DE4244437A1 - Verfahren zur Gewinnung körpereigener Zytokine - Google Patents

Description

¹) Überstand: Die Schicht der über den Zellen, die auf den Boden des Kulturgefäßes herabsinken, befindlichen Nährlösung.

Zytokine sind Botenstoffe, die Signale zwischen immunkompetenten Zellen übertragen und die Empfängerzelle entweder zur Übernahme bestimmter Funktion veranlassen und/oder zur Teilung anregen. Das vermehrte Wachstum bestimmter immunkompetenter Zelltypen im Blut darf als die wesentlichste Aufgabe der Zytokine betrachtet werden. Es gibt heutzutage nur einen Weg, Zytokine zu einem vertretbaren Marktpreis in größeren Mengen herzustellen: die Gentechnologie. Trotz inzwischen ausgereifter Technologie und Massenproduktion ist jedoch das Verfahren so aufwendig, daß die Zytokine derzeit noch zu den teuersten Medikamenten überhaupt auf dem Markt gehören. Obwohl in ihrer Struktur bekannt und im wesentlichen rein darstellbar, ist die Anwendung der Zytokine doch noch mit erheblichen Nebenwirkungen behaftet. Die Verabreichung gentechnologisch gewonnener Zytokine zeigt außerdem, daß bei aller Reinheit der Darstellung offenbar Fremdreaktionen doch nicht zu vermeiden sind, wie die teilweise starke Nebenwirkungsrate einschlägiger Präparate auf dem Markt belegt. Es haftet ihnen darüberhinaus ein prinzipieller Nachteil an: Da sie meist einen Zelltyp oder eine Gruppe als Zielzellen haben und das übrige Zusammenspiel des Immunsystems unberücksichtigt lassen, ist die Wirksamkeit gentechnologisch gewonnener und einzelverabreichter Zytokine unphysiologisch. Das eigene Verfahren bietet dem gegenüber die Möglichkeit körpereigene homologe Zytokine zu gewinnen, die - aufgrund ihrer Herkunft - dem eigenen Organismus erneut einverleibt, wesentlich besser verträglich sind und da sie im körpereigenen Medium belassen werden, den oben geschilderten Nachteil der unphysiologischen Wirkung auch nicht aufweisen. Die Möglichkeit immunmodulatorische Substanzen zu gewinnen , wurde erstmals in EP Nr. 0265 548 B1 aufgezeigt. Dort werden nach Desaggregation, durch Ozonolyse und Proteolyse aus einzelnen Blutfraktionen, aber auch aus Urin Lysate gewonnen, deren klinische Wirksamkeit bei Autoimmunerkrankungen zwischenzeitlich unbestritten ist. In diesem Patent wird bereits die Beaufschlagung von Zellkulturen durch Ozonbegasung und daraus zu gewinnende Lysate zur Immunmodulation beschrieben. Die Gewinnung von Gammainterferon aus Leukozytenkulturen, die mit Ozon begast wurden, ist zwischenzeitlich von Bocci 1990 nachgewiesen worden. Bocci konnte auch zeigen, daß die eigenen Angaben (Kief) bezüglich Konzentration des O₂O₃-Gemisches eine optimale Ausbeute von Gammainterferon aus Leukozytenkulturen gewährleistete. Wie man aus dieser Arbeit ersehen kann, ist die maximale Ausbeute bei diesem Vorgehen etwa 140 Picogramm pro ml. Nimmt man jedoch keine reine Leukozytenkultur sondern Vollblut oder andere Fraktionen, beispielsweise Leukozyten u. Lymphozyten zusammen für eine Kurzzeitkultur, lassen sich gemäß EP.Nr. 0 265 548 B1 auch andere Zytokine gewinnen, beispielsweise Interleukin 2, das im Überstand¹) einer derartigen Kultur verarbeitet nach diesem Verfahren, 40fach über den Ausgangswerten liegt.

Bei dem neuen vorzuschlagenden Verfahren können jedoch sowohl wesentlich höhere Ausbeuten erzeugt werden als auch unterschiedliche Zytokingemische gewonnen werden, wie weiter unten beschrieben.

Das Verfahren wird nachfolgend beschrieben:

Es basiert grundsätzlich auf der Anwendung von EP Nr. 0 265 548 B1. Sein Vorzug besteht darin, die gemäß EP Nr. 0 265 548 B1 gewonnenen Lysate zur Mitoseanregung bei Leukozyten- und Lymphozytenkulturen einzusetzen. Dabei kann, je nach Auswahl der zu gewinnenden Lysate aus Serum, Leukozyten, Lymphozyten oder Erythrozyten ein unterschiedliches Spektrum an Zytokinen gewonnen werden. Der prinzipielle Ablauf des Verfahrens zur Gewinnung körpereigener Zytokine ist folgender:

Zunächst wird Vollblut ozonisiert und bebrütet. Danach werden Leukozyten durch Gewinnung des Buffycoats oder Lymphozyten über Trennmittel und Zonenzentrifugation gewonnen. Diese Populationen haben bereits eine Selektion durch die Anreicherung von Sauerstoffradikalen im Vollblut erfahren, da man davon ausgehen muß, daß radikalempfindliche Zellen unter dieser Behandlung zugrunde gehen und nur die resistenten Zellen überleben. Diese überlebenden Zellen werden sodann in üblicher Weise kultiviert und als Stimulantien Lysate gemäß EP Nr. 0 265 548 B1 hinzugegeben. Diese Lysate können gewonnen werden beispielsweise nur aus Erythrozyten, Granulozyten oder Lymphozyten oder auch aus Serum des Patienten.

Wesentlicher Vorteil dieses Verfahrens ist die ausschließliche Verwendung körpereigenen Materials. Dies wird sehr deutlich beim Vergleich mit den üblichen Nährlösungen, die bei Flüssigzellkulturen Verwendung finden und die praktisch immer Kälberserum enthalten. Das eigene Verfahren schließt eine Sensibilisierung gegen Tiereiweiß von vorneherein aus.

Je nach Wahl des Ausgangsmaterials lassen sich unterschiedliche Zytokingemische anregen. Bei Verwendung eines Lysats aus Serum gemäß EP Nr. 0 265 548 B1 beispielsweise ein besonderer Reichtum an Gammainterferon und Interleukin 2. Die Zellkulturen werden hernach gemäß bereits in EP Nr. 0 265 548 B1 beschriebener Weise lysiert und als injizierbare Lösung gemäß arzneimittelrechtlichen Vorschriften aufgearbeitet. Derartig gewonnene Lysate regen im Organismus selbst in Verdünnungen von 1 : 1 000 000 und in Mengen von 0,1 ml subcutan verabreicht noch eine körpereigene Produktion von Gammainterferonen an, die in einem ersten Screening 7fach über den Ausgangswerten lagen. Interleukin 2-Spiegel wurden 6fach im Durchschnitt über der Norm gemessen. Eine weitere Steigerung ist dadurch möglich, daß nach derartiger Anregung erneut Blut zu einer Kultur gewonnen wird, das mit derartig gewonnenen Lysaten erneut beaufschlagt wird, so daß man von einer Kulturkaskade sprechen kann mit noch höherem Zytokinspiegel. Der Einsatz, der nach EP Nr. 0 265 548 B1 gewonnenen Lysate als Stimulans für körpereigene Blutkulturen führt jedoch nicht nur zum Gewinn spezifischer Zytokine je nach Auswahl von Lysat und Kulturzelle, sondern auch zum vermehrten Ansprossen von Makrophagen und Killerzellen, die für den besonderen Einsatz bei malignen Erkrankungen geeignet sind.

Gewinnt man Makrophagen, die nach EP Nr. 0 265 548 B1 aufbereitet wurden und setzt sie einer derartig vorbereiteten Kultur als Antigen zu, kann die Ausbeute an den Interleukinen 3, 4, 5 und 6 wesentlich erhöht werden bei einer zahlenmäßig deutlich erhöhten Anzucht an Eosinophilen. Im Gegensatz dazu können die löslichen IL-2-Rezeptoren beim erstgeschilderten Verfahren um das zwei- bis dreifache reduziert werden, ein wesentliches Kriterium bei der Behandlung von Autoimmunerkrankungen.

Es ist leicht einsehbar, daß derartig gewonnene körpereigene Zytokine wesentlich billiger herzustellen sind, bei dem eingangs bereits beschriebenen Vorzug, den körpereigene Substanzen aufgrund ihrer Verträglichkeit grundsätzlich aufweisen. Dabei ist es nicht einmal notwendig, die Zytokine rein darzustellen, da gerade das Zusammenspiel von Zytokingemischen, körpereigenen Proteinen des Kulturmediums, Zellnukleotiden und Plasmaanteil offenbar einen stärkeren immunmodulatorischen Effekt ausüben, als das Zytokin für sich allein.

Claims (5)

1. Verfahren zur Gewinnung von Zytokinen und zur Anzucht körpereigener Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß eine Kultur aus dem Eigenblut des Patienten mit einem Ozon-Sauerstoff-Gemisch begast wird, Überstand, Serum oder Zellen dieser Kultur gewonnen und gemäß EP. Nr. 0 265 548 B1 zu einem makromolekularen Proteingemisch verarbeitet werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß diese Proteingemische als mitogene Stimulantien für eine zweite Kultur aus Eigenblut gleicher Herkunft dienen.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß diese Kultur als Vollblutkultur, Leukozytenkultur, Lymphozytenkultur oder einer Mischkultur angelegt ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß der Überstand mit dem darin enthaltenen Zytokingemisch als Medikament zum Einsatz bei dem gleichen Patienten dient.

5. Verfahren nach Anspruch 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen aus derartig stimulierten Kulturen selektiert und lysiert werden als reinjizierbare Medikamente.