DE60002821T2

DE60002821T2 - Reversibel photokuppelnde nukleinsäure und phosphoramidit

Info

Publication number: DE60002821T2
Application number: DE60002821T
Authority: DE
Inventors: Isao Kyoto-shi SAITO; Kenzo Kyoto-shi FUJIMOTO; Shigeo Moriguchi-shi MATSUDA
Original assignee: Japan Science and Technology Corp
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 1999-08-27
Filing date: 2000-08-24
Publication date: 2004-05-06
Anticipated expiration: 2020-08-25
Also published as: DE60002821D1; US6593088B1; EP1125945B1; EP1125945A4; EP1125945A1; TWI239337B; WO2001016151A1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäuren und Phosphoramidite zur reversiblen Photoligation. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung neue Nukleinsäuren zur reversiblen Photoligation, die bei ihrer Anwendung auf Antisense-DNA, antigene DNA, photogenetische diagnostische Therapie und bei der Analyse von DNA-Protein-Wechselwirkungen und dergleichen brauchbar sein und verwendet werden können, um die Bildung und spezifische Spaltung von Ligationsstrukturen in biofunktionalen Molekülen unter Verwendung von Licht zu kontrollieren; die vorliegende Erfindung betrifft auch Phosphoramidite, die zur Synthese solcher Nukleinsäuren brauchbar sind, sowie Verfahren zur Photoligation und Photospaltung, wobei solche Nukleinsäuren verwendet werden.
Stand der Technik
Es ist bekannt, dass für die Bestimmung von Biofunktionen und von Bioaktivitätsmechanismen genau so wie für die Erzeugung bioaktiver Substanzen es wichtig ist, die Ligation und lokale Spaltung zwischen DNAs, RNAs, PNAs und Proteinen zu kontrollieren.
Beispielsweise ist es für die Erforschung von Antisense-DNAs, antigenen DNAs und genetischer diagnostischer Therapie, und für die Bestimmung von Wechselwirkungen zwischen DNA-Protein sowie für die entsprechende Kontrolle der Struktur von Biomolekülen sehr wichtig, die Bildung und die Spaltung der Ligationsstrukturen von DNA-DNA, DNA-RNA, DNA-PNA oder DNA-Protein zu kontrollieren.
Daher wurden viele Mittel zur Ligation und Spaltung studiert, und Verfahren, an denen eine Photobestrahlung beteiligt ist, werden ebenfalls untersucht.
Die bislang beschriebenen Verfahren machen allerdings Probleme, so z.B. die niedrige Ausbeute an Ligationsprodukt von etwa 40% und die Erzeugung verschiedener Nebenprodukte. Ferner sind Beispiele für Verfahren, in denen die ligierten Stellen spezifisch gespaltet werden, nicht bekannt.
Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Endung, die oben beschriebenen Probleme der herkömmlichen Verfahren zu lösen und neue technische Mittel zur Verfügung zu stellen, die eine selektive, hohe Ausbeute an Ligationsprodukt und eine selektive Photospaltung der ligierten Seite ergeben und eine freie und reversible Kontrolle von Photoligation und Photospaltung möglich machen.
EP-A-0324616 offenbart Polynukleotidsonden mit Photoreaktiven funktionalen Gruppen auf Basis von Cumarin.
Zur Lösung besagter Probleme betrifft die vorliegende Erfindung erstens eine Nukleinsäure zur reversiblen Photoligation der Formel (I):
Zweitens wird auch ein Phosphoramidit der folgenden Formel (2):
zur Verfügung gestellt.
Weiterhin betrifft die vorliegende Endung drittens ein Verfahren zur Photoligation, wobei ein System, das obige Nukleinsäure zur reversiblen Photoligation und ein biofunktionales Polymer enthält, bestrahlt wird, um die Ligationsstruktur zu bilden. Viertens wird ein Verfahren zur Photospaltung zur Verfügung gestellt, wobei die zwischen einer Nukleinsäure zur reversiblen Photoligation und einem biofunktionalen Polymer gebildete ligierte Stelle durch die Bestrahlung mit Licht bei einer kurzen Wellenlänge gespalten wird.
Indem man die obenbeschriebene erfindungsgemäße Nukleinsäure zur reversiblen Photoligation, d.h. eine ein photoligierendes Nukleosid enthaltende DNA bestrahlt, wird 1) die Ligation und Spaltung von DNA-DNA, DNA-RNA, DNA-PNA und DNA-Protein ermöglicht, und Anwendungen in a) Antisense-DNA, b) antigene DNA, c) fotogenetischer diagnostischer Therapie und d) der Analyse von DNA-Protein-Wechselwirkungen können entwickelt werden.
Außerdem wird erfindungsgemäß eine hohe Ausbeute an Ligationsprodukt von 95% oder höher erhalten, und die spezifische Spaltung der ligierten Stelle durch Bestrahlung wird ebenfalls ermöglicht.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt ein Absorptionsspektrum als Beispiel für eine reversible Photoligations- und Photospaltungsreaktion.
Der beste Weg zur Ausführung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung beinhaltet die obenbeschriebenen Charakteristika; nachstehend ist der beste Weg zur Ausführung der Erfindung beschrieben.
Die erfindungsgemäße Nukleinsäure zur reversiblen Photoligation der obenbeschriebenen Formel (1 ), d.h. eine ein fotoligierendes Nukleosid enthaltende DNA, besitzt eine charakteristische Struktur, die an der 5-Position des Pyrimidinrings eine Vinylgruppe beinhaltet. Dadurch dass die Vinylgruppe in der Struktur vorhanden ist, wird die Kontrolle von Ligation oder Spaltung mit dem damit paarenden biofunktionalen Polymer wie DNA, RNA, PNA oder Protein unter Verwendung von Licht möglich. Die Nukleinsäure zur reversiblen Photoligation kann auch als eine funktionale Nukleinsäure, die Vinylcytosin enthält, bezeichnet werden. Die Nukleinsäure zur reversiblen Photoligation kann auch weitere annehmbare Substituenten am Pyrimidinring und der Nukleosidregion beinhalten; des weiteren können die Aminogruppe (NH₂) und die Hydroxylgruppe (OH) mit einer beliebigen zulässigen Schutzgruppe geschützt sein. Derivate der Nukleinsäure werden von der vorliegenden Erfindung miterfasst.
Die erfindungsgemäße, photoligierende Nukleinsäure der obenbeschriebenen Formel (1) kann auf einfache Art und Weise beispielsweise auf dem folgenden Weg über ein Phosphoramidit der obenbeschriebenen Formel (2) synthetisiert werden.
Beispielsweise wird in Schritt 1 ein phosphitylierendes Reagens mit einem 5-Vinyldeoxyurtdin-DMTr umgesetzt, wodurch eine Vinylcytosinamidit-Vorstufe gebildet wird, die dann mit 1,2,4-Triazol umgesetzt wird. In diesem Fall gehören zu phosphitylierenden Reagenzien beispielsweise die folgenden:
Des weiteren können in Schritt 2 DNA-Oligomere mit einer Festphasensynthese in einem DNA-Synthesegerät synthetisiert werden.
Die Photoligation wird in Gegenwart biofunktionaler Polymere wie DNA, RNA, PNA oder Protein, an welche die Nukleinsäure ligiert wird, durch Photobestrahlung ermöglicht. Andererseits kann eine Photospaltung als Spaltung mit Spezifität für die ligierte Stelle durchgeführt werden, indem man Licht mit kürzerer Wellenlänge einstrahlt. Beispielsweise kann die Photoligation durch Photoexcitation bei einer Wellenlänge, die länger als 330 nm ist, durchgeführt werden, während die Photospaltung durch Photoexcitation bei einer Wellenlänge, die kürzer als 320 nm ist, durchgeführt werden kann.
Das Verfahren zur Photobestrahlung kann unter diversen Mitteln ausgewählt werden, wobei es sich beispielsweise um die Verwendung eines Trans-Illuminators handelt.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele genauer beschrieben.
Beispiele
<Beispiel 1> (Synthese)
Eine funktionale Nukleinsäure, die Vinylcytosin enthielt, wurde als erfindungsgemäße, reversibel fotoreaktive Nukleinsäure synthetisiert, indem man die Schritte 1 und 2 des oben beschriebenen Reaktionsschemas vollzog.
(a) Stufe 1
2,0 ml einer Lösung eines phosphitylierenden Reagens (98,0 μL, 0,309 mmol) und 0,5 M Tetrazol in CH₃CN (2,0 mL) wurden zu einer Lösung von 5-Vinyldeoxyuridin-DMTr (166 mg, 0,298 mmol) in CH₃CN gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 1 Stunde gerührt, dann extrahiert, wonach die organische Phase getrocknet und mit CH₃CN gekocht wurde, was eine Vinylcytosinamidit-Vorstufe (228 mg) ergab. Anschließend wurde die Vinylcytosinamidit-Vorstufe bei 0°C in drei Portionen zu einer CH₃CN-Lösung von Phosphortrichlord (0,32 g, 2,10 mmol) und 1,2,4-Triazol (0,667 g, 9,676 mmol) gegeben und 3 Stunden gerührt. Dann wurde extrahiert; die erhaltene organische Phase wurde getrocknet und mit CH₃CN gekocht, was 95,7 mg (0,118 mmol) Vinylcytosinamidit mit einer Ausbeute von 75% ergab.
Tabelle 1
¹H-N-MR (400 MHz, CDCl₃), d 2,21 (ddd, J = 12.1 Hz, J = 7,4 Hz, J = 6,3 Hz, 1H, H-2'b), 2,35 (ddd, J = 12,1 Hz, J = 6,1 Hz, J = 3,1 Hz, 1H, H-2'a), 2,95 (dd, J = 10,6 Hz, J = 3,4 Hz, 1H, H-5'), 3,38 (dd, J = 10,6 Hz, J = 3,4 Hz, 1H, H-5'), 3,71 (s, 6H, OCH₃x2), 3,90–3,99 (m, 1H, H-4'), 4,45-4,48 (m, 3H, H-3'), 4,86 (dd, J = 10,2 Hz, 2,0 Hz, 1H, Vinyl trans), 5,60–5,73 (m, 1H, Vinyl cis. H-1'), 6,29 (dd, J = 7,4 Hz, J = 6,1 Hz, 1H, H-1'), 6,73–6,77 (m, 4H, H-b zu OCH₃x4), 7,17-7,28 (m, 9H, Phenyl, 7,29–7,32 (m, 1H-CH=CH₂), 7,58 (s, 1H, H-6), 8,23 (bs, 1 N, NH).
³¹P-NMR (CDCl₃, 85% – H₃PO₄ in D₂O ext. 0 ppm) d 149,811 & 150,386 (Diastereomer der Produkte).
(b) Schritt 2
Die in Schritt 1 erhaltene CH₃CN-Lösung des Vinylcytosinamidits (0,1 M, 3 mL) wurde einem automatischen DNA-Synthetisiergerät zugeführt, und DNA-Oligomere wurden nach herkömmlichen Festphasen-Syntheseverfahren synthetisiert, ausgeschnitten, entschützt und mit Hochleistungsflüssigchromatographie gereinigt.
Die erhaltene Verbindung wurde mittels Molekulargewichtsbestimmung mit einem ESI-TOF-Verfahren identifiziert.
<Beispiel 2> (Reversible Photoligation und Photospaltung)
Das Zieloligomer (5'-TGTGCT-3', 20 mM) wurde mit einem Vinylcytosin enthaltenden Oligomer (5'-VCGCGTG-3', 20 mM) in Gegenwart eines Templatoligomers (5'-CACGCGAGCACA-3', 25 mM) vermischt und in einem 500 mM Cacodylsäure-Puffer (50 mM, pH 7,0) bei 366 nm unter Verwendung eines Trans-Illuminators bestrahlt. Die Photoligation der Oligomere fand mit einer Ausbeute von 90% oder höher statt (1 a) und b)).
Anschließend wurde die Lösung bei 302 nm unter Verwendung eines Trans-Illuminators bestrahlt. Die Photospaltung des Oligomers gelang nahezu quantitativ (siehe 1 b) und c)).
Das Molekulargewicht von 5'-VCGCGTG-3' wurde mit ESI-TOFF bestimmt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 2 gezeigt.
Tabelle 2
ESI-TOFF-Masse berechnet für C₈₀H₇₅N₂₃O₃₅P₅(M-H), 1832.36; gefunden, 1832,34
Gewerbliche Anwendbarkeit
Wie oben im Detail beschrieben, stellt die vorliegende Erfindung eine neue Technik zur Verfügung, die eine hohe Ausbeute an Ligationsprodukt, eine spezifische Photospaltung ligierter Stellen, und eine freie und reversible Kontrolle von Photoligation und Photospaltung ermöglicht.

Claims

Nukleinsäure zur reversiblen Photoligation der Formel (1):
Nukleinsäure nach Anspruch 1, worin DNA in Formel (1) für ein DNA-Oligomer steht.
Phosphoramidit der folgenden Formel (2):
Verfahren zur Synthese einer Nukleinsäure nach Anspruch 1 über das Phosphoramidit nach Anspruch 3.
Verfahren zur Photoligation, wobei ein System, das die Nukleinsäure zur reversiblen Photoligation nach Anspruch 1 und ein biofunktionales Polymer enthält, bei einer Wellenlänge, die länger als 330 nm ist, bestrahlt wird, um die Ligationsstruktur davon zu bilden.
Verfahren zur Photospaltung, wobei die zwischen der Nukleinsäure zur reversiblen Photoligation nach Anspruch 1 und einem biofunktionalen Polymer gebildete ligierte Stelle bei einer kurzen Wellenlänge bestrahlt wird, wobei die kurze Wellenlänge kürzer als die zur Photoligation verwendete Wellenlänge ist.
Verfahren zur Photospaltung nach Anspruch 6, wobei die kurze Wellenlänge eine Wellenlänge kürzer als 320 nm ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, wobei das biofunktionale Polymer ein unter DNA, RNA, PNA und Protein ausgewähltes Polymer ist.