DE60009083T2

DE60009083T2 - NEUE ATPase-TESTS

Info

Publication number: DE60009083T2
Application number: DE60009083T
Authority: DE
Inventors: Peter White
Original assignee: Boehringer Ingelheim Canada Ltd
Current assignee: Boehringer Ingelheim Canada Ltd
Priority date: 1999-06-17
Filing date: 2000-06-15
Publication date: 2004-07-29
Anticipated expiration: 2020-06-16
Also published as: DE60009083D1; HUP0201512A2; IL146535A0; PT1203234E; JP2003502074A; EP1203234A1; US20020102626A1; AU773610B2; HUP0201512A3; CA2374455C; DK1203234T3; JP3754367B2; NZ516654A; ATE262180T1; AU5383100A; CA2374455A1; WO2000079277A1; EP1203234B1; MXPA01012921A; US6492181B1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft einen neuen ATPase-Test. Insbesondere betrifft die Erfindung ein neues Verfahren zum Nachweisen und Messen der Menge an Orthophosphat, die durch Hydrolyse von ATP oder eines anderen phosphathaltigen Moleküls freigesetzt wird. Insbesondere betrifft die Erfindung ein neues Verfahren zum Messen der ATPase-Aktivität des E1-Helicase-Enzyms aus dem humanen Papillomavirus (HPV).
Hintergrund der Erfindung
Mit HPV in Zusammenhang stehende Krankheiten
Die humanen Papillomaviren (HPVs) sind kleine DNA-Viren, die Zellen der kutanen und mukosalen Epidermis infizieren. Es wurden über 80 verschiedene HPV-Genotypen charakterisiert. Einige Typen, wie HPV-1, -2, -3, -4 und -10 verursachen kutane Läsionen, die als Warzen oder Papillome bekannt sind. Diese Wachstumserscheinungen sind gutartig und selbstbeschränkend. Sie finden sich an Händen und Füßen von 7 bis 10% der allgemeinen Bevölkerung. Von größerer medizinischer Bedeutung sind HPV-Typen, die den anogenitalen Trakt infizieren. Diese Genotypen werden unter Bezugnahme auf ihre maligne Weiterentwicklung als "wenig gefährlich" oder "stark gefährlich" bezeichnet.
Sogenannte HPVs von geringer Gefährlichkeit sind mit genitalen Warzen oder Condiloma acuminata verbunden. Beispielsweise finden sich die HPV-Typen 6 und 11 bei mehr als 90% von gutartigen genitalen Läsionen und sind sehr selten mit einer malignen Transformation verbunden. Sie stellen aber dennoch ein ernsthaftes allgemeines Gesundheitsproblem dar. Etwa 1% der sexuell aktiven Erwachsenen in den USA weisen sichtbare genitale Warzen auf, wobei aber in zahlreichen anderen Fällen die Infektion subklinisch ist. Tatsächlich wird angenommen, dass weitere 15% der Bevölkerung im Alter von 15 bis 49 Jahren molekulare Anzeichen einer HPV-Infektion in Form von viraler DNA aufweisen, die durch den Polymerase-Kettenreaktionstest (PCR-Test) nachweisbar ist. Tatsächlich wird HPV als das am häufigsten auf sexuellem Wege übertragene virale Mittel in den USA und in Großbritannien eingestuft. Das Auftreten nimmt ständig zu.
Eine Infektion mit gefährlichen HPV-Typen, wie 16, 18, 31 und 33 ist in starkem Maße mit der Entwicklung von anogenitalen malignen Erscheinungen verbunden, insbesondere mit Zervikalkrebs. Die HPV-Typen 16 und 18, die selten in gutartigen genitalen Läsionen auftreten, sind bei etwa 70% von sämtlichen invasiven Karzinomen des Gebärmutterhalses nachweisbar. Die Verbindung zwischen HPV und anogenitalem Krebs ist gut dokumentiert; neuere Untersuchungen haben ergeben, dass fast 90% der zervikalen Karzinome HPV-DNA enthalten.
Derzeitige Therapien und das Bedürfnis nach einer virusspezifischen Behandlung
Trotz der weiten Verbreitung von HPV-Infektionen und ihrer möglichen lebensbedrohenden Konsequenzen wurde bisher kein virusspezifischer Inhibitor beschrieben. Das Auffinden von antiviralen Arzneistoffen für HPV hat sich bisher als Folge der Schwierigkeiten, die bei der Vermehrung des Virus im Laboratorium auftreten, als recht schwierig erwiesen.
Alle derzeitigen Therapien von HPV-Infektionen stützen sich auf die nicht-spezifische Zerstörung oder Entfernung von infiziertem Gewebe. Anerkannte chirurgische Maßnahmen bedienen sich der Verwendung von Trockeneis, flüssigem Stickstoff, der CO₂-Lasertherapie, der elektrischen Verschorfung oder der lokalen Exzision. Ferner werden verschiedene zytotoxische Mittel zur Zerstörung von Gewebe verwendet, z. B. Salicylsäure, Trichloressigsäure, Podophyllin, Colchicin, Bleomycin und Cantharidin.
Obgleich diese Maßnahmen aufgrund der Krebsgefahr für die Behandlung von hochriskanten HPVs besonders empfehlenswert sind, sucht man nach weniger invasiven Behandlungen zur Beherrschung von Genotypen von geringer Gefährlichkeit. Verbindungen, die das Immunsystem stimulieren, wurden mit dem Ziel untersucht, die spontane Regression, die bei gutartigen Läsionen häufig zu erkennen ist, zu reproduzieren. Imiquimod, ein derartiger Modifikator der Immunantwort, hat kürzlich klinische Tests durchlaufen und die Zulassung zur Behandlung von mit HPV verbundenen genitalen Warzen erhalten.
Patienten mit genitalen Warzen zeigen häufig hohe Rückfallraten, üblicherweise 30 bis 90%, im Anschluss an nicht-spezifische Behandlungen, wie chirurgische Eingriffe. Ein derart geringer Wirkungsgrad ist eine Folge der unvollständigen Beseitigung von HPV-DNA oder der Anwesenheit des Virus im normal erscheinenden Gewebe in der Nachbarschaft des Papilloms. Offensichtlich besteht ein erhebliches Bedürfnis nach einer wirksamen, virusspezifischen Therapie von HPV-Infektionen. Dieses Bedürfnis wurde bisher nicht befriedigt.
Virale DNA-Replikation und E1
Die semikonservative DNA-Replikation ist ein komplizierter Vorgang, der durch zahlreiche Enzyme und Hilfsproteine vermittelt wird. Helicasen sind Enzyme, die während der DNA-Replikation wirken und das Entwinden von Duplex-DNA vor der Replikationsgabelung katalysieren. Sie sind in prokaryontischen und eukaryontischen Zellen sowie in den meisten Viren sehr verbreitet. Der genaue Mechanismus, gemäß dem Helicasen die Bindung und Hydrolyse von ATP in mechanische Energie umwandeln, um das Entwinden von DNA und ihre gleichzeitige Bewegung entlang der Nucleinsäure anzutreiben ist noch nicht vollständig geklärt.
Das 72 kDa-HPV-E1-Protein wurde als ein Mitglied der Helicase-Oberfamilie III zusammen mit dem T-Antigen von Simianvirus 40 (SV40 TAg), zu dem es strukturell und funktionell homolog ist, klassifiziert. E1 und Tag gehören zu einer bemerkenswerten Untergruppe von viralen DNA-Helicasen, die die Fähigkeit besitzen, DNA-Sequenzen an der viralen Replikationsursprungsstelle (ori) zu erkennen und spezifisch zu binden. Während ferner die meisten DNA-Helicasen für ihren Zutritt einen Bereich mit einzelsträngiger DNA benötigen, können diese Proteine die Entwindung einer vollständig doppelsträngigen DNA einleiten, vorausgesetzt, dass sie eine on enthält.
Molekulare Ereignisse an der HPV-Replikationsursprungsstelle
Humane Papillomaviren enthalten etwa 8 kb doppelsträngige ringförmige DNA. In den Basalzellen der Epidermis wird das Genom repliziert und extrachromosomal auf einem stationären Niveau von etwa 20–100 Kopien pro Zelle gehalten. Eine hochgradige Amplifikation des Genoms erfolgt nur, nachdem die Zelle endgültig differenziert und in die oberen Epithelschichten gewandert ist.
In einem zellfreien DNA-Replikationssystem kann das E1-Protein die ursprungsspezifische DNA-Replikation in ausreichenden Konzentrationen von selbst steuern, wenn es mit dem vollständigen Komplement von Wirtsreplikationsproteinen, einschließlich DNA-Polymerase-α-Primase-Enzym, bereitgestellt wird. Jedoch wird die Replikation in starkem Maße durch das virale E2-Protein stimuliert, und bei Grenzkonzentrationen von E1 wird die in vitro-Replikation vollständig E2-abhängig. Dies ist eine Folge davon, dass E1 eine relativ geringe Affinität für seine DNA-Bindungsstelle aufweist. E2 unterstützt die Lokalisierung von E1 an der Ursprungsstelle, indem es als Hilfsprotein wirkt. Die E1- und E2-Bindungsstellen an der viralen ori-Stelle befinden sich in enger Nachbarschaft innerhalb eines Bereichs von etwa 100 bp voneinander. Der Carboxy-Terminus von E2 bindet seine Palindromstelle an DNA, während der Amino-Terminus E1 bindet und somit E1 an die Bindungsstelle bringt.
E1 als Ziel für eine antivirale Therapie
In letzter Zeit sind pharmazeutische Firmen dazu in der Lage, ihre Screeningprogramme für antivirale Verbindungen erheblich zu erweitern und zu beschleunigen, was eine Folge der Fortschritte in der Molekularbiologie darstellt. Viren werden nunmehr routinemäßig auf dem molekularen Niveau geprüft, um spezifische Inhibitoren von viruskodierten Genprodukten aufzufinden.
Für verschiedene Viren stellen Enzyme, wie Polymerasen, Kinasen und Proteasen, Ziele für die Hemmung dar. Im Gegensatz dazu ist unter den etwa 8 verschiedenen Proteinen, die durch das HPV-Genom kodiert werden, die E1- Helicase das einzige Protein mit enzymatischer Aktivität (Fields et al., Fields Virology, 3. Auflg., Lippincott-Raven, Philadelphia, (1996), Kapitel 65 und die dort zitierte Literatur). E1 zeigt eine ori-spezifische DNA-Bindungsaktivität, eine E2-Bindungsaktivität, eine ATPase-Aktivität und eine DNA-Helicase-Aktivität, die alle unabhängig voneinander auf potentielle Inhibitoren untersucht werden können. Ferner ist es von sämtlichen Papillomavirus-Proteinen am stärksten konserviert, so dass ein Inhibitor von E1 vermutlich gegen zahlreiche HPV-Typen wirksam wäre.
Es sind Screening-Untersuchungen mit hohem Durchsatz bekannt, die das Auffinden von Inhibitoren der Helicase-Aktivität von E1 ermöglichen (WO 99/57283, 11. November 1999). Obgleich ATP zum Antreiben der E1-Helicase-Aktivität erforderlich ist und bei der Reaktion zugesetzt wird, kann dieser Helicase-Test nicht zur Identifizierung von kompetitiven Inhibitoren der E1-ATPase-Funktion herangezogen werden. Dies ist ein direktes Ergebnis des sehr geringen K_m-Wertes der ATPase, z. B. etwa 10 μM für HPV-11-E1, und der Tatsache, dass der Helicase-Test routinemäßig mit 300 μm–1 mM ATP durchgeführt wird. Es muss ein empfindlicherer Test entwickelt werden, wenn die ATP-Bindungsstelle von E1 das Ziel der Hemmung sein soll.
Bestehende ATPase-Tests
Die Helicase-Aktivität ist praktisch immer mit Nucleosid-triphosphatase-Aktivität verbunden (Matson et al., Ann. Rev. Biochem., Bd. 59 (1990) S. 289). Die enzymatische ATP-Hydrolyse wird nach verschiedenen Verfahren gemessen, einschließlich kolorimetrische Reaktionen. In sämtlichen Fällen werden enzymatische Reaktionen gemäß enzymspezifischen Vorgehensweisen durchgeführt, wobei die Reaktionsbedingungen nicht vom Nachweisverfahren abhängig sind (ausgenommen die Zugabe von radioaktiv markiertem ATP). Das Nachweisverfahren für die verschiedenen Tests unterscheidet sich folgendermaßen:
Dünnschichtchromatographie:
Der Einbau von [α-³³P]- oder [γ-³³P]-ATP in das Substrat für eine ATPase-Reaktion führt zur Freisetzung von radioaktiv markiertem Phosphat oder ADP. Aufgrund ihrer unterschiedlichen Polarität können ATP, ADP und Phosphat mit [³³P]-Markierung dünnschichtchromatographisch in einem Laufmittel (z. B. Lithiumchlorid/Ameisensäure) getrennt werden (Bronnikov et al., Anal. Biochem., Bd. 131 (1983), S. 69). Die beiden Spezies wandern auf einer dünnschichtchromatographischen Platte auf der Basis ihrer relativen Affinitäten für die polare mobile Phase und die nicht-polare feste Phase über unterschiedliche Strecken hinweg. Die Ergebnisse werden durch Szintillationszählung oder "Phosphorimager"-Analyse analysiert. Obgleich der dünnschichtchromatographische Test zur quantitativen Bestimmung von freigesetztem Phosphat genaue Daten der Aktivität und Hemmung von ATPase liefert, ist er für ein Massenscreening von potentiellen Inhibitoren ungeeignet. Das Aufsetzen und das Entwickeln einer großen Anzahl von dünnschichtchromatographischen Platten ist zeit- und arbeitsaufwändig. Ein Verfahren, das sich für eine Platte mit 96 Vertiefungen und zur raschen quantitativen Bestimmung eignet, ist erforderlich, wenn ein ATPase-Test im HTS-Format eingeführt werden soll.
Aktivkohle:
ATP bindet an Aktivkohle, während dies Orthophosphat nicht tut (Zimmerman et al., J. Biol. Chem., Bd. 236 (5) (1961), S. 1480). Wenn somit eine Umsetzung unter Verwendung von γ-markiertem ATP durchgeführt wird und Aktivkohle zugesetzt wird, wird das Ausgangsmaterial adsorbiert, während das Produkt in Lösung bleibt. Man kann dieses Verfahren in einem Plattentest mit 96 Vertiefungen durchführen, indem man Lösungen durch Aktivkohle enthaltende Filterplatten filtriert und das durchströmende Produkt zählt. Dieses Verfahren weist vermutlich keine hohe Reproduzierbarkeit auf und lässt sich nicht zu einem automatisierten Screening-Test ausarbeiten.
Gekuppelte Enzymtests:
Es gibt eine Anzahl von verwandten Verfahren, bei denen eine weitere Reaktion am Phosphatprodukt mit einem zweiten Enzym durchgeführt wird (Rieger et al., Anal. Biochem., Bd. 246 (1997), S. 86, und die darin zitierte Literatur). Diese Tests eignen sich sehr gut für kinetische Untersuchungen, und zwar aufgrund der Tatsache, dass die Absorptionsänderung kontinuierlich über den Testverlauf hinweg entsteht, so dass der Reaktionsverlauf überwacht werden kann, ohne dass Aliquotmengen entnommen werden, wie es bei den anderen vorstehenden Verfahren erforderlich ist (Unterschied zwischen kontinuierlichen und gestoppten Tests). Diese Verfahren sind jedoch nicht deutlich empfindlicher als der (nachstehende) Molybdat-Test, und Screening-Ergebnisse würden durch die Möglichkeit von falschen positiven Ergebnissen aufgrund von Inhibitoren des Kupplungsenzyms zusätzlich komplizierter gestaltet.
Molybdat:
Ammoniummolybdat bildet nur mit Phosphat einen Komplex unter Entstehung von Phosphomolybdat. Pyrophosphat, Nucleotidtriphosphate oder andere phosphathaltige Moleküle, die bei der Umsetzung entstehen, treten mit Molybdänoxiden nicht in Wechselwirkung. Die meisten kolorimetrischen Reaktionen beruhen auf der Bildung eines Komplexes zwischen Phosphat und dem Molybdation in saurer Lösung, gefolgt von einer Reduktion oder Bindung an Farbstoffe, die gefärbte Komplexe bilden. Zahlreiche Variationen dieser Techniken wurden eingeführt, mit dem Ziel, die Farbempfindlichkeit und die Farbstabilität zu erhöhen und den Anteil der spontanen ATP-Hydrolyse, die während der Farbentwicklungsinkubation erfolgt, zu verringern (Gonzalez-Romo et al., Anal. Biochem., Bd. 200 (1992), S. 235). Beispielsweise kann der Phosphomolybdatkomplex durch Ascorbinsäure unter Bildung eines blauen Molybdän-Chromogens mit einer maximalen Absorption bei 700 nm reduziert werden (Hergenrother et al., Anal. Biochem., Bd. 251 (1997), S. 45). Ein weiteres Verfahren beruht auf der Bildung eines brillantgrünen Komplexes mit Malachitgrün in einem Säuremedium, wobei die maximale Absorption bei 650 nm liegt (Moslen et al., Anal. Biochem., Bd. 131 (1983), S. 69).
Tatsächlich wurde der Malachitgrün-Test früher als ein möglicher Test für die ATPase-Aktivität von E1 angesehen, er hat sich jedoch aufgrund der Tatsache, dass Phosphatkonzentrationen unter 25 μm nicht genau erfasst werden konnten, als ungeeignet erwiesen. Dies stellte ein Problem dar, da der Nachweis von kompetitiven Inhibitoren bei Substratkonzentrationen unter dem K_m-Wert eines Enzyms optimal ist. Wie vorstehend erwähnt, hat es sich gezeigt, dass der K_m-Wert (ATP) der HPV-11-E1-ATPase etwa 10 μM beträgt, so dass die E1-ATPase-Reaktion routinemäßig bei etwa 1–10 μM ATP durchgeführt wird. Ferner wird der Substratverbrauch in einem Hemmversuch unter 30% gehalten, damit die Substratkonzentration während der Reaktionszeit im wesentlichen konstant bleibt. Das Ergebnis ist, dass 3 μM die maximal freigesetzte Phosphatkonzentration darstellt, was deutlich unter der 25 μM-Nachweisgrenze des Malachitgrün-Tests liegt.
Alle diese kolorimetrischen ATPase-Tests benötigen eine minimale ATP-Konzentration von einigen hundert μM. Da der Wert von K_m (ATP) für HPV-11-E1 etwa 10 μM (gemessen in Abwesenheit von DNA) beträgt, um in wirksamer Weise ein Screening auf kompetitive Inhibitoren von E1-ATPase-Aktivität vorzunehmen, sollte man Tests unter Verwendung von [ATP] ≤ 10 μM durchführen.
Adsorption von Phosphomolybdat an einem festen Träger:
Phosphomolybdat ist ein großes Heteropolymolybdat mit einer Stöchiometrie von [PMo₁₂O₄₀]^3–. Aufgrund seiner relativ geringen Ladung kann es aus einer wässrigen Lösung in organische Lösungsmittel extrahiert oder an einer hydrophoben Oberfläche, wie Sephadex-Kügelchen oder Nitrocellulosefilter, adsorbiert werden. Ohnishi et al. (J. Solid-Phase Biochem., Bd. 1 (4) (1976), S. 287) und Ohnishi (Anal. Biochem., Bd. 86 (1978), S. 201) beschreiben ein Verfahren zum Isolieren des Phosphomolybdatkomplexes aus einer Lösung durch Affinitätschromatographie an einer Polyvinylpolypyrrolidon (PVPP)-Säule. PVPP wirkt als Katalysator für die Komplexbildungsreaktion zwischen PO₄ und Molybdän und adsorbiert dabei den Komplex selektiv gegenüber anderen phosphathaltigen Molekülen. Phosphat kann radioaktiv markiert und zur Zählung der Radioaktivität von der Säule eluiert werden. Dieses Verfahren wird durch die Tatsache begrenzt, dass das markierte Phosphat vor der Zählung aus dem Reaktionsgemisch abgetrennt werden muss. Somit bleibt ein Bedürfnis nach einem robusten Verfahren zur Phosphatbestimmung, das sich für ein Format mit hohem Durchsatz eignet.
Yoshimura et al. (Anal. Biochem., Bd. 58 (1986), S. 591) beschreibt eine kolorimetrische Mikrobestimmung von Molybdänblau durch Adsorption des Komplexes an einer Sephadex-Gel-Phase. Dieses Verfahren erfordert die Reduktion des Komplexes vor der Adsorption und die Messung der Phosphatkonzentration durch direkte Absorptionsmessung der in der Gelphase kanzentrierten Heteropolysäure. Bei diesem Verfahren ist die Abtrennung der Gelkügelchen aus dem Überstand vor der kolorimetrischen Messung erforderlich. Obgleich dieses kolorimetrische Verfahren den Nachweis niedriger Phosphatkonzentrationen ermöglicht, ist es für die Automatisierung immer noch ungeeignet.
Szintillationsproximitätstest:
Hart et al. (Molec. Immunol., Bd. 16 (1979), S. 265) und Hart et al. (J. Nucl. Med., Bd. 20 (1979), S. 1062) beschreiben ein neues Immunoassay-Verfahren, das als "Szintillationsproximitätstest" bezeichnet wird. Bei dieser Technik werden szintillierende Latexteilchen verwendet, die mit einem Liganden beschichtet sind, der spezifisch an einen zu untersuchenden organischen Reaktanten bindet. Sämtliche weiteren Anwendungsmöglichkeiten dieser Technik mit hydrophoben Kügelchen beruhen auf der Bereitstellung eines spezifischen Liganden, der schichtförmig auf die Kügelchen aufgetragen ist, um spezifisch ein Molekül zu binden.
Das US-Patent 4 568 649 beschreibt derartige Kügelchen, die mit einem spezifischen Liganden beschichtet sind, und führt aus, dass die verbleibenden aktiven Zentren an den Kügelchen vor dem Test blockiert werden müssen, um zu verhindern, dass der Reaktant von Interesse oder andere Reaktanten eine direkte Bindung mit dem Kügelchen und nicht mit dem Liganden eingehen. Diese Offenbarung führt von der vorliegenden Erfindung weg,
Trotz der breiten Anwendungsmöglichkeiten, die diese Technik seit ihrer Einführung gefunden hat, gibt es nicht die leiseste Andeutung dafür, dass die gleiche Technik auch in vorteilhafter Weise zum Nachweis von radioaktiv markiertem Phosphat durch eine hydrophobe Wechselwirkung mit einem Phosphomolybdatkomplex eingesetzt werden könnte. Die Anwendung des SPA-Konzepts beim Nachweis der ATPase-Aktivität durch die Anmelderin beruht auf der Beobachtung, dass der hydrophobe Phosphomolybdatkomplex an hydrophobe Oberflächen, insbesondere an die Oberfläche von Polyvinyltoluol-SPA-Kügelchen, bindet, während das geladene ATP-Molekül dies nicht tut. Die Anmelderin zieht diese Eigenschaft zur Trennung des Orthophosphats von ATP oder ADP heran und nützt die szintillierend beschichteten Kügelchen zur Messung von radioaktivem Orthophosphat aus. Die Anmelderin stellt somit ein robustes Verfahren zum Nachweisen und Messen von Orthophosphat bereit. Dieser Test ist im Großmaßstab durchführbar und liefert reproduzierbare Ergebnisse zum Nachweis von Pi im niedrigen nanomolaren Bereich. Dieses Verfahren eignet sich auch für kinetische Analysen, die durch herkömmliche Tests nicht in einfacher Weise durchgeführt werden konnten.
Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bedient sich des Prinzips, dass Phosphomolybdat an hydrophobe Oberflächen bindet, zur Isolierung des Phosphomolybdatkomplexes von anderen phosphathaltigen Molekülen, und bedient sich ferner des SPA-Konzepts, um einen radioaktiv markierten Phosphomolybdatkomplex in engen Kontakt mit einem Szintillationsmittel zur Messung durch Szintillationszählung zu bringen.
Gemäß einer ersten Ausführungsform wird erfindungsgemäß ein Verfahren zum Nachweisen und Messen von radioaktiv markiertem Orthophosphat (Pi) in einem wässrigen Reaktionsgemisch bereitgestellt, das folgende Stufen umfasst:

a. Zugeben einer Lösung von Molybdat zum Reaktionsgemisch unter sauren Bedingungen zur Bildung eines Phosphomolybdat-Komplexes; und
b. Kontaktieren des Phosphomolybdat-Komplexes mit einer szintillierenden, hydrophoben Oberfläche;

Gemäß einer zweiten Ausführungsform besteht die Erfindung in einem Verfahren zur Bestimmung der ATPase-Aktivität, das die folgenden Stufen umfasst:

a. Vermischen von radioaktiv markiertem [γ-³³P]ATP mit einem ATP hydrolysierenden Enzym;
b. Inkubieren des Reaktionsgemisches für eine ausreichende Zeitspanne, um eine Freisetzung von Orthophosphat aufgrund von Hydrolyse zu ermöglichen;
c. Zugeben einer Lösung von Molybdat zum Reaktionsgemisch unter Bildung eines Phosphomolybdat-Komplexes;
d. Kontaktieren des Phosphomolybdat-Komplexes mit einer szintillierenden, hydrophoben Oberfläche; und
e. Messen der Szintillation des Szintillationsmittels als Maßnahme zur Berechnung der Menge des Orthophosphats.

Gegebenenfalls umfasst das Verfahren ferner: als Stufe f) das Zugeben einer Lösung von CsCl zum Reaktionsgemisch vor dem Zählvorgang. Ferner umfasst das Verfahren gegebenenfalls als Stufe g) das Zugeben einer Lösung von Citronensäure zum CsCl enthaltenden Gemisch vor dem Zählvorgang.
Gemäß einer dritten Ausführungsform besteht die vorliegende Erfindung in einem Screeningtest für Inhibitoren einer Phosphat-hydrolysierenden Enzymaktivität, der folgende Stufen umfasst: Durchführen der Stufen a bis e (und gegebenenfalls der Stufen f und g) gemäß dem vorstehenden Verfahren in Gegenwart und Abwesenheit eines mutmaßlichen Inhibitors; und das Vergleichen der Phosphatmenge in den beiden Fällen, um den Hemmgrad zu berechnen.
Handelsübliche SPA-Kügelchen sind mikroskopische Kügelchen, die mit einem Szintillationsmittel imprägniert sind. Sie sind mit einer Reihe von an ihren Oberflächen gebundenen Molekülen (z. B. Streptavidin, Glutathion, Protein A) erhältlich. Polyvinyltoluol (PVT)-SPA-Kügelchen weisen relativ hydrophobe Oberflächen auf und sind zur selektiven Adsorption von Phosphomolybdat aus Reaktionsgemischen in Gegenwart von überschüssigem ATP befähigt. Obgleich SPA-Kügelchen behandelt werden, um sie weniger hydrophob zu machen, kann die hydrophobe Wechselwirkung durch hohe Konzentrationen an Cäsiumchlorid, das üblicherweise zum Aufschwimmen von Kügelchen in SPA-Vorgehensweisen verwendet wird, verstärkt werden. In einem wässrigem Medium müssen schwache Emitter von β-Teilchen, wie [³³P] in enger physikalischer Nähe zu szintillierenden Molekülen vorliegen, um sie zur Emission von Licht zu veranlassen; ansonsten würde ihre Energie im Lösungsmittel abgeführt und ginge verloren. Somit bewirkt [³³P]-markiertes Phosphat, das mit Molybdat komplexiert und an die Kügelchenoberfläche gebunden ist, eine Aktivierung des Szintillationsmittels, während dies [³³P]-markiertes ATP, das sich frei in Lösung befindet, nicht tut. Das durch eine Probe emittierte Licht wird mit einem β-Szintillationszähler gemessen und ist proportional zur Menge des vorhandenen Phosphats. SPA-Kügelchen sind im Handel erhältlich und werden derzeit von der Herstellerfirma mit einem Polyhydroxyfilm behandelt, um sie weniger hydrophob zu machen. Die Anmelderin zieht es jedoch in Betracht, dass unbehandelte SPA-Kügelchen sich für diesen speziellen Test besonders gut eignen.
Das Verfahren und die Tests der vorliegenden Erfindung eignen sich nicht nur für HPV-E1-Helicase, sondern auch für beliebige ATPasen, NTPasen oder Enzyme, die Orthophosphat als Produkt bilden, insbesondere wenn der K_m-Wert im nanomolaren bis niedrigen mikromolaren Bereich liegt.
Der erfindungsgemäße Test eignet sich insbesondere zur Bestimmung der ATPase-Aktivität verschiedener ATP-hydrolysierender Enzyme, wo es erwünscht ist, den Test bei Substratkonzentrationen im nM- bis niedrigen μM-Bereich durchzuführen. Zu derartigen Enzymen gehören (ohne Beschränkung hierauf): Helicasen, z. B. aus anderen Viren, wie HPV, HSV, CMV, HCV), andere infektiöse Mittel (z. B. Bakterien) oder zelluläre Helicasen; andere energieübertragende ATPasen (z. B. Myosine, Dyneine, Kinesine), Ionentransport-ATPasen oder Chaperonine; andere Nucleotidphosphat hydrolysierende Enzyme (z. B. G-Proteine); Protein- oder Kleinmolekül-phosphatasen; oder anorganische Pyrophosphatasen.
Gemäß einer vierten Ausführungsform umfasst die Erfindung eine Testpackung zur Messung von radioaktiv markiertem Orthophosphat in einer wässrigen Lösung, wobei die Testpackung folgendes umfasst:

a. eine Lösung von Molybdat; und
b. eine szintillierende hydrophobe Oberfläche;

Weitere Ziele, Vorteile und Merkmale der vorliegenden Erfindung ergeben sich beim Studium der folgenden, nicht beschränkenden Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen unter Bezugnahme auf die beigefügte Zeichnung, die als beispielhaft anzusehen ist und den Schutzumfang der Erfindung nicht beschränken soll.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
1: Einfluss auf das SPA-Signal bei Verwendung verschiedener Typen von Kügelchen. (a) cpm für E1-Reaktionen und Leerwerte. (b) Verhältnis von Kontrolle zu Leerwert.
2: Einfluss auf das SPA-Signal durch Variation der AmMo-Konzentration. Die angegebenen Konzentrationen sind %AmMo (Gew./Vol.)-Werte bei Lösung in HCl vor der Zugabe zu den Reaktionen. (a) cpm für E1-Reaktionen (Quadrate) und Leerwerte (Rauten). (b) Verhältnis von Kontrolle zu Leerwert.
3: Einfluss auf das SPA-Signal bei Variation der HCl-Konzentration in der AmMo-Lösung. (a) cpm für E1-Reaktionen (Quadrate) und Leerwerte (Rauten). (b) Verhältnis von Kontrolle zu Leerwert.
4: Einfluss auf das SPA-Signal bei Variation der CsCl-Konzentration. Die für die Vorratslösung, die den Reaktionen zugesetzt wurde, angegebenen Konzentrationen entsprechen den Angaben in Beispiel 3. (a) cpm für E1-Reaktionen (Quadrate) und Leerwerte (Rauten). (b) Verhältnis von Kontrolle zu Leerwert.
5: Einfluss auf das SPA-Signal bei Variation der Zeitspanne für die Inkubation des Reaktionsgemisches mit AmMo vor Zugabe der Suspension von SPA-Kügelchen und CsCl. (a) cpm für E1-Reaktionen (Quadrate) und Leerwerte (Rauten). (b) Verhältnis von Kontrolle zu Leerwert.
6: Einfluss auf das SPA-Signal bei Variation der Zeitspanne, in der das vollständige Reaktionsgemisch nach Zugabe von CsCl und vor dem Zählen inkubiert wird. (a) cpm für E1-Reaktionen (Quadrate) und Leerwerte (Rauten). (b) Verhältnis von Kontrolle zu Leerwert.
7: Einfluss des CsCl-Volumens und der Zugabe von Citronensäure zum Reaktionsgemisch auf das Verhältnis der E1-Reaktion zum Leerwert. Die Ergebnisse sind für die Zugabe von 30 oder 90 μl CsCl mit oder ohne Zugabe von 0,2 M Citronensäure dargestellt. Die Testplatte wurde zu Zeitpunkten im Bereich von 1 bis 74 Stunden nach Zugabe von CsCl abgelesen.
8: Einfluss der Konzentrationen von HCl, AmMo und Citrat auf das Verhältnis Kontrolle zu Leerwert. Die Ergebnisse sind für drei verschiedene Ablesezeitpunkte nach Zugabe von CsCl dargestellt. Die markierten Ergebnisse gelten für die bevorzugten Reagenzienkonzentrationen. Diese markierte Kombination wird 3-mal wiederholt, um Vergleiche innerhalb der einzelnen Konzentrationsreihen zu erleichtern. Wie in Beispiel 3 beschrieben, gelten die ersten beiden Sätze von Ergebnissen für die Abwesenheit von Igepal-CA630 in den Reaktionsgemischen bzw. für die Zugabe von Tween-20 zur AmMo-Lösung.
9: Zeitlicher Reaktionsverlauf gemäß den Angaben am Ende von Beispiel 3. Dargestellt sind die CPM-Werte für E1-Reaktionen (Quadrate) und die Leerwerte (Rauten).
10: IC₅₀-Kurve für die Hemmung der HPV-6a-ATPase-Aktivität durch ATP-γ-S. Eine nicht-lineare Regression ergab einen IC₅₀-Wert von 8,0 ± 1,6 μm.
11: Linearität und Genauigkeit des Phosphatnachweises. Folgende Linien sind dargestellt: theoretischer Referenzwert (beobachteter Wert = erwarteter Wert, Rauten; SPA-Ergebnis unter Verwendung von 1,2 M HCl, 2% AmMo und 0,2 M Citrat gemäß Beispiel 5 (Quadrate); SPA-Ergebnis unter Verwendung von 1,8 M HCl, 0,5% AmMo und 0,1 M Citrat (Dreiecke); SPA-Ergebnis unter Verwendung von 1,9 M HCl, 1% AmMo und 0,1 M Citrat (Kreuze); SPA-Ergebnis unter Verwendung von 2,4 M HCl, 1% AmMo und 0,1 M Citrat (Sterne); und dünnschichtchromatographisches Ergebnis (Kreise).
12: Signal für E1-Reaktionen (Quadrate) und Leerwerte (Rauten) an drei getrennten Platten. Die x-Achse gibt die Nummer der Vertiefung an, und zwar als willkürlichen Maßstab um die Daten für die Betrachtung auseinander zu ziehen.
13: SPA-Signal für 0,2 bis 200 μm Phosphat. Die Ergebnisse sind für vier verschiedene Konzentrationen von SPA-Kügelchen aufgeführt. (a) linearer Maßstab, (b) logarithmischer Maßstab. Die in (b) (Sterne) dargestellte theoretische Linie stellt lediglich eine Gerade für Vergleichszwecke dar.
14: SPA-Signal für 0,5 bis 10 μM Phosphat oder ATP. Die Ergebnisse sind angegeben für Phosphat in Gegenwart von AmMo (Rauten); Phosphat in Abwesenheit von AmMo (Dreiecke); ATP in Gegenwart von AmMo (Quadrate); und ATP in Abwesenheit von AmMo (Kreuze). (a) linearer Maßstab, (b) logarithmischer Maßstab.
15: Bestimmung des Werts von K_m (ATP) für HPV-11-E1 durch SPA-Nachweis. Die experimentell bestimmten Werfe sind als Kreise angegeben. Die Linie gibt die berechnete, theoretische Anpassung für die Michaelis-Menten-Gleichung wieder.
16: Bestimmung des Werts von K_m (ATP) für HPV-11-E1 durch Dünnschichtchromatographie. Die experimentell bestimmten Werte sind als Kreise angegeben. Die Linie gibt die berechnete, theoretische Anpassung für die Michaelis-Menten-Gleichung wieder.
17: Lineweaver-Burke-Diagramme (doppelt reziprok) zum Vergleich der experimentellen Hemmdaten mit den theoretischen Ergebnissen beruhen auf Parametern, die durch nicht-lineare Regression erhalten wurden. (A) Kompetitives Hemmmodell. (B) Nicht-kompetitives Hemmmodell (gleiche Bindung an E und ES). Für beide Diagramme sind die experimentellen Werte als Punkte mit Inhibitorkonzentrationen von 24 μm (Rauten); 12 μm (Sterne); 6 μm (Quadrate); 3 μm (Dreiecke); und 0 (Kreise) angegeben. Die Linien beruhen auf der optimalen Anpassung der Parameter für jedes Hemmmodell.
Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Definitionen
Der hier verwendete Ausdruck "szintillierende hydrophobe Oberfläche" bedeutet eine hydrophobe Oberfläche, bei der eine Imprägnierung, Integration, Beschichtung oder anderweitige Zugabe eines Szintillationsmittels vorgenommen worden ist.
Der hier verwendete Ausdruck "Szintillationsmittel" bedeutet ein fluoreszierendes Molekül (auch als fluoreszierendes Produkt bezeichnet), das dann, wenn es in unmittelbare Nähe zu einer Strahlungsenergie, die von einem radioaktiv markierten Reaktanten emittiert wird, gebracht wird, unter Emission von Lichtenergie aktiviert wird, die mit einem Szinitillationszähler nachgewiesen und gemessen werden kann.
Bevorzugte Ausführungsformen
Gemäß einer ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Nachweis und Messen von radioaktiv markiertem Orthophosphat (Pi) in einem wässrigen Reaktionsgemisch bereitgestellt, das folgende Stufen umfasst:

Gemäß einer zweiten Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Bestimmung der Aktivität eines Phosphat-hydrolysierenden Enzyms bereitgestellt, das das die folgenden Stufen umfasst:

a. Vermischen von radioaktiv markiertem [γ-³³P]ATP mit dem Enzym;
b. Inkubieren des Reaktionsgemisches für eine ausreichende Zeitspanne, um eine Freisetzung von Orthophosphat aufgrund von Hydrolyse zu ermöglichen;
c. Zugeben einer Lösung von Molybdat zum Reaktionsgemisch unter Bildung eines Phosphomolybdat-Komplexes;
d. Kontaktieren des Phosphomolybdat-Komplexes mit einer szintillierenden, hydrophoben Oberfläche; und
e. Messen der Szintillation des Szintillationsmittels als Maßnahme zur Berechnung der Menge des Orthophosphats.

Gegebenenfalls umfasst das Verfahren ferner: als Stufe f) das Zugeben einer Lösung von CsCl zum Reaktionsgemisch vor dem Zählvorgang. Ferner umfasst das Verfahren gegebenenfalls als Stufe g) das Zugeben einer Lösung von Citronensäure zum CsCl enthaltenden Gemisch vor dem Zählvorgang.
Gemäß einer dritten Ausführungsform der Erfindung wird ein Screeningtest auf Inhibitoren einer Phosphat-hydrolysierenden Enzymaktivität bereitgestellt, der die folgende Stufen umfasst: Durchführen der Stufen a bis e (und gegebenenfalls der Stufen f und g) gemäß dem vorstehenden Verfahren in Gegenwart und Abwesenheit eines mutmaßlichen Inhibitors; und das Vergleichen der Hemmgrade.
Gemäß einer vierten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Testpackung zur Messung von radioaktiv markiertem Orthophosphat in einer wässrigen Lösung bereitgestellt, wobei die Testpackung folgendes umfasst:

Vorzugsweise können gemäß den vorstehenden erfindungsgemäßen Ausführungsformen die Molybdatlösung und die hydrophobe Oberfläche gleichzeitig zum Reaktionsgemisch gegeben werden.
Vorzugsweise umfassen die erfindungsgemäßen Ausführungsformen ferner die folgende Stufe: Zugeben einer Lösung von CsCl zum Reaktionsgemisch vor dem Zählvorgang. Insbesondere umfasst die Erfindung ferner die folgende Stufe: Zugeben einer Lösung von Citronensäure zum CsCl enthaltenden Gemisch vor dem Zählvorgang. Insbesondere werden das CsCl und die Citronensäure gleichzeitig zum Reaktionsgemisch gegeben.
Vorzugsweise wird das CsCl und Citronensäure enthaltende Reaktionsgemisch vor der Szintillationszählung länger als 1 Stunde inkubiert.
Vorzugsweise liegt das Ammoniummolybdat in einer Endkonzentration von 0,05 bis 0,3% und insbesondere von 0,1 bis 0,2% (Gew./Vol.) vor. Ganz besonders bevorzugt ist es, dass das Ammoniummolybdat in einer Endkonzentration von etwa 0,17% (Gew./Vol.) vorliegt.
Vorzugsweise wird die hydrophobe Oberfläche aus folgender Gruppe ausgewählt: Polyvinyltoluol (PVT), Sephadex, Latex, Polystyrol, Polyacrylamid, Acrylamid, Agarose, Polypropylen, Polycarbonat und Sepharose. Insbesondere handelt es sich bei der hydrophoben Oberfläche um Polyvinyltoluol-Kügelchen, wie SPA-Kügelchen.
Vorzugsweise liegt das CsCl in einer Endkonzentration von mehr als 1 M vor.
Insbesondere liegt das CsCl in einer Endkonzentration im Bereich von 2 M bis 4 M vor. Ganz besonders bevorzugt ist es, dass das CsCl in einer Endkonzentration von etwa 3,5 M vorliegt.
Vorzugsweise liegt die Citronensäure in einer Endkonzentration von 0,05 bis 0,2 M vor. Insbesondere liegt die Citronensäure in einer Endkonzentration von etwa 0,1 M vor.
Vorzugsweise wird das Phosphat hydrolysierende Enzym aus folgender Gruppe ausgewählt: Helicase, ATPase und Phosphatase. Insbesondere handelt es sich bei dem Enzym um eine ATPase. Ganz besonders bevorzugt ist es, dass es sich bei der ATPase um die E1-Helicase von humanem Pappilomavirus handelt.
Beispiele

In den Beispielen werden folgende Abkürzungen verwendet:

AmMo	Ammoniummolybdat
ATP-γ-S	Adenosin-5'-O-(3-thiotriphosphat)
cpm	Zählereignisse pro Minute
DMSO	Dimethylsulfoxid
DTT	Dithiothreit
EDTA	Ethylendiamintetraessigsäure
HEPES	N-[2-Hydroxyethyl]-piperazin-N'-[2-ethansulfonsäure]
MES	2-[N-Morpholino]-ethansulfonsäure
MgOAc	Magnesiumacetat
PEI	Polyethylenimin
Pi	anorganisches Orthophosphat
PVPP	Polyvinylpolypyrrolidon
PVT	Polyvinyltoluol
SPA	Szintillationsproximitätstest
TLC	Dünnschichtchromatographie

Materialien und Methoden
Mit Polyhistidin markiertes HPV-11-E1 wurde in mit Baculovirus infizierten Insektenzellen exprimiert und durch Ni-Affinitätschromatographie gemäß den Angaben in WO-99/57283 gereinigt.
Beispiel 1
Verfahrensweise für den ATPase-Szintillationsproximitätstest (SPA) unter Verwendung von HPV-E1
Radioaktiv markiertes [γ-³³P] ATP (NEN) wurde nach Erhalt durch 100-fache Verdünnung in Reaktionspuffer und Lagerung bei –80°C vorbereitet. Das in dieser Weise gelagerte Material erwies sich für länger als 1 Monat als geeignet. E1-ATPase-Reaktionen wurden in einem Puffer aus 20 mM HEPES, pH-Wert 7,5, mit einem Gehalt an 0,05 mM EDTA und 1 mM DTT, sowie 0,05% Igepal CA-630 (gleichwertig zu Nonidet P40) durchgeführt. Die nachstehend angegebenen Volumina und Konzentrationen sind typisch, wobei diese Parameter aber unter minimaler Auswirkung auf die Ergebnisse etwas variiert werden können, wie in den nachstehenden Beispielen dargelegt ist. 1 μM ATP (Amersham Pharmacia) und 500 μM MgOAc wurden mit [γ-³³P] ATP in 100-facher Verdünnung des gelagerten Materials (10000-fache Verdünnung des Ausgangsmaterials) oder etwa 1 nCi/μl in frischem Zustand vermischt. Der tatsächliche ATP-Konzentrationsbeitrag von [γ-³³P] ATP betrug etwa 1 nM. Diese Menge konnte gegebenenfalls weiter verringert werden. Eine zur Erzielung des gewünschten Umwandlungsgrades ausreichende Enzymmenge wurde zugesetzt. Beispielsweise wandelte 4 nM HPV-6a E1 etwa 30% des Substrats in ATP und Phosphat innerhalb von 2 Stunden um. Ein typisches Reaktionsvolumen betrug 40 μl. Die Umsetzungen wurden bei Raumtemperatur in Platten mit 96 Vertiefungen (typischerweise Optiplates (Packard)) durchgeführt.
Zum gewünschten Zeitpunkt wurden die 40 μl-Reaktionen durch Zugabe von 20 μl eines SPA-Kügelchen-AmMo-Gemisches gestoppt. Das Gemisch bestand aus 1 Teil 2% (Gew./Vol.) AmMo in 2,4 M HCl auf 2 Teile Streptavidin-PVT-SPA-Kügelchen (Pharmacia Amersham #RPNQ0007), in Suspension in einer Konzentration von 30 mg/ml in 50 mM HEPES plus 0,02% Natriumazid. Die Ammoniummolybdatlösung wurde üblicherweise täglich frisch hergestellt, während die Suspension von SPA-Kügelchen länger als 1 Monat stabil war. Das Gemisch konnte mehrere Stunden vorher und bei Lagerung bei 4°C sogar mehrere Tage vorher hergestellt werden. Unmittelbar nach der Zugabe des Ammoniummolybdat-Kügelchen-Gemisches wurden 80 μl 7 M Cäsiumchlorid plus 0,2 M Citronensäure zugegeben. Die Platten wurden kurz geschüttelt und sodann mehr als 1 Stunde zum Absetzen stehengelassen. Der Grad der Phosphatbildung wurde sodann durch Szintillationszählung unter Verwendung des TopCount-Geräts (Packard) bestimmt. Gegebenenfalls lässt sich ein cpm-Wert in eine Phosphatkonzentration umwandeln, indem man einen Vergleich der SPA-Ergebnisse mit den TLC-Ergebnissen (vergl. die nachstehenden Angaben) für identische Reaktionen durchführt. Alternativ lassen sich die Ergebnisse mit einer "100% Kontrolle" vergleichen, einer Reaktion mit einem großen Überschuss an Enzym, der vorher durch TLC bestätigt worden war, um eine vollständige Umwandlung von ATP zu Phosphat und ADP zu erzielen. Leerwerte ohne Gehalt an Enzym, aber ansonsten von gleicher Zusammensetzung wurden parallel mitgeführt und abgezogen.
Beispiel 2
E1-ATPase-TLC-Test
ATPase-Reaktionen wurden genau wie beim SPA-Format durchgeführt. Am Ende der geplanten Reaktionszeit wurden die Reaktionen durch Zugabe des halben Volumens an eiskalter 500 mM EDTA-Lösung, pH-Wert 8,0, gestoppt. 1 bis 2 μl Reaktionsproben wurden auf mit Polyethylenimin beschichtete Cellulose-TLC-Platten (Sigma) aufgesetzt und einer Elution in einer Lösung mit 1 M LiCl und 1 M Ameisensäure unterworfen. [γ-³³P] Phosphat und ATP wurden unter Verwendung des Storm 860-Phosphorabbildungssystems (Molecular Dynamics) bestimmt. Für jede Probe, einschließlich der Leerwerte, wurden die Phosphat- und ATP-Fleckenintensitäten quantitativ bestimmt. Der prozentuale Phosphatwert wurde folgendermaßen berechnet:
Die Leerwerte lagen im gleichen Bereich wie für den SPA-Test bei etwa 2–5% und wurden von den Werten für die einzelnen Reaktionen subtrahiert, wodurch man den prozentualen Wert des durch die enzymatische Reaktion erzeugten Phosphats erhielt.
Beispiel 3
Einfluss variierender Nachweisbedingungen auf das Signal und den Leerwert
Zahlreiche Reaktionen in diesem Abschnitt wurden unter geringfügig abweichenden Bedingungen unter Verwendung eines Reaktionspuffers aus 20 mM MES, pH-Wert 7,0, 10% Glycerin und 0,05 mM EDTA. durchgeführt. Die Reaktionen wurden mit 10 μM ATP (etwa 1 nM [γ-³³P] ATP), 500 μM MgOAc und ausreichend E1 zur Erzielung einer 20%igen Umwandlung des Substrats innerhalb von 90 Minuten bei Raumtemperatur durchgeführt. Wie bei den Beispielen 1 und 2 wurden die Reaktionen in Packard Optiplates durchgeführt. Bei diesen Versuchen wurde der Nachweis typischerweise durch Vermischen von 20 μl ATPase-Reaktionsgemisch mit 20 μl 2% AmMo in 1,2 M HCl mit einem Gehalt an 0,05% Tween-20 erreicht. Nach 10 Minuten wurden 20 μl Streptavidin-SPA-Kügelchen-Suspension zugegeben (10 mg/ml in 50 mM HEPES, pH-Wert 7,5 + 0,02% NaN₃). Nach kurzem Mischen wurden 20 μl 7,0 M CsCl zugegeben. Nach dem Mischen ließ man die Platten 1 Stunde stehen, bevor sie wie in Beispiel 1 am TopCount-Gerät ausgezählt wurden.
Typ der SPA-Kügelchen:
PVT-SPA-Kügelchen mit verschiedenen, an der Oberfläche haftenden Molekülen sind erhältlich. Zu den Typen, die für die Bewertung bei dem Test verfügbar waren, gehörten Streptavidin, Weizenkeim-Agglutinin, Protein A, anti-Maus-IgG und Glutathion. Obgleich es die hydrophoben Eigenschaften von PVT-Kügelchen sind, die Affinität für Phosphomolybdat aufweisen, wurden verschiedene Überzüge getestet, um festzustellen, ob der Typ des Moleküls auf der Oberfläche einen Einfluss auf das SPA-Signal hatte. Die cpm-Daten sind in 1A angegeben. Die Verhältnisse von Kontrollsignal und Leerwertsignal oder die "Signal-zu-Hintergrund"-Verhältnisse sind in 1B dargestellt. Es besteht kein signifikanter Einfluss des Beschichtungstyps. Ähnliche Ergebnisse wurden mit Kupfer-Kügelchen (His-tag-Bindung) erhalten. Tatsächlich ergaben auch unbeschichtete PVT-Kügelchen (Produkt der Fa. Amersham-Pharmacia) ein gleichwertiges Signal. Yttriumsilicat-SPA-Kügelchen funktionierten bei diesem Test nicht, wie aufgrund des Fehlens einer hydrophoben Oberfläche zu erwarten war.
Ammoniummolybdat-Konzentration:
Die Funktion von Ammoniummolybdat beim Stoppen der Lösung besteht in einer Komplexierung des bei der ATPase-Reaktion freigesetzten Phosphats. Die getesteten Konzentrationen an Ammoniummolybdat in der Stopplösung lagen im Bereich von 1 bis 4%. Die Einflüsse auf die cpm-Werte sind in 2A und die Signal-zu-Hintergrund-Verhältnisse in 2B dargestellt. (Anmerkung: Der Leerwert bleibt durch Erhöhung der AmMo-Konzentrationen relativ unbeeinflusst. Somit ist anscheinend unter diesen Bedingungen der Hintergrundwert nicht das Ergebnis einer Verunreinigung mit in der ATP-Lösung vorhandenem Orthophosphat, sondern ist vielmehr auf ein nicht-spezifisches Anhaften von ATP an den Kügelchen oder auf das Einfangen von einiger β-Teilchenstrahlung, die durch [γ-³³P] ATP in Lösung emittiert wird, zurückzuführen).
HCl Konzentration:
Die Funktion von HCl in der Stopplösung besteht in der Bereitstellung eines sauren Mediums, in dem sich der Phosphomolybdatkomplex bilden kann. Die Einflüsse von HCl-Konzentrationen im Bereich von 0 bis 2,4 M in der Stopplösung auf die cpm-Werte sind in 3A dargestellt. Signal-zu-Hintergrund-Verhältnisse sind in 3B dargestellt. Unter diesen Bedingungen wurden Werte von mehr als 1 M als optimal ermittelt.
CsCl-Konzentration:
CsCl wird vor der Szintillationszählung aus zwei Gründen zugegeben. Der erste Grund besteht in der Bildung eines stark salzhaltigen Mediums, das die hydrophobe Wirkung verstärkt und die Bindung des Phosphomolybdatkomplexes an die SPA-Kügelchen verfestigt. Der zweite Grund besteht in der Erhöhung der Dichte der Flüssigkeit in der Vertiefung. PVT-SPA-Kügelchen weisen ein spezifisches Gewicht von etwa 1,05 g/ml auf und tendieren dazu, in der wässrigen Lösung in Dispersion zu bleiben und sich erst nach mehreren Stunden langsam auf den Boden abzusetzen. Die Zugabe von CsCl in hoher Molarität erhöht die Dichte der Flüssigkeit, was dazu führt, dass die SPA-Kügelchen eine dünne Schicht bilden, die auf der Oberfläche schwimmt, wodurch das nachweisbare Signal verstärkt wird. Bei einer Konzentration von 7,0 M CsCl handelt es sich im wesentlichen um eine gesättigte Lösung. Der Einfluss der Zugabe von 20 μl CsCl mit verschiedenen Konzentrationen auf die cpm-Werte ist in 4A dargestellt. Der Einfluss auf die Signal-zu-Hintergrund-Verhältnisse ist in 4B dargestellt. Ein optimales Verhältnis von Signal zum Hintergrund wurde unter Verwendung einer 7,0 M Lösung erhalten.
Inkubationszeit in Ammoniummolybdat vor Zugabe von CsCl:
Der Einfluss unterschiedlicher Zeitspannen zwischen der AmMo-Zugabe und der CsCl-Zugabe auf die cpm-Werte ist in 5A dargestellt. Der Einfluss auf die Signal-zu-Hintergrund-Verhältnisse ist in 5B dargestellt. Offensichtlich ist das Reaktionssignal in etwa konstant, während der Leerwert mit der Zeit ansteigt. Somit nehmen die Signal-zu-Hintergrund-Verhältnisse mit steigender Inkubationszeit ab.
Zeitspanne zwischen der CsCl-Zugabe und der Szintillationszählung: Im Standardverfahren werden die Platten 1 Stunde nach Zugabe der CsCl-Lösung gezählt. Die cpm-Werte und die Signal-Rausch-Verhältnisse, die bei Zählen der gleichen Platte zu verschiedenen Zeitpunkten innerhalb einer Zeitspanne von 48 Stunden erhalten wurden, sind in den 6A und 6B dargestellt.
Stabilität des Signals:
Die Versuche in den 5 und 6 zeigen, dass das Testsignal instabil ist. Der Leerwert steigt im Laufe der Zeit stetig an. Es wurde durch TLC-Nachweis gezeigt, dass ein Mischen von ATP und HCl in den vorstehenden Konzentrationen zu einem langsamen Abbau von ATP zu Phosphat führt und dies fast sicher für den beobachteten Anstieg des Signals verantwortlich ist. Das gleiche Problem tritt bei anderen Tests auf, die sich zum Nachweis von Phosphat der Bildung von Phosphomolybdat bedienen, beispielsweise aufgrund einer Veränderung der Farbe oder der Bildung eines Niederschlags. Es wurde gezeigt, dass Citronensäure, die unmittelbar nach AmMo zugesetzt wird, eine feste Bindung an etwaiges freies Molybdat eingeht, was den Einbau von anschließend freigesetztem Phosphat in Phosphomolybdatanionen verhindert. Der Austausch ist äußerst langsam, so dass eine Zugabe von Citrat die Konzentration an vorgebildetem Phosphomolybdat selbst nach mehreren Tagen nicht verringert.
Der Einfluss der Zugabe von 0,2 M Citronensäure zu der 7 M CsCl-Lösung ist in 7 dargestellt. Bei diesem Versuch wurden 30 μl E1-ATPase-Reaktionen, wie zu Beginn von Beispiel 3 beschrieben, durchgeführt. Anschließend wurden 30 μl einer 2%igen AmMo-Lösung in 1 M HCl und danach sofort 30 μl 10 mg/ml SPA-Kügelchen und sodann 30 oder 90 μl 7 M CsCl ± 0,2 M Citronensäure zugesetzt. Das Signal steigt nach 1-stündiger Inkubation auf etwa das 2-fache und wird durch die Zugabe von Citronensäure erheblich stabilisiert, so dass selbst nach 3 Tagen nur eine geringe Veränderung beobachtet wird.
Ein zusätzlicher Versuch, der den Einfluss der Konzentrationen von AmMo, CsCl, HCl und Citronensäure auf das Signal und die Signalstabilität zeigt, ist in 8 dargestellt. Die Reaktionen wurden wie zu Beginn dieses Beispiels durchgeführt, mit der Ausnahme, dass das Detergens Igepal-CA630 (Sigma, entsprechend Nonidet-P40) in einer Konzentration von 0,005% vorhanden war, ausgenommen ein Satz von Reaktionen, und Citronensäure der CsCl-Lösung in einer Konzentration von 0,1 M, 0,2 M oder 0,4 M zugesetzt wurde. 0,05% Tween-20 wurde in einem Fall der Ammoniummolybdatlösung zugesetzt. Von Tween-20 ist bekannt, dass es den Phosphomolybdat-Malachitgrün-Komplex beim Test von Itaya und Ui (Clin. Chim. Acta, 1966) stabilisiert, jedoch weist es bei diesem Test keine günstige Wirkung auf. Die Testplatte wurde 1,5, 6,5 und 20 Stunden nach Zugabe von CsCl/Citronensäure abgelesen. Das Signal nahm nach 1,5 Stunden nur geringfügig zu und war mindestens 20 Stunden stabil.
Der Kontrollinhibitor ATP-γ-S wurde einigen Vertiefungen in einer Konzentration von 10 μM zugesetzt (Daten nicht dargestellt; vergl. jedoch Beispiel 4), um die Robustheit der zu den unterschiedlichen Zeitpunkten erhaltenen Daten zu bestätigen. Über alle Bedingungen und getesteten Zeitpunkte hinweg variierte der Hemmgrad nur von 63,9 bis 70,0%. Somit können die Variationen im Nachweis unter den verschiedenen Bedingungen des Tests einen Einfluss auf die beobachteten cpm-Werte ausüben, beeinträchtigen jedoch die relativen Signale zwischen den Enzymreaktionen, gehemmten Reaktionen und Leerwerten nicht und beeinträchtigen somit nicht die grundlegende Testgenauigkeit.
Ein Beispiel für den zeitlichen Verlauf unter Verwendung von HPV-11-E1 ist in 9 dargestellt. Dieser Versuch wurde unter den vorstehend für 8 beschriebenen Bedingungen durchgeführt, mit Ausnahme der Anwesenheit von 0,005% Detergens gemäß den vorstehenden Angaben. Die dargestellten Daten sind Mittelwerte für vier 180 μl-Reaktionen. Zu jedem Zeitpunkt wurden 30 μl entfernt und mit 30 μl AmMo/SPA-Kügelchen-Lösung versetzt, wonach 90 μl 7,0 M CsCl/0,2 M Citronensäure vor der Szintillationszählung zugesetzt wurden.
Beispiel 4
Hemmung durch ATP-γ-S
Die folgenden Lösungen wurden zur Durchführung von 45 μl-Reaktionen für IC₅₀-Kurven verwendet:

– ATP (15 μl pro Reaktion), bestehend aus 3,0 μM ATP, 1,5 mM Mg-acetat und 0,06 μCi [γ-³³P] ATP;
– E1 (15 μl pro Reaktion), bestehend aus 18 nM HPV-6-E1;
– Inhibitorlösung (15 μl pro Vertiefung) bestehend aus γ-S-ATP, gelöst in Puffer plus 18% DMSO.

Sämtliche Lösungen werden in dem in Beispiel 3 beschriebenen Testpuffer angesetzt, mit der Ausnahme, dass der Testpuffer ferner 0,005% Igepal CA-630 enthielt. Sämtliche Komponenten werden beim Mischen der Reaktionsansätze 3-fach verdünnt. Die Reaktanten wurden in der folgenden Reihenfolge zugegeben: a) Inhibitor, b) HPV-6-E1, c) ATP. Der Konzentrationsbereich für den Inhibitor bei den Reaktionen betrug 0,2 bis 100 μm. Nach 75 Minuten wurden die Reaktionen durch Zugabe von 45 μl eines Gemisches aus 2 Teilen Streptavidin SPA-Kügelchen (15 mg/ml Suspension) in Resuspensionspuffer (Beispiel 2) und 1 Teil 2,4 M HCl mit einem Gehalt an 2% Ammoniummolybdat gestoppt. Sodann wurden 90 μl 7 M CsCl mit einem Gehalt an 0,1 M Citronensäure zugegeben. Nach kurzem Vermischen wurden die Platten 90 Minuten stehengelassen und sodann an einem TopCount-Gerät ausgezählt. Die Hemmdaten (vergl. 10) wurden an eine Logistik unter Verwendung des SAS-Programms (Statistical Software System, SAS Institute, Inc. Cary, N. C.) mit positiven Kontrollen mit einem Durchschnitt von 16000 cpm und Leerwerten mit einem Durchschnitt von 1300 cpm angepasst. Ähnliche Ergebnisse wurden auch in Fällen erhalten, wo der Nachweis durch TLC durchgeführt wurde.
Beispiel 5
Linearität und Genauigkeit des Phosphatnachweises
Bei diesem Versuch wurde eine große ATPase-Reaktion mit ausreichend E1 durchgeführt, um eine 100%ige ATP-Hydrolyse zu erzielen. Das E1 wurde sodann hitzeinaktiviert. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend in verschiedenen Verhältnissen mit einem Reaktionsleerwert ohne einen Gehalt an E1 vermischt. Der Reaktionspuffer und die Inkubationsbedingungen entsprachen den Angaben in Beispiel 1, mit der Ausnahme, dass der in Beispiel 3 beschriebene Reaktionspuffer verwendet wurde, wobei jedoch 0,005% Igepal-CA630 vorhanden waren. Reaktionsleerwertgemische wurden in den Verhältnissen 2 : 3, 1 : 5, 1 : 10 und 1 : 20 hergestellt, um einen Hydrolysebereich von 40% bis 5% zu simulieren. Wie bei einigen der vorstehenden Versuche wurde der SPA-Nachweis unter Verwendung von Ammoniummolybdat, HCl und Citronensäure mit mehreren unterschiedlichen Konzentrationen durchgeführt. Die Ergebnisse für einige Bedingungen zusammen mit denen für den TLC-Nachweis sind in 11 dargestellt. In sämtlichen Fällen sind die ermittelten Signale (angegeben als Anteil von 100% für SPA und als beobachtete Phosphatkonzentration für TLC) sehr ähnlich. Obgleich das absolute Signal (cpm) in Abhängigkeit von den Bedingungen variiert, bleiben das relative Signal und somit die Testgenauigkeit konstant. Insbesondere simuliert eine 20%ige Umwandlung ein typisches Ausmaß der Reaktion unter Screening-Bedingungen und eine 10%ige Umwandlung stellt das Signal dar, das für Testverbindungen, die eine 50%ige Hemmung ergeben, beobachtet wurde.
Beispiel 6
Variation für Testkontrollen unter Screening-Bedingungen
Um die Variabilität dieses Verfahrens von Vertiefung zu Vertiefung zu bestätigen, wurden Reaktionen gemäß den Angaben in Beispiel 1 in 80 Vertiefungen von 3 getrennten Platten mit 96 Vertiefungen durchgeführt. Reaktionsleerwerte ohne Enzym wurden in den übrigen 16 Vertiefungen angesetzt. Die Ergebnisse sind in 12 dargestellt. Die Variabilität von Vertiefung zu Vertiefung lässt sich durch die z-Statistik messen, die die Standardabweichungen der Signale und die Trennung zwischen den Signalen für enzymatische Reaktionen und Leerwerte berücksichtigt (J. N. Zhang, et al., J. Biomol. Screening, Bd. 4 (1999), S. 67–73). Die Werte können im Bereich von unter 0 bis 1,0 liegen, wobei Werte von mehr als 0,5 für einen Screeningtest als akzeptabel angesehen werden. Der z-Wert für diesen Versuch betrug 0,63 oder 0,75, wenn zwei klare Ausreißer bei der Analyse unberücksichtigt blieben.
Beispiel 7
Linearität des Phosphatnachweises bei höheren Phosphatkonzentrationen
Die vorstehenden Beispiele belegen, dass der SPA-Nachweis von Phosphat bei niedrigen Phosphatkonzentrationen von 0,1 bis 1 μM gut funktioniert. Zur Durchführung von Untersuchungen des Mechanismus ist es jedoch erforderlich, die ATP-Konzentration stärker zu variieren. Wir beobachteten, dass das in Beispiel 1 geschilderte Verfahren nicht das gesamte Orthophosphat quantitativ erfasste, da ein verstärktes Signal beobachtet wurde, wenn größere Mengen an SPA-Kügelchen zugesetzt wurden. Auf der Grundlage dieser anfänglichen Ergebnisse wurde ein SPA-Kügelchen-Titrationsversuch gemäß den nachstehenden Angaben durchgeführt.
Ähnlich wie in Beispiel 5 wurde bei diesem Versuch eine größere Reaktion unter Verwendung einer höheren Konzentration an E1 durchgeführt. In diesem Fall betrug die ATP-Konzentration 200 μm. Die Umsetzung wurde 4 Stunden bei Raumtemperatur und sodann 2 Stunden bei 37°C durchgeführt, um eine vollständige Umwandlung zu gewährleisten. Eine Probe wurde durch TLC analysiert, um die quantitative Umwandlung zu bestätigen. Sodann wurde das Reaktionsgemisch seriell mit Reaktionspuffer plus Magnesium unter Erzielung von Phosphatkonzentrationen im Bereich von 200 μM bis 0,2 μM verdünnt. Die Proben wurden unter Vereinigen von 45 μl des verdünnten Reaktionsgemisches mit 15 μl Ammoniummolybdat (2% in 2,4 M HCl) und 30 μl SPA-Kügelchen-Suspension mit 7,5, 15, 30 oder 60 mg/ml analysiert. Schließlich wurden sämtliche Vertiefungen mit 90 μl 7 M CsCl plus 0,2 M Citronensäure versetzt.
Die Ergebnisse sind in 13A dargestellt und in 13B als log-log-Diagramm dargestellt. Wie besonders klar aus 13B ersichtlich ist, war für jede SPA-Kügelchen-Konzentration das Signal direkt proportional zur Phosphatkonzentration bis zu etwa 100 μM. Jedoch hängt das absolute Signal von der Kügelchen-Konzentration ab. Interessanterweise sind in 13B die Linien parallel, d. h. die durch Erhöhung der SPA-Kügelchen-Konzentration erzielte proportionale Signalzunahme ist bei sämtlichen Phosphatkonzentrationen bis zu etwa 100 μm gleich.
Beispiel 8
Titration von ATP und Phosphat in Gegenwart und Abwesenheit von AmMo zur Bestimmung der Quelle des Signals in Abwesenheit von Enzym
Bei diesem Versuch wurde eine große Reaktion ähnlich der vorstehenden Reaktion durchgeführt, um 10 μM ATP vollständig zu Phosphat und ADP umzusetzen. Die vollständige Umwandlung wurde durch TLC bestätigt (Beispiel 2). Parallel wurde ein identisches Gemisch ohne Enzym hergestellt. Die einzelnen Ansätze wurden im vorstehenden Puffer unter Bildung von Lösungen mit Phosphat- oder ATP-Konzentrationen im Bereich von 10 μM bis 0,5 μM verdünnt. 45 μl-Proben im Doppelversuch wurden jeweils mit entweder 40 μl AmMo/SPA-Kügelchen-Gemisch gemäß Beispiel 1 oder mit einem ähnlichen Gemisch ohne AmMo (jedoch mit einem Gehalt an HCl) vermischt, wonach die Zugabe von 80 μl CsCl/Citronensäure erfolgte. Die Ergebnisse sind in 14A graphisch oder als log-log-Diagramm in 14B dargestellt. Auf der Grundlage von Beispiel 7 ist das Signal erwartungsgemäß in linearer Weise in sämtlichen Fällen von der Konzentration der Radioaktivität abhängig. Im Fall von AmMo ergibt der Reaktionsleerwert (ATP-Lösung) ein Signal von etwa 5% der Phosphatlösung, die durch die vollständige Umwandlung erzeugt wird. Im Gegensatz zum Versuch von Beispiel 3 (2) ist der Großteil des Leerwertsignals von AmMo abhängig und somit ist unter diesen Bedingungen der Leerwert vorwiegend auf die Verunreinigung mit Orthophosphat, das bereits in der handelsüblichen ATP-Lösung enthalten ist, zurückzuführen.
Beispiel 9
K_m-Wert (ATP) für HPV-11, bestimmt durch SPA und TLC-Verfahren
ATPase-Zeitversuche wurden bei verschiedenen ATP-Konzentrationen durchgeführt, um für HPV-11-E1 den kinetischen Parameter K_m (ATP) zu bestimmen. Die Umsetzungen wurden in beiden Versuchen unter ähnlichen Bedingungen unter Anwendung der in den Beispielen 1 und 2 angegebenen Vorgehensweisen durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die Konzentration von Igepal-CA630 0,01% und nicht 0,005% betrug, wobei die nachstehend aufgeführten spezifischen Änderungen der Versuchsbedingungen vorgenommen wurden. Die E1-Konzentration betrug 2 nM und die ATP-Konzentrationen lagen im Bereich von 3– 75 μM (TLC) oder 2–50 μM (SPA), wobei die MgOAc-Konzentration der ATP-Konzentration plus 0,5 mM entsprach. Vorratslösungen von ATP mit den einzelnen Konzentrationen wurden durch Verdünnen der Lösung mit der höchsten Konzentration mit Puffer mit einem Gehalt an 0,5 mM MgOAc hergestellt. Somit wurde für sämtliche Reaktionen ein konstantes Verhältnis von radioaktiv markiertem zu unmarkiertem ATP verwendet. Die Reaktionsgeschwindigkeiten wurden durch Messungen in Zeitabständen von 10 oder 20 bis 120 Minuten gemessen. Um die Bedingungen für die Anfangsgeschwindigkeit zu gewährleisten, wurden Zeitpunkte, die eine über 20%ige Umwandlung ergaben, nicht für die Analyse herangezogen.
Nachweis und Datenverarbeitung für das SPA-K_m-Experiment:
Die gesamten Reaktionsvolumina betrugen 150 μl. Für jeden Zeitpunkt wurden 20 μl Reaktionsgemisch entnommen und mit 40 μl Ammoniummolybdat/SPA-Kügelchen-Gemisch und anschließend mit 80 μl CsCl/Citronensäure vereinigt. Sämtliche Versuche wurden als Dreifachversuche durchgeführt. Die Platten wurden nach Inkubation über Nacht ausgezählt. Beim letzten Zeitpunkt wurde eine zusätzliche 20 μl-Aliquotmenge entnommen und mit 10 μl 0,5 M EDTA vereinigt. In diesem Fall wurde die Umwandlung von ATP zu Phosphat quantitativ durch TLC bestimmt und die durch TLC bestimmte Phosphatkonzentration wurde mit dem cpm-Wert für das SPA-Verfahren verglichen (nach Subtraktion der Leerwerte in beiden Fällen). Die Beziehung zwischen der Phosphatkonzentration und dem cpm-Wert ist linear. Die Steigung der Gerade wurde zur Umwandlung der cpm-Werte aus dem SPA-Nachweis in die Konzentration an gebildetem Phosphat verwendet. Die Geschwindigkeiten der Phosphatbildung bei jeder ATP-Konzentration wurden durch nicht-lineare Regression an die Michaelis-Menten-Gleichung unter Verwendung des Grafit-Programms (V 3.01, R. Leatherbarrow) angepasst. Die Ergebnisse sind in 15 dargestellt.
Nachweis und Datenverarbeitung für das TLC-K_m-Experiment:
Wie beim vorstehenden SPA-Experiment wurden 150 μl-Reaktionen im Doppelversuch durchgeführt. Zu jedem Zeitpunkt wurden 20 μl entnommen und mit 10 μl eiskaltem 0,5 M EDTA vereinigt. Nach Ablauf der Zeitspanne wurden die Reaktionsgemische so verdünnt, das die gesamte Radioaktivitätskonzentration für jeden Punkt etwa gleich war. Somit wurden Reaktionsgemische mit 75 μM ATP 25-fach verdünnt, während 3 μM ATP-Reaktionsgemische nicht verdünnt wurden. Der Verdünnungspuffer bestand aus 2 Teilen Reaktionspuffer mit einem Gehalt an 500 μM Magnesiumacetat und 1 Teil 0,5 M EDTA. 1 μl eines jeden verdünnten Reaktionsgemisches wurde für den TLC-Nachweis aufgesetzt. Die Werte für die prozentuale Umwandlung von ATP in Phosphat wurden gemäß den Angaben in Beispiel 2 bestimmt. Diese Werte wurden zur Bestimmung der Reaktionsgeschwindigkeiten bei jeder ATP-Konzentration herangezogen. Die Geschwindigkeiten wurden sodann auf die vorstehend angegebene Weise an die Michaelis-Menten-Gleichung angepasst, wodurch man eine Abschätzung für den Wert von K_m (ATP) erhielt (16).
Ein Vergleich der 15 und 16 zeigt klar, dass die beiden Techniken zu ähnlichen Ergebnissen führen, dass jedoch die Qualität der Daten für das SPA-Verfahren besser ist. Ferner erfordert das SPA-Verfahren erheblich weniger Manipulationsvorgänge und eine kürzere Zeitspanne für die Datenverarbeitung. Die dargestellten Ergebnisse sind typische Beispiele, von denen jedes mehrere Male wiederholt wurde.
Beispiel 10
K_i-Wert (ATP-γ-S) für HPV-11, bestimmt durch die SPA-Verfahren
Das γ-Thiophosphatanaloge von ATP hemmt zahlreiche ATPasen durch einen kompetitiven Mechanismus. Eine experimentelle Bestimmung des Mechanismus der Inhibitorwirkung erfordert die Messung der Anfangsgeschwindigkeiten für eine Anzahl von Substrat- und Inhibitorkonzentrationen. Die Anzahl der erforderlichen Datenpunkte (mehrere Hundert) und die für dieses Experiment erforderliche Genauigkeit bedeuten, dass die Durchführung des Experiments durch TLC-Nachweis sehr schwierig und mühsam ist. Das SPA-Verfahren ist jedoch gut geeignet. Für dieses Experiment wurden ATP-Konzentrationen von 5, 10, 20 und 40 μM zusammen mit Inhibitorkonzentrationen von 0, 3, 6, 12 und 24 μM verwendet. Die Reaktionen wurden gemäß Beispiel 9 durchgeführt (SPA-Nachweis). Die Daten wurden auf die vorstehende Weise verarbeitet und durch nicht-lineare Regression an eine Gleichung für die kompetitive Hemmung unter Verwendung von GraFit angepasst. Wir erhielten K_i-Werte (ATP-γ-S) von 3,8 ± 0,4 μM und K_m-Werte (ATP) von 6,7 ± 0,7 μM. Ein Lineweaver-Burk-Diagramm, das die Genauigkeit der Anpassung zeigt, ist in 17A dargestellt. Das Diagramm wurde unter Verwendung der für die Geraden angepassten Parameter und der experimentellen Werte für die Punkte erzeugt. Zum Vergleich wurden die Daten auch an eine Gleichung für eine nicht-kompetitive Hemmung angepasst (gleichwertige Bindung von Inhibitor an Enzym und Enzym-Substrat-Komplexe). Die erhaltenen Werte betrugen 16 ± 2 μM für K_i (ATP-γ-S) und 12 ± 2 μM für K_m (ATP). Das entsprechende, doppelt reziproke Diagramm ist in 17B dargestellt. Aufgrund der Gleichheit der erhaltenen Daten ist es möglich, eine systematische Abweichung zwischen den experimentellen und den angepassten Werten für diesen zweiten Mechanismus, insbesondere bei höheren Inhibitorkonzentrationen, festzustellen. Ein ähnlicher Schluss kann aus dem signifikant niedrigeren reduzierten Chi-Quadrat-Wert für die kompetitive Anpassung im Vergleich zur nicht-kompetitiven Anpassung gezogen werden (62 bzw. 347).
Somit ist erwartungsgemäß das kompetitive Modell für diesen Inhibitor besser geeignet.
Diskussion
Die vorstehend dargelegte Verfahrensweise stellt ein empfindliches, genaues und robustes Verfahren für den Nachweis von Orthophosphat, das durch die Spaltung von radioaktiv markierten, phosphathaltigen Verbindungen erzeugt worden ist, dar. Es ist in hohem Maße dazu geeignet, die Messung der Aktivität von Enzymen, für die Orthophosphat ein Reaktionsprodukt darstellt, und die Messung der Hemmung derartiger Aktivitäten durchzuführen. Es gibt zahlreiche derartige Enzyme. Einige Beispiele hierfür sind Helicasen, ATPasen und Phosphatasen. Das Verfahren eignet sich besonders für Fälle, bei denen nur geringe Konzentrationen an Orthophosphat (nm oder niedriger μM-Bereich) erzeugt werden. Wichtige Fälle sind Enzyme, wie die E1-Helicase von HPV, die das Phosphosubstrat fest binden. Dieses Verfahren ermöglicht die Durchführung von Tests bei Substratkonzentrationen unter dem K_m-Wert für eine maximale Empfindlichkeit gegenüber kompetitiven Inhibitoren. Das Verfahren ist für ein Inhibitor-Screening im Großmaßstab genügend einfach und robust. Insbesondere ist das Verfahren gegenüber zahlreichen üblichen Artefakten unempfindlich, z. B. gegenüber der scheinbaren Hemmung, die durch gefärbte oder fluoreszierende Verbindungen hervorgerufen wird. Das erzeugte Signal ist stabil, reproduzierbar und relativ unempfindlich gegen geringfügige Schwankungen der Konzentrationen oder der Volumina der Testkomponenten. Ferner ist das Verfahren von ausreichender Genauigkeit zur Anwendung für quantitative enzymologische Untersuchungen.
In der Literatur wurden weitere Verfahren zum Nachweis von Orthophosphat diskutiert. Zwei Verfahren, über die viel berichtet wird, verwenden radioaktiv markiertes ATP zur Messung der ATPase-Aktivität. Diese beiden Verfahren beinhalten die physikalische Abtrennung von Produkten (z. B. ADP und Pi) vom Ausgangsmaterial, entweder durch TLC an PEI-Cellulose oder durch selektive Adsorption von ATP an Aktivkohle. Obgleich bei diesen klassischen Verfahren die Empfindlichkeit zum Nachweis von sehr geringen Konzentrationen an Orthophosphat ausreicht, lassen sie sich nicht leicht auf moderne Screening-Anwendungen übertragen. Weitere Testverfahren beruhen auf der Kupplung von Enzymen, die Orthophosphat (oder ein anderes Reaktionsprodukt) als Substrat in einer zweiten Reaktion verwenden und eine Absorptions- oder Fluoreszenzänderung hervorrufen. Diese Verfahren können recht genau sein, sind aber weniger empfindlich als Tests auf der Basis von Radioaktivität. Ferner wird durch die Zugabe eines Kupplungsenzyms die Interpretation der Ergebnisse erschwert, da gekuppelte Enzymtests Gegenstand weiterer Artefakte sind. Mehrere andere Verfahren beinhalten die Bildung von Phosphomolybdat unter anschließender Reduktion oder Farbstoffabsorption unter Bildung einer Farbänderung, die mit der Phosphatkonzentration korreliert werden kann. Einige Enzymtests, die auf diesen Vorgehensweisen beruhen, weisen eine ausreichende Genauigkeit und Robustheit auf, um sie beim Screening von Verbindungen oder enzymologischen Untersuchungen einzusetzen, jedoch ist die Anwendung dieser Verfahren zum Nachweis geringer μM- oder nm-Konzentrationen von Orthophosphat unzweckmäßig. Bei einigen Anwendungen ist es möglich, die Empfindlichkeit dieser Verfahren zu steigern, indem man große Volumina von verdünntem Phosphomolybdat an Sephadex oder verwandten Harzen einengt. Dies hat sich für Screening-Anwendungen jedoch als nicht durchführbar erwiesen, da bei jeder Testreaktion normalerweise nur sehr geringe Volumina verwendet werden. Es wurde gezeigt, dass man radioaktiv markiertes Phosphat selektiv auf der Oberfläche von Polyvinylpolypyrrolidon (PVPP) adsorbieren kann. Radioaktiv markiertes ATP oder andere Verunreinigungen können sodann ausgewaschen werden und das verbleibende Phosphat kann durch Elution bei erhöhtem pH-Wert nachgewiesen werden. Dieses spezifische Verfahren ist für enzymatische Untersuchungen nicht sehr zweckmäßig, da es die physikalische Trennung von Reaktanten und Produkten erfordert und da die Reproduzierbarkeit, die von der Elution von mehrfachen Proben aus PVPP-Säulen abhängig ist, relativ gering ist. Die Autoren weisen darauf hin, dass ein wichtiger Beitrag für die Selektivität ihrer Vorgehensweise darin besteht, dass Polyvinylpyrrolidon die Fähigkeit besitzt, die Bildung von Phosphomolybdat zu katalysieren, woraus zu schließen ist, dass andere hydrophobe Oberflächen für ihr Verfahren weniger gut geeignet sein sollten, was von der vorliegenden Erfindung weg führt.

Claims

Verfahren zum Nachweisen und Messen von radioaktiv markiertem Orthophosphat (Pi) in einem wässrigen Reaktionsgemisch, umfassend folgende Stufen: a. Zugeben einer Lösung von Molybdat zum Reaktionsgemisch unter sauren Bedingungen zur Bildung eines Phosphomolybdat-Komplexes; und b. Kontaktieren des Phosphomolybdat-Komplexes mit einer szintillierenden, hydrophoben Oberfläche; wobei die Bindung von Phosphomolybdat an die Oberfläche für das radioaktiv markierte Phosphat eine ausreichende Nähe schafft, um eine messbare Szintillation des Szintillationsmittels, die mit der Menge des Orthophosphats korreliert, herbeizuführen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Molybdatlösung und die hydrophobe Oberfläche gleichzeitig zum Reaktionsgemisch gegeben werden.
Verfahren nach Anspruch 1, ferner umfassend die folgende Stufe: c. Zugeben einer Lösung von CsCl zum Reaktionsgemisch vor dem Zählvorgang.
Verfahren nach Anspruch 3, ferner umfassend die folgende Stufe: d. Zugeben einer Lösung von Citronensäure zum CsCl enthaltenden Gemisch vor dem Zählvorgang.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei CsCl und Citronensäure gleichzeitig zum Reaktionsgemisch gegeben werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Molybdat Ammoniummolybdat in einer Endkonzentration von 0,05 bis 0,3% (Gew./Vol.) ist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Ammoniummolybdat in einer Endkonzentration von 0,1 bis 0,2% (Gew./Vol.) vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Ammoniummolybdat in einer Endkonzentration von etwa 0,17% (Gew./Vol.) vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die hydrophobe Oberfläche aus folgender Gruppe ausgewählt ist: Polyvinyltoluol (PVT), Sephadex, Latex, Polystyrol, Polyacrylamid, Acrylamid, Agarose, Polypropylen, Polycarbonat und Sepharose.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei es sich bei der Oberfläche um Polyvinyltoluol-Kügelchen handelt.
Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, wobei das CsCl in einer Endkonzentration von mehr als 1 M vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei das CsCl in einer Endkonzentration von 2 bis 4 M vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das CsCl in einer Endkonzentration von etwa 3,5 M vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Citronensäure in einer Endkonzentration von 0,05 bis 0,2 M vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Citronensäure in einer Endkonzentration von etwa 0,1 M vorliegt.
Verfahren zur Bestimmung der ATPase-Aktivität, umfassend die folgenden Stufen: a. Vermischen von radioaktiv markiertem [γ-³³P]ATP mit einem ATP hydrolysierenden Enzym; b. Inkubieren des Reaktionsgemisches für eine ausreichende Zeitspanne, um eine Freisetzung von Orthophosphat aufgrund von Hydrolyse zu ermöglichen; c. Zugeben einer Lösung von Molybdat zum Reaktionsgemisch unter Bildung eines Phosphomolybdat-Komplexes; d. Kontaktieren des Phosphomolybdat-Komplexes mit einer szintillierenden, hydrophoben Oberfläche; und e. Messen der Szintillation des Szintillationsmittels als Maßnahme zur Berechnung der Menge des Orthophosphats.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei es sich beim ATP hydrolysierenden Enzym um das E1-Helicase-Protein von humanem Papillomavirus handelt.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei, die Molybdatlösung und die hydrophobe Oberfläche gleichzeitig zum Reaktionsgemisch gegeben werden.
Verfahren nach Anspruch 16, ferner umfassend die folgende Stufe: f. Zugeben einer Lösung von CsCl zum Reaktionsgemisch vor dem Zählvorgang.
Verfahren nach Anspruch 19, ferner umfassend die folgende Stufe: g. Zugeben einer Lösung von Citronensäure zum CsCl enthaltenden Gemisch vor dem Zählvorgang.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei CsCl und Citronensäure gleichzeitig zum Reaktionsgemisch gegeben werden.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei das Molybdat Ammoniummolybdat in einer Endkonzentration von 0,05 bis 0,3% (Gew./Vol.) ist.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei das Ammoniummolybdat in einer Endkonzentration von 0,1 bis 0,2% (Gew./Vol.) vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei das Ammoniummolybdat in einer Endkonzentration von etwa 0,17% (Gew./Vol.) vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei die hydrophobe Oberfläche aus folgender Gruppe ausgewählt ist: Polyvinyltoluol (PVT), Sephadex, Latex, Polystyrol, Polyacrylamid, Acrylamid, Agarose, Polypropylen, Polycarbonat und Sepharose.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei es sich bei der Oberfläche um Polyvinyltoluol-Kügelchen handelt.
Verfahren nach Anspruch 19 oder 20, wobei das CsCl in einer Endkonzentration von mehr als 1 M vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei das CsCl in einer Endkonzentration von 2 bis 4 M vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 28, wobei das CsCl in einer Endkonzentration von etwa 3,5 M vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei die Citronensäure in einer Endkonzentration von 0,05 bis 0,2 M vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 30, wobei die Citronensäure in einer Endkonzentration von etwa 0,1 M vorliegt.
Screeningtest für Inhibitoren einer Phosphat-hydrolysierenden Enzymaktivität, umfassend folgende Stufen: Durchführen der Stufen a bis e gemäß dem Verfahren von Anspruch 16 in Gegenwart und Abwesenheit eines mutmaßlichen Inhibitors; und Vergleichen der Phosphatmenge in den beiden Fällen, um den Hemmgrad zu berechnen.
Screeningtest für Inhibitoren einer Phosphat-hydrolysierenden Enzymaktivität, umfassend folgende Stufen: Durchführen der Stufen a bis g gemäß dem Verfahren von Anspruch 20 in Gegenwart und Abwesenheit eines mutmaßlichen Inhibitors; und Vergleichen der Phosphatmenge in den beiden Fällen, um den Hemmgrad zu berechnen.
Test nach Anspruch 33, wobei das Phosphat-hydrolysierende Enzym aus folgender Gruppe ausgewählt ist: Helicase, ATPase und Phosphatase.
Test nach Anspruch 33, wobei es sich bei dem Enzym um eine ATPase handelt.
Test nach Anspruch 33, wobei es sich bei der ATPase um die E1-Helicase von humanem Papillomavirus handelt.
Testpackung zur Messung von radioaktiv markiertem Orthophosphat in einer wässrigen Lösung, wobei die Testpackung folgendes umfasst: a. eine Lösung von Molybdat; und b. eine szintillierende hydrophobe Oberfläche; wobei die Molybdatlösung zu der wässrigen Lösung gegeben wird, um einen Phosphomolybdatkomplex zu bilden, wobei der Komplex durch die hydrophobe Oberfläche eingefangen wird, um daran eine messbare Szintillation herbeizuführen.
Testpackung nach Anspruch 37, ferner umfassend eine CsCl-Lösung, um ein Schwimmen von Kügelchen vor der Szintillationszählung zu verstärken.
Testpackung nach Anspruch 38, ferner umfassend eine Citronensäurelösung, um das Szintillationssignal zu stabilisieren.