ES2197148T3 - Casete de expresion y plasmidos para una expresion especifica para celulas guardas y su uso para la introduccion de celulas de plantas transgenicas y plantas. - Google Patents
Casete de expresion y plasmidos para una expresion especifica para celulas guardas y su uso para la introduccion de celulas de plantas transgenicas y plantas.Info
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Abstract
SE DESCRIBEN UNA CASILLA DE EXPRESION Y PLASMIDOS QUE CONTIENEN UNA CASILLA DE EXPRESION, QUE CONTIENEN LA REGION INICIADORA REGULADORA DE TRANSCRIPCION PARA UNA EXPRESION DE GEN ESPECIFICO DE CELULA DE PROTECCION. EN LA CASILLA DE EXPRESION ESTA CONTENIDO EL PROMOTOR DE CELULA PROTECTORA QUE TIENE LA SECUENCIA SEQ.ID NO: 1: LA REGION INICIADORA EN LA CASILLA DE EXPRESION ASEGURA UNA EXPRESION DE GEN ESPECIFICO DE CELULA PROTECTORA Y CAUSA LA NO EXPRESION EN CELULAS MESOFILICAS O CELULAS EPIDERMICAS DE LAS HOJAS DE PLANTAS. TAMBIEN SE DESCRIBE LA PREPARACION DE LA CASILLA DE EXPRESION Y LOS PLASMIDOS QUE CONTIENEN ESTA CASILLA DE EXPRESION. TAMBIEN SE DESCRIBE EL USO DE LA CASILLA DE EXPRESION Y LOS PLASMIDOS QUE CONTIENEN ESTA CASILLA DE EXPRESION PARA PREPARAR PLANTAS CELULAS VEGETALES TRANSGENICAS.
Description
Casete de expresión y plásmidos para una
expresión específica para células guardas y su uso para la
introducción de células de plantas transgénicas y plantas.
El presente invento se refiere a una casete de
expresión y a plásmidos que contienen esta casete de expresión. La
secuencia de ADN de la casete de expresión contiene una región
iniciadora reguladora de la transcripción, que asegura una
expresión de genes específicos en la célula guarda de las hojas de
plantas, y no asegura ninguna expresión en células mesófilas o
epidérmicas de las hojas. El invento se refiere además a un
procedimiento para la preparación de células de plantas
transgénicas, que contienen secuencias de la casete de expresión,
así como al uso de los plásmidos que contienen la casete de
expresión para la preparación de plantas transgénicas.
A causa del continuo crecimiento en la población
mundial, hay una demanda que va creciendo continuamente de
materiales nutritivos y materias primas, a causa de la previsible
limitación a largo plazo del terreno agrícola, la tarea constante de
la investigación biotecnológica es hacer lo posible para la
producción de plantas útiles ecológicamente aceptables de alto
rendimiento. Para conseguir esto, ha de ser modificado el
metabolismo de las plantas. Esto se puede conseguir, entre otras
vías, alterando el ADN en el núcleo celular. El proceso para la
modificación genética de plantas dicotiledóneas y monocotiledóneas
ya es conocido, (véanse por ejemplo las citas de Fraley, R.T.
(1989) Science 244: 1293-1299; y Potrykus (1991)
Ann. Rev. Plant. Mol. Biol. Plant. Physiol. 42:
205-225.
Con el presente invento es posible influir sobre
el proceso de transpiración y sobre el intercambio gaseoso de una
planta tomando en consideración al aumento de rendimiento por medio
de manipulación de los genes que son expresados específicamente en
células guardas. Esto no es practicable usando los conocidos
sistemas de expresión a causa de las consecuencias de amplio alcance
de una expresión de genes específicos para células que no sean
guardas, para el intercambio total de material de la planta. Un
aumento en el rendimiento de las plantas útiles se puede conseguir
cambiando la carga con fotosíntesis de las plantas o las necesidades
de agua. Para esto, las células guardas de la epidermis del tejido
de las hojas constituyen un valioso punto de partida.
Las células guardas son células específicas con
forma arriñonada de aquella parte de la epidermis que está por
encima del suelo y en el aire que rodea a las partes verdes de las
plantas superiores, y que están dispuestas por pares y tienen un
intersticio (agujero) entre una y otra. El agujero interrumpe a la
película, por lo demás continua, de células de la epidermis y causa
la conexión entre el aire exterior y el sistema intercelular. En la
mayor parte de las plantas, el área de poros que resulta de los
agujeros abiertos ocupa alrededor de 0,5 a 1,5% del área de las
hojas. Debido a su formación especial, las células guardas pueden
regular su forma a través de cambios activos de la turgencia, de
tal manera que el agujero entre ellas se cierre o se abra. Los
orificios son por lo tanto reguladores del intercambio,
especialmente de la transpiración. Por lo tanto, las células
guardas tienen la tarea de regular la resistencia a la difusión de
tal manera que la demanda de agua por transpiración y recogida de
CO_{2} para la fijación de CO_{2} por fotosíntesis o en la
oscuridad, esté en una relación apropiada para los requisitos
particulares. La apertura o el cierre de las células guardas lleva
de retorno a un cambio en la turgencia en las células guardas
propiamente dichas y con ello a la formación de una diferencia de
la turgencia en las células guardas con respecto a la existente en
las células epidérmicas colindantes (células vecinas).
Las células guardas controlan el intercambio
gaseoso entre la recogida de dióxido de carbono y la transpiración
(espiración de vapor de agua). Además de la concentración de
dióxido de carbono y de las fitohormonas, un constituyente del
sistema de control es la concentración de sustancias disueltas,
puesto que éstas conducen, por medio de cambios en la turgencia, a
la apertura y al cierre de los agujeros. Puesto que los cambios de
concentración en sustancias disueltas tienen consecuencias de amplio
alcance para el metabolismo de las plantas, independientemente de
que esto ocurra en tejidos o en células, es deseable permitir estos
cambios solamente en ciertas zonas de plantas o durante un cierto
período de tiempo en el ciclo de crecimiento de las plantas. Deberá
especialmente ser posible tener un cambio que influya sobre el
intercambio gaseoso del dióxido de carbono o también sobre el
contenido de sustancia osmóticamente activa de las células guardas
que sea independiente de la concentración de estas sustancias en
células mesófilas. Por esta razón, hay un gran interés en la
identificación y el uso económico de secuencias reguladoras del ADN
de genomas de plantas que sean responsables de la transcripción
específica en células guardas.
Con la ayuda de secuencias reguladoras
específicas para células guardas, por expresión de apropiados genes
recientemente introducidos o por modulación de productos de genes
endógenos, se pueden introducir una apertura o un cierre o bien un
alargamiento o un acortamiento permanentes del período de tiempo de
apertura de las células guardas.
El presente invento proporciona un sistema de
expresión específica para células guardas, con el que son posibles
tales efectos.
La apertura permanente de las células guardas,
teniendo en cuenta una transpiración aumentada, debería conducir a
una mayor pérdida de agua en las plantas que, sin embargo, por
ejemplo en fases tardías del ciclo de crecimiento, puede ser
deseable para la aceleración de la maduración de las plantas útiles.
Además de esto, puede concebirse, en la producción de plantas
fuertemente activas en transpiración para esta finalidad, un
drenaje controlado del suelo. Las plantas que enraízan por encima
del terreno pueden causar, por una disminución de la capacidad de
calor del suelo, un calentamiento más temprano a lo largo de un año
de zonas en crecimiento y hacer posible de esta manera una cosecha
más temprana de plantas útiles sensibles térmicamente, tales como,
por ejemplo, las de remolacha azucarera. Puesto que las plantas
cooperantes modificadas genéticamente, introducidas en primer lugar,
están obstaculizadas en las fases tardías del ciclo de crecimiento,
no conducen a un impedimento del desarrollo de plantas útiles, sino
que por el contrario conducen a un aumento del rendimiento a través
de una prolongación de la fase de vegetación.
Un mantenimiento en estado ampliamente cerrado de
los orificios de agujeros deberá causar, a través de un intercambio
gaseoso reducido, un crecimiento retrasado y, como resultado, una
prolongación oportuna de la fase de vegetación. Esto puede ser de
interés en plantas útiles ornamentales. Además, se pueden producir
plantas útiles cooperantes agrícolas que, como cubierta de una
tierra débil en transpiración, impiden una erosión de terreno útil
en la fase calmada o al comienzo de la fase de vegetación de las
plantas útiles.
Se ha mostrado que un cambio en el período de
tiempo de apertura de los agujeros es valioso en plantas útiles. Por
ejemplo. en plantas cosechadas verdes, especialmente en plantas
útiles forrajeras, por retención de agua, se puede impedir la
desecación del material de hojas más antiguo, y de esta manera se
puede aumentar el rendimiento. Además, se puede considerar una
adaptación a una zona con concentración aumentada de dióxido de
carbono atmosférico (por ejemplo por adición de CO_{2} a
invernaderos). Mediante alargamiento artificial del período de
tiempo de apertura, se pueden compensar efectos tales como
privación de minerales en una transpiración reducida, como
consecuencia de una presión parcial de dióxido de carbono más alta
en las plantas.
Por combinación de elementos reguladores,
específicos para células guardas, con otros sistemas de control, se
pueden observar posibilidades adicionales de uso. Por ejemplo,
mediante un acoplamiento de sensores químicos, se puede producir un
cierre de los orificios de agujeros, inducido desde fuera de los
orificios de agujeros, y de esta manera se podría producir en el
momento deseado una detención del crecimiento de ciertas plantas,
las denominadas plantas cooperantes agrícolas.
Con el fin de especificar secuencias reguladoras
de ADN, se deben buscar primeramente productos que aparezcan
solamente en ciertos momentos en el ciclo de crecimiento de las
células o en una cierta parte de la planta, tal como aquí en
células guardas. Una vez que ha sido identificado y aislado el gen
responsable, es necesario realizar una investigación básica de la
secuencia y sobre todo la identificación y el aislamiento de la
deseada región reguladora de la transcripción. Entonces se debe
preparar un modelo apropiado, cuya validez pueda ser demostrada
mediante un experimento.
Se proporciona ahora una casete de expresión, que
comprende una secuencia de ADN con una región iniciadora reguladora
de la transcripción, que asegura una expresión de genes específicos
para células guardas, que no causa expresión en células mesófilas o
en células epidérmicas de las hojas, de acuerdo con la
reivindicación 1. Con la casete de expresión es posible una
manipulación de genes de las plantas que causa una apertura o un
cierre o bien un alargamiento o un acortamiento permanentes del
período de tiempo de apertura de las células guardas.
La secuencia de ADN contiene la región iniciadora
reguladora de transcripción para una expresión de genes específicos
para células guardas.
En la casete de expresión de acuerdo con la
reivindicación 1 está situada la secuencia de ADN del promotor
específico para células guardas, que tiene la secuencia (Seq. ID
No:1)
(véase también el Ejemplo 4)
Las células de plantas, que contienen una región
reguladora para una expresión de genes específicos para células
guardas, se pueden preparar por el siguiente procedimiento:
- a)
- Aislamiento del clon GS 6-11 como se describe en los Ejemplos 1 y 2. El clon contiene un fragmento de ADN con un tamaño de aproximadamente 12 kb (kilobases), que contiene un elemento regulador específico para células guardas (véase la Figura 1).
- b)
- Preparación del plásmido pSF-6 correspondiente al Ejemplo 3 usando el fragmento para SaII con un tamaño de aproximadamente 12 kb del clon GS 6-11.
- c)
- Preparación del plásmido pH 6-1 usando el fragmento para HincII con un tamaño de aproximadamente 5,3 kb del plásmido pSF-6 correspondiente al Ejemplo 3.
- d)
- Preparación de los plásmidos pAS (DSM 6906), pAS-GUS (DSM 6907) y/o pS1-D4GUS, usando el fragmento de HincII/BgIII con un tamaño de aproximadamente 3,2 kb de la región iniciadora reguladora del gen de la ADP glucosa pirofosforilasa de Solanum tuberosum procedente del plásmido pH 6-1 (Ejemplo 3). El plásmido pAS-GUS contiene, además de la secuencia del plásmido pAS, la región codificadora del gen de la \beta-glucuronidasa.
- e)
- Transferencia del ADN-T de los plásmidos pAS (DSM 6906), pAS-GUS (DSM 6907) y/o pS1-D4GUS, a una célula de planta.
Para la introducción de un ADN en una célula
hospedante de planta hay disponibles muchas técnicas. Estas técnicas
incluyen la transformación con un ADN-T (ácido
desoxirribonucleico transformador) usando Agrobacterium
tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes como agente de
transformación, fusión de protoplastos, inyección o electroporación
de un ADN, etc. Cuando se usan Agrobacterias para la
transformación, el ADN que se está introduciendo debe ser clonado
en plásmidos especiales y esto implica ya sea en un vector
intermediario o binario. Los vectores intermediarios, constituidos
sobre la base de las secuencias, que son homólogas a secuencias
existentes en el ADN-T, se pueden integrar por
recombinación homóloga en el plásmido Ti o Ri. Éste contiene
también la necesaria región vir para la transferencia del
ADN-T. Los vectores intermediarios no pueden ser
replicados en Agrobacterias. Usando un plásmido cooperante,
el vector intermediario puede ser transferido a Agrobacterium
tumefaciens (por conjugación). Los vectores binarios pueden ser
replicados en E. Coli así como en Agrobacterias.
Éstos contienen un gen marcador de selección y un enlazador o
polienlazador, que están enmarcados por las regiones colindantes de
ADN-T, derecha e izquierda. Éstos se pueden
transformar directamente dentro de las Agrobacterias
(Holsters y colaboradores (1978) Mol gene geneet
163:181-187). Las Agrobacterias que sirvan
como células hospedantes deberán contener un plásmido que lleve una
región vir. La región vir es necesaria para la transferencia del
ADN-T a las células de plantas. Puede estar
contenida una cantidad adicional de ADN-T. La
bacteria así transformada se usa para la transformación de células
de plantas. Para la transferencia del ADN a las células de plantas,
un explante de planta se puede cultivar apropiadamente de modo
conjunto con Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium
rhizogenes. A partir del material de plantas infectadas (p.ej.
trozos de hojas, segmentos de tallos, raíces y también protoplastos
o suspensiones de células cultivadas) las plantas enteras pueden
ser regeneradas en un medio apropiado, que contiene antibióticos o
biocidas para la selección. Las plantas resultantes se pueden
ensayar seguidamente para determinar la presencia de un ADN
introducido. No se plantean demandas especiales a los plásmidos en
la inyección ni en la electroporación. Se pueden usar plásmidos
simples tales como p.ej. derivados de pUC. Sin embargo, si se
tuvieran que regenerar plantas enteras a partir de dichas células
transformadas, sería necesaria la presencia de un gen marcador
seleccionable.
Los plásmidos pAS y pAS-GUS
tienen un tamaño de alrededor de 13,3 y 15,2 kb respectivamente y
contienen el gen de resistencia a kanamicina con un tamaño de
aproximadamente 2,0 kb, el fragmento de promotor para HindII/BgIII
con un tamaño de aproximadamente 3,2 kb de la región iniciadora
reguladora del gen de la ADP glucosa pirofosforilasa
GS6-11 de Solanum tuberosum, un enlazador y
un terminador de la transcripción del gen de la nopalina sintasa.
El plásmido pAS-GUS contiene también el gen de la
\beta-glucuronidasa con un tamaño de
aproximadamente 2 kb.
Con el fin de efectuar la preparación para la
introducción de genes ajenos en plantas superiores, están
disponibles un gran número de vectores de clonación, que contienen
una señal de replicación para E. Coli y un marcador, que
permite una selección de las células transformadas. Ejemplos de
vectores son pBR 332, la serie de pUC, la serie de M13 mp, pACYC
184, etc. La secuencia deseada se puede introducir en el vector en
una apropiada posición de restricción. El plásmido resultante es
usado para la transformación en el seno de E. Coli. Las
células de E. Coli son cultivadas en un apropiado medio
nutritivo, y luego cosechadas y lisadas. El plásmido es vuelto a
extraer. Para un análisis en general, se pueden usar un análisis de
secuencias, un análisis por restricción, una electroforesis y otros
métodos bioquímicos y de biología molecular. Después de cada
manipulación, la secuencia de ADN usada puede ser cortada y unida a
otra secuencia de ADN. Cada secuencia de plásmido puede ser clonada
en el mismo plásmido o en diferentes plásmidos. Dependiendo del
método para realizar introducciones del gen deseado en la planta,
pueden ser necesarias secuencias de ADN adicionales. Sí, por
ejemplo, el plásmido Ti o Ri se usase para la transformación de las
células de plantas, por lo menos el lindero derecho, y con
frecuencia, sin embargo, los linderos derecho e izquierdo del
ADN-T de los plásmidos Ti y Ri, deberían ser
enlazados como una zona flanqueadora del gen introducido.
El uso de un ADN-T para la
transformación de células de plantas ha sido investigado
intensamente y está bien descrito en el documento de patente europea
EP 120.516; y en las citas de Hoekema, En: The Binary Plant Vector
System [El sistema de vectores binarios de plantas],
Offset-drukkerij Kanters B.V., Alblasserdam,
(1985), capítulo V; de Fraley y colaboradores, Crit. Rev. Plant.
Sci., 4:1-46; y de An y colaboradores (1985) EMBO J.
4:277-287.
Una vez que el ADN introducido ha sido integrado
en el genoma, éste por regla general es estable allí y permanece
también en la progenie de las células transformadas originales.
Éste contiene normalmente un marcador de selección, que induce en
las células de plantas transformadas una resistencia contra un
biocida o antibiótico, tal como kanamicina, G 418, bleomicina,
higromicina o fosfinotricina. El marcador individual empleado
deberá por lo tanto permitir la selección de células transformadas
a partir de células, que carecen del ADN introducido.
Las células transformadas crecen dentro de las
plantas de la manera usual (véase también la cita de McCormick y
colaboradores (1986) Plant Cell Reports 5:81-84).
Estas plantas se pueden hacer crecer de una manera normal y cruzar
con plantas, que posean los mismos o diferentes genes
transformados. Los individuos híbridos resultantes tienen las
correspondientes propiedades fenotípicas.
Deberán hacerse crecer dos o más generaciones
para asegurar que la característica fenotípica permanezca estable y
heredada. También se deberán cosechar semillas para asegurar que
permanezcan el correspondiente fenotipo u otras individualidades.
Todas las especies de plantas son apropiadas como plantas
hospedantes para la expresión específica para células guardas, pero
lo son especialmente especies de plantas útiles.
Las plantas útiles apropiadas son p.ej. las de
patatas, tabaco, tomates y remolachas azucareras así como de plantas
útiles suplementarias de especies agrícolas, p.ej. plantas útiles
que proporcionan nitrógeno.
La secuencia de ADN contenida en la casete de
expresión del invento se puede insertar detrás de secuencias de ADN
adicionales que contienen información acerca de la formación y
distribución cuantitativa de productos endógenos o acerca de la
formación de productos de expresión heterólogos en plantas
útiles.
Los productos de expresión endógenos son p.ej.
fitohormonas, hidratos de carbono y otros metabolitos. Los productos
heterólogos son p.ej. hidratos de carbono que no se forman de modo
natural en plantas, o enzimas para la liberación de sustancias con
actividad de fitohormonas como una etapa primaria, que no son
convertidas de un modo natural en fitohormonas en plantas.
Las secuencias de ADN que se pueden introducir
detrás de la secuencia reguladora de la casete de expresión, deberán
contener todos los posibles cuadros de lectura abiertos para un
péptido preferido, así como uno o más intrones. Como ejemplo se
pueden mencionar: secuencias para enzimas, secuencias que son
complementarias:
- a)
- con una secuencia de genoma, con lo cual la secuencia del genoma deberá ser un cuadro de lectura abierto;
- b)
- con un intrón;
- c)
- con una secuencia de lectura no codificada;
- d)
- con cualquier secuencia,
que inhiba, de manera complementaria a la
integración en el genoma, la transcripción, el tratamiento (por
ejemplo el empalme) de ARNm (ácido ribonucleico mensajero) o la
traducción.
La deseada secuencia de ADN se puede preparar por
síntesis o se puede extraer por medios naturales, o puede constar de
una mezcla de constituyentes de ADN sintéticos y naturales. En
general, las secuencias de ADN sintéticos se producen con codones
que son preferidos para plantas. Estos codones preferidos para
plantas pueden ser fijados a partir de codones con la más elevada
abundancia de proteínas, que son expresados en las especies de
plantas más interesantes. En la preparación de una casete de
expresión, se pueden manipular diversos fragmentos de ADN con el
fin de obtener la secuencia de ADN que lea apropiadamente en la
dirección correcta y que sea suministrada con el correcto cuadro de
lectura. Para efectuar la combinación de fragmentos de ADN unos con
otros, se pueden disponer adaptadores o enlazadores en los
fragmentos.
De manera apropiada, una región de comienzo y de
terminación de la transcripción en la dirección de transcripción
deberá ser vista a través de un enlazador o polienlazador que
contenga una o más posiciones de restricción para la introducción
de esta secuencia. Como regla general, el enlazador tiene de 1 a
10, en la mayor parte de los casos de 1 a 8, y preferiblemente 2 a 6
posiciones de restricción. En general, el enlazador tiene, dentro
de la zona reguladora, un tamaño de menos que 100 pb (pares de
bases), generalmente de menos que 60 pb y por lo menos, sin
embargo, 5 pb. La zona de comienzo de la transcripción, además de
ser nativa y/u homóloga, puede ser también ajena y/o heteróloga con
respecto a las plantas hospedantes. La casete de expresión
comprende, en la dirección de transcripción 5'-3',
una región representativa para la planta, para la iniciación de la
transcripción, una secuencia preferida y una región para la
terminación de la transcripción. Diversas zonas de terminación son
intercambiables, preferiblemente unas con otras.
Además, se pueden llevar a cabo manipulaciones
que preparen apropiados sitios de corte por restricción o separen el
exceso de ADN o de posiciones de corte. Cuando se han de considerar
inserciones, deleciones o sustituciones, por ejemplo transiciones y
transversiones, se puede usar una mutagénesis in vitro, una
reparación con cebadores, una restricción o una ligación. En
manipulaciones apropiadas, tales como por ejemplo restricción,
retro-mascadura o relleno de partes colgantes para
extremos romos, se pueden usar extremos complementarios de los
fragmentos para la ligación. Para llevar a cabo las diversas
etapas, es necesaria una clonación para obtener una ampliación de
las cantidades de ADN y para el análisis de ADN que asegure el
éxito esperado de la intervención.
Para la introducción de genes ajenos dentro de
plantas por uso de la secuencia reguladora específica para células
guardas, están disponibles un cierto número de posibilidades, pero
es especialmente interesante, sin embargo, la expresión de genes
que cambien la regulación de la célula guarda en relación con el
intercambio gaseoso así como con la espiración de vapor de agua
(transpiración).
Para la expresión de dichos genes, es
especialmente valioso el uso de la casete de expresión del
invento.
Una modificación de las células guardas que
afecte sobre la condición de apertura de los estomas se puede
conseguir de dos maneras: por medio de una modulación del contenido
de proteínas endógenas, enzimas, vehículos o bombas que transporten
el metabolito a través de membranas, presentes en las células
guardas; o por medio de una transferencia y una expresión de genes
de origen homólogo o bien heterólogo o sintético, que codifiquen
las proteínas, las enzimas, los vehículos o las bombas, que no
pertenezcan a los constituyentes normales de una célula guarda,
pero cuya actividad o presencia influya sobre el estado de las
células en relación con la apertura de los estomas.
Para la regulación de la transcripción están
implicados tres sistemas de sensores: sensores para medir la
concentración de dióxido de carbono, sensores de fitohormonas y un
sistema de medición de los gradientes de turgencia entre células
guardas y las células epidérmicas colindantes. Los cambios de
turgencia son posibles, por ejemplo, influyendo sobre la actividad
de enzimas o sistemas de transporte del metabolismo de hidratos de
carbono. Además de un cambio directo de la concentración de la
actividad osmótica del hidrato de carbono, por ejemplo por medio de
invertasas citosólicas o vacuolares o de los translocadores de
triosa-fosfatos de cloroplastos, se han de esperar
consecuencias para la regulación osmótica, por medio de un
enriquecimiento o una reducción de compuestos precursores de
sustancias osmóticamente activas. Por ejemplo, modificando la
actividad de la ADP glucosa pirofosforilasa, se puede influir sobre
la síntesis de almidones, y de esta manera se pueden modificar las
cantidades en substratos para el ciclo de glicolisis y de citrato,
con lo que a fin de cuentas está implicada la concentración del
malato, que es una sustancia con importancia en relación con la
turgencia de las células. Un aumento en la actividad de invertasas
apoplásticas en células guardas puede aumentar la concentración de
almidones mediante una recogida aumentada de hexosas. Dicha
introducción debe seguir una especificidad para células guardas,
puesto que un aumento de la actividad de invertasas apoplásticas en
las células mesófilas fuertemente activas en fotosíntesis, conduce
a una reducción del transporte de materiales asimilados y con ello
a una mayor carga osmótica de los tejidos (véase la cita de
Schaewen y colaboradores 1990 EMBO J. 9:3033-3044).
Además, se puede tomar en consideración un aumento de la expresión,
o la propia expresión de una
fosfo-enol-piruvato carboxilasa
modificada. La enzima cataliza la reacción de
fosfo-enol-piruvato para formar el
oxalo-acetato, que a su vez es un predecesor para el
malato. Además, las bombas de protones (ATPasas de protones) pueden
contribuir a un cambio en el potencial osmótico, que hace posible
el proceso de transporte de iones para los gradientes
electroquímicos.
Se ven posibilidades adicionales de influencia en
la actividad de la carbonato deshidratasa, que controla el
equilibrio entre el dióxido de carbono y el carbonato disueltos,
por cuanto que ésta influye por lo tanto sobre la concentración de
dióxido de carbono celular; sin embargo, también por ejemplo en la
fructosa bifosfatasa, que contribuye como una enzima en la sección
regeneradora del ciclo de Calvin en la fijación de dióxido de
carbono.
La casete de expresión del invento se puede usar
también para una expresión, específica para células guardas, de
genes que regulan el nivel de fitohormonas de plantas.
Los cambios locales en el nivel de fitohormonas
son especialmente interesantes para ejercer influencia sobre las
propiedades de las células guardas: mientras que, por ejemplo, las
auxinas causan una apertura de los agujeros, la aplicación de ácido
abscísico conduce a un rápido cierre de los agujeros. Ya han sido
clonados numerosos genes cuyos productos tienen influencia en la
constitución hormonal de las plantas (véase p.ej. la cita de Klee,
H. & Estelle, M. (1991) Ann. Rev. Plant. Physiol. Plant. Mol.
Biol. 42:529-551). Los genes 1 y 2 del
ADN-T de Agrobacterium tumefaciens codifican
la enzima para síntesis de auxinas, mientras que la indol acetato
lisina sintetasa (Romano y colaboradores (1991) Genes &
Development 5:438-446) cataliza la desactivación de
las auxinas. Las citocininas son liberadas a través de una
glucosidasa codificada por el gen rol c del
ADN-T procedente de Agrobacterium rhizogenes
(Estruch y colaboradores (1991) EMBO J.
10:3125-3128); el producto génico del gen 6b de
ADN-T de A. Tumefaciens reduce la actividad
de citocininas (Spanier y colaboradores (1989) Mol. Gen. Genet.
219:209-216). La producción de etileno puede ser
estimulada en plantas por expresión de la aminociclopropano
carboxilato sintasa (Huang y colaboradores (1991) Proc. Nat. Acad.
Science 88:7021-7025); la inhibición de la
aminociclopropano carboxilato oxidasa por expresión de un ARN
antisentido rebaja la liberación de etileno.
A causa de las consecuencias de alto alcance de
la actividad hormonal para las plantas, una influencia sobre la
actividad de las células guardas es factible solamente usando la
casete de expresión del invento para una expresión de genes
específicos para células guardas.
Los procedimientos para la reducción de la
actividad y/o la cantidad de una enzima especificada ya son
conocidos en el sector de la técnica. Como una regla general se
introducen genes quiméricos en la planta. Éstos constan de un
promotor activo en la planta, una secuencia de codificación de la
enzima unida al promotor en la dirección antisentido, cuya
actividad es reducida (desde el extremo 3' de la secuencia de
codificación hasta el extremo 3' de los promotores) y una señal de
terminación, que es funcional en plantas, para la transcripción.
Para la introducción de genes de esta clase en células de plantas,
están disponibles diversos procedimientos. A partir de las células
transformadas, se pueden regenerar plantas transgénicas intactas
para las que se debe determinar el deseado fenotipo (disminución de
la actividad de la enzima diana).
La identificación de necesarias zonas de comienzo
de la transcripción se puede conseguir de un cierto número de
maneras. Por regla general se trata con un ARNm, que es aislado a
partir de ciertas partes de las plantas (aquí, células guardas)
(véase también el Ejemplo 1). Para un aumento adicional en la
concentración del ARNm que caracteriza a la condición del tejido o
de la planta, se puede preparar un ADNc en el que un ADNc
inespecífico es unido al ARNm o al ADNc a partir de otros estados de
tejidos (células mesófilas) o de plantas. El ADNc remanente se
puede usar entonces para el sondeo del genoma de las secuencias
complementarias usando una apropiada biblioteca de ADN de
plantas.
Cuando se aísla una proteína, que aparece en un
tipo específico de célula o tejido, ésta se puede secuenciar
parcialmente de manera tal que se pueda preparar una sonda para la
identificación directa de las correspondientes secuencias en una
biblioteca de ADN de plantas (véase el Ejemplo 2). Entonces, las
secuencias que se hibridan con la sonda pueden ser aisladas y
manipuladas. Además, la zona en 5' no traducida, que está asociada
con la zona codificada, se puede aislar y ensayar en casetes de
expresión para determinar la actividad de transcripción.
Las casetes de expresión obtenidas, que usan las
regiones en 5' no traducidas pueden ser transformadas en plantas
(véase anteriormente), en las que se puede ensayar su funcionalidad
como reguladoras de la transcripción en combinación con un gen
estructural heterólogo (distinto del cuadro de lectura abierto de
los genes de tipo salvaje, que está asociado con la región en 5' no
traducida), así como la especificidad para células guardas. De esta
manera se pueden identificar las secuencias que son necesarias para
la transcripción específica para células guardas.
Los siguientes plásmidos fueron depositados en la
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM, Colección Alemana de
Microorganismos) en Braunschweig, Alemania el 13.02.1992 (número de
depósito):
Plásmido pAS (DSM 6906);
Plásmido pAS-GUS (DSM 6907).
La Figura 1 muestra el mapa de restricción del
clon genómico GS 6-11, que codifica la
subunidad-S de la ADP glucosa pirofosforilasa de
Solanum tuberosum. Por encima del mapa de restricción se
encuentran las denominaciones de genes de los fagos Lambda así como
una escala para estimar la longitud de las secuencias de ADN en
kilobases (kb).
La Figura 2 muestra la fusión del promotor GUS
del plásmido pAS-GUS, que contiene la secuencia de
ácido nucleico de una parte de las zonas importantes para la
regulación de la transcripción del gen de la ADP glucosa
pirofosforilasa GS6-11, que también está contenido
en el plásmido pAS. ATG significa el comienzo de la traducción para
la \beta-glucuronidasa. Se muestra el sitio de
corte con BgI II en que el clon pH6-11 es cortado y
unido con el plásmido pUC 19 linealizado al sitio de corte con
SmaI. La secuencia hasta el sitio de corte con BamHI procede del
polienlazador de pUC 19 y el siguiente nucleótido procede del
plásmido pBI101.1 (Jefferson y colaboradores (1987) Plant. Mol.
Biol. Rep. 5:387-405). La correspondiente zona con
el ADNc se muestra en negrita. Los dos primeros codones de
\beta-glucuronidasa están encuadrados. Una
secuencia que posiblemente representa a una caja de Hogness, está
subrayada.
La Figura 3 muestra el plásmido pAS con un tamaño
de aproximadamente 13,2 kb. Éste contiene el gen de resistencia a
kanamicina con un tamaño de aproximadamente 2,0 kb, como un
constituyente del vector de iniciación pBIN 19 (Bevan, M. (1984)
Nucl. Acids Res. 12:8711-8721), la zona reguladora
con un tamaño de aproximadamente 3,2 kb para una expresión de genes
específicos para células guardas a partir del gen de la ADP glucosa
pirofosforilasa de Solanum tuberosum procedente del clon
GS6-11 (A), insertado entre las posiciones de
nucleótidos (nt) 2.525 y 2.544 de pBIN 19 así como el terminador de
la transcripción procedente del gen de la nopalina sintasa (C),
insertado junto a la posición nt 2.494 del pBIN 19.
A= Fragmento A (de aproximadamente 3,2 kb):
contiene:
- las nt 400-414 procedentes de pUC 19,
- aproximadamente 3,2 kb procedentes de GS 6-11,
- las nt 415-421 procedentes de pUC 19
C= Fragmento C (192 pb): contiene
- las nt 11.749-11.939 procedentes de pTiACH5
- (Gielen y colaboradores (1984) EMBO J. 3:835-846).
La Figura 4 muestra el plásmido
pAS-GUS con un tamaño de aproximadamente 15,2 kb,
que es un derivado del pBI101.1 (Jefferson y colaboradores (1987)
Plant Mol Biol Rev 5:387-405). El plásmido
pBI101.1, de nuevo, es un derivado de pBIN 19 quecontiene, junto a
la nt 2.534, una inserción de 1,87 kb de la región de codificación
de \beta-glucuronidasa (B).
El plásmido pAS-GUS es incluso
diferenciado del pAS por esta inserción. En detalle el
pAS-GUS contiene los siguientes fragmentos:
A= Fragmento A (de aproximadamente 3,2 kb):
contiene:
- las nt 400-414 procedentes de pUC 19
- aproximadamente 3,2 kb procedentes de GS6-11.
- las nt 415-421 procedentes de pUC 19
B= Fragmento B (1,87 kb): región de codificación
de la \beta-glucuronidasa.
C= Fragmento C (192 pb): contiene
- las nt 11.749-11.939 procedentes de pTiACH5
- (Gielen y colaboradores (1984) EMBO J. 3:835-846).
La Figura 5 muestra la expresión de
\beta-glucuronidasa en la hoja de una planta de
patata transgénica transformada con el plásmido
pAS-GUS. Puede observarse con claridad que no se
puede detectar ninguna expresión en las células mesófilas o las
células de epidermis, sino solamente una expresión específica en
las células guardas.
Con el fin de entender los Ejemplos que
constituyen la base de este invento, antes de nada se han de
enumerar todos los procesos necesarios para estos ensayos y que son
de por sí conocidos:
Se usaron para la clonación los vectores pUC
18/19 y los de la serie M13 mp10 (Yanisch-Perron y
colaboradores (1985) genee 33:103-119), así como el
vector EMBL 3 (Frischauf y colaboradores (1983) J. Mol. Biol.
170:827-842).
Se clonaron las estructuras artificiales
(construcciones) de genes en el vector binario BIN 19 (Bevan (1984)
Nucl. Acids Res. 12:8711-8720) para las
transformaciones de las plantas.
Se usaron las cepas BMH71-18
(Messing y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1977), 24,
6342-6346) o TB1 de E. Coli para los vectores
pUC y M13 mp.
Para el vector BIN19 se usó exclusivamente la
cepa TB1 de E. Coli. La TB1 es una cepa derivada resistente
a tetraciclina, negativa en cuanto a recombinantes, de la cepa
JM101 (Yanisch-Perron y colaboradores, genee (1985),
33, 103-119).
El genotipo de la cepa TB1 es (según Bart Barrel,
comunicación personal): F'(traD36, proAB, lacl. lacZ\DeltaM15),
\Delta(lac, pro), SupE, thiS, recA. Sr1::Tn10 (TcR).
La transformación de los plásmidos dentro de las
plantas de patata se llevó a cabo por medio de la cepa LBA4404 de
Agrobacterium tumefaciens (Bevan M., Nucl. Acids Res.
12, 8711-8720, (1984); derivado de
BIN19).
En el caso de los derivados de BIN19, la
inserción del ADN en las agrobacterias se efectuó por
transformación directa de acuerdo con el método desarrollado por
Holsters y colaboradores, (Mol. gene. geneet. (1978), 163,
181-187). El ADN de plásmido de las agrobacterias
transformadas se aisló de acuerdo con el método desarrollado por
Birnboim y Doly (Nucl. Acids Res. (1979), 7,
1513-1523) y se analizó por electroforesis en gel
después de una apropiada disociación por restricción.
Diez pequeñas hojas, heridas con un escalpelo, de
un cultivo estéril de patata se dispusieron en 10 ml de un medio MS
con 2% de sacarosa que contenía de 30 a 50 \mul de un cultivo
durante la noche de Agrobacterium tumefaciens crecido bajo
selección. Después de 3 a 5 minutos de sacudimiento suave, las
cápsulas de Petri se incubaron en la oscuridad a 25ºC. Después de 2
días, las hojas fueron extendidas sobre un medio MS con 1,6% de
glucosa, 2 mg/l de zeatina ribosa, 0,02 mg/ml de ácido
naftil-acético, 0,02 mg/l de ácido giberélico, 500
mg/ml de claforano, 50 mg/l de kanamicina y 0,8 % de agar de Bacto.
Después de incubación durante una semana a 25ºC y 3.000 lux, la
concentración de claforano en el medio fue reducida a la mitad.
El aislamiento de un ADN genómico de las plantas
se efectuó de acuerdo con Rogers y Bendich (Plant. Mol. Biol.
(1985), 5, 69-76). Después de una
apropiadadisociación por restricción, se ensayaron de 10 a 20 \mug
del ADN por medio de borrones de transferencia Southern para la
integración de las secuencias de ADN que se tenían que
introducir.
La \beta-glucuronidasa es una
enzima bacteriana, que hidroliza a la
\beta-glucuronida y es accesible a determinaciones
de la actividad tanto cuantitativas como también histoquímicas. Las
mediciones de las actividades se llevaron a cabo por el método de
Jefferson y colaboradores (1987) EMBO J 6:3901- 3907. Muestras de
tejidos incubadas en 1 mM de X-Gluc, 50 mM de
fosfato de sodio de pH 7,0 y 0,1% de Tween 20 hasta dar la
intensidad deseada de la coloración azul.
Los siguientes Ejemplos ilustran la preparación
de la casete de expresión, cuya secuencia de ADN contiene una
secuencia reguladora para la expresión de genes específicos para
células guardas. Se ilustra también la introducción de la secuencia
en un plásmido, con el que es posible una transformación de células
de plantas así como la transformación de las células de plantas, la
regeneración de plantas transgénicas y la investigación de la
función de la casete de expresión en plantas transgénicas.
Clones de ADNc, que codifican la subunidad S de
la ADP glucosa pirofosforilasa de patata, se aislaron a partir de
la variedad de patata ``Desirée'' y se secuenciaron
(Müller-Röber y colaboradores (1990) Mol gene geneet
224:136-146; documento EP 455.316). Estos clones de
ADNc se usan para aislar un clon genómico y homólogo de la ADP
glucosa pirofosforilasa, procedente de la variedad de patata AM
80/5793 (Max-Planck-Institut for
Züchtungsforschung [Instituto Max Planck para Investigación de
Cultivos], Colonia).
Una biblioteca genómica del ADN nuclear
procedente de la variedad de patata AM 80/5793, que había sido
establecida en el vector EMBL 3 derivado de fagos Lambda, se sondeó
con la ayuda del ADNc S25-1 de la ADP glucosa
pirofosforilasa (véase el Ejemplo 1). Se obtuvieron varios clones
independientes, a partir de los cuales se usó el clon GS
6-11 para el tratamiento adicional. El mapa de
restricción del clon GS 6-11 se muestra en la Figura
1. Una parte del gen se secuenció y la secuencia se muestra en la
Figura 2.
La inserción por Sal I con un tamaño mayor que 12
kpb (kilo-pares de bases) del clon genómico GS
6-11 fue clonada en la posición de corte con Sal I
de los vectores pUC 19 y resultó el plásmido SF-6.
Un fragmento de HincII con una longitud de aproximadamente 5,3 kpb
del plásmido SF-6 fue sub-clonado en
la posición de corte con Hincll de los vectores pUC 19 y resultó el
plásmido pH6-1. El fragmento de Hincll/Bgl II con
una longitud de aproximadamente 3,2 kpb del plásmido
pH6-1, fue clonado después de haber rellenado la
posición de corte con Bgl II dentro de la posición de corte con
SmaI del vector pUC 19. De esta manera fue orientado el extremo 5'
para la posición de corte con EcoRI del polienlazador, de manera
tal que se obtuvo el plásmido pSA. Luego, el fragmento de
EcoRI/BamHI fue cortado a partir del pSA derivado de pUC 19, y
después de haber introducido por relleno la posición de corte con
EcoRI, fue dispuesto dentro del vector pBI101.1 (Jefferson y
colaboradores (1987) Plant Mol. Biol. Rep.
5:387-405) con lo cual se obtuvo el
pAS-GUS (véase la Figura 4). El vector pBI101.1 fue
cortado previamente con HindIII/BamHI y se introdujo por relleno la
posición de corte con HindIII. El vector pBI101.1 contiene la
región de codificación del gen de la
\beta-glucuronidasa como gen reportero. La
\beta-glucuronidasa es indicativa de una
determinación histológica de su actividad y por lo tanto se puede
introducir para el análisis de la especificidad para células de una
región reguladora de un sistema de expresión que se ha de ensayar.
En paralelo con la clonación de pAS-GUS, se preparó
el vector de expresión pAS, que contiene un polienlazador entre el
fragmento de promotor de la ADP glucosa pirofosforilasa y el
terminador del gen de la octopina sintasa (véase la Figura 3). Con
la ayuda de este plásmido es posible una expresión de genes
preferidos bajo el control de promotores de la ADP glucosa
pirofosforilasa.
La estructura artificial pAS-GUS,
con la región de codificación de la
\beta-glucuronidasa como gen reportero, se
transfirió dentro de la cepa LBA 4404 de Agrobacterias
(Bevan, M. (1984) Nucl. Acids Res. 12:8711-8721), y
las Agrobacterias que contienen el gen quimérico de la ADP
glucosa pirofosforilasa y de la
\beta-glucuronidasa se introducen para la
transformación de hojas de patata y de tabaco.
De diez transformantes independientes
resultantes, en los que se había demostrado la presencia del gen
quimérico de la ADP glucosa pirofosforilasa y de la
\beta-glucuronidasa, no acondicionado e intacto,
se ensayaron, con la ayuda de análisis por transferencia Southern,
hojas, tallos, tubérculos y raíces para determinar la actividad de
\beta-glucuronidasa. Los resultados se muestran en
la Figura 5. A partir de estos datos se muestra con claridad que el
fragmento de HincII del gen GS 6-11 de la ADP
glucosa pirofosforilasa, que se había fusionado con el gen de la
\beta-glucuronidasa, había inducido en la hoja
una actividad específica para células guardas de la
\beta-glucuronidasa. Esta actividad no se podría
observar en las células mesófilas y epidérmicas.
El fragmento de HindIII/BamHI con un tamaño de
0,35 kpb se aisló a partir del plásmido pSA descrito en el Ejemplo 3
y se introdujo en el vector pBI101.1 que había sido linealizado con
las enzimas de restricción BamHI y HindIII. El plásmido resultante
lleva la denominación pS1-D4GUS. La inserción por
HindIII/BamHI, con un tamaño de 0,35 kpb, del plásmido demuestra en
la Figura 2 así como en Seq ID No 1. El vector pBI101.1 contiene la
región de codificación del gen de la
\beta-glucuronidasa como gen reportero. La
\beta-glucuronidasa es indicativa de una
determinación histológica de su actividad y por lo tanto se puede
introducir para el análisis de la especificidad para células de
una región reguladora de un sistema de expresión que se ha de
ensayar. La estructura artificial pS1-D4GUS con la
región de codificación de \beta-glucuronidasa como
gen reportero, se transfirió dentro de la cepa LBA 4.404 de
Agrobacterias (Bevan, M. (1984) Nucl Acids Res
12:8711-8721) y las Agrobacterias,} que contienen el
gen quimérico de la ADP glucosa pirofosforilasa y de la
\beta-glucuronidasa, se introducen para la
transformación de hojas de patata y de tabaco.
De diez transformantes independientes
resultantes, en los que se había demostrado la presencia del gen
quimérico de la ADP glucosa pirofosforilasa y de la
\beta-glucuronidasa, intacto y sin redisponer, con
la ayuda de análisis por transferencia Southern, se ensayaron
hojas, tallos, tubérculos y raíces para determinar la actividad de
\beta-glucuronidasa. Se mostró que el fragmento de
promotor para HindIII/BamHI, con un tamaño de 0,35 kpb del gen de
la ADP glucosa pirofosforilasa, tiene una actividad comparable con
la del fragmento de promotor de EcoRI/BamHI del plásmido pSA (véase
la Figura 5) en las células de estomas de hojas, mientras que no se
observó actividad en tejidos vasculares, tubérculos y estolones de
plantas de patata y raíces.
Claims (20)
1. Una casete de expresión caracterizada porque
comprende una secuencia de ADN con una región iniciadora reguladora
de la transcripción, que asegura la expresión de genes específicos
para células guardas en las células guardas de hojas de plantas y
ninguna expresión en células mesófilas o células epidérmicas de las
hojas, que comprende la Seq ID No.1:
2. La casete de expresión de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizada porque contiene un fragmento
de promotor de HincII/BglIII con un tamaño de aproximadamente 3,2
kb del plásmido pAS (DSM 6906).
3. La casete de expresión de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque la secuencia de
ADN allí contenida, que está fusionada con apropiadas secuencias de
codificación de ADN, cambia las células guardas de plantas allí
existentes, de manera tal que se hacen posibles una apertura o un
cierre o bien un alargamiento o un acortamiento permanentes del
período de tiempo de apertura de estas células.
4. La casete de expresión de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1-3,
caracterizada porque comprende una secuencia de ADN, que
contiene la información acerca de la formación de productos
endógenos o de la formación de productos de expresión heterólogos en
plantas útiles, introducido detrás de la región de iniciadora
reguladora de la transcripción para una expresión de genes
específicos para células guardas.
5. Un plásmido que comprende la casete de
expresión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
4.
6. Un plásmido que comprende la secuencia de ADN
de Seq ID No.1.
7. El plásmido pAS (DSM 6906) de acuerdo con la
reivindicación 6, que consta de una secuencia de ADN con un tamaño
de aproximadamente 13,2 kb, en la que está contenido un gen de
resistencia a kanamicina con un tamaño de aproximadamente 2,0 kb, y
de un fragmento de promotor de HincII/BglII con un tamaño de
aproximadamente 3,2 kb de la zona de iniciación de la regulación del
gen de la ADP glucosa pirofosforilasa GS6-11 de
Solanum tuberosum, de un polienlazador y del terminador de
la transcripción del gen de la nopalina sintasa.
8. El plásmido pAS-GUS (DSM 6907)
de acuerdo con la reivindicación 6, que consta de una secuencia de
ADN con un tamaño de aproximadamente 15,2 kb, en la que está
contenido un gen de resistencia a kanamicina con un tamaño de
aproximadamente 2,0 kb, de un fragmento de promotor de HincII/BglIII
con un tamaño de aproximadamente 3,2 kb de la zona de iniciación de
la regulación del gen de la ADP glucosa pirofosforilasa
GS6-11 procedente de Solanum tuberosum, de la
región codificadora de \beta-glucuronidasa con un
tamaño de aproximadamente 2 kb, y del terminador de la
transcripción del gen de la nopalina-sintasa.
9. Un procedimiento para la manipulación genética
de una célula de plantas, que comprende la operación de introducir
una casete de expresión de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4 dentro de una célula de planta.
10. Una célula de planta preparada de acuerdo con
el procedimiento de la reivindicación 9, que contiene una casete de
expresión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
4.
11. Una planta o un tejido de planta que se ha
regenerado a partir de una célula de planta de acuerdo con la
reivindicación 10.
12. Uso de la casete de expresión de acuerdo con
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para la expresión de
genes en células guardas que cambian la regulación del intercambio
gaseoso y de la transpiración.
13. Uso de la casete de expresión de acuerdo con
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para la expresión de
genes homólogos o heterólogos en células guardas de plantas
transformadas.
14. Uso de la casete de expresión de acuerdo con
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para la expresión de
genes en células guardas que causan un cambio local del nivel de
fitohormonas.
15. Uso del plásmido pAS (DSM 6906) o
pAS-GUS (DSM 6907) para la transformación de plantas
útiles.
16. Uso del plásmido pAS (DSM 6906) o
pAS-GUS (DSM 6907) para la regulación de la
expresión de genes específicos para células guardas, o para la
preparación de productos heterogéneos en plantas útiles.
17. Una planta de acuerdo con la reivindicación
11, caracterizada porque es una planta de tabaco.
18. Una planta de acuerdo con la reivindicación
11, caracterizada porque es una planta de patata.
19. Una planta de acuerdo con la reivindicación
11, caracterizada porque es una planta de tomate.
20. Una planta de acuerdo con la reivindicación
11, caracterizada porque es una planta de remolacha
azucarera.
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