zur Transformation von Kulturpflanzen.

16. Verwendung der Plasmide pAS oder pAS-GUS oder Derivate davon zur Regulation endogener Prozesse oder zur Herstellung heterogener Produkte in Kulturpflanzen.

17. Eine Pflanze gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Tabakpflanze ist.

18. Eine Pflanze gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Kartoffelpflanze ist.

19. Eine Pflanze gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Tomatenpflanze ist.

20. Eine Pflanze gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Zuckerrübenpflanze ist.