DE69029657T2

DE69029657T2 - Menschliches cytokin, interleukin-9

Info

Publication number: DE69029657T2
Application number: DE69029657T
Authority: DE
Inventors: Agnes B. Haverhill Ma 01832 Ciarletta; Steven C. Clark; Robert E. Shirley Ma 01464 Donahue; Susan T. Ricciardi; Yu-Chung Yang
Original assignee: Ludwig Cancer Research
Current assignee: Ludwig Cancer Research
Priority date: 1989-05-23
Filing date: 1990-05-18
Publication date: 1997-08-07
Anticipated expiration: 2010-05-19
Also published as: US5580753A; ES2099096T3; DE69029657D1; AU5928990A; CA2056997C; JPH04506006A; ATE147436T1; EP0473724A1; DK0473724T3; EP0473724B1; JP2914393B2; AU637620B2; WO1990014432A1; US5734037A; CA2056997A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Cytokin, das die Hämatopoese und insbesondere die Vorläufer-Erythrocyten-Kolonieentwicklung im hämatopoetischen System stimulieren kann und bei der Stimulierung der Immunantwort wirksam ist, und Verfahren zur Herstellung des gereinigten Faktors durch rekombinante gentechnische Verfahren.

Hintergrund der Erfindung

Eine immer größer werdende Familie von regulatorischen Proteinen wurde identifiziert, die Signale zwischen Zellen des hämatopoetischen Systems und des Immunsystems vermitteln. Dieses regulatorischen Moleküle sind als Cytokine bekannt. Es wurde festgestellt, daß viele der Cytokine das Wachstum, die Entwicklung und die biologischen Aktivitäten der Zellen des hämatopoetischen Systems und des Immunsystems regulieren. Diese regulatorischen Moleküle umfassen alle Kolonie-stimulierenden Faktoren (GM-CSF, G-CSF, M-CSF und Multi-CSF oder Interleukin-3), die Interleukine (IL-1 bis IL-10), die Interferone (α, β und γ), die Tumomekrosefaktoren (α und β), Erythropoietin und den Leukämie-inhibierender Faktor (LIF). Diese Cytokine zeigen einen großen Bereich biologischer Aktivitäten mit Zielzellen aus dem Knochenmark, dem peripheren Blut, der fötalen Leber und anderen lymphoiden oder hämatopoetischen Organen. Vgl. z.B. Wong G. und Clark S., Immunology Today 9(5) (1988), 137.
Die biochemische und biologische Identifizierung und Charakterisierung bestimmter Cytokine wurde durch die kleinen Mengen der natürlich vorkommenden Faktoren erschwert, die aus natürlichen Quellen, z.B. Blut und Urin, verfügbar sind. Viele der Cytokine wurden in letzter Zeit molekular doniert, heterolog exprimiert und bis zur Homogenität gereinigt (Metcalf D. "The Molecular Biology and Functions of the Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factors", Blood 67(2) (1986), 257-267). Unter diesen Cytokinen befinden sich γ-Interferon. menschliches und murines GM-CSF, menschliches G-CSF menschliches CSF-1 und menschliches und murines IL-3. Es wurde festgestellt, daß mehrere dieser gereinigten Faktoren regulatorische Wirkungen auf das härnatopoetische System und das Immunsystem in vivo zeigen, einschließlich GM-CSF, MIP, M-CSF, G-CSF, IL-3, IL-2, IL-1, IL-7, IL-6, LIF: TNF, γ-Interferon und Erythropoietin.
Vor kurzem wurde von Van Snick J. et al., J. Exp. Med. 169 (1989), 363-368, über einen neuen als P40 bezeichneten murinen T-Zell-Wachstumsfaktor berichtet. Der gleiche Faktor wird auch in der EP-A-0 361 284 offenbart, ein unter Art. 54(3) EPC zitierbares Dokument.
Die Erzeugung von Erythrocyten aus Knochenmarks- oder peripheren Blut-Vorläuferzellen ist ein komplexer Prozeß, der in Kultur durch mehrere verschiedene hämatopoetische Wachstumsfaktoren unterstützt wird. Erythropoietin (Epo), der primäre Regulator der in vivo im Blutkreislauf befindlichen Erythrocytenmengen, ist in der Kultur zur Förderung der letzten Stadien der Erythrocytenentwicklung, einschließlich der Hämoglobinisierung, unbedingt erforderlich. Das Wachstum und die Entwicklung von frühen erythroiden Vorläufern, bekannt als erythroide Burst-bildende Einheiten ("erythroid burst forming units" (BFU-E)), kann durch mehrere verschiedene Cytokine unterstützt werden, umfassend Interleukin-3 (IL-3), den Granulocyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF) und zumindest im Maussystem IL-4 (vgl. Donahue R. et al., Blood 66 (1985), 1479; Sieff C. et al., Science 230 (1985), 1171; Yang Y. et al., Cell 47 (1986), 3; Emerson S. et al., J. Clin. Invest. 82 (1988), 1282: Emerson S. et al., Blood 74 (1989), 49; Rennick D., Proc. Natl. Acad. Sci. 84 (1987) 6889 ; und Rennick D., Blood 73 (1989), 1828 [Rennick II]). Jedoch tritt jedes dieser Cytokine mit mehreren Zellinien verschiedener hämatopoetischer Abstammung in Wechselwirkung und keines von ihnen ist in bezug auf die Unterstützung der Erythropoese spezifisch.
Auf dem Fachgebiet besteht weiterhin ein Bedarf für zusätzliche aus ihren natürlichen Quellen gereinigte oder anders in gereinigter Form hergestellte Proteine, die die Hämatopoese, insbesondere die Erythrocytenentwicklung, stimulieren oder die Immunempfänglichkeit steigern können und für die pharmazeutische Anwendung geeignet sind.

Kurze Zusammenfassung der Erfindung

Gemäß einem Gesichtspunkt stellt die vorliegende Erfindung eine DNA-Sequenz bereit, die ein Protein mit der Aktivität von menschlichem IL-9 codiert, ausgewählt aus:
(a) einer DNA-Sequenz. die die DNA-Sequenz aus Tabelle 1 enthält;
(b) der DNA-Sequenz aus Tabelle I, die das IL-9-Protein zusammen mit seiner sekretorischen Leäder-Sequenz codiert;
(c) der DNA-Sequenz aus Tabelle I, die das IL-9-Protein codiert;
(d) einer DNA-Sequenz, die sich in ihrer Codonsequenz von den DNA-Sequenzen nach (a), (b) oder (c) aufgrund der Degenerationen des genetischen Codes unterscheidet:
(e) einer DNA-Sequenz, die unter stringenten Bedingungen mit einer DNA-Sequenz nach (a), (b), (c) oder (d) hybridisiert; und
(f) einer allelischen Variante oder einem Derivat oder einem Fragment der DNA-Sequenz nach (a) oder (b).
Ein anderer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt umfaßt eine RNA-Sequenz, wie in Anspruch 3 definiert.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt betrifft ein Protein mit der Aktivität von menschlichem IL-9, wie in Anspruch 9 definiert.
IL-9 ist ferner durch ein apparentes Molekulargewicht zwischen etwa 20 bis 30 kD gekennzeichnet, bestimmt unter reduzierenden Bedingungen durch Natriumdodecylsulfatpolyacrylamid-Gelelektrophorese. Der erfindungsgemäße IL-9-Faktor zeigte im M07E-Test eine biologische Aktivität, was auf seine Beteiligung bei der Regulierung der Hämatopoese hinweist. IL-9 zeigt in Verbindung mit Epo ebenfalls eine biologische Aktivität bei der selektiven Unterstützung der Vermehrung von erythroiden Vorläuferzellen, wenn es in donalen Kultursystemen mit entweder peripheren Blut-, Nabelschnurblut- oder Knochenmarks- Zielzellen getestet wird. Folglich ist IL-9 ein Cytokin mit dem Potential, als Regulator sowohl im lymphoiden als auch im hämatopoetischen System zu dienen. IL-9 unterstützt vorzugsweise die Entwicklung einer relativ frühen BFU-E-Population. Zusätzlich unterstützt IL-9 allein das Wachstum einiger Mischkolonien. Die Antwort auf IL-9 in diesen Kulturen weist auf seine Rolle bei der Stimulierung einer frühen Vorläuferzellpopulation vor der Festlegung der erythroiden Bindung hin. Diese IL-9-Antwort wird zumindest während den frühen Stadien der Erythrocytenentwicklung selektiv beibehalten.
Durch die vorliegende Erfindung werden auch Vektoren bereitgestellt, die eine IL-9 codierende DNA-Sequenz in funktioneller Verknüpfung mit einer Expressions-Kontrollsequenz enthalten. Erfindungsgemäß werden auch Wirtszellen bereitgestellt, die mit solchen Vektoren zur Verwendung bei der Herstellung von rekombinantem IL-9 transformiert wurden.
Die erfindungsgemaßen Vektoren und transformierten Zellen werden gemäß einem anderen Gesichtspunkt in einem neuen Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten menschlichen IL-9-Polypeptids verwendet. Bei diesem Verfahren wird eine Zellinie mit einer IL-9 codierenden DNA-Sequenz transformiert. Die IL-9-DNA-Sequenz ist mit einer Expressions-Kontrollsequenz in der Zelle fünktionell verknüpft. Die transformierte Zelle wird dann gezüchtet. Bei diesem beanspruchten Verfahren kann eine Anzahl von bekannten Zellen als Wirtszellen zur Expression des Polypeptids verwendet werden. Gegenwärtig bevorzugte Zelllinien umfassen Säuger-Zellinien und Bakterienzellen.
Ein andere Gesichtspunkt dieser Erfindung sieht Arzneimittel vor, die eine therapeutisch wirksame. Menge an IL-9 oder einem Fragment davon enthalten. Diese Arzneimittel können bei Verfahren zur Behandlung von Erkrankungszuständen oder Störungen eingesetzt werden, die durch Erythrocytenmangel gekennzeichnet sind. Zusätzlich kann dieser Faktor als allgemeines das Immunsystem stimulierendes Mittel, z.B. zur Unterstützung bei T-Zellmangel, verwendet werden.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt betrifft gegen IL-9 gerichtete Antikörper. Diese Antikörper werden durch die Verwendung von IL-9 oder eines Fragments davon als Immunogen in herkömmlichen Verfahren zur Herstellung von monodonalen Antikörpern erzeugt. Folglich können anti-IL-9-Antikörper als diagnostische oder therapeutische Mittel verwendet werden.
Andere Gesichtspunkte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden unter Berücksichtigung der folgenden ausführlichen Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen davon deutlich.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt ein biologisch aktives menschliches Lympkokin bereit (IL-9), das im wesentlichen frei ist von anderen proteinähnlichen Säugermaterialien. Dieses Protein kann in vielfältiger Weise hergestellt werden, einschließlich durch gentechnische DNA-Verfahren. um die großtechnische Herstellung von reinem, aktivem IL-9 zu ermöglichen, das für therapeutische Anwendungen nützlich ist.
Das vollständige menschliche IL-9 dieser Erfindung ist durch die gleiche oder im wesentlichen die gleiche etwa 144 Aminosäuren umfassende Proteinsequenz gekennzeichnet, wie nachstehend in Tabelle I veranschaulicht. Rekombinantes menschliches IL-9 dieser Erfindung, wie es in Säugerzellen exprimiert wird, ist auch durch ein unter reduzierenden Bedingungen durch Natriumdodecylsulfatpolyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) bestimmtes apparentes Molekulargewicht zwischen 20 bis 30 kD gekennzeichnet. Diese Größenheterogenität ist ein gemeinsames Merkmal vieler Glycoproteine, das aus Variationen im Umfang der Kohlehydratmodifikation resultiert.
Die DNA-Sequenz aus Tabelle 1 enthält etwa 630 Nudeotide, wobei etwa 450 Nucleotide im richtigen Leseralunen für das Protein vorliegen. IL-9 wurde ursprünglich aus einer cDNA-Bank doniert, die aus mRNA der bei Leary A.G. et al., Blood 69(3) (1987), 953- 956, beschriebenen menschlichen T-Lymphoblasten-Zellinie C5MJ2 gemäß dem Expressions-Clonierungsverfahren hergestellt wurde. IL-9 kann auch von anderen menschlichen Zellinien produziert werden.
Das Expressions-Clonierungsverfahren wurde schon beschrieben bei Wong G.G. et al., Science 228 (1985), 810-815; Yang Y.C. et al., Cell 47 (1986), 3-10; und Namen A.E. et al., Nature 333 (1988), 571-573. Kurz zusammengefaßt wurde die Bank gemäß dem Expressions-Clonierungsverfahren in dem Expressionsvektor pXM konstruiert, der die Expression von cDNA-Insertionen in Säugerzellen, z.B. COS-1-Zellen, erlaubt. Das Durchmustern der Bank erfolgte durch die Transfektion von COS- 1-Zellen mit Pools von cDNA-Clonen. Durch das Analysieren des Überstands auf IL-9-Aktivität wurden cDNA-Clone identifiziert, die eine IL-9-Aktivität zeigen.
mRNA aus mehreren Zellquellen wurde auf ihre Fähigkeit untersucht, mit einem ausgewählten IL-9-cDNA-Clon zu hybridisieren. Eine Northern-Blot-Analyse zeigte, daß die T-Zellinien C5MJ2 und C10MJ2 sowie Lectin-stimulierte menschliche Lymphocyten aus peripherem Blut (PBL) leicht nachweisbare Mengen von mRNA synthetisierten, die mit dem IL-9-Clon hybridisierte.
Ein aus einer Bank von 250 000 Clonen isolierter positiver Clon wurde sequenziert. Die IL-9-cDNA-Sequenz aus diesem Clon wird zusammen mit der dadurch codierten etwa 144 Aminosäure langen Sequenz nachstehend in Tabelle I gezeigt. Tabelle 1
Die cDNA-Sequenz aus Tabelle 1 enthält einen langen offenen Leserahmen aus 432 Nucleotiden, der mit einem ATG-Codon bei den Nudeotiden 17-19 beginnt. An das ATG- Codon schließen sich 143 Codons und ein TGA-Terminationstriplett bei den Nucleotiden 449-451 an. Die 432 Nucleotide codieren ein aus 144 Aminosäuren bestehendes Polypeptid mit einer berechneten Niolekülmasse von 16 000.
Entsprechend vielen sezemierten Proteinen enthält die DNA-Sequenz aus Tabelle I für IL-9 am N-Terminus einen Bereich aus hydrophoben Aminosäuren, der herkömmlichen sekretorischen Leader-Sequenzen ähnlich ist (Periman D. et al., J. Mol. Biol. 167 (1983), 391-409). Diese sehr hydrophobe Sequenz ist für ein protein-Signalpeptid charakteristisch und sie legt nahe, daß der Mechanismus der IL-9-Sekretion demjenigen typischer sekretorischer Proteine entspricht.
Die cDNA-Sequenz für IL-9 codiert auch drei potentielle Asparagin-gebundene Glycosylierungsstellen an den Aminosäuren 50-52 (Asn-Val-Thr); 63-65 (Asn-Cys-Thr); und 78-80 (Asn-Thr-Thr) [vgl. z.B. Winzler R.J., "The Chemistry of Glycoproteins in Hormonal Proteins and Peptides", Bd. 1(1973), Seite 1, Li C.H. (Hrsg.), Academic Press, New York]. Die IL-9-DNA-Sequenz codiert 11 Cysteinreste, die sich an den Aminosäurepositionen 14, 21, 45, 47, 54, 56, 64, 68, 104, 109 und 113 befinden.
Die Nucleotidsequenz dieser erfindungsgemäßen IL-9-cDNA wurde mit den in "Genbank" registrierten Nucleotidsequenzen verglichen. Der einzige Faktor, mit dem IL-9 anscheinend eine signifikante Sequenzübereinstimmung aufweist, ist der Maus-Faktor P40 (vgl. Van Snick et al., vorstehend angeführt). Folglich unterscheidet sich der erfindungsgemäße menschliche IL-9-Faktor immunologisch von anderen bekannten menschlichen Faktoren und Proteinen. Der IL-9-Faktor kann sich auch ausreichend vom Maus-Faktor P40 unterscheiden, so daß er immunologisch verschieden davon ist.
Die erfindungsgemäßen cDNA-Sequenzen codieren aufgrund des Nachweises der von Säugerzellen produzierten funktionellen Polypeptide biologisch aktives menschliches IL-9. Eine in das Plasmid pC5.22-3 donierte Sequenz wurde bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, am 23. Mai 1989 unter der ATCC- Hinterlegungsnummer 67988 hinterlegt. Diese Hinterlegung erfolgte gemäß den Bedingungen des Budapester Vertrags über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren und den Vorschrifien davon (Budapester Vertrag).
Den vorstehend beschriebenen IL-9-Faktor codierende allele Variationen der DNA- Sequenz aus Tabelle I sind ebenfalls in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen sowie Analoge oder Derivate davon. Folglich umfaßt die vorliegende Erfindung auch diese neuen DNA-Sequenzen, die nicht mit andere Primatenproteine codierenden DNA-Sequenzen assoziiert sind und die Expression für IL-9-Polypeptide codieren. Diese DNA-Sequenzen umfassen diejenigen Sequenzen, die unter stringenten Hybridisierungsbedingungen (vgl. Maniatis T. et al., Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory (1982), 387-389) mit der DNA-Sequenz aus Tabelle I hybridisieren. Ein Beispiel einer solchen stringenten Hybridisierungsbedingung ist die Hybridisierung in 4x SSC bei 65ºC, gefölgt von einem Waschschritt in 0,1x SSC bei 65ºC während 30 Minuten. In einer anderen Ausführungsform ist eine exemplarische stringente Hybridisierungsbedingung die Ausführung in 50% Formamid und 4x SSC bei 42ºC.
Andere DNA-Sequenzen als die des Maus-Faktors P40, die mit der Sequenz für IL-9 unter erleichterten Hybridisierungsbedingungen hybridisieren und die Expression für IL-9-Peptide mit biologischen Eigenschafien von IL-9 codieren codieren auch neue IL-9- Polypeptide. Beispiele solcher nicht-stringenten Hybridisierungsbedingungen sind 4x SSC bei 50ºC oder die Hybridisierung mit 30-40% Formamid bei 42ºC. Zum Beispiel codiert eine DNA-Sequenz. die Bereiche signifikanter Homologie, z.B. Glycosylierungsstellen oder Disulfidbrücken, mit den Sequenzen von IL-9 gemeinsam hat und ein Protein mit einer oder mehreren biologischen Eigenschaften von IL-9 codiert, offensichtlich ein IL-9-Polypeptid, auch wenn eine solche DNA-Sequenz mit der IL-9-Sequenz aus Tabelle I nicht stringent hybridisieren würde.
Entsprechend sind DNA-Sequenzen, die IL-9-Polypeptide codieren, sich jedoch aufgrund der Degenerationen des genetischen Codes unterscheiden, oder allele Variationen (natürlich vorkommende Basenaustausche in der Population einer Art, die zu einem Aminosäureaustausch führen können oder nicht) ebenfalls in dieser Erfindung eingeschlossen. Variationen in der DNA-Sequenz von IL-9, die durch Punktmutationen oder durch induzierte Modifikationen zur Steigerung der Aktivität, Halbwertszeit oder Produktion der dadurch codierten Polypeptide verursacht wurden, sind ebenfalls in der Erfindung eingeschlossen.
IL-9-Polypeptide können auch durch ein bekanntes herkömmliches chemisches Syntheseverfahren hergestellt werden. Verfahren zur Konstruktion der erfindungsgemäßen Polypeptide durch synthetische Mittel sind dem Fachmann bekannt. Die synthetisch konstruierten IL-9-Polypeptidsequenzen können aufgrund mit IL-9-Polypeptiden gemeinsamen Primär-, Sekundär- oder Tertiärstruktur- und Konformationseigenschaften biologische Eigenschaften von IL-9 gemeinsam haben. Folglich können sie als biologischer Wirkstoff oder immunologische Ersatzstoffe für natürliche gereinigte IL-9-Polypeptide in therapeutischen und immunologischen Verfahren verwendet werden.
Die hier bereitgestellten IL-9-Polypeptide umfassen auch Faktoren, die von Sequenzen codiert werden, welche jenen von gereinigtem rekombinantem IL-9 entsprechen, worin jedoch Modifikationen natürlich bereitgestellt oder eigens eingebaut wurden.
Modifikationen in den Peptid- oder DNA-Sequenzen können vom Fachmann unter Anwendung bekannter Verfahren eingeführt werden. Modifikationen von Interesse in den IL-9-Sequenzen können den Austausch, die Insertion oder Deletion eines ausgewählten Aminosäurerestes in der codierenden Sequenz umfassen. Zum Beispiel können ein oder mehrere der Cvsteinreste deletiert oder durch eine andere Aminosäure ersetzt werden, um die Konformation des Nloleküls zu verändern. Mutageneseverfahren für eine(n) solche(n) Austausch, Insertion oder Deletion sind dem Fachmann gut bekannt (vgl. z.B. das US-Patent 4,518,584).
Andere spezifische Mutationen der Sequenz des hier beschriebenen IL-9-Polypeptids können Modifikationen einer Glycosylierungsstelle umfassen. Das Fehlen der Glycosylierung oder eine nur teilweise Glycosylierung ergibt sich aus einer Aminosäuresubstitution oder -deletion an einer beliebigen Asparagin-gebundenen Glycosylierungserkennungsstelle oder an einer Stelle des Moleküls, die durch die Addition eines O-gebundenen Kohlehydrats modifiziert wird. Eine Asparagin-gebundene Glycosylierungserkennungsstelle umfaßt eine Tripeptid-Sequenz, die von geeigneten zellulärem Glycosylierungsenzymen spezifisch erkannt wird. Diese Tripeptid-Sequenzen umfassen entweder Asparagin-X-Threonin oder Asparagin-X-Serin, wobei X üblicherweise eine beliebige Aminosäure ist. Eine Vielzahl von Aminosäuresubstitutionen oder -deletionen an einer oder beiden der ersten oder dritten Aminosäurepositionen einer Glycosylierungserkennungsstelle (und/oder eine Aminosäuredeletion an der zweiten Position) führt dazu, daß die modifizierte Tripeptid-Sequenz nicht glycosyliert wird. Eine Expression von derartig veränderten Nucleotidsequenzen ergibt Varianten, die an dieser Stelle nicht glycosyliert sind.
Andere Analoge und Derivate der Sequenz von IL-9, von denen erwartet wird, daß sie ihre IL-9-Aktivität vollständig oder teilweise beibehalten, können unter Zugrundelegung der hier angeführten Offenlegungen vom Fachmann ebenfalls leicht hergestellt werden. Eine solche Modifikation kann die Anlagerung von Polyethylenglykol (PEG) an vorhandene Lysinreste oder die Insertion von Lysinresten in die Sequenz zur Anlagerung von PEG-Einheiten sein. Solche Modifikationen sind in dieser Erfindung eingeschlossen.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung von IL-9-Polypeptiden bereit. Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt das Züchten einer geeigneten Zelle oder Zellinie, die mit einer die Expression für ein IL-9-Polypeptid codierenden DNA-Sequenz oder einem aktiven Fragment davon unter der Kontrolle bekannter regulatorischer Sequenzen transformiert wurde. Regulatorische Sequenzen umfassen Promotorfragmente, Terminatorfragmente und andere geeignete Sequenzen, die die Expression des Proteins in einer geeigneten Wirtszelle regulieren. Geeignete Zellen oder Zellinien können Säugerzellen sein, wie Ovarzellen des Chinesischen Hamsters (CHO) oder 3T3-Zellen. Die Auswahl geeigneter Säugerwirtszellen und Verfahren zur Transformation, Züchtung, Amplifizierung, Durchmusterung und Produktherstellung und -reinigung sind auf dem Fachgebiet bekannt. Vgl. z.B. Gething und Sambrook, Nature 293 (1981), 620-625; oder alternativ Kaufman et al., Mol. Cell Biol. 5(7) (1985), 1750-1759; oder Howley et al., US-Patent 4,419,446. Andere geeignete Säuger-Zellinien sind die COS-1-Affen-Zellinie und die CV-1-Zellinie. Säugerzellen werden gegenwärtig zur Expression des IL-9-Faktors aufgrund der Anzahl der Cysteinreste bevorzugt, die auf einen gegebenenfalls hohen Faltungsgrad dieses Moleküls hinweisen.
Bakterienzellen sind ebenfalls als Wirtszellen für die vorliegende Erfindung geeignet, mit der Maßgabe, daß das darin produzierte Molekül seine Aktivität in einem nicht gefalteten oder nur teilweise oder anders gefalteten Zustand beibehält, der auf die aus der Expression des Faktors in Säugerzellen im Vergleich zu Bakterienzellen resultierenden Unterschiede in bezug auf die Glycosylierung zurückzuführen ist. In einer anderen Ausführungsform kann das vollständig denaturierte IL-9-Protein gefaltet und zur Erzeugung von gefalteten IL-9- Molekülen, die dem nativen Molekül ausreichend ähnlich sind, so daß sie die biologische Aktivität des nativen Proteins beibehalten oder nachahmen, einer Oxidation unterzogen werden. Die verschiedenen Stämme von E. coli (z.B. HB101, MC1061 und in den folgenden Beispielen verwendete Stämme) sind zum Beispiel auf dem Gebiet der Biotechnologie als Wirtszellen gut bekannt. Bei diesem Verfahren können auch verschiedene Stämme von B. subtilis, Pseudomonas, andere Bacillen und ähnliches verwendet werden.
Viele dem Fachmann bekannte Stämme von Hefezellen sind ebenfalls als Wirtszeilen zur Expression der erfindungsgemäßen Polypeptide verfügbar. Zusätzlich können, wo gewurischt, Insektenzellen als Wirtszellen in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. Vgl. z.B. Miller et al., Genetic Engineering 8, 277-298, (Plenum Press 1986) und hier angeführte Literaturstellen.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Vektoren zur Verwendung im Expressionsverfahren für die neuen IL-9-Polypeptide bereit. Diese Vektoren enthalten die neuen IL-9- DNA-Sequenzen, die die erfindungsgemäßen IL-9-Polypeptide codieren. Vektoren, die verkürzte oder veränderte Fragmente von IL-9, allelische Varianten davon oder modifizierte Sequenzen enthalten. wie vorstehend beschrieben, sind ebenfalls Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung und bei der Herstellung der IL-9-Polypeptide nützlich. Der in dem Verfahren verwendete Vektor enthält auch ausgewählte regulatorische Sequenzen, die mit den erfindungsgemäßen DNA codierenden Sequenzen flinktionell verknüpft sind und die Replikation und Expression davon in ausgewählten Wirtszellen regulieren können. Ein Vektor, für den gezeigt wurde, daß er IL-9 in COS-Zellen gut exprimiert und der in den nachstehenden Beispielen beschrieben wird. ist pXM (Yang Y.C. et al., Cell 47 (1986), 3-10). Ein anderer Vektor, für den gezeigt wurde, daß er IL-9 in CHO-Zellen gut exprirniert und der in den Beispielen beschrieben wird, ist pEMC2B1.
Folglich kann bis zur Homogenität aus Zellquellen gereinigtes oder rekombinant oder synthetisch hergestelltes IL-9 in einem pharmazeutischen Präparat oder einer Formulierung zur Regulierung der Funktionen des hämatopoetischen Systems oder des Immunsystems verwendet werden. Insbesondere kann IL-9 die Erythropoese regulieren. IL-9 findet folglich Anwendung bei der Behandlung pathologischer Zustände, die durch Erythrocytenmangel gekennzeichnet sind. Als Erythrocyten-Stimulator kann IL-9 an Patienten verabreicht werden, für die ein chirurgischer Eingriff in Betracht gezogen wird, um die Blutzusammensetzung zu fördern. Es kann in Verbindung mit einer Chemotherapie zur Stimulierung der Produktion von erythroiden Vorläufern therapeutisch verwendet werden. Zum Beispiel kann IL-9 bei der Behandlung von β-Thalassämie und Sichelzellen-Anämie allein oder in Verbindung mit anderen Behandlungsverfahren vorzugsweise durch die Erhöhung der Zahl der fötales Hämoglobin exprimierenden Erythrocyten eingesetzt werden. Es kann auch in Verbindung mit Transfusionen oder einem Erythrocytenmangel nach einer Knochenmarkstransplantation verwendet werden. IL-9 kann auch bei der Behandlung von Thrombocytenmangel eingesetzt werden, um eine Gewebeschädigung zu beheben und die Wundheilung zu beschleunigen oder um die Abwehr des Patienten allgemein zu steigern.
Bei seiner Verwendung bei der Stimulierung der Patientenabwehr kann IL-9 zur Behandlung pathologischer Zustände verwendet werden, die auf eine Krankheit und eine Exposition von Strahlung oder Arzneimitteln zurückzuführen sind und beispielsweise Leukopenie, bakterielle und virale Infektionen umfassen, z.B. AIDS, Anämie, B - oder T-Zellmangel, einschließlich Immunzellmangel. Die therapeutische Behandlung von Wunden und Kränkheiten mit diesen IL-9-Polypeptidzusammensetzungen kann unerwänschte Nebenwirkungen vermeiden, die durch die Behandlung mit gegenwärtig verfügbaren Arzneimitteln verursacht werden.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide können auch allein oder in Verbindung mit anderen pharmazeutischen Mitteln, Cytokinen, Hämatopoetinen, Interleukinen, Wachstumsfaktoren oder Antikömern bei der Behandlung von Wunden oder Erkrankungszuständen verwendet werden;
Andere Anwendungsmöglichkeiten für diese neuen Polypeptide oder aktive Fragmente davon gibt es bei der Entwicklung monodonaler und polydonaler Antikörper. Solche Antikörper können unter Verwendung von IL-9, einem Fragment davon oder einer modifizierten oder allelischen Version davon als Antigen erzeugt werden. Durch Anwendung von dem Fachmann bekannten Standardverfahren zur Entwicklung solcher Antikörper werden polydonale oder monodonale Antikörper hergestellt, die als diagnostische oder therapeutische Mittel nützlich sein können.
Deshalb betrifft ein anderer Gesichtspunkt der Erfindung therapeutische und diagnostische Zusammensetzungen zur Behandlung oder Diagnose der vorstehend erwähnten Zustände und Verfahren zur ihre Anwendung.
Solche Zusammensetzungen umfassen eine therapeutisch wirksame Menge eines erfindungsgemäßen IL-9-Polypeptids, Fragments oder einer modifizierten Version davon in Beimischung mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger. Diese Zusammensetzung kann systematisch parenteral verabreicht werden. In einer anderen Ausführungsform kann die Zusammensetzung intravenös verabreicht werden. Falls gewünscht, kann die Zusammensetzung subkutan verabreicht werden. Bei der systematischen Verabreichung liegt die therapeutische Zusammensetzung für die erfindungsgemäße Anwendung in Form einer pyrogenfreien, parenteral verträglichen, wäßrigen Lösung vor. Für die Verwendung bei der Gewebeheilung kann der IL-9-Faktor in einer Formulierung vorliegen, die zur lokalen oder topischen Anwendung geeignet ist. Die Herstellung solcher pharmazeutisch verträglichen Proteinlösungen oder Formulierungen ist, was pH, Isotonizität, Stabilität oder ähnliches betrifft, dem Fachmann bekannt.
Das mit einem Verfahren zur Behandlung der vorstehend beschriebenen Zustände verbundene Dosierungsschema wird von dem behandelnden Arzt unter Berücksichtigung verschiedener Faktoren festgelegt, die die Wirkung der Arzneimittel modifizieren, z.B. der Zustand, Körpergewicht. Geschlecht und die Diät des Patienten, die Schwere einer Infektion, der Zeitpunkt der Verabreichung und andere klinische Faktoren. Im allgemeinen sollte das Tagesschema im Bereich von 1-1000 Mikrogramm Polypeptid oder 50 bis 5000 Einheiten (d.h. eine Einheit pro ml entspricht der Polypeptidkonzentration, die im nachstehend beschriebenen M07E-Test zur haibmaximalen Stimulierung führt) Polypeptid pro Kilogramm Körpergewicht liegen.
Das therapeutische Verfahren und die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung kann bzw. können auch die gleichzeitige Verabreichung mit anderen menschlichen Faktoren umfassen. Ein besonders bevorzugter Faktor zur gleichzeitigen Verabreichung mit IL-9 ist Erythropoietin, um eher Erythrocyten als andere härnatopoetische Abstammungslinien selektiv zu unterstützen. Andere exemplarische Cytokine oder Hämatopoietine für eine solche Anwendung umfassen die bekannten Faktoren IL-1 IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, MIF Meg-CSF, CSF-1 und die Interferone. Wachstumsfaktoren, wie der B-Zell-Wachstumsfaktor, B-Zell-Differenzierungsfaktor oder eosinophile Differenzierungsfaktoren, können sich bei der gleichzeitigen Verabreichung mit IL-9 ebenfalls als nützlich erweisen. Die vorstehend angeführte Dosierung wird zur Kompensierung solcher zusätzlichen Komponenten in der therapeutischen Zusammensetzung eingestellt. Der Fortschritt des behandelten Patienten kann durch herkömmliche Verfahren überwacht werden.
Die folgenden Beispiele beschreiben veranschaulichend die Clonierung, Expression und die Herstellung von menschlichem IL-9 und andere erfindungsgemäße Verfahren und Produkte. Diese Beispiele dienen allein der Veranschaulichung und begrenzen den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung nicht.

Beispiel 1: Isolierung von mRNA und Konstruktion der cDNA-Bank

Die menschliche lymphoblastoide T-Zellinie C5MJ2 wurde als Quelle für die RNA-Extraktion ausgewählt. Diese mit HTLV I transformierten T-Zellen wurden ursprünglich aus einem Patienten mit einer Diagnose von Mycosis fungoides gewonnen. Die Zellen wurden gemäß dem bei Leary et al. beschriebenen und vorstehend angeführten Verfahren gezüchtet. Die gesamte RNA wurde gemäß dem Verfahren von Chirgwin et al., Biochemistry 18 (1979), 5294-5299 aus C5MJ2-Zellen extrahiert, die mit 0,1% Phytohämagglutinin (PHA) und 5 ng/ml Phorbol- 1 2-myristat- 1 3-acetat (PMA) während 24 Stunden stimuliert wurden.
Die mRNA wurde durch Oligo(dT)-Cellulose-Chromatographie präpariert (Aviv H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69 (1972), 1408-1412). 5 Mikrogramm mRNA wurden für die Synthese doppelsträngiger cDNA, wie von Wong et al. beschrieben, vorstehend angeführt, mit DNA-Polymerase I und RNase H bei der zweiten Strangreaktion verwendet (Maniatis T. et al., vorstehend angeführt). Die doppeisträngige DNA wurde mit glatten Enden versehen und mit den synthetischen semi-Xho-Adaptern ligiert (Yang et al., Cell 47 (1986), 3-10).
Der COS-1-Zellen-Expressionsvektor pXM (Yang Y.C. et al., vorstehend angeführt) wurde an der einzigen XhoI-Stelle linearisiert, angepaßt und mit der semi-Xho-angepaßten cDNA ligiert. Das Ligierungsreaktionsprodukt wurde zur Transformation von Zellen des kompetenten Escherichia coli-Stamms HB1O1 verwendet (Yang Y.C. et al., vorstehend angeführt), um eine Bank aus etwa 250 000 Ampicillin-resistenten Kolonien zu erzeugen.

Beispiel 2: DNA-Präparation und Transfektion von COS-1-Zellen

Das vorher von Wong G.G. et al., vorstehend angeführt, beschriebene Expressions- Clonierungssystem wurde zur Isolierung einer die IL-9-Aktivität codierenden cDNA wie folgt angewendet.
Bakterienkolonien aus der vorstehend beschriebenen cDNA-Bank wurden auf Nitrocellulosefilter repliziert. Die Kolonien auf einem jedem Filter wurden in L-Brühe abgeschabt und die Plasmid-DNA wurde durch schon beschriebene Verfahren isoliert (Meyers J.A. et al., J. Bacteriol. 127 (1976), 1529-1536). Jede primäre DNA-Probe wurde aus einem Pool von 200-500 Kolonien präpariert.
5 Mikrogramm einer jeden Plasmid-DNA wurden zur Transfektion von COS-1- Zellen durch DEAE-Dextran-vermittelte DNA-Transfektion mit einer zusätzlichen 0,1 mM Chloroquin-Behandlung verwendet (Sompayrac L.M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 7575-7578, und Luthman H. et al., Nucl. Acids Res. 11(1983), 1295-1308). Der Kulturüberstand der transfizierten COS-l-Zellen wurde 72 Stunden nach der Transfektion geerntet und gemäß dem nachstehend in Beispiel 6 beschriebenen M07E-Test auf eine IL-9- Aktivität untersucht.
Die Plasmid-DNA aus den positiven Pools wurde in COS-1-Zellen retransfiziert und die Überstände der transfizierten Zellen wurden erneut auf eine IL-9-Aktivität durchmustert. Diese Proben wurden dann aufgeteilt, so daß sie weniger Clone enthalten, bis einzelne Clone isoliert wurden. Von den 550 Überständen für die ersten COS-1-Zelltransfektionen der primären Pools zeigte eine Probe die beste IL-9-Gesamtaktivität.
Die Pools mit der höchsten IL-9-Aktivität wurden selektiert und aufgeteilt, so daß sie weniger Clöne enthalten, ihre DNA wurde präpariert, Zellen wurden damit transfiziert und die Überstände der transfizierten Zellen wurden auf eine IL-9-Aktivität untersucht, bis einzelne Clone erhalten wurden, die aktives IL-9 exprimieren.
Ein Clon, der konstant die beste IL-9-Aktivität zeigte, wurde in dem M07E-Test von Beispiel 6 erneut untersucht. Die IL-9-Aktivität dieses Clons wurde auch mit anderen Cytokinen verglichen (IL-3, GM-CSF, IL-1a, IL-1β, IL-6, LIF, Lymphotoxin und IL-4).

Beispiel 3: Proteinanalyse

Das durch die cDNA von pC5.22-3 codierte Polypeptid wurde durch Markierungsexperimente mit radioaktiv markierten Bausteinen identifiziert. 48 Stunden nach der Chloroquin-Behandlung wurde der Kulturüberstand aus COS- 1-Zellen entfernt, die mit rekombinanter DNA von IL-9-positiven Clonen trarisfiziert worden waren, und die Zellen wurden mit 0,5 mci [³&sup5;S]-Methionin in 0,5 ml DMEM 4 Stunden bei 37ºC radioaktiv markiert. Der radioaktiv markierte Überstand wurde gewonnen und einer 12%igen SDS-PAGE unterzogen (Laemmli U.K., Nature 227 (1970), 680-685). Nach einer Elektrophorese wurde das Gel in eine die Fluoreszenzaufnahme verstärkende Lösung getaucht (Enhance; New England Nudear, Boston, MA). getrocknet und einem Röntgenfilm ausgesetzt.
Diese Analyse der von mit pC5.22-3-DNA transfizierten COS-1-Zellen sezernierten Proteine offenbarte die Gegenwart eines 20-30 kD großen Polypeptids, das in einer scheintransfizierten Kontrolle fehlte.

Beispiel 4: RNA-Blot-Analyse

5 Mikrogramm mRNA aus PHA/PMA-stimulierten oder nicht stimulierten C5JM2- Zellen, C10MJ2-Zellen und PHA/PMA-stimulierten menschlichen PBLs wurde auf einem 1,2%igen Agarosegel mit 2,2 M Formaldehyd einer Elektrophorese unterzogen (Lehrach H. et al., Biochemistry 16 (1977), 4743). Die Formaldehyd-denaturierte RNA wurde wie beschrieben (Southern E.NI.. J. Mol. Biol. 98 (1975) 503-517) auf einen Nylonfilter (Zetabind; Cuno, Menden, CT) übertragen.
Die cDNA-Sonde wurde durch das Ausschneiden von cDNA-Insertionen aus dem Vektor mit einem XhoI-Restriktionsenzym und das Markieren der Insertionen mit ³²P unter Verwendung von statistisch zusammengesetzten Oligonucleotiden als Primer in Gegenwart des großen Fragments der DNA-Polymerase I hergestellt (Feinberg A.P. et al., Analy. Biochemistry 132 (1983) 6-13). Der Nylonfilter wurde 4 Stunden bei 65ºC vorhybridisiert und mit der ³²P-markierten cDNA-Sonde in einer Hybridisierungslösung, bestehend aus 4x SSC, 0,5% SDS, 5x Denhardt-Lösung und 100 µg/ml denaturierte Lachssperma-DNA, während 16 Stunden bei 65ºC hybridisiert.
Nach der Hybridisierung wurde der Filter zweimal mit 2x SSC/0, 1% SDS während 30 Minuten bei 65ºC und im Anschluß daran mit 0,2x SSC/0,1% SDS während 30 Minuten bei 65ºC gewaschen. Der Filter wurde dann getrocknet und einem Röntgenfilm ausgesetzt.
Diese RNA-Blot-Analyse zeigte, daß die T-Zellinien C5MJ2 und C10MJ2 sowie Lectin-stimulierte menschliche PBLs leicht nachweisbare Mengen einer 0,8 kb großen mRNA synthetisierten die mit dem IL-9-Clon hybridisierte.

Beispiel 5: DNA-Seguenzanalyse

Die Nucleotidsequenz des cDNA-Clons von pC5.22-3 wurde, wie beschrieben (Wong G.G. et al. und Yang Y.C. et al., vorstehend angeführt), durch die Erzeugung hintereinander angeordneter Sätze von sich überlappenden Fragmenten durch Bal31-Nucleasespaltung und Subclonierung in M13-Vektoren bestimmt (Poncz M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982), 4298-4302; und Messing J. et al., Gene 19 (1982), 269-276). Einzelsträngige DNA wurde präpariert und die Nucleotidsequenz wurde durch das Didesoxynucleotid-Kettenterminationsverfahren bestimmt (Sanger F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463-5467).

Beispiel 6: M07E-Zelltest auf IL-9

Die M07E-Zellinie wurde aus dem peripheren Blut eines Säuglings mit akuter megakaryotischer Leukämie abgeleitet (Avanzi G.C. et al., Brit. J. Haematol. 69 (1988), 359- 366). Das Wachstum der M07E-Zellen ist von der Gegenwart von GM-CSF oder IL-3 im Medium abhängig.
M07E-Zellen werden in Gegenwart von rekombinantem menschlichem IL-3 in einer Konzentration von etwa 8 Einheiten pro Milliliter gezüchtet. Der Test wurde im wesentlichen wie folgt durchgeführt: zwei bis vier Tage nach der Passage wurden die M07E-Zellen aus der Kultur entfernt, einmal gewaschen, gezählt und aufbewahrt.
100 µl Medium (hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum (HIFCS)/Dulbecco's modifiziertes Eagle-Medium (DME) mit Pen/Strep (PS) und Glutamin) mit dem zu untersuchenden Stoff wurden in jede Vertiefung einer Mikrotiterplatte eingebracht. Die vorstehend präparierten Zellen wurden abzentrifugiert und in einer Konzentration von 1-2 x 10&sup5; Zellen/ml in 10%igem HIFCS/DME+PS+Glutamin resuspendiert. 100 µl der Zellen wurden in jede Vertiefung eingebracht und mit den Proben in Abwesenheit oder Gegenwart von anti-Mensch- GM-CSF- oder anti-IL-6-Antikörpem bei 37ºC unter 10% CO&sub2; während 72 Stunden inkubiert. Danach wurden 0,5 µCi ³H-Thymidin pro Vertiefung zugegeben und die Vertiefungen wurden 4 Stunden bei 37ºC inkubiert. Die Zellen wurden mit einem automatischen Zellerntegerät auf GFC-Typ C-Filterpapier (LKB) geerntet, mit Ethanol gewaschen und getrocknet. Die Filter wurden dann in Szintillationsflüssigkeit getaucht und die Werte der ³H-Aufnahme wurden bestimmt.
Das konditionierte Medium von C5JM2-Zellen ergab einen höheren Stimulierungswert im M07E-Test als für die Cytokine bestimmt werden konnte, von denen bekannt ist, das sie von diesen Zellen produziert werden. Dies wurde unter Verwendung von anti-GM-CSF-, anti-IL-3- und anti-IL-6-Antikörpem mit dem C5MJ2-Zellüberstand bestätigt. Der restliche Einbau in diesem Experiment deutete auf das Vorhandensein des neuen "IL-9"-Faktors hin und stellt einen Biotest auf die Expressions-Clonierung dieses Faktors bereit.
Unter Zugrundelegung der Messung der Thymidinaufnahme ist das IL-9-Protein in diesem Test in bezug auf die Stimulierung der Vermehrung leukämischer Blastenzellen aktiv. Diese Aktivität wurde nicht durch die Exposition von Antikörpern gegen bekannte Lymphokine neutralisiert, die in diesem Test ebenfalls aktiv sind, was darauf hinweist, daß IL-9 direkt als Mitogen auf die Zellen und nicht durch die Induktion bekannter Faktoren wirkt.

Beispiel 7: Expression von rekombinantem menschlichem IL-9

Zur Herstellung des IL-9-Faktors wird die ihn codierende cDNA in einen geeigneten Expressionsvektor. von denen viele Typen für die Expression in Säugern, Insekten, Hefe, Pilzen und Bakterien auf dem Fachgebiet bekannt sind, durch molekularbiologische Standardverfahren übertragen.
Ein solcher Vektor für Säugerzellen ist pXM (Yang Y.C. et al., Cell 47 (1986), 3- 10). Dieser Vektor enthält den SV40-Replikationsursprung und -Enhancer, den späten Adenovirus-Hauptpromotor. eine cDNA-Kopie der dreiteiligen Adenovirus-Leader-Sequenz, eine kleine dazwischenliegende Hybridsequenz, ein SV40-Polyadenylierungssignal und das Adenovirus-VA-I-Gen in einer geeigneten Beziehung zueinander, um die hohe Expressionsrate der gewünschten cDNA in Säugerzellen zu regulieren (vgl. z.B. Kaufman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985), 689-693). Der pXM-Vektor wird mit dem Endonucleaseenzym XhoI linearisiert und anschließend in einer äquimolaren Menge mit der IL-9 codierenden cDNA getrennt ligiert, die vorher durch die Addition synthetischer Oligonucleotide modifiziert wurde, welche zu XhoI komplementäre Enden zur Erzeugung von Konstrukten für die Expression generieren.
Ein anderer Vektor zur Expression in Säugern ist pEMC2B1. Dieser Vektor kann von pMT2pc abgeleitet werden, der bei der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD (USA).. unter der Hinterlegungsnummer ATCC 40348 hinterlegt wurde. Die DNA wird durch Spaltung des Plasmids mit PstI linearisiert. Die DNA wird dann unter Verwendung der T4-DNA-Polymerase mit glatten Enden versehen. Ein Oligonucleotid mit der Sequenz 5', TGCAGGCGAGCCTGAATTCCTCGA 3' wird dann in die DNA ligiert, wobei die PstI-Stelle am 5'-Ende wiederhergestellt und eine EcoRI-Stelle und eine XhoI-Stelle vor dem ATG-Codon der DHFR-cDNA eingefügt wird. Dieses Plasmid wird bezeichnet als pMT21. pMT21 wird mit EcoRI und XhoI gespalten, die das Plasmid an zwei benachbarten Clonierungsstellen spalten. Ein EMCV-Fragment aus 508 Basenpaaren wurde aus pMT&sub2;- ECAT&sub1; (Jong S.K. et al., J. Virol. 63(1989), 1651-1660) mit den Restriktionsenzymen EcoRI und TaqαI ausgeschnitten. Ein Oligonucleotid-Paar mit einer Länge von 68 Nueleotiden wurde synthetisiert, um die EMCV-Sequenz bis zum ATG-Codon zu ergänzen. Das ATG-Codon wurde in ein ATT-Codon umgewandelt und ein C angehängt, wodurch eine XhoI-Stelle am 3' -Ende erzeugt wird. Eine TaqαI-Stelle befindet sich am 5'-Ende. Die Sequenz der Oligonucleotide war wie folgt: 5' CGAGGTTAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCA- CGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATTGC 3' und deren Komplementärstrang.
Die Ligierung des pMT21-EcoRI-bis-XhoI-Fragments mit dem EMCV-EcoRI-bis- TaqαI-Fragment und den TaqαI/XHOI-Oligonucleotiden erzeugt den Vektor pEMC2B1.
Dieser Vektor enthält den SV40-Replikationsursprung und -Enhancer, den späten Adenovirus-Hauptpromotor, eine cDNA-Kopie des größten Teils der dreiteiligen Adenovirus- Leader-Sequenz. eine kleine dazwischenliegende Hybridsequenz, ein SV40-Polyadenylierungssignal und das Adenovirus-VA-I-Gen sowie DHFR- und β-Lactamase-Marker und eine EMC-Sequenz in einer geeigneten Beziehung zueinander, um die hohe Expressionsrate der gewurischten cDNA in Säugerzellen zu regulieren. Der EMC2B1-Vektor wird mit dem Endonucleaseenzym EcoRI linearisiert und anschließend in einer äquimolaren Menge mit der IL-9 codierenden cDNA getrennt ligiert, die vorher durch die Addition von synthetischen Oligonucleotiden modifiziert wurde, welche zu EcoRI komplementäre Enden zur Erzeugung von Konstrukten für die Expression generieren. Diese Konstrukte können in Wirtszellen mit geeigneten Vektoren exprimiert werden.

a. Expression in Säugerzellen

Zur Herbeiführung der Expression des IL-9-Proteins zur Verwendung in dem nachstehend beschriebenen Test wird das die cDNA für IL-9 enthaltende pXM-Konstrukt in COS-Zellen eingeschleust, wie in Beispiel 5 beschrieben. In ähnlicher Weise wird das pEMC2B1-Konstrukt mit der cDNA für IL-9 in CHO-Zellen eingeschleust (vgl. Beispiel 8). Das konditionierte Medium der transfizierten COS-Zellen enthält biologisch aktives IL-9, wie im M07E-Test bestimmt wurde.
Die hier beschriebenen Expressionsvektoren für Säugerzellen können durch Verfahren synthetisiert werden, die dem Fachmann bekannt sind. Die Komponenten der Vektoren, z.B. Replicons, Selektionsgene, Enhancer, Promotoren und ähnliches, können aus natürlichen Quellen gewonnen oder durch bekannte Verfahren synthetisiert werden. Vgl. Kaufman et al., J. Mol. Biol. 159 (1982), 511-521; und Kaufman, Proc Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985), 689-693. Exemplarische Säugerwirtszellen umfassen insbesondere Primaten-Zellinien und Nagetier-Zelllinen, einschließlich transformierter Zellinien. Normale diploide Zellen, von in vitro-Kulturen von Primärgewebe abgeleitete Stämme sowie primäre Explantate sind ebenfalls geeignet. Kandidatenzellen müssen in bezug auf das Selektionsgen nicht genotypisch defizient sein, so lange das Selektionsgen dominant wirksam ist. Zur stabilen Integration der Vektor-DNA-Sequenzen und zur anschließenden Amplifizierung der integrierten Vektor- DNA-Sequenzen beides durch herkömmliche Verfahren, können CHO-Zellen verwendet werden. In einer anderen Ausführungsform kann die Vektor-DNA das gesamte oder einen Teil des Rinderpapillomavirus-Genoms umfassen (Lusky et al., Cell 36 (1984), 391-401) und in Zellinien, wie C127-Mauszellen, als stabiles episomales Element getragen werden. Andere geeignete Säuger-Zellinien umfassen, sind aber nicht darauf begrenzt, HeLa, COS-1-Affenzellen, L-929-Mauszellen, von Swiss-, Balb-c- oder NIC-Mäusen abgeleitete 3T3-Zellinien, BHK- oder HaK-Hamster-Zellinien.
Stabile Transformanten werden dann auf die Expression des Produkts durch immunologische, biologische oder enzymatische Standardtests durchmustert. Die Gegenwart der die IL-9-Polypeptide codierenden DNA und mRNA kann durch Standardverfahren nachgewiesen werden, wie Southern-Blot und RNA-Blot. Eine vorübergehende Expression der die Polypeptide codierenden DNA während mehreren Tagen nach der Einschleusung der Expressionsvektor-DNA in geeignete Wirtszellen, wie COS-1-Affenzellen, wird ohne Selektion durch einen Aktivitäts- oder immunologischen Test der Proteine im Kulturmedium bestimmt.
Der Fachmann kann auch andere mit dem pXM-Vektor vergleichbare Säuger-Expressionsvektoren z.B durch Insertion der DNA-Sequenzen von IL-9 aus den Plasmiden mit geeigneten Enzymen und durch Anwendung bzw. Verwendung von gut bekannten rekombinanten gentechnischen Verfahren und anderen bekannten Vektoren, wie pJL3 und pJL4 (Gough et al., EMBO J. 4 (1985), 645-653) und pMT2 (beginnend mit pMT2-VWF, ATCC #67122; vgl. die PCT-Anmeldung PCT/US87/00033) konstruieren. Die Transformation der Vektoren mit IL-9 in geeigneten Wirtszellen kann die Expression der IL-9-Polypeptide zur Folge haben.

b. Bakterielle Expressionssysteme

Entsprechend kann der Fachmann die IL-9 codierenden Sequenzen durch die Entfernung aller die codierenden Sequenzen flankierenden regulatorischen Säugersequenzen und die Insertion der bakteriellen regulatorischen Sequenzen manipulieren, um bakterielle Vektoren für die intrazelluläre oder extrazelluläre Expression von erfindungsgemäßem IL-9 durch Bakterienzellen zu erzeugen. Die IL-9 codierende DNA kann ferner so modifiziert werden, daß sie zur Optimierung der bakteriellen Expression verschiedene Codons enthält, wie auf dem Fachgebiet bekannt ist. Vorzugsweise wird die das reife IL-9 codierende DNA ebenfalls durch auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren innerhalb des Leserahmens funktionell verknüpft mit Nucleotidsequenzen die ein sekretorisches Leader-Polypeptid codieren, das die bakterielle Expression Sekretion und die Prozessierung des reifen IL-9-Polypeptids erlaubt. Die Expression von IL-9 in E. coli unter Verwendung solcher Sekretionssysteme kann zur Sekretion eines aktiven Polypeptids führen. Alternativ, falls die intrazelluläre Expression die Herstellung eines denaturierten und inaktiven IL-9-Polypeptids zur Folge hat, kann diese Molekülart Proteinfaltungsstandardverfahren unterzogen werden, um aktives IL-9 zu gewinnen.
Die auf jede Weise in bakteriellen Wirtszellen exprimierten Verbindungen können dann jeweils durch bekannte Verfahren gewonnen, gereinigt und/oder im Hinblick auf physikochemische, biochemische und/oder klinische Parameter charakterisiert werden.

c. Expression in Insekten- oder Hefezellen

Ahnliche Manipulationen können zur Konstruktion eines Insektenvektors für die Expression der IL-9-Polypeptide in Insektenzellen durchgeführt werden (vgl. z.B. die in der veröffentlichten Europäischen Patentanmeldung 155,476 beschriebenen Verfahren).
In entsprechender Weise werden Hefevektoren unter Verwendung regulatorischer Hefesequenzen zur Expression der IL-9 codierenden DNA in Hefezellen konstruiert, wobei extrazellulär sezerniertes aktives IL-9 erhalten wird (vgl. z.B. die in der veröffentlichten PCT-Anmeldung WO86/00639 und in der Europäischen Patentanmeldung EP-123,289 beschriebenen Verfahren).

Beispiel 8: Konstruktion von CHO-Zellinien, die IL-9 in großen Mengen exprimieren

Ein Verfahren zur Herstellung von großen Mengen des erfindungsgemäßen IL-9- Proteins aus Säugerzellen umfaßt die Konstruktion von Zellen mit multiplen Kopien der IL-9 codierenden cDNA.
Die cDNA wird gemeinsam mit einem amplifizierbaren Marker eingeschleust, z.B. mit dem DHFR-Gen. für das Zellen ansteigende Konzentrationen von Methotrexat (MTX) gemäß den Verfahren von Kaufman und Sharp, J. Mol. Biol. (1982), a.a.O., enthalten. Dieses Verfahren kann auf eine Anzahl verschiedener Zelltypen angewendet werden. In einer anderen Ausführungsform können die IL-9-cDNA und das Wirkstoffresistenz-Selektionsgen (z.B. DHFR) in den gleichen Vektor eingeschleust werden. Ein bevorzugter Vektor für dieses Verfahren ist pEMC2B1.
Zum Beispiel wird der Vektor pEMC2B1, der das IL-9-Gen in funktioneller Verknüpfung mit anderen Plasmidsequenzen enthält, die die Expression davon erlauben, in DHFR-defiziente CHO-Zellen (DUKX-BII) durch Protoplastenfüsion bzw. Transfektion eingeschleust. Das IL-9-Gen und das DHFR-Markergen werden beide wirksam exprimiert, wenn IL-9 in pEMC2B1 eingeschleust wird. DHFR-exprimierende Transformanten werden auf das Wachstum in α-Medium mit dialysiertem fötalem Kälberserum selektiert. Die Transformanten werden auf die Expression von IL-9 durch einen Biotest, Immuntest oder einen RNA-Blot überprüft und positive Pools werden anschließend durch das Züchten in ansteigenden Konzentrationen von MTX (aufeinanderfolgende Schritte in 0,02, 0,2, 1,0 und 5 µM MTX) auf eine Amplifizierung selektiert, wie bei Kaufman et al., Mol. Cell Biol. 5 (1983), 1750, beschrieben. Die amplifizierten Linien werden doniert und die Expression des IL-9-Proteins wird mit dem IL-9-Test überwacht. Es wird erwartet, daß die IL-9-Expression mit zunehmenden MTX-Resistenzwerten ansteigt.
Bei allen vorstehend beschriebenen Expressionssystemen können die so erhaltenen Zellinien durch eine geeignete Wirkstoffwahl weiterhin amplifiziert, erhaltene Zellinien erneut doniert und die Expressionsrate unter Anwendung des hier beschriebenen IL-9-Tests abgeschätzt werden.

Beispiel 9: Wirkung von IL-9 auf die Koloniebildung von peripheren Blut-Vorläuferzellen

Clonale Tests wurde zum Nachweis der Wirkung von IL-9 auf Vorläuferzellen des hämatopoetischen Systems wie folgt durchgeführt.

a. Herstellung von Cytokinen und Antikörpern

Rekombinantes menschliches GM-CSF, IL-3, IL-6, der Granulocyten-Koloniestimulierende Faktor (G-CSF) und Erythropoetin (Epo) lagen alle als gereinigte Proteine mit spezifischen Aktivitäten von 8,7 x 10&sup6;; 3,9 x 10&sup6;; 1 x 10&sup6;; 2,0 x 10&sup6; bzw. 1,5 x 10&sup5; Einheiten pro mg Protein vor. Bis auf Epo, das in einer Endkonzentration von 2 U/ml verwendet wurde wurden diese Proteine in der Kultur in einer Endkonzentration von 10 ng/ml verwendet. IL-4, IL-9, der Leukämie-inhibierende Faktor (LIF) und IL-1α lagen in Form von konditionierten Medien von COS-1-Zellen vor, die mit der geeigneten cDNA transfiziert wurden. Diese Transfektionsüberstände wiesen halbmaximale Aktivitäten von 1,3 x 10&sup4;, 6 x 10³, 1 x 10&sup5; bzw. 1,5 x 10³ auf IL- 1α wurde in der Kultur in einer Konzentration von 5 U/ml verwendet. Die anderen Transfektionsüberstände wurden in einer Endverdünnung von 1:100 verwendet.
Zur Neutralisierung der endogenen GM-CSF-Produktion durch kontaminierende Lymphocyten oder Monocyten wurde gegen GM-CSF gerichtetes Schaf-Heteroantiserum in einer Endverdünnung von 1:100 (Genetics Institute, Cambridge, MA) direkt zu den Kulturen zugegeben. Diese Antikörperkonzentration kann in diesem Testsystem 90 U vollständig neutralisieren.

b. Zellpräparation: peripheres Blut

Die zurückbleibenden Leukocyten wurden als Nebenprodukt aus der Thrombapherese gesunder Spender unter Verwendung eines Fenwal CS-3000-Blutseparators erhalten. Aus peripherem Blut abgeleitete Vorläufer wurden aus durch Kälte aggregierte Monocyten isoliert, die unter Verwendung der einkemigen Zellen dieser zurückbleibenden Leukocyten präpariert wurden, wie zuerst bei Mentzer et al., Cell Immunol. 101(1986), 101, beschrieben. Die aggregierten Zellen wurden vorsichtig aufgebrochen und die Monocyten wurden durch ein Konzentrationsgerät für magnetische Partikel (Dynal, Great Neck, NY) entfernt, nachdem man ihnen erlaubt hatte, Eisenpartikel (Lymphocyte Separator Reagent, Technicon, Tarrytown, NY) bei 37ºC während 45 Minuten zu phagocytieren. Die zurückbleibenden Zellen ließ man sich 1 bis 2 Stunden an Kunststoffschalen anhaften, um kontaminierende Monocyten weiterhin zu entfernen. Diese Zellen wurden für donale Routinekulturen in Zelidichten von 1-2 x 10&sup4;/ml verwendet. Unter diesen Bedingungen ergab die Zellpräparation bei der Ausplattierung in IL-3 plus Erythropoetin üblicherweise eine BFU-E-Ausplattierungswirksamkeit von 118 pro 10&sup5; Zellen. Falls Granulocyten/Makrophagen-Kolonien erhalten wurden, waren es nur einige wenige. Stärker gereinigte Vorläuferpopulationen wurden durch positive immunmagnetische Selektion auf den frühen hämatopoetischen Zelloberflächenmarker CD34&spplus; präpariert. Diese Methodik wurde schon beschrieben (Lea T. et al. Scand J. Immunol. 22 (1985), 207). Die positive Selektion auf CD34-Vorläufer wurde unter Verwendung des im Handel erhältlichen Antikörpers HPCA-1 durchgeführt, der von Becton-Dickinson (Moutainview, CA) bezogen wurde. Diese stark gereinigte Zellpräparation wurde in clonalen Tests in Konzentrationen zwischen 100 und 250 Zellen/ml verwendet und sie ergab üblicherweise eine BFU-E-Ausplattierungswirksamkeit von etwa 50% in Gegenwart von IL-3.

c. Clonale Testkulturen

Angereicherte Vorläuferzellen wurden in 0,9%iger Methylcellulose in IMDM mit 30% FCS, 0,9% entionisiertem Rinderserumalbumin (Sigma, Fraktion V) und 10&supmin;&sup4; M 2-Mercaptoethanol gezüchtet. Eine Einheit rekombinantes Erythropoetin (Genetics Institute, Cambridge, MA) wurde zu jeweils 0,5 ml der Kultur am Tag 3 tropfenweise zugegeben. Rote Kolonien mit üblicherweise > 1000 Zellen wurden 12 bis 14 Tage nach Beginn der Kulturen in dreifacher Ausfertigung als BFU-E beurteilt.
Für erste Studien mit IL-9 wurden erythroide Vorläufer verwendet, die aus den als Nebenprodukt der. Thrombapherese erhaltenen Leukocyten isoliert wurden. Bei der Reinigung der erythroiden Vorläufer wurde beobachtet, daß diese Zellen zusammen mit Monocyten selektiv aggregieren, wenn periphere einkernige Zellen bei 4ºC inkubiert werden.
Die aggregierten Vorläuferzellen wurde weiterhin fraktioniert und als Zielzellen in Erythrocyten-Methylcellulose-Standardkulturen in Gegenwart von Epo verwendet. Zusätzlich zu IL-3 und GM-CSF wurde nachgewiesen, daß IL-9 bei der Unterstützung der Erzeugung erythroider Bursts (BFU-E) wirksam ist, während G-CSF, IL-1α, IL-4, IL-6 und LIF es nicht sind (Tabelle II). In diesem Kultursystem ergab IL-9 40 bis 50% der Menge an BFU-E, wie entweder von IL-3 oder GM-CSF erzeugt wurde. Die Erythrocyten-Burst-Förderungsaktivität ("erythroid burst promoting activity, BPA") von IL-9 wurde durch die Zugabe eines neutralisierenden Antiserums gegen GM-CSF nicht blockiert; die von begleitenden Zellen in diesen Kulturen erzeugte besonders hohe BPA zeigt, daß IL-9 direkt auf die erythroiden Vorläufer einwirkt. IL-3 allein ergab die größte BFU-E-Bildungshäufigkeit und diese Menge wurde durch die Zugabe von entweder IL-9 oder GM-CSF nicht erhöht, was darauf hinweist, daß IL-9 und GM-CSF jeweils mit Untergruppen von IL-3-empfindlichen erythroiden Vorläufern in Wechselwirkung treten. Die meisten der durch IL-9 unterstützten BFU-E wiesen eine diffuse, spät-hämoglobinisierende Morphologie auf, was auf eine mögliche Wechselwirkung mit einer verhältnismäßig frühen Subpopulation von IL-3-empfindlichen Vorläufern hindeutet.
Die peripheren Blut-Vorläuferzellen wurden durch immunologische Selektion auf CD34&spplus;-Zellen mit Hilfe magnetischer Kügelchen weiterhin gereinigt, um zu untersuchen, ob IL-9 indirekt oder direkt mit erythroiden Vorläufern in Wechselwirkung tritt. Beim Ausplattieren in Gegenwart von IL-3 und Epo in Konzentrationen von entweder 100 oder 250 Zellen/ml erzeugten 46% dieser Zellen erythroide Bursts (Tabelle II). Die gleiche Zellpopulation zeigte eine BFU-E-Ausplattierungswirksämkeit von etwa 20% bei IL-9 und 42% bei GM-CSF. Aufgrund der hohen Reinheit dieser Vorläufer und der geringen Ausplattierungsdichte liefert dieses Ergebnis einen starken Beweis dafür, daß es eine Subpopulation von BFU-E gibt, die direkt auf IL-9 anspricht. Tabelle II Durch verschiedene Cytokine unterstützte BFU-E aus peripherem Blut

Beispiel 10: Wirkung von IL-9 auf die Koloniebildung von Knochenmarks- und Nabelschnurblut-Vorläufern

Da peripheres Blut eine verhältnismäßig schlechte Quelle für Granulocyten/Makrophagen (GM)-Vorläufer ist, wurde IL-9 mit IL-3 und GM-CSF in bezug auf seine Fähigkeit verglichen, die Koloniebildung von aus Knochenmark von Erwachsenen abgeleiteten Vorläufern und von Vorläufern aus menschlichem Nabelsehnurblut zu unterstützen. Jede dieser Quellen, jedoch insbesondere Knochenmark, weist überschüssige Mengen von Vorläufern aller Abstammungslinien auf und ist nützlicher als peripheres Blut zur Überprüfung der Abstammungsspezifität der verschiedenen Cytokine.

a. Zellpräparation: Knochenmark

Knochenmark wurde durch Absaugen aus normalen erwachsenen Freiwilligen in konservierungsmittelfreies Heparin gewonnen. Einkernige Zellen wurden durch Dichtezentrifugation mit Ficoll-Paque (Pharmacia, Piscataway, NJ) isoliert und adhärente Zellen wurden durch das Anhaften über Nacht an 100 x 15 mm große Kunststoffgewebekulturschalen (Corning, Corning, NY) in Iscove's modifiziertem Dulbecco-Medium (IMDM) mit 20% fötalem Kälberserum (FCS) bei 37ºC unter 5% CO&sub2; entfernt. Clonale Tests wurden in einer Zellkonzentration von 2,5 x 10&sup4; Zellen/ml ausplattiert.

b. Zellpräparation: Nabelschnurblut

Nabelschnurblut wurde aus Nabelschnur- und Plazentagewebe gewonnen, das zum Verwerfen vorgesehen war, mit Zustimmung des Brigham and Women's Hospital Human Investigations-Komittees. Das Nabelschnurblut wurde in konservierungsmittelfreiem Heparin gewonnen, wobei die einkernigen Zellen durch Zentrifugation über Ficoll-Paque (Pharmacia, Piscataway, NJ) isoliert wurden. Adhärente Zellen wurden durch das Anhaften über Nacht an Kunststoffgewebekulturschalen entfernt. Die so erhaltene nicht-adhärente Fraktion wurde in donalen Tests in einer Zellkonzentration von 2,5 x 10&sup4; Zellen/ml ausplattiert.

c. Ergebnisse

Wie in Tabelle III zusammengefaßt, unterstützte IL-9 bei jeder Zielzellenquelle in hohen Maße die BFU-E-Bildung, wobei vereinzelt gemischte Kolonien (CFU-GEMM) zu beobachten waren. Jedoch wurden Kolonien der späten Vorläufer der Neutrophilen- und Makrophagen-Abstammungslinien (CFU-CM, CFU-M und CFU-G) in IL-9-unterstützten Kulturen selten beobachtet. Im Gegensatz dazu erzeugten IL-3 und GM-CSF große Mengen dieser Kolonietypen. IL-9 zeigte keine Aktivität, wenn es allein oder in Verbindung mit IL-3 in Kulturen menschlicher und muriner Megakaryocyten-Vorläufem getestet wurde. Folglich scheint IL-9 im Gegensatz zu IL-3 und GM-CSF, die mit mehreren hämatopoetischen Abstammungslinien Aktivitäten zeigen, für die Erythrocytenentwicklung spezifisch zu sein. Tabelle III Vergleich der hämatopoetischen Abstammungsspezifitäten von Interleukin-3, Interleukin-9 und GM-CSF

Claims

1. DNA-Sequenz, codierend ein Protein mit der Aktivität von menschlichem IL-9, ausgewählt aus:

(a) einer DNA-Sequenz, die die DNA-Sequenz aus Tabelle 1 enthält;

(b) der DNA-Sequenz aus Tabelle I, die das IL-9-Protein zusammen mit seiner sekretorischen Leader-Sequenz codiert;

(c) der DNA-Sequenz aus Tabelle I, die das IL-9-Protein codiert;

(d) einer DNA-Sequenz, die sich in ihrer Codonsequenz von den DNA-Sequenzen nach (a), (b) oder (c) aufgrund der Degenerationen des genetischen Codes unterscheidet;

(e) einer DNA-Sequenz, die unter stringenten Bedingungen mit einer DNA-Sequenz nach (a), (b), (c) oder (d) hybridisiert; und

(f) einer allelischen Variante oder einem Derivat oder Fragment der DNA-Sequenz nach (a) oder (b).

2. DNA-Sequenz nach Anspruch 1, wobei das Protein zusätzlich eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften besitzt:

(a) ein apparentes Molekulargewicht von etwa 20 bis 30 kD unter reduzierenden Bedingungen in einer SDSPAGE;

(b) biologische Aktivität in einem M07E-Bioassay;

(c) die Fähigkeit, die Entwicklung von erythroiden Blastocyten in Kulturen von Knochenmarks-, peripheren Blut- oder Nabelschnurblut-Zellen zu unterstützen.

3. RNA-Sequenz, codierend ein Protein mit der Aktivität von menschlichem IL-9, die die folgenden Eigenschaften hat:

(a) sie ist komplementär zu einer DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder 2; und/oder

(b) sie hybridisiert mit einer DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder 2.

4. DNA-Molekül, enthaltend eine DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder 2, gegebenenfalls in funktioneller Verknüpfung mit einer Expressions-Kontrollsequenz.

5. DNA-Molekül nach Anspruch 4, das ein Plasmid-Vektor ist.

6. DNA-Molekül nach Anspruch 5, das pC5.22-3 (ATCC 67988) ist.

7. Wirtszelle, die transformiert ist mit einem DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 4 bis 6.

8. Wirtszelle nach Anspruch 7, die eine Säuger-, Insekten-, Hefe-, Pilz- oder Bakterienzelle ist.

9. Protein oder Fragment davon mit der Aktivität von menschlichem IL-9, das (a) codiert wird von einer DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder 2, einer RNA-Sequenz nach Anspruch 3, und/oder einem DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 4 bis 6; und/oder

(b) produziert wird von der Wirtszelle nach Anspruch 7 oder 8.

10. Verfahren zur Herstellung von menschlichem IL-9 oder einem Fragment davon mit der Aktivität von menschlichem IL-9, das die folgenden Schritte umfaßt:

(a) Züchtung der Wirtszelle nach Anspruch 7 oder 8 in einem geeigneten Medium; und

(b) Gewinnung des menschlichen IL-9 oder Fragmentes davon aus der Zellkultur und/oder aus dem Kulturmedium.

11. Antikörper, der gegen ein Epitop gerichtet ist, das spezifisch ist für menschliches IL-9 oder ein Fragment davon nach Anspruch 9.

12. Arzneimittel, enthaltend eine therapeutisch wirksame Menge an menschlichem IL-9 oder einem Fragment davon, wie in Anspruch 9 definiert, in Verbindung mit einem pharmazeut isch verträglichen Träger.

13. Arzneimittel nach Anspruch 12, das weiterhin eine therapeutisch wirksame Menge eines zusätzlichen Cytokins, Hematopoietins, Wachstums faktors oder Tumor-aktivierten Antikörpers enthält.

14. Arzneimittel nach Anspruch 13, worin das Hematopoietin Erythropoietin ist.

15. Arzneimittel nach Anspruch 13 oder 14, worin das Cytokin ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, den Interferonen, TNF und LIF.

16. Verwendung von menschlichem IL-9 oder einem Fragment davon, wie in Anspruch 9 definiert, zur Herstellung eines Arzneimittels, das geeignet ist zur Behandlung von Krankheiten, die gekennzeichnet sind durch Erythrocytenmangel.

17. Verwendung von menschlichem IL-9 oder einem Fragment davon, wie in Anspruch 9 definiert, und von mindestens einem Hematopoietin, Cytokin, Wachstumsfaktor oder Antikörper zur Herstellung eines kombinierten Arzneimittels zur Verwendung in der Behandlung von Krankheiten, die durch Erythrocytenmangel gekennzeichnet sind.

18. Verwendung nach Anspruch 17, worin das Hematopoietin Erythropoietin ist.

19. Verwendung nach Anspruch 17 oder 18, worin das Cytokin ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, den Interferonen, TNF und LIF.

20. Verwendung nach einem der Ansprüche 16 bis 19, worin die Krankheiten ausgewählt sind aus β-Thalassämie, Sichelzellen-Anämie und viralen Infektionen.