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GEBIET DER ERFINDUNG
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Die
in den angeschlossenen Ansprüchen
definierte Erfindung bezieht sich auf Verfahren zum Nachweisen von
Nucleinsäurezielsequenzen.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Die
sequenzspezifische Hybridisierung von markierten Oligonucleotidsonden
wird seit langem als Mittel zum Nachweisen und Identifizieren ausgewählter Nucleotidsequenzen
eingesetzt, und das Versehen solcher Sonden mit fluoreszierenden
Markierungen sorgte für
ein relativ empfindliches, nichtradioaktives Mittel zum Ermöglichen
des Nachweisens einer Sondenhybridisierung. Bei jüngst entwickelten
Nachweismethoden wird anstelle der direkten Detektion der Fluoreszenzintensität zum Nachweisen
einer Sondenhybridisierung eher das Verfahren des Fluoreszenzenergietransfers
(FET) angewandt. Ein Fluoreszenzenergietransfer erfolgt zwischen
einem Donor-Fluorophor und einem Quencher-Farbstoff (der ein Fluorophor
sein kann oder auch nicht), wenn das Absorptionsspektrum des einen
(des Quenchers) mit dem Emissionsspektrum des anderen (des Donors) überlappt
und sich die beiden Farbstoffe in enger Nachbarschaft befinden.
Farbstoffe mit diesen Eigenschaften werden als Donor/Quencher-Farbstoffpaare
oder Energietransferfarbstoffpaare bezeichnet. Die Energie des angeregten
Zustands des Donor-Fluorophors wird durch eine dipolinduzierte Resonanz-Dipol-Wechselwirkung
auf den benachbarten Quencher übertragen.
Dies führt
zu einer Löschung
der Donor-Fluoreszenz. Wenn der Quencher (der auch als „Akzeptor" bezeichnet wird)
ebenfalls ein Fluorophor ist, kann in manchen Fällen die Intensität seiner
Fluoreszenz verstärkt
werden. Die Effizienz der Energieübertragung hängt stark
vom Abstand zwischen dem Donor und dem Quencher ab, und diese Beziehungen
vorhersagende Gleichungen wurden von Förster entwickelt (1948, Ann.
Phys. 2, 55–75).
Die Distanz zwischen dem Donor- und dem Quencher-Farbstoff, bei
welcher die Effizienz der Energieübertragung 50% beträgt, wird als
Förster-Distanz
(RO) bezeichnet. Auch andere Mechanismen
der Fluoreszenzlöschung
sind bekannt, einschließlich
z.B. der Ladungsübertragung
und der Stoßlöschung.
In diesen Fällen
kann der Quencher ein fluoreszierender Farbstoff sein, allerdings
muss er dies nicht sein. Mechanismen der Fluoreszenzlöschung,
die nicht auf einem FET beruhen, erfordern typischerweise keine
nennenswerte Überlappung
zwischen dem Absorptionsspektrum des Quenchers und dem Emissionsspektrum
des Donor-Fluorophors.
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Die
Energieübertragung
und andere Mechanismen, die von der Wechselwirkung zwischen zwei
eng benachbarten Farbstoffen abhängen,
um eine Löschung
hervorzurufen, stellen ein interessantes Mittel zum Nachweisen oder
Identifizieren von Nucleotidsequenzen dar, da solche Analysen in
homogenen Formaten durchgeführt
werden können.
Homogene Analyseformate sind einfacher als herkömmliche Sondenhybridisierungsanalysen,
welche auf dem Nachweis der Fluoreszenz einer einzigen Fluorophor-Markierung
beruhen, da heterogene Analysen im Allgemeinen zusätzliche
Schritte zum Abtrennen einer hybridisierten Markierung von einer
freien Markierung erfordern. Typischerweise beruhten der FET und
verwandte Methoden auf dem Überwachen
einer Veränderung
der Fluoreszenzeigenschaften einer oder beider Farbstoffmarkierungen,
wenn diese durch Hybridisierung zweier komplementärer Oligonucleotide
zusammengebracht werden. Bei diesem Format kann die Veränderung
der Fluoreszenzeigenschaften als Veränderung der Menge an Energieübertragung oder
als Veränderung
der Menge an Fluoreszenzlöschung
gemessen werden, was typischerweise als Anstieg der Fluoreszenzintensität bei einem
der Farbstoffe angezeigt wird. Auf diese Art und Weise kann die
Nucleotidsequenz, die von Interesse ist, ohne Trennung nicht hybridisierter
und hybridisierter Oligonucleotide nachgewiesen werden. Die Hybridisierung
kann zwischen zwei getrennten komplementären Oligonucleotiden erfolgen,
von denen eines mit dem Donor-Fluorophor und eines mit dem Quencher
markiert ist. In der doppelsträngigen
Form kommt es im Vergleich zu einzelsträngigen Oligonucleotiden zu
einer verminderten Donor-Fluoreszenz (gesteigerten Löschung)
und/oder zu einer erhöhten
Energieübertragung.
Mehrere Formate für FET-Hybridisierungsanalysen
werden in Nonisotopic DNA Probe Techniques (1992, Acadamic Press,
Inc., S. 311–352)
besprochen. Alternativ können
der Donor und der Quencher solcherart mit einem einzelnen Oligonucleotid
verbunden sein, dass es bei einem oder beiden zu einem nachweisbaren
Unterschied in den Fluoreszenzeigenschaften kommt, und zwar wenn
das Oligonucleotid nicht hybridisiert ist, verglichen mit dem Zustand,
wenn es mit seiner komplementären
Sequenz hybridisiert ist. Bei diesem Format ist die Donor-Fluoreszenz typischerweise
erhöht
und die Energieübertragung/Löschung vermindert,
wenn das Oligonucleotid hybridisiert ist. Ein mit Donor- und Quencher-Farbstoffen
markiertes Oligonucleotid kann beispielsweise selbstkomplementäre Sequenzen
enthalten, die Basenpaare bilden, um eine Haarnadel zu formen, welche
die beiden Farbstoffe in enge räumliche
Nähe bringt,
wo eine Energieübertragung
und -löschung
stattfinden kann. Eine Hybridisierung dieses Oligonucleotids mit
seiner komplementären
Sequenz in einem zweiten Oligonucleotid zerstört die Haarnadel und vergrößert den
Abstand zwischen den beiden Farbstoffen, wodurch die Löschung verringert
wird. Siehe Tyagi und Kramer (1996, Nature Biotech. 14, 303–308) und
B. Bagwell, et al. (1994, Nucl. Acids Res. 22, 2424–2425; U.S.-Patent Nr. 5,607,834).
Homogene Verfahren, bei denen eine Energieübertragung oder andere Mechanismen
der Fluoreszenzlöschung
zum Nachweisen einer Nucleinsäureamplifikation
eingesetzt werden, wurden ebenfalls beschrieben. L. G. Lee, et al.
(1993, Nuc. Acids Res. 21, 3761–3766)
offenbaren ein Echtzeit-Nachweisverfahren, bei dem eine doppelt
markierte Detektorsonde während
einer PCR in zielamplifikationsspezifischer Weise gespalten wird.
Die Detektorsonde wird stromabwärts vom
Amplifikationsprimer hybridisiert, so dass die 5'-3'-Exonucleaseaktivität von Taq-Polymerase
die Detektorsonde aufschließt,
wobei zwei fluoreszierende Farbstoffe, die ein Energieübertragungspaar
bilden, getrennt werden. Die Fluoreszenzintensität nimmt beim Spalten der Sonde
zu.
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Signalprimer
(die manchmal auch als Detektorsonden bezeichnet werden), welche
mit der Zielsequenz stromabwärts
von der Hybridisierungsstelle der Amplifikationsprimer hybridisieren,
wurden in Hinblick auf eine homogene Detektion einer Nucleinsäureamplifikation
beschrieben (U.S.-Patent Nr. 5,547,861). Der Signalprimer wird durch
die Polymerase in einer Weise verlängert, die der Verlängerung
der Amplifikationsprimer ähnelt.
Die Verlängerung
des Amplifikationsprimers verdrängt
das Verlängerungsprodukt
des Signalprimers in einer zielamplifikationsabhängigen Weise, wobei ein doppelsträngiges sekundäres Amplifikationsprodukt
hergestellt wird, das als Hinweis auf eine Zielamplifikation nachgewiesen
werden kann. Beispiele für
homogene Nachweisverfahren zur Verwendung bei einzelsträngigen Signalprimern
sind im U.S.-Patent Nr. 5,550,025 (Einbau von lipophilen Farbstoffen
und Restriktions-Schnittstellen) und im U.S.-Patent Nr. 5,593,867 (Nachweis
von Fluoreszenzpolarisation) beschrieben. In jüngerer Zeit wurden Signalprimer
zur Detektion von Nucleinsäurezielen
angepasst, wobei FET-Verfahren eingesetzt werden, bei denen das
Entfalten sekundärer Strukturen
zur Anwendung kommt (z.B. U.S.-Patent 5,691,145 und
US 5,928,869 ). Teils einzelsträngige, teils doppelsträngige Signalprimer,
die mit Donor/Quencher-Farbstoffpaaren markiert sind, wurden ebenfalls
vor kurzem beschrieben. Die
US
5,846,726 offenbart beispielsweise Signalprimer mit Donor/Quencher-Farbstoffpaaren,
welche eine einzelsträngige
Restriktionsendonuclease-Erkennungsstelle
flankieren. In Gegenwart des Ziels wird die Restriktions-Schnittstelle
doppelsträngig
und durch die Restriktionsendonuclease spaltbar. Die Furchungsteilung
trennt das Farbstoffpaar und vermindert das Donor-Quenching.
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Das
U.S.-Patent Nr. 5,866,336 beschreibt die Verwendung einer fluoreszenzmarkierten
Haarnadel an einem Amplifikationsprimer bei einer PCR. Das 3'-Ende des Haarnadelprimers
hybridisiert mit dem Complement einer Nicht-Zielsequenz, die durch
einen zweiten Primer am Ziel angefügt ist. Bei diesem System hat
der Haarnadelprimer einen wesentlichen Anteil an der Amplifikation
der Zielsequenz und muss verlängerbar
sein.
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Im
Gegensatz dazu ist es bei der vorliegenden Erfindung nicht notwendig,
dass die Reportersonde verlängerbar
ist, da sie an der Amplifikation der Zielsequenz nicht beteiligt
ist, sondern in einer separaten Abfolge von gleichzeitig mit der
Zielamplifikation stattfindenden Reaktionsschritten ein Signal erzeugt.
Ein weiterer Gegensatz besteht darin, dass die erfindungsgemäßen Signalprimer
mit einer internen Sequenz des Ziels (d.h. zwischen den Amplifikationprimern)
hybridisieren, so dass die Signalerzeugungsreaktion eine Subsequenz des
Ziels und nicht das Amplifikationsprodukt selbst nachweist.
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Bei
anderen Fluoreszenzlöschverfahren
zum Nachweisen einer Zielsequenz kommt eine Furchungsteilung einer
Restriktions-Schnittstelle zur Anwendung, welche durch direkte Hybridisierung
einer die einzelsträngige
Restriktions-Schnittstelle enthaltenden Sonde mit dem einzelsträngigen Ziel
produziert wird. Das japanische Patent Nr. 93015439 B offenbart
Verfahren zum Messen von Polynucleotiden durch Hybridisierung des
einzelsträngigen
Ziels mit einer einzelsträngigen
Polynucleotidsonde, welche mit zwei Markierungen, die ein Energieübertragungspaar
bilden, versehen ist. Das doppelsträngige Hybrid wird durch ein
Restriktionsenzym zwischen den Markierungen gespalten, und die Fluoreszenz
einer der Markierungen wird gemessen. Ein Nachteil dieses Verfahrens
besteht darin, dass die Restriktions-Schnittstelle in der Sonde
auch in der Zielsequenz, die nachgewiesen wird, vorhanden sein muss.
S. S. Ghosh, et al. (1994, Nucl. Acids Res. 22, 3155–3159) beschreiben
die Restriktionsenzym-katalysierte Furchungsteilung Fluorophor-markierter
Oligonucleotide, welche unter Anwendung eines Fluoreszenzresonanz-Energietransfers
analysiert werden. Bei dieses Analysen werden die komplementären Oligonucleotide
hybridisiert, um die doppelsträngige
Restriktions-Schnittstelle herzustellen, wobei eine der fluoreszierenden
Markierungen mit jedem der beiden Stränge verbunden ist.
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KURZFASSUNG DER ERFINDUNG
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Bei
der in den angeschlossenen Ansprüchen
definierten, vorliegenden Erfindung wird ein Signalprimer zum Nachweisen
einer Nucleinsäurezielsequenzamplifikation
eingesetzt. Der bei der Erfindung verwendete Signalprimer hat eine ähnliche
Struktur wie der im U.S.-Patent
Nr. 5,547,861 beschriebene Signalprimer, ist jedoch unmarkiert.
Das Nachweissystem umfasst weiters eine markierte Reportersonde,
deren 3'-Ende mit
dem Complement der 5'-Schwanzsequenz des
Signalprimers hybridisiert, um einen 5'-Überhang
zu erzeugen. Der den 5'-Überhang
bildende Bereich der Reportersonde (die Reporterkomponente) umfasst
eine Struktur oder Sequenz, die in einer Weise markiert ist, welche
das Nachweisen der Synthese des Complements des Überhangs ermöglicht.
Vorzugsweise ist die Reporterkomponente fluoreszenzmarkiert, so
dass die Fluoreszenz vor der Verlängerung des Signalprimers und
der Synthese eines komplementären
Strangs gelöscht
wird. Das Vorhandensein des Complements der Reporterkomponente,
welches diese doppelsträngig
macht, reduziert in direkter Weise die Fluoreszenzlöschung und/oder
ermöglicht
das Stattfinden einer anschließenden
Reaktion zwecks Verringerung der Löschung. Bei beiden Mechanismen
führt das
Complement der markierten Struktur oder Sequenz zu einem vergrößerten Abstand
zwischen den Farbstoffen. Ein damit zusammenhängender Anstieg der Donor-Fluoreszenz
oder eine Veränderung
eines anderen, mit einer verminderten Fluoreszenzlöschung zusammenhängenden
Fluoreszenzparameters kann als Hinweis auf eine Amplifikation der
Zielsequenz nachgewiesen werden.
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Die
5'-Schwanzsequenz
des Signalprimers umfasst eine Sequenz, welche nicht mit dem Ziel
hybridisiert (die Adaptorsequenz). Die Adaptorsequenz kann dahingehend
ausgewählt
sein, dass sie bei einer Vielzahl von Signalprimern, die verschiedene
3'-Zielbindesequenzen
aufweisen, gleich ist (d.h. eine „universelle" 5'-Schwanzsequenz).
Dies ermöglicht
die Verwendung einer einzigen Reportersondensequenz zum Nachweisen
jeder gewünschten
Zielsequenz, was einen Vorteil darstellt, da die Synthese der Reportersonde
aufgrund der Markierung komplexer ist. Weiters vereinfacht die Erfindung
die Synthese des zielspezifischen Signalprimers. Da der Signalprimer
nicht markiert ist, können
Signalprimer mit verschiedenen, für unterschiedliche Ziele spezifischen
Zielbindesequenzen leichter und effizienter synthetisiert werden.
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BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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1A veranschaulicht
die Detektion einer Nucleinsäurezielsequenz
in einer Strangverdrängungsamplifikations(SDA)-Reaktion
gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren. 1B stellt
die zusätzlichen
Reaktionsschritte dar, welche auftreten können, wenn die fluoreszenzmarkierte
Sequenz in der Reportersonde eine mit Einzelstrangbrüchen versehbare
RERS ist.
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2 stellt
die Ergebnisse von Beispiel 1 dar.
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3A und 3B stellen
die Ergebnisse von Beispiel 2 dar.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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Bestimmte,
hier verwendete Begriffe sind wie folgt definiert:
Ein Amplifikationsprimer
ist ein Primer für
die Amplifikation einer Zielsequenz durch Primerverlängerung.
Bei einer SDA hybridisiert das 3'-Ende
des Amplifikationsprimers (die Zielbindesequenz) mit dem 3'-Ende der Zielsequenz.
Der Amplifikationsprimer umfasst in der Nähe seines 5'-Endes eine Erkennungsstelle für eine Restriktionsendonuclease.
Die Erkennungsstelle besteht für
eine Restriktionsendonuclease, die einen Strang eines DNA-Doppelstrangs
spaltet, wenn die Erkennungsstelle hemimodifiziert wird („Einführen von
Einzelstrangbrüchen"), wie im U.S.-Patent
Nr. 5,455,166; im U.S.-Patent Nr. 5,270,184 und in der
EP 0 684 315 beschrieben. Da zum Vorantreiben
der Amplifikationsreaktion keine speziellen Sequenzen oder Strukturen
erforderlich sind, können
Amplifikationsprimer für
eine PCR nur aus Zielbindesequenzen bestehen. Im Gegensatz dazu
umfassen Amplifikationsprimer für
3SR und NASBA in der Nähe
des 5'-Endes einen RNA-Polymerase-Promotor.
Der Promotor ist an der Zielsequenz angefügt und dient zum Vorantreiben
der Amplifikationsreaktion durch Steuern der Transcription multipler
RNA-Kopien des Ziels.
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Verlängerungsprodukte
sind Nucleinsäuren,
die einen Primer oder einen Teil eines Primers und einen neu synthetisierten
Strang umfassen, welcher das Complement der stromabwärts von
der Primerbindungsstelle gelegenen Sequenz ist. Verlängerungsprodukte
resultieren aus der Hybridisierung eines Primers mit einer Matrize,
die eine komplementäre
Sequenz enthält,
und der Verlängerung
des Primers durch Polymerase unter Verwendung der Matrize.
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Die
Begriffe „Ziel" oder „Zielsequenz" beziehen sich auf
zu amplifizierende oder nachzuweisende Nucleinsäuresequenzen. Diese umfassen
die ursprüngliche,
zu amplifizierende Nucleinsäuresequenz,
deren komplementären
zweiten Strang und beide Stränge
einer Kopie der ursprünglichen
Sequenz, die durch Replikation oder Amplifikation hergestellt wird.
Eine Zielsequenz kann auch als Matrize für die Verlängerung hybridisierter Primer
bezeichnet werden.
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Ein
Signalprimer, wie er bei der vorliegenden Erfindung verwendet wird,
umfasst eine 3'-Zielbindesequenz,
die mit einer komplementären
Sequenz im Ziel hybridisiert und weiters eine 5'-Schwanzsequenz umfasst, die zum Ziel
nicht komplementär
ist (die Adaptorsequenz). Die Adaptorsequenz ist dahingehend ausgewählt, dass
ihre komplementäre
Sequenz mit dem 3'-Ende
der untenstehend beschriebenen Reportersonde hybridisiert. Bei manchen
Ausführungsformen
der Erfindung ist die Adaptorsequenz dahingehend ausgewählt, dass
ihre komplementäre
Sequenz sowohl an das 3'-Ende
der Reportersonde als auch an eine Sequenz innerhalb der Reporterkomponente
der Reportersonde bindet, so wie untenstehend beschrieben. Bei der
Erfindung weist der Signalprimer keine nachweisbare Markierung auf.
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Eine
Reportersonde, wie sie bei der vorliegenden Erfindung verwendet
wird, umfasst eine Markierung, die vorzugsweise zumindest ein Donor/Quencher-Farbstoffpaar,
d.h. ein fluoreszierender Donor-Farbstoff und ein Quencher für das Donor-Fluorophor,
ist. Die Markierung ist mit einer Sequenz oder Struktur in der Reportersonde
(der Reporterkomponente) verbunden, welche nicht direkt mit der
Zielsequenz hybridisiert. Die Sequenz der Reportersonde, die 3' zur Reporterkomponente
gelegen ist, wird dahingehend ausgewählt, um mit dem Complement
der Signalprimer-Adaptorsequenz zu hybridisieren. Im Allgemeinen
enthält
das 3'-Ende der Reportersonde
keine Sequenzen mit signifikanter Komplementarität zur Zielsequenz. In manchen
Fällen
kann die Reportersonde jedoch die Sequenz enthalten, die mit dem
Adaptor-Complement hybridisiert, sowie eine weitere kurze Sequenz
am 3'-Ende, die
mit einem kurzen Segment des Ziel-Complements hybridisiert. In diesem
Fall ist der Bereich der Zielkomplementarität nicht groß genug, um eine signifikante
Hybridisierung ohne gleichzeitige Hybridisierung des adaptorspezifischen
Bereichs der Reportersonde zu ermöglichen. Die Markierung der
Reportersonde wird als Hinweis auf das Vorhandensein eines Complements
der Reporterkomponente, welches diese doppelsträngig macht, nachgewiesen, wodurch
das Vorhandensein oder die Amplifikation des Ziels angezeigt wird.
Der 3'-Terminus
der Reportersonde kann zwecks Verhinderung einer Verlängerung durch
Polymerase mit einem Cap versehen werden oder kann verlängerbar
sein. Das Anbringen des Caps kann die Leistung steigern, indem das
Hintergrundsignal und der unproduktive Verbrauch von Reagenzien
in unerwünschten
Nebenreaktionen, die aus der Bildung von Primerdimeren und anderen
fehlgeleiteten Startvorgängen
resultieren, reduziert werden.
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Jede
Nucleinsäuresequenz
oder -struktur, die so markiert werden kann, dass das Vorhandensein
ihres gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren
hergestellten Complements auf das Vorhandensein der Zielsequenz
hinweist, kann als Reporterkomponente der Reportersonde dienen.
Vorzugsweise ist die Reporterkomponente mit einem Donor/Quencher-Farbstoffpaar
markiert, so dass die Donor-Fluoreszenz vor dem Nachweis eines Ziels
gelöscht
wird und die Löschung
der Donor-Fluoreszenz als Hinweis auf das Vorhandensein des Ziels
reduziert wird. Die Reporterkomponente kann eine sekundäre Struktur
am 5'-Ende der Reportersonde sein,
zum Beispiel ein Stern-Loop (oder eine Haarnadel), wie im U.S.-Patent
Nr. 5,928,869 beschrieben, oder eine G-Quartett, wie im U.S.-Patent
Nr. 5,691,145 beschrieben. Die sekundäre Struktur ist solcherart
markiert, dass sich der Donor und der Quencher in enger Nachbarschaft
befinden, wenn die sekundäre
Struktur gefaltet wird, was zur Löschung der Donor-Fluoreszenz
führt.
Bei Vorhandensein eines Ziels wird die sekundäre Struktur in einer zielabhängigen Primerverlängerungsreaktion
entfaltet, so dass der Abstand zwischen dem Donor und dem Quencher
vergrößert wird.
Dies vermindert die Löschung
und erzeugt einen Anstieg der Donor-Fluoreszenz, was als Hinweis
auf das Vorhandensein der Zielsequenz nachgewiesen werden kann.
Alternativ kann die Reporterkomponente eine einzelsträngige Sequenz
am 5'-Ende der Reportersonde
sein, welche mit dem Donor und dem Quencher in ausreichend enger
Nachbarschaft markiert ist, um eine Löschung zu erzeugen, und welche
eine einzelsträngige
Restriktionsendonuclease-Erkennungsstelle
(RERS) enthält,
so wie im U.S.-Patent Nr. 5,846,726 und im U.S.-Patent Nr. 5,919,630
beschrieben. In der einzelsträngigen
Reportersonde ist die RERS nicht spaltbar. Bei Vorhandensein eines
Ziels wird die einzelsträngige
RERS jedoch in einer zielabhängigen
Primerverlängerungsreaktion
in die doppelsträngige
Form umgewandelt und wird dadurch spaltbar. Eine Behandlung mit
der geeigneten Restriktionsendonuclease spaltet die RERS zwischen
den beiden Farbstoffen und teilt diese dabei in getrennte Nucleinsäurefragmente.
Die damit zusammenhängende
Vergrößerung des
Abstands zwischen den Farbstoffen führt zu einer reduzierten Löschung der
Donor-Fluoreszenz, die als Hinweis auf das Vorhandensein der Zielsequenz
nachgewiesen werden kann. Bei einer weiteren Ausführungsform
kann eine RERS-Reporterkomponente während der zielabhängigen Primerverlängerungsreaktion
für das
Einführen
von Einzelstrangbrüchen
geeignet gemacht werden, wie im U.S.-Patent Nr. 5,846,726 und im
U.S.-Patent Nr. 5,919,630 gelehrt. Bei dieser Ausführungsform
führt die
Restriktionsendonuclease an dem Strang, mit dem der Donor und der
Quencher verbunden sind, Einzelstrangbrüche ein, wenn die RERS doppelsträngig gemacht
wird. Die Polymerase verlängert
vom Einzelstrangbruch weg, wobei ein mit einem der Farbstoffe verbundenes,
einzelsträngiges
Fragment aus der Reportersonde verdrängt wird. Dies vergrößert auch
den Abstand zwischen dem Donor und dem Quencher und führt zu einem
Anstieg der Donor-Fluoreszenz aufgrund verminderter Löschung.
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Eine
Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens,
die bei einer SDA zur Anwendung kommt, ist in 1A schematisch
dargestellt. Die Anfangsschritte der Reaktion stimmen mit der im
U.S.-Patent Nr. 5,547,861 beschriebenen Signalprimerreaktion überein.
Ein Signalprimer mit einer 3'-Zielbindesequenz
(B) und einem nicht komplementären
5'-Schwanz (A) hybridisiert
mit dem Ziel stromabwärts
von einem Amplifikationsprimer (S1) (Schritt
1). Wie dargestellt, ist die gesamte Hybridisierungsstelle des Signalprimers
stromabwärts
von der Hybridisierungsstelle des Amplifikationprimers gelegen.
Die Hybridisierungsstellen des Signalprimers und des Amplifikationprimers
am Ziel können
jedoch auch teilweise überlappen
(typischerweise nur durch einige Nucleotide), ohne die erfindungsgemäßen Verfahren
maßgeblich
zu beeinflussen. Wie hier verwendet, soll der Begriff „stromabwärts von" bezüglich der
Hybridisierungsstellen des Signalprimers und des Amplifikationprimers
am Ziel nicht überlappende
und teilweise überlappende
Stellen im Ziel umfassen. Im Anschluss an eine Hybridisierung mit
dem Ziel werden der Amplifikationsprimer und der Signalprimer an
der Zielsequenz gleichzeitig verlängert, und die Verlängerung
des Amplifikationsprimers verdrängt
das einzelsträngige Signalprimer-Verlängerungsprodukt
(Schritt 2). Der zweite Amplifikationsprimer (S2)
hybridisiert mit dem Signalprimer-Verlängerungsprodukt (Schritt 3),
und sowohl das Signalprimer-Verlängerungsprodukt
als auch der Amplifikationsprimer werden verlängert, um ein doppelsträngiges sekundäres Amplifikationsprodukt
mit einer hemimodifizierten RERS an einem Ende zu erzeugen (Schritt
4). Bei einer SDA wird durch das Einführen von Einzelstrangbrüchen am
nicht modifizierten S2-Strang der RERS (in
Schritt 4 als Pfeil dargestellt) und das Verdrängen des stromabwärts vom
Einzelstrangbruch gelegenen Strangs ein einzelsträngiges Oligonucleotid
erzeugt, welches das Complement des Signalprimers umfasst (Schritt
5). Das Complement des Signalprimers und das doppelsträngige sekundäre Amplifikationsprodukt
werden nur dann hergestellt, wenn das Ziel vorhanden und amplifiziert
ist. Sie können
daher als Hinweis auf eine Zielamplifikation nachgewiesen werden.
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Bei
dem im U.S.-Patent Nr. 5,547,861 gelehrten Nachweisverfahren wird
das doppelsträngige
sekundäre
Amplifikationsprodukt nachgewiesen. Im Gegensatz dazu weist die
vorliegende Erfindung das einzelsträngige Oligonucleotid nach,
welches nach dem Einführen
von Einzelstrangbrüchen
aus dem doppelsträngigen
sekundären
Amplifikationsprodukt verdrängt
wird. Da dieses Oligonucleotid das Complement des Signalprimers
umfasst, hybridisiert das 3'-Ende
der Reportersonde mit ihm (Schritt 6). Das 5'-Ende der Reportersonde, welches die
markierte Struktur oder Sequenz enthält, bildet einen Überhang
mit zwei zurückversetzten 3'-Enden, welche geeignete
Substrate für
Polymerase sind. Wenn die Reportersonde nicht mit einem Cap zur Verhinderung
einer Verlängerung
versehen ist, werden sowohl die Reportersonde als auch das einzelsträngige Oligonucleotid
verlängert,
um ein völlig
doppelsträngiges
Molekül
zu produzieren (Schritt 7). Ist die Reportersonde nicht verlängerbar,
so wird nur das zurückversetzte
3'-Ende des einzelsträngigen Oligonucleotids
(welches das Complement des Signalprimers umfasst) verlängert, und
das Produkt ist teilweise einzelsträngig und teilweise doppelsträngig. In
beiden Fällen
wird jene Sequenz synthetisiert, die zur markierten Struktur oder
Sequenz der Reportersonde komplementär ist, und wird dabei doppelsträngig gemacht. 1A veranschaulicht die
Erfindung unter Verwendung einer Haarnadel-Reporterkomponente, die
mit einem Donor/Quencher-Farbstoffpaar markiert ist, so dass die
Donor-Fluoreszenz gelöscht
wird. Aus diesem Beispiel ist zu erkennen, dass es für den Nachweis
der Reporterkomponente nicht unbedingt notwendig ist, diese vollständig doppelsträngig zu
machen. Ein Teilcomplement der Haarnadelstruktur kann beispielsweise
ausreichen, um die Arme des Stamms davon abzuhalten, miteinander
zu hybridisieren. Wie hier verwendet, soll „doppelsträngige Reporterkomponente" sowohl völlig als
auch teilweise doppelsträngige
Reporterkomponenten umfassen, vorausgesetzt, dass sie ausreichend
doppelsträngig
sind, um die Reporterkomponente nachweisbar zu machen. Wenn die
Reporterkomponente in der Primerverlängerungsreaktion doppelsträngig gemacht
wird, wird die Haarnadel entfaltet. Beim Entfalten werden die beiden
Farbstoffe räumlich
genügend
voneinander getrennt, um die Löschung
der Donor-Fluoreszenz durch den Quencher zu verringern oder auszuschalten.
Der resultierende Anstieg der Donor-Fluoreszenz oder eine Veränderung
eines anderen Fluoreszenzparameters in Zusammenhang mit einer Veränderung
der Fluoreszenzlöschung
(wie z.B. Fluoreszenzlebensdauer, Fluoreszenzpolarisation oder Veränderung
der Emission des Quencher/Akzeptor-Farbstoffs) kann als Hinweis
auf die Amplifikation der Zielsequenz nachgewiesen werden. Außerdem können, wie
in 1A dargestellt, mehrere Reporterkomponenten in
einer einzigen Reportersonde vereinigt sein, und eine markierte
Haarnadel kann beispielsweise in der einzelsträngigen „Schleife" eine einzelsträngige RERS aufweisen. Bei dieser
Ausführungsform
entfaltet die Synthese des Complements der Reporterkomponente nicht
nur die Haarnadel, um einen Fluoreszenzanstieg zu bewirken, sondern
die RERS wird gleichzeitig auch spaltbar oder mit Einzelstrangbrüchen versehbar,
wodurch im Allgemeinen ein zusätzlicher
Fluoreszenzanstieg erzeugt wird.
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Wie
in 1A dargestellt, hybridisiert die gefaltete Reporterkomponente
(z.B. eine Haarnadel) der Reportersonde nicht mit dem Complement
der Adaptorsequenz. Die Adaptorsequenz kann jedoch dahingehend ausgewählt sein,
dass ihre komplementäre
Sequenz mit einer gesamten gefalteten Reporterkomponente der Reportersonde
oder einem Teil davon hybridisiert. In diesem Fall wird allein die
Hybridisierung die Reporterkomponente entfalten oder teilweise entfalten,
wobei ohne Notwendigkeit einer Polymerase-katalysierten Verlängerung im Anschluss an die
Hybridisierung ein Signal erzeugt wird. Die gefaltete Reporterkomponente
kann bei dieser Ausführungsform
die gesamte Reportersondensequenz oder einen Teil davon umfassen.
Bei einem Beispiel für
eine solche Ausführungsform
kann die Reportersonde ein molekularer Beacon sein, wie von Tyagi und
Kramer beschrieben, siehe oben, wobei die Schleife der Beacon-Haarnadel
die gesamte Adaptorsequenz oder einen Teil davon umfasst. Da das
Complement der Adaptorsequenz während
der Zielamplifikation synthetisiert wird, bindet es an den molekularen
Beacon und entfaltet die Struktur und erzeugt dabei eine erhöhte Fluoreszenz.
Bei einer weiteren Ausführungsform
enthält
die Reportersonde eine einzelsträngige
Sequenz 3' zur gefalteten
Reporterkomponente, so dass sowohl die einzelsträngige Sequenz als auch die
gesamte gefaltete Reporterkomponente oder ein Teil davon mit der
zur Adaptorsequenz komplementären
Sequenz hybridisieren, wenn diese während der Amplifikation erzeugt
wird.
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Bei
anderen alternativen Ausführungsformen
können
in dem in 1A gezeigten Reaktionsschema andere
Reporterkomponenten substituiert werden. Beispielsweise können andere
gefaltete Nucleinsäurestrukturen,
wie z.B. G-Quartetts, in einer ähnlichen
zielabhängigen
Weise substituiert und entfaltet werden, um die Fluoreszenzlöschung zu
reduzieren. Alternativ kann eine spezialisierte lineare Sequenz
als Reporterkomponente verwendet werden, beispielsweise eine RERS.
Wird eine RERS als Reporterkomponente verwendet, so sind der Donor
und der Quencher die Spaltstelle flankierend gebunden, so dass die
beiden Farbstoffe auf separaten Nucleinsäurefragmenten getrennt werden,
wenn die RERS doppelsträngig
gemacht und in zielabhängiger
Weise gespalten wird (Schritt 8, 1A). Diese
alternativen sekundären
Strukturen können
ebenfalls mit spezialisierten Sequenzen, wie z.B. einer RERS in
einem G-Quartett, kombiniert werden. Alternativ kann die RERS in
ihrer doppelsträngigen
Form für
das Einführen
von Einzelstrangbrüchen
geeignet gemacht werden, anstatt spaltbar gemacht zu werden. Dies
ist eine besonders geeignete Ausführungsform für die Verwendung
bei einer SDA, da der Einbau von modifizierten Nucleotiden und die
Herstellung von RERS, an denen Einzelstrangbrüche eingeführt werden können, einen
wesentlichen Teil der Amplifikationsreaktion bilden. Die Erzeugung
einer RERS, an der Einzelstrangbrüche eingeführt werden können, in
der Reportersonde fügt
einige zusätzliche
Nebenreaktionen zum Reaktionsschema der 1A hinzu
(gezeigt in 1B). 1B veranschaulicht
die Reaktion, wenn die RERS des in Schritt 7 der 1A dargestellten,
doppelsträngigen
Moleküls, anstatt
gespalten zu werden, einer Einführung
von Einzelstrangbrüchen
unterzogen wird. Unter Bezugnahme auf 1B werden
zwei Produkte erzeugt, wenn Polymerase vom Einzelstrangbruch weg
verlängert:
das doppelsträngige
Molekül
(das nun nur einen der beiden Farbstoffe trägt) wird regeneriert, und das
einzelsträngige Molekül stromabwärts vom
Einzelstrangbruch wird verdrängt
(Schritt 9, trägt
den anderen der beiden Farbstoffe). Am doppelsträngigen Molekül können erneut
Einzelstrangbrüche
eingeführt
werden, wobei es zu einer Verdrängung
zusätzlicher
einzelsträngiger
Moleküle
kommt, und die verdrängten
einzelsträngigen
Moleküle können mit
einem Amplifikationsprimer hybridisieren (Schritt 10) und verlängert werden,
um in einem vollständig
doppelsträngigen
Molekül
eine RERS zu produzieren, an der Einzelstrangbrüche eingeführt werden können (Schritte
11 und 12). Durch weiteres Einführen
von Einzelstrangbrüchen
und Verdrängen
werden einzelsträngige
Moleküle
erzeugt, die an einem Ende eine von der vorhergehenden Reportersonde
abgeleitete teilweise RERS und keine Markierung aufweisen (Schritt
13). Diese hybridisiert mit einer neuen Reportersonde (Schritt 14),
und das zurückversetzte
Ende wird verlängerbar,
da die Haarnadel atmet und eine Hybridisierung der teilweisen RERS
ermöglicht.
Das Auffüllen
des zurückversetzten
Endes macht die RERS für
das Einführen von
Einzelstrangbrüchen
geeignet (Schritt 15), und das verdrängte einzelsträngige Molekül tritt
erneut in die Reaktion ein und der Kreislauf wiederholt sich. Dies
verstärkt
das Signal, das anfänglich
durch eine einzige Signalprimer/Ziel-Wechselwirkung erzeugt wurde,
und zwar mittels einer separaten Reaktion, die unabhängig von
jeder weiteren Zielamplifikation abläuft.
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Im
Allgemeinen ist die Länge
der Sequenzen, die an der intermolekularen Basenpaarung zwischen dem
Complement der Adaptorsequenz des Signalprimers und der Reportersonde
beteiligt sind, nicht entscheidend. Hinsichtlich des Signalprimers
wurde jedoch beobachtet, dass die Tm der
Zielbindesequenz im Allgemeinen einen größeren Einfluss auf die Analyseeffizienz
hat und dass längere
Zielbindesequenzen im Allgemeinen mehr fluoreszierendes Signal während der
Analyse erzeugen. Dies könnte
an der Konkurrenz zwischen dem Signalprimer und dem Verlängerungsprodukt
des stromaufwärts
gelegenen Amplifikationsprimers hinsichtlich der Hybridisierung
mit der Zielsequenz liegen. Die geeignete Länge für den Signalprimer und die
Reportersonde wird durch die Anzahl der Nucleotide bestimmt, die
für eine
stabile Basenpaarung erforderlich sind, um ein teilweise doppelsträngiges Molekül unter
den ausgewählten
Reaktionsbedingungen zu erhalten, und dies gehört zum durchschnittlichen Fachwissen.
Aus Gründen
der Zweckdienlichkeit sind die an der Basenpaarung beteiligten Sequenzen
typischerweise zwischen etwa 8 und 75 Nucleotide lang. Die maximale Länge wird
nur durch praktische Bedenken wie z.B. die Einfachheit und Effizienz
der Oligonucleotidsynthese und -gewinnung einschränkt.
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Das
Auswählen
der passenden Konzentrationen von Signalprimer und Reportersonde
bei der Reaktion gehört
ebenfalls zum durchschnittlichen Fachwissen. Vorzugsweise ist die
Konzentration an Signalprimer und Reportersonde relativ hoch und
die Konzentration an stromaufwärts
gelegenem Amplifikationsprimer relativ niedrig, da dies im Allgemeinen
für eine
höhere
Fluoreszenzsignalerzeugung bei der Reaktion sorgt.
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Ein
zweiter Signalprimer, der mit dem zweiten komplementären Strang
einer doppelsträngigen
Zielsequenz hybridisiert, kann gegebenenfalls in der Reaktion inkludiert
sein, vorausgesetzt, dass der erste und der zweite Signalprimer
nicht miteinander hybridisieren. Der zweite Signalprimer hybridisiert
mit dem zweiten Strang der Zielsequenz stromabwärts vom zweiten Amplifikationsprimer
und wird durch Verlängerung
des zweiten Amplifikationsprimers verlängert und verdrängt. Das
zweite Signalprimer-Verlängerungsprodukt
wird durch Hybridisierung und Verlängerung des ersten Amplifikationsprimers
doppelsträngig
gemacht. Die Erzeugung der doppelsträngigen markierten Struktur
oder Sequenz und die Trennung des Farbstoffpaars verlaufen wie beim
ersten Strang der Zielsequenz. Der zweite Signalprimer umfasst vorzugsweise
dieselbe 5'-Adaptorsequenz
wie der erste Signalprimer, um das Nachweisen der Amplifikationsprodukte
beider Zielstränge
mit einer einzigen Reportersonde zu ermöglichen.
-
Außerdem können, falls
gewünscht,
mehrere Signalprimer pro Zielstrang eingesetzt werden, wobei jeder
mit der Zielsequenz stromabwärts
vom anderen am selben Strang hybridisiert, wodurch alle Signalprimer stromabwärts vom
Amplifikationsprimer hybridisiert werden. Auf diese Art und Weise
wird jeder Signalprimer durch Verlängerung der stromaufwärts gelegenen
Detektornucleinsäure
verdrängt,
und der Signalprimer, der am meisten 5' ist, wird vom Amplifikationsprimer
verdrängt.
Die Verwendung mehrerer Signalprimer hat den Vorteil, dass das pro
Ziel erzeugte Signal erhöht
oder verstärkt
wird, wobei es zu einem Anstieg der Empfindlichkeit der Analyse
kommt. Wiederum ist es vorzuziehen, aber nicht notwendig, dass alle
Signalprimer dieselbe 5'-Adaptorsequenz
umfassen, um einen Nachweis aller Reaktionsprodukte unter Verwendung
einer einzigen Reportersonde zu ermöglichen.
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Mehrere
Signalprimer können
auch verwendet werden, um eine Mehrzahl von verschiedenen Zielsequenzen
gleichzeitig nachzuweisen. In diesem Fall sind die 5'-Adaptorsequenzen der Signalprimer vorzugsweise
für jedes
nachzuweisende Ziel verschieden. Durch das Markieren von Reportersonden,
die für
die 5'-Adaptorsequenz
jedes zielspezifischen Signalprimers spezifisch sind, mit Donor/Quencher-Farbstoffpaaren,
die unterscheidbar sind, kann durch das Nachweisen von Veränderungen
im Ausmaß der
Fluoreszenzlöschung bei
der auf jedes Ziel gerichteten Reportersonde das Vorhandensein jedes
Ziels ermittelt werden. Diese Ausführungsform der Erfindung ist
besonders nützlich
für das
Nachweisen einzelner Nucleotidsequenzvariationen wie z.B. solcher,
die mit bestimmten Erkrankungszuständen und -bedingungen zusammenhängen. Die
Zielbindesequenz jedes Signalprimers kann dahingehend ausgewählt werden,
um für
eine spezifische Sequenzvariante des Ziels spezifisch zu sein. Nur
jene Signalprimer, welche die korrekte Zielbindesequenz für die Hybridisierung
mit dem Ziel umfassen, hybridisieren, werden verlängert und
führen
dazu, dass ein Complement der Adaptorsequenz produziert wird. Die
für dieses
Adaptorsequenz-Complement spezifische Reportersonde erzeugt daraufhin
ein Signal, das anzeigt, welche Sequenzvariante(n) aufgrund ihrer
charakteristischen Markierung vorhanden ist bzw. sind.
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Alternativ
kann bei einer separaten Analyse mehrerer verschiedener Ziele dieselbe
5'-Adaptorsequenz bei
Signalprimern, die auf die mehreren verschiedenen Zielsequenzen
gerichtet sind, verwendet werden. Eine Spezifität für die verschiedenen Zielsequenzen
wird durch Abwandlung der 3'-Zielbindesequenz
des Signalprimers verliehen. Dieser Ansatz vereinfacht nicht nur
das Design und die Synthese von Signalprimern, sondern ermöglicht auch
die Verwendung derselben Reportersonde für das Nachweisen jeder gewünschten
Zielsequenz. In kommerzieller Hinsicht hat dies den Vorteil, dass
die Produktion nur einer einzigen Reportersonde erforderlich ist,
um Analysesysteme für
eine Vielzahl von Zielen herzustellen, wodurch Produktionskosten
gesenkt werden und die Entwicklung von Analysen für neue Ziele
vereinfacht wird. Weiters wird die Synthese der verschiedenen Signalprimer
einfacher und kostengünstiger,
da sie keine Markierung benötigen.
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Es
ist offensichtlich, dass die erfindungsgemäßen Signalprimer zusätzlich zur
SDA für
die Verwendung bei anderen Primerverlängerungsamplifikationsverfahren
(z.B. PCR, 3SR, TMA oder NASBA) angepasst werden können. Beispielsweise
können
die Verfahren für
die Verwendung in einer PCR angepasst werden, indem in der PCR PCR-Amplifikationsprimer
als Ersatz eingesetzt werden und eine Strangverdrängungs-DNA-Polymerase verwendet
wird, die keine 5'→3'-Exonucleaseaktivität aufweist
(z.B. Sequencing Grade Taq von Promega oder exo–Vent
oder exo–Deep
Vent von New England BioLabs). Die Signalprimer hybridisieren mit
dem Ziel stromabwärts
von den PCR-Amplifikationsprimern. Sie werden verlängert, aus
dem Ziel verdrängt
und doppelsträngig
gemacht, und zwar im Wesentlichen wie hinsichtlich der SDA beschrieben.
Das einzelsträngige Oligonucleotid,
welches das Complement der Signalprimer-5'-Adaptorsequenz umfasst, wird durch
Denaturierung des doppelsträngigen
sekundären
Amplifikationsprodukts erzeugt, gefolgt von einer Hybridisierung
der Reportersonde und einer Polymerase-Verlängerung zwecks Synthetisierung
des komplementären
Strangs der markierten Reporterkomponente in der Reportersonde.
Wie bei SDA-Systemen sorgt eine Synthese des komplementären Strangs
entweder direkt oder indirekt für
eine Veränderung
der Nähe
zwischen Donor- und Quencherfarbstoff und verändert den Grad der Fluoreszenzlöschung.
Eine damit zusammenhängende
Veränderung eines
Fluoreszenzparameters, wie z.B. der Intensität, dient als Hinweis auf eine
Zielamplifikation.
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Zur
Anpassung der erfindungsgemäßen Verfahren
an 3SR, TMA oder NASBA wird eine 5'→3'-Exonuclease-defiziente
Reverse Transcriptase mit strangverdrängender Aktivität eingesetzt,
wobei es zu einer Hybridisierung des Signalprimers mit dem RNA-Ziel
stromabwärts
von einem Amplifikationsprimer kommt. In einem Reaktionsschema,
das dem zuvor beschriebenen ähnelt,
wird der hybridisierte Signalprimer 1) verlängert und 2) durch Verlängerung
des stromaufwärts
gelegenen Amplifikationsprimers verdrängt. Das verdrängte Signalprimer-Verlängerungsprodukt
wird danach durch Hybridisierung und Verlängerung des zweiten Amplifikationsprimers,
der einen RNA-Polymerase-Promotor enthält, vollständig doppelsträngig gemacht.
Die Promotorsequenz, welche sich am 5'-Schwanz
des zweiten Amplifikationsprimers befindet, wird durch Verlängerung des
3'-Endes des Signalprimer-Verlängerungsprodukts
doppelsträngig
gemacht. Aus dem doppelsträngigen Promotor
erzeugt RNA-Polymerase RNA-Kopien, die zum Signalprimer-Verlängerungsprodukt
komplementär sind.
Das 3'-Ende jeder
RNA-Kopie enthält
eine zur Adaptorsequenz des Signalprimers komplementäre Sequenz.
Diese Sequenz hybridisiert dann mit einem komplementären Bereich
der Reportersonde. Wenn die Reportersonde verlängerbar ist, verlängert eine
Reverse Transcriptase das 3'-Ende
der Sonde auf der RNA-Matrize,
um ein Reportersonden-Verlängerungsprodukt
zu erzeugen. Danach zerlegt RNase H den RNA-Strang dieser Heteroduplex
und befreit dabei das Reportersonden-Verlängerungsprodukt
für die
Hybridisierung mit dem zweiten Amplifikationsprimer, welcher die
Promotorsequenz enthält.
Eine Umwandlung der Promotorsequenz in die doppelsträngige Form
leitet eine neue Runde der RNA-Synthese ein, wodurch sich Produkte
ergeben, die zum Reportersonden-Verlängerungsprodukt, einschließlich der
vollen Reporterkomponentensequenz, komplementär sind. Eine Hybridisierung
von Reportersonden mit diesen RNA-Zielen bewirkt eine Entfaltung
der Reporterkomponente, wodurch beim Trennen von Donor- und Quencher-Farbstoff
und beim Verringern der Löschung
ein Signal erzeugt wird. Außerdem
werden die Reportersonden, wie obenstehend beschrieben, am RNA-Ziel
verlängert,
und der Zyklus wird wiederholt.
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Wenn
die Reportersonden nicht verlängerbar
(mit Cap versehen) sind, muss die Adaptorsequenz des Signalprimers
dahingehend ausgewählt
werden, um solche Sequenzen zu enthalten, dass das Complement der
Adaptorsequenz mit der Reporterkomponente der Reportersonde hybridisiert.
Die Reaktion schreitet voran wie obenstehend beschrieben, abgesehen
davon, dass die mit Cap versehenen Reportersonden nicht verlängert werden
und die RNA-Complemente des Signalprimer-Verlängerungsprodukts mit der mit
einem Cap versehenen Reportersonde (einschließlich der Reporterkomponente)
hybridisieren. Ein Signal wird erzeugt, wenn sich die Reporterkomponente
entfaltet und die Löschung
der Donor-Fluoreszenz während
der Hybridisierung abgeschwächt
wird.
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In
Hinblick auf einen reduzierten Hintergrund wird bevorzugt, dass
die erfindungsgemäßen Signalprimer
wie obenstehend beschrieben verwendet werden, wobei das Signalprimer-Verlängerungsprodukt
durch Verdrängung
aufgrund einer Verlängerung
des stromaufwärts
gelegenen Amplifikationsprimers von der Zielsequenz getrennt wird.
Es ist jedoch zu erkennen, dass die für die Verwendung in den verschiedenen
Nucleinsäureamplifikationsreaktionen
bekannten Amplifikationsprimer selbst für eine Hybridisierung der Reportersonde
verwendet werden können,
wenn die Primer geeignete Adaptorsequenzen enthalten. Bei dieser
Ausführungsform
befindet sich die Adaptorsequenz eines SDA-Primers zwischen der
mit Einzelstrangbrüchen
versehbaren Restriktionsendonuclease-Stelle, welche die SDA vorantreibt,
und der Zielbindesequenz. Eine SDA mit diesem Primer erzeugt ein
amplifiziertes Produkt, das an seinem 3'-Ende eine zur Reportersonde komplementäre Sequenz
enthält.
Das Binden der Reportersonde an diese komplementäre Sequenz erzeugt ein Signal,
so wie obenstehend beschrieben. Für eine PCR und eine NASBA werden
die Amplifikationsprimer durch Hinzufügen eines nicht komplementären 5'-Schwanzes modifiziert,
wie obenstehend hinsichtlich des Signalprimers beschrieben. Im Falle
einer NASBA ist der Primer, dem der RNA-Polymerase-Promotor fehlt,
der mit der 5'-Adaptorsequenz
modifizierte Primer. Während
einer PCR und einer NASBA werden Complemente der Primerverlängerungsprodukte,
die einen Adaptor enthalten, hergestellt, so wie obenstehend hinsichtlich
der Signalprimer beschrieben. Diese komplementären Sequenzen werden entweder
durch Wärmedenaturierung (PCR)
oder durch enzymatischen Aufschluss der RNA-Matrize (RNase H in
NASBA) einzelsträngig
gemacht, und das einzelsträngige
Complement bindet danach an die Reportersonde, so wie obenstehend
hinsichtlich der Signalprimer beschrieben. Die Verwendung von Amplifikationsprimern
als Signalprimer beseitigt bei der Reaktion den Bedarf am zusätzlichen
Signalprimer, da der Hintergrund bei dieser Ausführungsform jedoch höher sein
kann, könnte
die Empfindlichkeit der Analyse vermindert sein.
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Bei
anderen alternativen Ausführungsformen
können
die erfindungsgemäßen Signalprimer
bei Analyseformaten, die nicht auf einer Amplifikation beruhen,
zum Nachweisen von Zielsequenzen verwendet werden. Bei einer ersten
Ausführungsform
einer Nicht-Zielamplifikation hybridisiert die einzelsträngige 3'-Zielbindesequenz
des Signalprimers solcherart mit dem 3'-Ende der Zielsequenz, dass die 5'-Adaptorsequenz einen 5'-Überhang
bildet. Die Zielsequenz funktioniert als Primer für die Synthese
eines zum Signalprimer komplementären Strangs, wobei zum Verlängern der
Zielsequenz eine Polymerase verwendet wird und der 5'-Überhang als Matrize verwendet
wird. Wenn die Zielbindesequenz des Signalprimers nur mit einem
Teil der Zielsequenz hybridisiert, bildet die Zielsequenz ebenfalls
einen 5'-Überhang
und kann der Signalprimer gleichermaßen verlängert werden, wobei der 5'-Überhang des Ziels als Matrize
verwendet wird. Alternativ kann der Signalprimer nicht verlängerbar
sein, da bei dieser Ausführungsform
der Erfindung eine Synthese einer Kopie der Zielsequenz nicht erforderlich
ist. In beiden Fällen
wird das Complement der Adaptorsequenz des Signalprimers synthetisiert.
Nach einer Trennung der beiden Stränge hybridisiert das Complement
der Signalprimer-Adaptorsequenz im Ziel mit dem 3'-Ende der Reportersonde,
wodurch die markierte Reporterkomponente nach einer Polymerase-Verlängerung
des zurückversetzten
3'-Endes des Adaptorsequenz-Complements
doppelsträngig
gemacht wird. Ein Vorteil dieser Ausführungsform gegenüber der
im U.S.-Patent Nr.
5,866,336 beschriebenen Reaktion besteht darin, dass die Verwendung
des Überhangs
eine Synthese des Complements der Adaptorsequenz in einem einzigen
Verlängerungsschritt
anstatt in zwei ermöglicht.
Das heißt,
das Complement der Adaptorsequenz wird direkt am ursprünglichen
Ziel angefügt,
wodurch eine Zieldetektion ohne Bedarf an einer Amplifikation ermöglicht wird.
Bei einer zweiten bevorzugten, erfindungsgemäßen Ausführungsform einer Nicht-Zielamplifikation
wird der Signalprimer mit einer internen Sequenz des Ziels hybridisiert,
wobei stromaufwärts
ein zusätzlicher
Primer hybridisiert wird, um ihn zu verdrängen (allgemein als „Bumper"-Primer bezeichnet).
Der Signalprimer und der Bumperprimer werden verlängert, so
dass das Signalprimer-Verlängerungsprodukt
aus der Zielsequenz verdrängt
wird. Ein zweites Paar von Primern wird mit dem Verlängerungsprodukt
hybridisiert und solcherart verlängert,
dass das stromabwärts
gelegene Primerverlängerungsprodukt das
Complement der Adaptorsequenz enthält und durch Verlängerung
seines Bumperprimers aus dem Signalprimer-Verlängerungsprodukt
verdrängt
wird. Die Reportersonde hybridisiert mit dem Complement der Adaptorsequenz,
und die Adaptorsequenz wird verlängert
so wie hier beschrieben, um das Complement der Reporterkomponente
zu synthetisieren. Da es sich dabei um eine isotherme Reaktion handelt,
die zum Trennen komplementärer
Stränge
von einer Strangverdrängung
abhängt,
macht eine Verlängerung
des ersten Bumperprimers das Ziel doppelsträngig und untauglich für die Teilnahme
an irgendwelchen weiteren Reaktionsschritten. Obwohl eine Kopie
erzeugt und verdrängt
wird, wird dies nicht als Zielamplifikation betrachtet, da die Kopie eine
Subsequenz des ursprünglichen
Ziels darstellt, welche als Hinweis auf das Vorhandensein des Ziels
nachgewiesen wird, und pro ursprünglicher
Zielsequenz nur eine Kopie der Subsequenz erzeugt wird.
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Die
vorhergehende Offenbarung bezieht sich in erster Linie auf bevorzugte
Ausführungsformen,
bei denen die Reporterkomponente mit einem fluoreszierenden Donor/Quencher-Farbstoffpaar
markiert ist und die Synthese des Complements der Reporterkomponente
durch einen Anstieg der Fluoreszenz nachgewiesen wird. Dieses Markierungssystem
ermöglicht
die Synthese des nachzuweisenden Complements in Echtzeit und/oder
in einer homogenen Analyse (d.h. ohne Abtrennung der Markierung
vor der Detektion). Dem Fachmann sind allerdings auch andere, bei
der Erfindung nützliche
Markierungen offensichtlich. An der Reporterkomponente kann zum
Beispiel eine einzige Fluoreszenzmarkierung verwendet werden, wobei
in Gegenwart des Complements der Reporterkomponente eine Veränderung
der Fluoreszenzpolarisation nachgewiesen wird (siehe U.S.-Patent
Nr. 5,593,867). Nicht fluoreszierende Markierungen sind ebenfalls
nützlich.
Die Reporterkomponente kann beispielsweise mit einem lipophilen
Farbstoff markiert sein und eine Restriktions-Schnittstelle enthalten,
die in Gegenwart des Complements der Reporterkomponente gespalten
wird (siehe U.S.-Patent Nr. 5,550,025). Alternativ kann die Reportersonde
radiomarkiert sein, und die aus einer Synthese des Complements der
Reporterkomponente resultierenden Produkte können durch Elektrophorese aufgelöst und durch
Autoradiographie sichtbar gemacht werden. Immunologische Markierungen
können
ebenfalls verwendet werden. Nach der Synthese des Complements der
Reporterkomponente kann eine mit einem Hapten markierte Reportersonde
nachgewiesen werden, indem zuerst eine nicht umgesetzte Reportersonde
entfernt wird (beispielsweise durch Adaptor-spezifisches Einfangen
an einer Festphase) und danach die Hapten-Markierung unter Verwendung standardmäßiger chemilumineszierender
oder kolorimetrischer ELISAs an der umgesetzten Reportersonde nachgewiesen
wird. Eine Biotinmarkierung kann das Hapten ersetzen und unter Anwendung
im Stand der Technik bekannter Verfahren nachgewiesen werden.
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Die
Markierung, welche das Vorhandensein des Complements der Reporterkomponente
anzeigt, kann an einem ausgewählten
Endpunkt in der Reaktion nachgewiesen werden. Da jedoch Oligonucleotide
mit einem vergrößerten Abstand
zwischen dem Donor und dem Quencher zugleich mit einer Hybridisierung
und Primerverlängerung
hergestellt werden, kann die Markierung auch beim Ablaufen der Reaktion,
d.h. in „Echtzeit", überwacht
werden. Dieses homogene Echtzeit-Analyseformat kann zur Bereitstellung
halbquantitativer oder quantitativer Informationen über die
Ausgangsmenge an vorhandenem Ziel verwendet werden. Die Geschwindigkeit,
mit der sich die Markierung (z.B. die Fluoreszenzintensität) während der
Reaktion ändert
(entweder als Teil einer Zielamplifikation oder in Nicht-Amplifikationsnachweisverfahren)
ist beispielsweise ein Hinweis auf anfängliche Zielpegel. Demzufolge
erreicht die Markierung rascher einen ausgewählten Schwellenwert (d.h. kürzere Zeit
bis zur Positivität),
wenn mehr Ausgangskopien der Zielsequenz vorhanden sind. Außerdem ist die
Geschwindigkeit der Veränderung
der Markierung im Verlauf der Reaktion bei Proben, die höhere Ausgangsmengen
an Ziel enthalten, höher
als bei Proben, die geringere Ausgangsmengen an Ziel enthalten.
Diese oder andere, im Stand der Technik bekannte Messungen kann
bzw. können
als Hinweis auf das Vorhandensein eines Ziels oder als Hinweis auf
eine Zielamplifikation durchgeführt
werden. Die Ausgangsmenge an Ziel wird typischerweise durch einen
Vergleich der Versuchsergebnisse mit den Ergebnissen hinsichtlich
bekannter Zielmengen ermittelt.
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Zahlreiche,
im Stand der Technik bekannte Donor/Quencher-Farbstoffpaare sind
bei bevorzugten Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung von Nutzen. Diese umfassen beispielsweise
Fluorescein-Isothiocyanat (FITC)/Tetramethylrhodaminisothiocyanat
(TRITC), FITC/Texas RedTM (Molecular Probes),
FITC/N-Hydroxysuccinimidyl-1-pyrenbutyrat (PYB), FITC/Eosinisothiocyanat
(EITC), N-Hydroxysuccinimidyl-1-pyrensulfonat (PYS)/FITC, FITC/Rhodamin
X, FITC/Tetramethylrhodamin (TAMRA) und andere. Die Auswahl eines
bestimmten Donor/Quencher-Paars ist nicht entscheidend. Bei Energietransfer-Löschungsmechanismen
ist es nur erforderlich, dass die Emissionswellenlängen des
Donor-Fluorophors mit den Anregungswellenlängen des Quenchers überlappen,
d.h., zwischen den beiden Farbstoffen muss eine ausreichende spektrale Überlappung
bestehen, um eine effiziente Energieübertragung, Ladungsübertragung
oder Fluoreszenzlöschung
zu ermöglichen.
P-(Dimethylaminophenylazo)benzoesäure (DABCYL) ist ein nicht
fluoreszierender Quencher-Farbstoff, welcher die Fluoreszenz aus
einem benachbarten Fluorophor, z.B. Fluorescein oder 5-(2'-Aminoethyl)aminonaphthalin
(EDANS), wirksam löscht.
Bestimmte Donor/Quencher-Paare sind obenstehend und in den nachfolgenden
Beispielen veranschaulicht, andere sind dem Fachmann jedoch offensichtlich
und bei der Erfindung ebenfalls von Nutzen. Jedes Farbstoffpaar,
das bei den erfindungsgemäßen Reportersonden eine
Fluoreszenzlöschung
bewirkt, ist für
die Verwendung bei den erfindungsgemäßen Verfahren geeignet, und
zwar ungeachtet des Mechanismus, durch den die Löschung erfolgt. Terminale und
interne Markierungsverfahren sind ebenfalls im Stand der Technik
bekannt und können
routinemäßig zum
Verbinden des Donor- und des Quencher-Farbstoffs an deren jeweiligen
Stellen in der Reportersonde verwendet werden.
-
BEISPIEL 1
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Strangverdrängungsamplifikationsreaktionen,
die erfindungsgemäße Signalprimer
enthalten, wurden im Wesentlichen so ablaufen gelassen, wie es im
U.S.-Patent Nr. 5,547,861 hinsichtlich der Detektion einer synthetischen
Zielsequenz beschrieben ist. Eine erste Reaktion enthielt 106 Kopien der Zielsequenz, für die Amplifikation
der synthetischen Zielsequenz geeignete SDA-Amplifikationsprimer,
100 nM eines erfindungsgemäßen Signalprimers,
umfassend eine für
das Ziel spezifische Zielbindesequenz und eine zur 3'-Sequenz einer Reportersonde identische
5'-Schwanzsequenz,
sowie 200 nM der Reportersonde. Die Sequenz der Reportersonde enthielt
eine RERS im 5'-Bereich,
welche von Fluorescein und Rhodamin X (Rox) solcherart flankiert
war, dass die Fluoreszenz von Fluorescein gelöscht wurde, wenn die RERS intakt
war. Die Sequenzen des Signalprimers und der Reportersonde (in der
5'- bis 3'-Richtung dargestellt)
werden untenstehend gezeigt. Die Zielbindesequenz ist kursiv dargestellt,
die 5'-Adaptorsequenz
des Signalprimers und die identische 3'-Sequenz der Reportersonde sind unterstrichen,
und die RERS der Reportersonde ist fett geschrieben.
-
Signalprimer
(SEQ ID NO: 1):
-
Reportersonde
(SEQ ID NO: 2):
-
Eine
zweite Reaktion enthielt kein Ziel und denselben Signalprimer wie
in der ersten Reaktion. Eine dritte Reaktion war eine Kontrollreaktion,
die nur 106 Zielkopien und die Reportersonde
(d.h. keinen Signalprimer) enthielt. Die Fluorescein-Fluoreszenz
wurde während
der Amplifikationsreaktionen in Echtzeit ermittelt. Wie in 2 gezeigt,
blieb die Donor-Fluoreszenz bei Fehlen eines Ziels niedrig und konstant,
was auf eine Löschung
der Fluoreszenz während
der gesamten Reaktion aufgrund eines Versagens der RERS der Reportersonde,
in die doppelsträngige
Form umgewandelt und gespalten zu werden, hinwies. Bei Fehlen eines
Signalprimers blieb die Donor-Fluoreszenz ebenfalls während der
gesamten Amplifikationsreaktion gelöscht. Bei Vorhandensein eines
Ziels, eines Signalprimers und einer Reportersonde war die Donor-Fluoreszenz
jedoch anfänglich
gering, stieg aber während
des Zeitverlaufs der Amplifikationsreaktion an, als die RERS der
Reportersonde in die doppelsträngige
Form umgewandelt und gespalten wurde, um das Ausmaß der Fluoreszenzlöschung zu
reduzieren. Diese Ergebnisse zeigen, dass die erfindungsgemäßen Signalprimer
und Reportersonden zum Nachweisen einer Nucleinsäurezielsequenz verwendet werden
können,
und zwar durch Überwachung
der Veränderungen
beim Ausmaß der
Fluoreszenzlöschung.
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In
einem ähnlichen
Versuch wurden 0 und 250 Kopien von klonierter HIV-Ziel-DNA unter
Verwendung einer Vielzahl von Signalprimern in Kombination mit einer
von zwei Reportersonden nachgewiesen, wobei jede dieselbe Sequenz
aufwies, aber mit unterschiedlichen Donor/Quencher-Farbstoffpaaren
markiert war. Die Sequenzen der Signalprimer und Reportersonden
sind untenstehend in der 5'-
bis 3'-Richtung
dargestellt. Die Zielbindesequenz ist kursiv dargestellt, die 5'-Adaptorsequenz des
Signalprimers und die identische 3'-Sequenz der Reportersonde sind unterstrichen,
und die RERS der Reportersonde ist fett geschrieben.
-
-
Reportersonden
(Sequenz ID NO: 15)
-
Die
Signalprimer unterschieden sich in der Länge und in der Tm der
Zielbindesequenz und der Reporterbindesequenz. Die Fluorescein-Fluoreszenz
wurde während
der Amplifikation überwacht.
Zum Vergleich der Reportersonden/Signalprimer-Kombinationen wurden
die Ergebnisse als Fläche
unter der Fluoreszenzkurve oder „MOTA" ausgedrückt. Je mehr Fläche sich
unter der Kurve befand, desto mehr Fluoreszenz wurde von einer bestimmten
Reportersonden/Signalprimer-Kombination erzeugt und desto effizienter
war die Detektion der amplifizierten Produkte. Beide Reportersonden
funktionierten gut in Kombination mit allen Signalprimern für den Nachweis
des HIV-Ziels, obwohl die Leistung im Allgemeinen nicht so gut war
wie bei Reportersonden, die Haarnadel-Reporterkomponenten enthalten.
Lineare Reportersonden wie diese sind jedoch kürzer als Reportersonden, die
sekundäre
Strukturen enthalten, und können
daher leichter in höherer
Ausbeute synthetisiert werden. Unter Verwendung der Fluorescein-Dabcyl-Reportersonde
wurden höhere
MOTA-Werte erzielt, was darauf hinweist, dass dieses Farbstoffpaar
eine höhere
Löschungseffizienz
besitzen könnte.
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BEISPIEL 2
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SDA-Reaktionen
wurden dahingehend vorbereitet, um die in Beispiel 1 gezeigten,
verschiedenen Signalprimer, entweder 0 oder 5.000 Kopien des klonierten
HIV-Ziels und eine Reportersonde zu enthalten. Die Sequenz der Reportersonde
war wie folgt:
-
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SEQ
ID NO: 16 enthält
eine BsoBI-RERS in der einzelsträngigen
Schleife einer Haarnadelstruktur am 5'-Ende. Die SDA-Reaktionen enthielten
500 nM SDA-Amplifikationsprimer,
50 nM Bumperprimer und jeweils 200 nM Signalprimer und Reportersonden.
Die Rhodamin-Fluoreszenz wurde während
der Amplifikation überwacht.
Bei jeder Signalprimer/Reportersonden-Kombination erhöhte sich
die Rhodamin-Fluoreszenz
bei Vorhandensein eines Ziels während
der Amplifikationsreaktion. Bei Fehlen eines Ziels blieb die Rhodamin-Fluoreszenz
während
der gesamten Reaktion gering. Die Ergebnisse einer der Reaktionen
werden in 3A für den Signalprimer SEQ ID NO:
3 gezeigt, wobei die multiplen Kurven wiederholte Proben darstellen.
Die Ergebnisse zeigten, dass die Länge und die Tm der
Adaptorsequenz die Analyseleistung nicht maßgeblich beeinflussten. Die
Tm der Zielbindesequenz des Signalprimers
beeinflusste jedoch die Signalerzeugung, wobei Signalprimer mit
längeren
Zielbindesequenzen bessere Leistungen erbrachten als jene mit kürzeren Zielbindesequenzen.
-
Der
Versuch wurde unter Verwendung dreier verschiedener Reportersonden,
einschließlich
SEQ ID NO: 16, wiederholt. Die zusätzlichen Reportersonden waren
wie folgt:
-
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Bei
diesem Versuch wurde die Konzentration des stromaufwärts gelegenen
Amplifikationsprimers auf 100 nM reduziert. Eine Amplifikation wurde
in Gegenwart von entweder 0 oder 250 Kopien an Ziel-DNA durchgeführt. Reaktionen,
die ein Ziel enthielten, wiesen nach nur 5-minütiger Inkubation einen raschen
Anstieg der Fluorescein-Fluoreszenz auf. Im Gegensatz dazu wiesen
Reaktionen ohne Ziel während
des gesamten Reaktionszeitraums eine geringe Fluorescein-Fluoreszenz
auf. Die Ergebnisse hinsichtlich einer SEQ ID NO: 8 und SEQ ID NO:
17 enthaltenden Reaktion werden in 3B gezeigt,
wobei die multiplen Kurven wiederholte Proben darstellen. Die Reportersonden/Signalprimer-Kombinationen SEQ
ID NO: 16/SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 17/SEQ ID NO: 8 brachten ähnliche
MOTA-Werte (62,147 bzw. 66,051) hervor, wohingegen die SEQ ID NO:
18/SEQ ID NO: 12-Kombination weniger effizient war (MOTA = 49,879),
was auf eine weniger effiziente Hybridisierung und Umwandlung aufgrund
der kürzeren
Sonden- und Primerlänge
hinweist.
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BEISPIEL 3
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Bei
diesem Versuch wurde in einer SDA eine Reportersonde mit einer Haarnadel
und einer BsoBI-RERS, die anstatt spaltbar zu sein, eher mit Einzelstrangbrüchen versehbar
war, getestet. Die Reportersonde hatte folgende Sequenz (SEQ ID
NO: 19, TBD13,1):
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Diese
Reportersonde wurde bei der Amplifikationreaktion mit SEQ ID NO:
4 als Signalprimer verwendet. In Gegenwart von 250 Kopien der HIV-Ziel-DNA
wurde ein mittlerer MOTA-Wert von 48.000 erhalten, verglichen mit
einer Punktezahl von weniger als 150 bei negativen Kontrollen. Die
niedrigere MOTA-Punktezahl, die im Vergleich zur dieselbe 3'-Zielsequenz aufweisenden
Reportersonde SEQ ID NO: 16 beobachtet wurde, kann an einem ineffizienten
Primen der Polymerase von dem kurzen Oligonucleotid weg liegen,
das nach dem Einführen
von Einzelstrangbrüchen
an der BsoBI-Stelle zurückbleibt.
Die Leistung der Reaktion kann durch eine Vergrößerung der Länge der
Haarnadel erhöht
werden, um dieses Oligonucleotid zu stabilisieren und einen größeren Bereich
zum Binden der Polymerase bereitzustellen.
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BEISPIEL 4
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Bei
diesem Versuch wurde eine SDA durchgeführt, wobei eine Reportersonde,
die eine G-Quartettstruktur und eine RERS als Reporterkomponente
enthielt, verwendet wurde. Diese Reportersonde hatte folgende Sequenz
(SEQ ID NO: 20, TBD14):
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Im
Verlauf der Amplifikation von 250 Kopien der HIV-Ziel-DNA wurde
ein Anstieg der Fluorescein-Fluoreszenz beobachtet. Bei Fehlen eines
Ziels wurde kein derartiger Fluoreszenzanstieg beobachtet.
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