DE4410655C2 - Verfahren und Vorrichtung zur schnellen kontinuierlichen Sequenzanalyse von verschiedenen linearen polymeren Substanzen nach einer einheitlichen Vorgehensweise - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung, die es erlaubt eine Sequenzanalyse, nach einem einheitlichem Prinzip, von linearen polymeren Substanzen durchzuführen, ohne diese schrittweise abzubauen.

Dieses Verfahren ermöglicht es nach einer einheitlichen Arbeitsweise, die Abfolge der Monomere großer linearer polymerer Substanzen wie Desoxyribonukleinsäure (DNA), Ribonukleinsäure (RNA), Proteine, lineare Polysaccharide oder strukturell verwandter Substanzen zu bestimmen, ohne diese in die Monomere zu überführen oder das endständige Monomer schrittweise abzuspalten zu müssen. Dies kann in einer vielfachen Geschwindigkeit im Vergleich zu den bis her bekannten Verfahren durchgeführt werden. Dieses Verfahren ermöglicht es weiterhin mehr als 10 000 Monomere einer polymeren Substanz in einem Analyseschritt zu bestimmen. Dies ist von großen praktischen Interesse, da so Sequenzanalysen erheblich schneller durchgeführt werden können und eine Kosteneinsparung möglich wird. Ferner erlaubt das Verfahren eine automatisierte Anwendung, sowohl in der wissenschaftlichen Einzelanalytik, als auch in der gewerblichen Routineanalytik.

Es sind bereits Verfahren zur Sequenzanalyse von polymeren Substanzen wie DNA, RNA, Proteinen und Polysacchariden bekannt, die nach verschiedenen Prinzipien arbeiten (für Proteine "Laursen, R. A. (Herausgeb.) (1975), Solid-phase Methods in Protein Sequence Analysis, Pierce Chem. Comp. Rocklord III", für DNA und RNA "Maniatis T., Frisch E. F. & Sambrook, Molecular cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2. Auflage (1991)). Für jede Klasse polymerer Substanzen werden unterschiedliche Verfahren verwendet. Diese richten sich nach den chemischen bzw. physikalischen Verhalten der Polymere und deren Monomere. Aus diesem Grund sind die Analyseverfahren prinzipiell verschieden und benötigen so auch verschiedene Apparaturen und Vorgehensweisen. Sie arbeiten zumeist nach folgenden Grundprinzip. Zuerst werden einzelne endständige Monomere abgespalten, dann werden je nach Verfahren entweder die abgespaltenen oder Restpolymere in Verfahren wie Hochgeschwindigkeitschromatographie (HPLC), Dünnschichtchromatographie (DC) oder Säulenchromatographie aufgetrennt und analysiert.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde eine kontinuierliche Sequenzanalyse polymerer linearer Substanzen wie DNA, RNA, Proteine oder Polysaccharide nach einem einheitlichem Verfahren zu ermöglichen, ohne dabei diese zuvor in ihre Monomere zu überführen oder das endständige Monomer abzuspalten zu müssen. Das Verfahren hat weitergehend die Aufgaben, auf einem schnellen Weg die Abfolge der Monomere in linearen Polymeren zu bestimmen, sowie große Sequenzen mit einem Arbeitsschritt erfassen zu können.

Nach der Erfindung wird ein Verfahren verwendet, daß molekulare Mechanik nutzt. Als Basis für dieses Verfahren dient eine Festphase als Trägermaterial (Fig. 1, 1), an dem molekulare Kohlenstoffketten (Fig. 1, 2) von 10 bis 20 oder mehr Kohlenstoffatomen kovalent, nach bekannten chemischen Verfahren, als Spacer (Fig. 1, 2), gebunden werden können. Diese Spacer werden durch Doppelbindungen oder Dreifachbindungen zwischen den Kohlenstoffatomen in der Längsachse stabilisiert.

Über diese Spacer werden molekulare Ringstrukturen (Fig. 1, 3) wie z. B. Cyclopolysaccharide wie Cyclodextrine gezogen, sodaß die Spacer durch die intakten Ringe hindurch stoßen. Dies kann unter Ausnutzung der chemisch- physikalischen Eigenschaften der Cyclopolysaccharide in einer in situ Reaktion geschehen, ohne daß von außen Energie zu gefügt werden muß oder besondere Techniken angewendet werden müssen.

Die molekularen Ringe (Fig. 1, 3) müssen neben ihrer Grundeigenschaft, der Ringstruktur, folgende weitere notwendige Eigenschaften besitzen. Sie müssen flexibel sein und müssen mit Spektroskopieverfahran wie Infrarotspektroskopie (IR), Ultraviolettspektroskopie (UV), Kernresonansspektroskopie (MNR) oder Fluoreszensspektroskopie getrennt von den polymeren Substanzen detektierbar sein. Ferner müssen sie eine fixierte, möglichst große einheitliche elektrische Polarisierung besitzen. Die Ringgröße richtet sich nach dem größten Durchmesser des Monomers, des zu untersuchenden Polymers. Sie muß mindestens so groß sein, daß der Ring unter Einsatz von außen zugeführter Energie über das größte Monomer des Polymers durch den Ring geführt werden kann. Eine Deformation des Ringes (Fig. 1, 3) wird dabei beabsichtigt und ist notwendig. Diese Deformation ermöglicht es, den Moment und die Art und Weise des Überganges des Ringes über das Monomer zu spektroskopisch bestimmen.

Zur Verbesserung der Detektionsmöglichkeiten der Ringstruktur können, nach bekannten chemischen Verfahren, Substituenten, wie Farbstoffe, als Liganden an den Ring kovalent gebunden werden. Es hat sich erwiesen, daß die Fluoreszensspektroskopie günstige Voraussetzungen bietet. Aus diesem Grund können an den Ringen fluoreszierende Farbstoffe kovalent gebunden werden. Zur weiteren Steigerung der Detektionsempfindlichkeit können, in alternierender Reihenfolge, zwei unterschiedliche Fluoreszensfarbstoffe an den Ring gebunden werden, z. B. Rhodamin B und Fluorescein. Dies kann über bekannte chemische Kopplungsverfahren geschehen.

Nachdem die modifizierten Ringe in der in situ Reaktion über den Spacer gebracht worden sind, wird das so veränderte Trägermaterial in eine Analysekammer (Fig. 2) in eine Halterung (Fig. 1, 4) eingespannt.

Es wird ein elektrisches Feld mit Hilfe zweier Pole (Fig. 1, 5) so angelegt, daß die elektrisch polarisierten Ringe (Fig. 1, 3) zum Trägermaterial (Fig. 1, 1) gezogen (Fig. 1, 6) werden. Dies ist möglich, da der Ring sich frei, in Richtung der Längsachse des Spacers, bewegen kann. Anschließend wird das endständige Monomer des linearen Polymers (Fig. 1, 7) kovalent, nach bekannten chemisch- physikalisch Verfahren, nachdem das elektrische Feld ausgeschaltet worden ist, an den Spacer gebunden. Am gegenüberliegenden Ende des linearen Polymers wird anschließend eine Molekülgruppe (Blockmolekül) (Fig. 1, 8) kovalent, nach bekannten chemischphysikalisch Verfahren, gebunden. Dieses Blockmolekül ist im kleinsten Moleküldurchmesser so groß, daß der molekulare Ring nicht über diese Molekülgruppe, auch nicht mit Hilfe eines angelegten elektrischen Feldes, gezogen werden kann. Ferner ist diese Molekülgruppe wie der Ring elektrisch polarisiert, um eine Streckung, entlang der Längsachse des kovalent gebundenen Polymers, zu erreichen. Anschließend wird durch bekannte naßchemische Verfahren nicht gebundenes Material ausgewaschen.

Zur Analyse des linearen Polymers (Fig. 1, Schritt 6.) wird die Polung des elektrischen Feldes so eingerichtet, daß der molekulare Ring (Fig. 1, 3) über das lineare gestreckte Polymer (Fig. 1, 7), mit Hilfe des elektrischen Feldes, wandert bzw. gezogen werden kann. Die Feldstärke wird so eingestellt, das dies mit einer gleichbleibenden Geschwindigkeit geschieht. Während der Wanderung des Ringes über das Polymer werden gleichzeitig Spektren, entsprechend des Spektroskopieverfahrens oder Fluoreszensspektren, des Ringes und dessen Umgebung aufgenommen. Diese Spektren werden per Computersystem aufgezeichnet und ausgewertet. Sie sind abhängig von der Struktur des Ringes.

Diese ist wiederum abhängig von der Gestalt des Monomers über das der Ring gerade wandert oder gezogen wird. Also kann das Monomer, das gerade durch den Ring wandert, anhand der Momentanspektren des Ringes identifiziert Werden. Die Zahl der aufgenommenen Fluoreszensspektren pro Zeiteinheit muß mindestens dreimal so groß sein, wie die Wanderungsgeschwindigkeit der Ringe über die Monomere entlang des Polymers. Die Einheit, aus Energiequelle (Fig. 1, 9) des verwendeten Spektroskopieverfahrens und Detektor (Fig. 1, 10), wird synchron mit der Front der wandernden Ringe entlang der Kammer (Fig. 1, 6) gezogen. Dies ist bei kurzen Analysekammern oder Polymeren nicht notwendig.

Diese Analysekammer (Fig. 2) besteht aus einer Detektionskammer (Fig. 2, 1) aus einem Material, z. B. Quarzglas oder aus einem anderen Material, das eine Detektion der Substanzen im inneren der Kammer zuläßt. An den Enden der Detektionskammer befindet sich jeweils ein elektrischer Pol (Fig. 2, 2), mit denen ein umpolbares und in seiner Feldstärke variables homogenes elektrisches Feld erzeugt werden kann. Zwischen den Polen befindet sich eine Halterung (Fig. 2, 3) in die das modifizierte Trägermaterial eingespannt werden kann. Senkrecht oder gewinkelt zum elektrischen Feld befindet sich eine Fluoreszenslichtquelle (Fig. 2, 4) oder eine der Art der Spektroskopie entsprechende Energiequelle, die die Detektionskammer durchstrahlen kann (Fig. 2, 3). Gegenüber dieser ist ein Fluoreszensdetektor (Fig. 2, 5) oder ein der Art der Spektroskopie entsprechender Detektor (Fig. 2, 5). Beide sind so angebracht, daß sie sich parallel zueinander entlang der Detektionskammer, mit Hilfe eines mechanischen oder elektronischen Systems, bewegen können. Dieses besteht aus Steuerschienen (Fig. 2, 6), entlang denen sich Energiequelle und Detektor des Analysesystems mit Hilfe von Steuer- bzw. Antriebsmotoren (Fig. 2, 7) bewegen. An der Detektionskammer befindet sich ein Zufluß (Fig. 2, 8) und ein Abfluß (Fig. 2, 9) für Flüssigkeiten die in der Detektionskammer benötigt werden. Zur Aufrechterhaltung konstanter Temperatur-, Druck- und Umgebungsbedindungen ist um die Detektionskammer eine Isolierkammer (Fig. 2, 10) angebracht. Diese ist mit mindestens zwei Versorgungseingängen (Fig. 2, 11) versehen. Sowohl die Polung und die Feldstärke, als auch die Bewegung der Energiequelle und des Detektors sowie die Aufnahme und Auswertung der Spektroskopiedaten wird durch Computersysteme bewerkstelligt, die mit entsprechenden Computerprogrammen ausgerüstet sind.

Das Gesamtsystem besteht aus mehreren Komponenten, diese können als externe oder interne Einheiten zusammengeschaltet sein. Die Detektionskammer (Fig. 3, 1) wird mit einem Thermoblock (Fig. 3, 2) und einem Versorgungsblock (Fig. 3, 3) verbunden. Für die Steuerung des elektrischen Feldes wird ein Steuergerät (Fig. 3, 4) verwendet. Zur Stromversorgung wird ein Stromgeber (Fig. 3, 5), der wiederum am allgemeinen Stromnetz angeschlossen ist verwendet, um Spannungsschwankungen verkleinern. Alle Komponenten werden über ein Computersystem (Fig. 3, 6) angesteuert und über dieses aufeinander abgestimmt. Das Computersystem (Fig. 3, 6) ist seinerseits mit einem Druckmedium (Fig. 3, 7) und einem Massenspeicher (Fig. 3, 8) verbunden.

Claims (9)

1. Verfahren zur Sequenzanalyse mit folgenden Schritten:

• - Binden von mindestens einer molekularen Kohlenstoffkette als Spacer an die Oberfläche eines Trägermaterials,
• - Überstülpen einer molekularen Ringstruktur über jeweils einen der Spacer,
• - kovalentes Binden der zu untersuchenden polymeren Moleküle an jeweils einen der Spacer,
• - Anlegen eines elektrischen Feldes, so daß die Ringstrukturen auf den Spacern einheitlich positio­ niert werden,
• - Umpolen des elektrischen Feldes, um die Ringstrukturen zu einer Wanderung über die zu unter­ suchenden polymeren Moleküle zu zwingen, und detektieren der Wanderung mittels Spektrosko­ pie.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Wanderung der molekularen Ringstrukturen durch eine Fluoreszenzdetektion spektroskopisch verfolgt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Wanderung der molekularen Ringstrukturen durch eine Fourier-Transformations-Infrarot-Spektroskopie verfolgt wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die molekulare Ringstruktur ein Cyclodextrinring ist, an dem zwei verschiedene Fluoreszenzfarbstoffmoleküle in alternierender Reihenfolge kovalent gebunden sind.

5. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 4 mit:

• - einer Analysenkammer,
• - einer Detektionskammer, die innerhalb der Analysenkammer angeordnet ist,
• - zwei Elektroden innerhalb der Detektionskammer, die von einem Stromgeber versorgt werden,
• - einem Halter für ein Trägermaterial, der vor einer der beiden Elektroden angeordnet ist,
• - einer Detektionsvorrichtung mit einer Energiequelle und mit einem Empfänger, welche entlang der Detektionskammer bewegbar sind und mit einem EDV-System, zur Steuerung des Stromge­ bers bezüglich Stärke und Richtung eines zwischen den beiden Elektroden gebildeten elektrischen Feldes, zur Steuerung der Bewegung der Detektionsvorrichtung entlang der Detektionskammer und zur Auswertung von mittels der Detektionsvorrichtung gewonnener Spektren.

6. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Analysenkammer von einer mit Versorgungseingängen versehenen Isolierkammer umgeben ist.

7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Detektions­ kammer aus Quarz oder Kunststoff besteht.

8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Detektionskammer einen Zufluß und einen Abfluß für Flüssigkeit aufweist.

9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Detektions­ kammer als Teil eines Gesamtsystems vorliegt, zu dem ein Thermoblock, ein Versorgungsblock, ein Steuergerät, ein Stromgeber, ein Zentralcomputer, ein Druckmedium und ein Daten­ speicher gehören.