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Verfahren zur Züchtung von im Menschen und Tierkörper parasitisch
vegetierenden Kleinlebewesen Durch die in der Patentschrift 17o 68o niedergelegten
grundlegenden Arbeiten von Dr. O t t o S c h m i d t ist ein Verfahren zur Züchtung
von im Menschen- und Tierkörper parasitisch lebenden Kleinlebewesen außerhalb des
tierischen Körpers bekannt geworden, welches darauf beruht, daß niedere Pflanzen
als Nährböden (Zwischenwirte) verwendet werden. Die Durchführung des Züchtungsvorgangs
soll nach dieser Patentschrift derart erfolgen, daß eine Reinkultur der niederen
Pflanze, z. B. von Mucor, auf einem sterilen Nährboden hergestellt und Sporen dieser
Kultur auf in sterilen Kulturgläsern befindliche Tumorstückchen übertragen werden.
Hierdurch gelangt man zu Stammkulturen, welche den Mucor und, in ihm vegetierend,
den Erreger enthalten. Durch überimpfung dieser Stammkultur auf geeignete Nährsubstrate,
kann man dann größere Mengen von aus Mucor und Parasit bestehenden Kulturen züchten:
Die nach längerem, z. B. 6- bis iowöchentlichem Stehenlassen gebrauchsfertigen Kulturen
werden dann schließlich noch durch Passieren eines groben Filters von voluminösen
Teilen der .Wirtspflanze befreit.
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Auf Grund langjähriger Untersuchungen und Versuche ist es gelungen,
dieses bekannte Verfahren, welches in seiner ursprünglichen Durchführungsweise umständlich
und in hohem Maße von Zufälligkeiten abhängig war und nur zu schwach konzentrierten,
mit erheblichen Mengen der niederen Pflanze verunreinigten Präparaten führten, so
zu verbessern, daß es auf einfachem und sicherem Wege zu hochwirksamen, von störenden
Nebenbestandteilen freien, in der Therapie mit ausgezeichnetem Erfolg verwertbaren
Präparaten führt.
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Zunächst wurde gefunden, daß es von Wichtigkeit ist, die Züchtung
des pathogenen Krankheitserregers in niederen Pflanzen bei Temperaturen, welche
unterhalb der Bluttemperatur (37° C) liegen, durchzuführen. Mit Vorteil verwendet
man solche Temperaturen, welche ein optimales Wachstum der als' Zwischenwirt dienenden
niederen Pflanze gewährleisten. Bei Verwendung von Mucor (Schimmelpilz) haben sich
z. B. Temperaturen unterhalb a8°, vorzugsweise solche zwischen io bis i8°, als vorteilhaft
erwiesen. Die als Ausgangsmaterial für die Züchtung der pathogenen Erreger in Betracht
kommenden Stoffe, wie z. B. Gewebestücke, Ödemflüssigkeit, Blut, Exsudat, enthalten
vielfach neben dem zu züchtenden Parasiten noch andere-Mikroorganismen. Durch die
Möglichkeit der Weiterzüchtung des erstrebten Parasiten in Symbiose mit niederen
Pflanzen unterhalb Bluttemperatur besteht nun die Möglichkeit, andersartige aus
den Ausgangsstoffen herrührende Mikroorganismen, welche nur bei Bluttemperatur gut
zur Entwicklung kommen, auszuschalten. Dabei werden auch solche Mikroorganismen,
welche unterhalb
Bluttemperatur an sich zu gedeihen vermögen, in
ihrer Entwicklung dadurch geschädigt, daß die bei der angewendeten Temperatur optimal
wachsenden niederen Pflanzen den zu schädigenden Mikroorganismen das Nährmedium
entziehen. Da die zu züchtenden pathogenen Erreger, insbesondere solche, welche
zur Bildung von Geschwülsten (Karzinom, Sarkom usw.) Veranlassung geben, sich sonst
nur bei Körperwärme entwickeln, war nicht vorauszusehen, daß sie bei der Symbiose
mit niederen Pflanzen, wie Mucor u. dgl., auch bei erheblich,niedrigeren Temperaturen
einen vollständigen Entwicklungszyklus durchzumachen vermögen. Weiterhin wurde gefunden,
daß der Zuckergehalt der Nährsubstrate, als welche Peptonzuckerbouillon, Erbsenzuckerbouillonagar
u. dgl. in Betracht kommen, für die vorliegenden Züchtungszwecke von beträchtlicher
Bedeutung ist. Es hat sich z. B. gezeigt, daß der Zuckergehalt von Nährbouillon,
Nährgelatine u. dgl. im allgemeinen 6 °/o nicht übersteigen soll. Im übrigen richtet
sich die Höhe des Zuckergehaltes nach den sonstigen Bestandteilen des Nährsubstrates,
z. B. dem Peptongehalt, und den jeweils angewendeten Arbeitsbedingungen. Außerdem
hat sich ergeben, daß die Verwendung reinen Zuckers nicht vorteilhaft ist. Dagegen
hat sich ungereinigter Zucker, z. B. die unter der Bezeichnung Traubenzucker im
Handel befindliche ungereinigte Glukose, als sehr geeignet für die Herstellung der
Nährsubstrate erwiesen. Ein gutes Wachstum wird z. B. bei Anwendung von Zuckermengen
zwischen 0,5 und 8 °i" erzielt; das Wachstumoptimum liegt im allgemeinen
zwischen o,8 bis 2 °/a Zuckergehalt. Weitere Untersuchungen haben ergeben, daß die
in Betracht kommenden Erreger vielfach schon im lebenden Körper mit niederen Pflanzen
oder pflanzlichen Kleinlebewesen in Gemeinschaft leben können. Auf Grund dieser
Erkenntnis hat es sich als möglich erwiesen, aus Körperbestandteilen erkrankter
Tiere oder Menschen die gesuchten Parasiten zusammen mit den niederen Pflanzen auf
verhältnismäßig einfachem Wege zu gewinnen und zu züchten und hierdurch das eingangs
erwähnte Züchtungsverfahren erheblich zu vereinfachen. Es bleibt dann auch außerhalb
des lebenden Körpers die Symbiose bestehen. Parasit und niedere Pflanze vermögen
sich ,auf geeigneten Nährböden, und zwar auch unterhalb Körpertemperatur zusammen
weiterzuentwickeln, derart, daß die als Zwischenwirt fungierende niedere Pflanze
sich von dem künstlichen Nährboden nährt, während die in dem Zwischenwirt lebenden,
.ihre Virulenz behaltenden Erreger ihre Nahrung aus der Wirtspflanze schöpfen. In
Ausübung des Verfahrens wird z. B. so vorgegangen, daß in einem keimfreien Raum
steril herausgenommene Geschwulststückchen oder steril entnommenes Blut oder Ödemflüssigkeit
von erkrankten Tieren oder Menschen in :geeignete flüssige oder feste Nährsubstrate,
z. B. Pepton-, »Liebig«-, Zuckerbouillon oder Erbsenzuckerbouillonagar, überimpft
werden. Es hat sich gezeigt, daß hierbei Kulturen erhältlich sind, welche niedere
Pflanzen und Erreger in Symbiose enthalten.
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In vielen Fällen hat es sich als vorteilhaft erwiesen, die Symbiose
von pathogenen Krankheitserregern mit niederen Pflanzen innerhalb eines lebenden
Organismus (Tierkörpers) künstlich herbeizuführen und dann aus dem Tierkörper Kulturen
zu gewinnen, welche Erreger und niedere Pflanze .in Symbiose enthalten. Man verfährt
z. B. derart, daß man geeigneten gesunden Tieren, z. B. Mäusen, Ratten, Meerschweinchen,
Kaninchen o. dgl., infektiöses Material, z. B. Aufschwemmungen von Tumorgewebe,
Blut, Exsudat usw., von an Tumoren erkrankten Menschen oder Tieren und außerdem
noch Kulturender niederen Pflanze, z. B. Aufschweminungen von Mucor, gleichzeitig
oder nacheinander einverleibt und z. B. durch Abimpfen von Blut :den pathogenen
Erreger und die niedere Pflanze, jetzt beide in Symbiose lebend, gewinnt und auf
geeignetem künstlichen Nährboden vorteilhaft bei -unter Blutwärme liegenden Temperaturen
züchtet. Die gegebenenfalls zusammen mit dem infektiösen Material in den tierischen
Organismus eingeführten nicht erwünschten Schmarotzer werden durch die Abwehrkräfte
des tierischen Organismus nach einiger Zeit abgebaut. Da aber weiterhin auch ein
verhältnismäßig schneller Abbau der niederen Pflanze erfolgt und auch der gesuchte
Parasit im Tierkörper beeinflußt wird, so ist es wichtig, die Abimpfung in Zeitpunkten
vorzunehmen, bei welchen der gesuchte Parasit und die niedere Pflanze, in Symbiose
lebend, noch 'erhaltensind.
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Im allgemeinen hat sich gezeigt, daß bei Abimpfung innerhalb der ersten
fünf Tage Kulturen erhalten werden, welche den Erreger und die niedere Pflanze,
in Symbiose miteinander lebend, enthalten. Wird dagegen die Abimpfung in späteren
Zeitpunkten vorgenommen, so kann man auf diesem Wege auch Reinkulturen des Erregers
erhalten. Anstatt die Symbiose von Parasiten und niederen Pflanzen erst im Tierkörper
herbeizuführen, kann -man z. B. auch derart verfahren, daß man Kulturen, welche
den Erreger und die niedere Pflanze in Symbiose enthalten, wie solche z. B. nach
der Patentschrift 17o 68o außerhalb des- Tierkörpers oder nach
vorliegender
Erfindung gezüchtet werden können, in den Organismus eines gesunden Tieres einführt.
In diesem werden dann zunächst die in mehr oder weniger großem Überschuß vorhandenen
niederen Pflanzen abgebaut, so daß man durch Abimpfung von dem Tier je nach Wahl
des Zeitpunkts der A.bimpfung Kulturen gewinnen kann, welche entweder den Erreger
noch in Symbiose mit der niederen Pflanze enthalten oder welche Reinkulturen des
Erregers darstellen.
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Zwecks Herstellung von Reinkulturen des F_rregers bzw. von den Erreger
gegenüber der niederen Pflanze vorwiegend enthaltenen Kulturen kann man z. B. derart
verfahren, daß man eine geeignete Kulturflüssigkeit mit Sporen der mit dem Erreger
infizierten niederen Pflanze, z. B. Mucor, impft. Bei Anwendung der eingangs erwähnten
niederen Temperatur, z. B. Zimmertemperatur, erfolgt rasche Keimung; die Keimschläuche
wachsen zu Mycelfäden, welche nach einigen Tagen, z. B. zwischen dem z. und 5. Tag,
sich als Wolke im unteren Teil der Flüssigkeit sammeln. In dieser Mycelwolke finden
sich zahlreiche Kohlensäurebläschen,- durch deren Auftrieb das ganze Mycel an die
Oberfläche der Flüssigkeit getrieben wird, woselbst Fruchtträger an die Luft entsandt
und Sporangien gebildet werden. Man verfährt nun derart, daß das Aufsteigen des
3\lycels an die Luft verhindert wird, was in einfachster Weise, z. B. durch Entfernung
der Kohlensäurebläschen z. B. durch mehrmaliges Schleudern oder Schütteln des Glases,
bewirkt werden kann. Hierdurch kann man zugleich eine Zerreißung von Mycelschläuchen
und anderer Teile der niederen Pflanze bewirken und den darin befindlichen Erregern
den Austritt in die Flüssigkeit gestatten. Zwecks Begünstigung der Trennung des
Erregers von der niederen Pflanze kann man an Stelle oder neben der mechanischen
Behandlung, z. B. durch Schütteln, auch noch thermische oder chemische Hilfsmittel
oder -Mittel beider Art zur Anwendung bringen, wie z. B. Erwärmen, und zwar vorteilhaft
auf nicht zu hohe Temperaturen, z. B. auf 28 bis q.o° C, Zusatz quellend wirkender
Stoffe, wie geringer Mengen von alkalischen Stoffen oder Salzen' o. dgl., z. B.
Kali- oder Natronlauge, Saponine oder schwache organische oder anorganische Säuren.
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Nachdem das Mycel sich wieder als geschlossene Wolke am Boden des
Kulturglases gesammelt hat, was in der Regel einige Stunden nach dem letzten Schütteln
geschehen ist, kann dasselbe z. B. unter Anwendung eines sterilen Häkchens entfernt
werden, oder die Flüssigkeit kann z. B. durch Abgießen oder Abhebern entfernt werden.
In der Flüssigkeit befindet sich nun der Erreger in seinem parasitären Stadium in
verschiedenen Entwicklungsformen. Die Flüssigkeit kann alsdann zu Immunisierungszwecken
oder zu Zwecken der Weiterzüchtung Verwendung finden.
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Die Herstellung von Reinkulturen kann z. B. auch derart erfolgen,
daß man gesunden Versuchstieren kleine Mengen des mit dem Erreger infizierten Mucors
oder z. B: nach vorstehendem Verfahren außerhalb des Tierkörpers gewonnene, im wesentlichen
nur den Erreger enthaltende Lösungen subkutan oder intravenös oder intraperitoneal
einspritzt. Durch die Ab-,vehrkräfte des gesunden tierischen Körpers werden die
Mucorsporen schnell abgebaut. Durch Abimpfung nach erfolgtem Abbau der Pilzsporen,
welcher je nach Wahl des Tieres und sonstigen Verhältnissen im allgemeinen nach
3 bis 5 Tagen erfol-en kann, und Übertragung des entnommenen Blutes oder sonstiger
Körperteile auf geeignete Nährsubstrate, z. B. solche der eingangs erwähnten Art,
gelangt man zu Reinkulturen des Erregers.
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Die Reinkulturen der Erreger werden im Gegensatz zu den Mischkulturen
von Erregern und niederen Pflanzen vorteilhaft bei Bluttemperatur oder Temperaturen,
welche nicht allzusebr darunter liegen, z. B. solchen zwischen 25 bis 37°,
gezüchtet. Zweckmäßig verfährt man' z. B. derart, daß das Nährsubstrat zuerst auf
Bluttemperatur gebracht und dann erst auf dasselbe abgeimpft wird. Weiterhin hat
sich als vorteilhaft erwiesen, die Entwicklung dieser Kulturen dadurch zu för= dern,
daß man der Luft (dem Luftsauerstoff) guten Zutritt gewährt, was z. B. durch Verwendung
flacher Gefäße, in welchen das Nährsubstrat eine große freie Oberfläche besitzt,
geschehen kann.
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Eine Möglichkeit zur Steigerung der Virulent bzw. zur Gewinnung von
Reinkulturen des Erregers besteht weiterhin darin, daß infektiöses Material und
Bestandteile von niederen Pflanzen, z. B. Sporen von Mucor, oder bereits vorhandene
Kulturen, welche den Erreger und die niedere Pflanze in Symbiose enthalten, in ein
mehrfach durchlöchertes; mit einem Überzug von Kollodium o. dgl. versehenes kleines
Röhrchen aus Glas o. dgl. steril eingebracht werden, worauf die Einführungsöffnung
ebenfalls mit z. B. Kollodiurn verschlossen wird. Dieses Röhrchen wird nun in die
Bauchhöhle eines gesunden Tiers eingenäht. Die dort befindlichen Säfte gelangen,
durch die Überzugsschicht hindurchgehend, in das Innere des Röhrchens, während die
im tierischen Organismus vorhandenen, an sich zur Schädigung des Erregers geeigneten;
Schutzkörper, wie Lymphocyten und
Phagocyten, die Kollodiumschicht
nicht -zu durchdringen vermögen. Es entwickelt sich nun in dem Röhrchen. der Erreger
gewissermaßen unter natürlichen Bedingungen in Gegenwart tierischer Säfte, aber
unter Vermeidung von Stoffen, welche zur Schädigung des Erregers führen könnten.
Nach einiger Zeit, z. B. nach 3 bis 8 Tagen, werden die Röhrchen entfernt und der
Inhalt auf künstliche Nährsubstrate, z. B. solche der eingangs erwähnten Art, übergeimpft.
Man kann den @% organg mehrfach wiederholen, indem man die hieraus entwickelten
Kulturen nach einer gewissen Zeit, z. B. nach einigen Wochen, wieder in Kollodiumsäckchen
einführt, diese in die Bauchhöhle bringt und nach Entnahme den Inhalt wiederum auf
Nährsubstrate überimpft. Durch diese Methode kann man, wie gefunden wurde, die Virulenz
der Erreger erheblich steigern. Da unter den gegebenen Bedingungen das Wachstum
des Erregers begünstigt wird, während das Wachstum der niederen Pflanze zurückgedrängt
wird, kann man weiterhin auf diesem Wege zu Kulturen gelangen, welche nur aus dem
pathogenen Erreger bestehen. . Mit Hilfe der so gewonnenen Kulturen kann man dann
besonders wirksame Vaccine oder Seren gewinnen.
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Es hat sich gezeigt, daß die im Tierkörper gezüchteten Reinkulturen
des Erregers Neigung zeigen, die saprophytische; nicht infektiöse Form anzunehmen.
Weiterhin wurde gefunden, daß man diese saprophytische Form wieder in die parasitische
virulente Form zurückverwandeln kann, und zwar dadurch, daß man dem, Erreger als
Nährboden niedere Pflanzen oder Abbauprodukte derselben darbietet, z. B. derart,
daß man Sporen von Mucor einimpft und Mischkulturen auf geeigneten Nährsubstraten
züchtet.
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Die Herstellung von wirksamen Vaccinen für die aktive Immunisierung
gegen infektiöse bzw. parasitäre, insbesondere geschwulstbildende Krankheiten, kann
z. B. in folgender Weise erfolgen: Man impft von den Stammkulturen, z. B. solchen,
welche den Erreger in Symbiose mit der niederen Pflanze enthalten, eine Reihe von
mit Nährsubstraten beschickten Gefäßen, z. B. r, bis 2-Liter-Flaschen, welche je
300 ccm Nährflüssigkeit enthalten und läßt sie bei Temperaturen zwischen 18 und
25° C stehen. Nachdem die niedere Pflanze sich gut entwickelt hat und den Erregern
einen guten Nährboden bietet, entwickeln sich die letzteren in großen Mengen, wobei
sie in der Hauptsache in der Wirtspflanze bleiben, während ein kleiner Prozentsatz
in den künstlichen Nährboden übergeht. Wenn die Entwicklung ihren Höhepunkt erreicht
hat, z. B. nach q. bis 6 Wochen, wird die einen üppigen Rasen bildende Nährpflanze
mit den darin lebenden Erregern herausgenommen und zerkleinert. Weiterhin wird der
Bodensatz, welcher ebenfalls Teile der niederen Pflanze und Erreger enthält, z.
B. durch Abhebern oder Abgießen der Hauptflüssigkeitsmenge und Zentrifugieren der
restlichen Menge gewonnen. Hierauf werden die gesamten .festen Bestandteile getrennt
oder zusammen einer Behandlung unterworfen, welche eine möglichst weitgehende Trennung
des Erregers von der niederen Pflanze gestattet. Man verfährt z. B. derart, daß
man das Produkt in einer geeigneten Flüssigkeit, z. B. Wasser, oder ihrer eigenen
Kulturflüssigkeit, welche geringe Mengen von quellend wirkenden Substanzen, z. B.
geringe von Salzen oder alkalischen Stoffen, z. B. o,5 g auf roo ccm. Flüssigkeit
enthalten, erwärmt, z. B. auf Temperaturen von 3o bis q.2° C, und das Gemisch dann
einer mechanischen Behandlung, z. B. in einem Schüttelapparat, unterwirft. Zweckmäßig
wird Erwärmung und Schütteln mehrmals abwechselnd vorgenommen. Durch diese Behandlung
werden die Bestandteile der niederen Pflanze zum Schwellen und Platzen gebracht,
so daß die Erreger austreten und in die Flüssigkeit gelangen können, woselbst sie
zum Teil- zur Auflösung gebracht, zum Teil. erhalten bleiben. Nach dieser Behandlung
wird die Flüssigkeit z. B. durch Zentrifugieren, Filtrieren und ähnliche Behandlungsmethoden
von den festen Bestandteilen getrennt und als Vaccine verwendet. Gegebenenfalls
kann man die Flüssigkeit auf gewünschte Stärke einstellen, z. B. durch Zusatz passender
Mengen der aus den Kulturkolben gewonnenen, von festen Bestandteilen befreiten,
ebenfalls noch Erreger und Abbauprodukte derselben enthaltenden Flüssigkeit. Das
Verfahren kann mit oder ohne Quellungsmittel oder unter Anwendung von nur einem
oder verschiedenen Quellungsmitteln zur Ausführung gelangen, wobei die jeweilige
Art des Verfahrens von dem beabsichtigten Endzweck (z. B. Erhalten von weniger oder
mehr Extraktstoffen, Abbauprodukten und ähnlichem) abhängt.
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Bei Durchführung des vorstehend beispielsweise erläuterten Trennungsverfahrens
ist es nicht nötig, alle die Trennung des Erregers von der niederen Pflanze begünstigenden
Maßnahmen anzuwenden. Man kann z. B. auch bei Verzicht auf den Zusatz von Chemikalien
oder bei Verzicht auf die Mitwirkung von Wärme gute Vaccine erhalten.
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Die Erfindung ermöglicht schließlich noch die Gewinnung von Seren,
z.. B. derart, daß man gesunden Tieren Kulturen des Erregers, wie solche nach vorstehendem
Verfahren gewonnen
werden können, z. B. Mischkulturen von niederen
Pflanzen und Erregern oder auch Reinkulturen des letzteren nach üblichen Methoden,
z. B. in steigenden Dosen einverleibt. Es bilden sich dann Antikörper unter Abbau
der gegebenenfalls mit dem Erreger eingeführten niederen Pflanzen. - Durch Abimpfung
von Blut und Weiterverarbeitung desselben nach üblichen Methoden kann man dann hochwertige
Immunseren gewinnen. In gegebenen Fällen kann man auch andere Teile des tierischen
Körpers, z. B. Drüsen und drüsenartige Organe, zur Im.pfstoffgewinnung verwenden
oder mitverwenden.