DE60202081T2

DE60202081T2 - Verfahren zur verbesserten Diagnose von Dysplasien

Info

Publication number: DE60202081T2
Application number: DE60202081T
Authority: DE
Inventors: Marcus Trunk-Gehmacher; Anja Reichert; Richard Batrla; Rüdiger Ridder
Original assignee: Roche MTM Laboratories AG; Dako Denmark ApS
Current assignee: Roche MTM Laboratories AG
Priority date: 2002-10-28
Filing date: 2002-10-28
Publication date: 2005-12-08
Anticipated expiration: 2022-10-29
Also published as: DK1416278T3; DE60202081D1; EP1416278A1; EP1416278B1; ATE283484T1; ES2231633T3

Description

Die vorliegende Erfindung liefert ein Verfahren zur verbesserten Diagnose von Dysplasien, basierend auf einem gleichzeitigen Nachweis von INK4a Genprodukten und mindestens einem Marker für Zellproliferation. Die vorliegende Erfindung liefert vor allem ein Verfahren zur Unterscheidung dysplastischer Zellen, die INK4a Genprodukte überexprimieren, von Zellen, die INK4a Genprodukte überexprimieren ohne dysplastisch zu sein, durch den Nachweis eines Markers, der zur Charakterisierung der Proliferationseigenschaften der jeweiligen Zelle geeignet ist. Die Charakterisierung der Proliferationseigenschaften kann den Nachweis eines Markers oder eines Sets von Markern, die für aktive Zellproliferation charakteristisch sind und/oder den Nachweis eines Sets von Markern, die charakteristisch für eine verzögerte oder ausbleibende Zellproliferation sind, umfassen. Das hier dargelegte Verfahren ermöglicht so eine spezifische Diagnose von Dysplasien in histologischen und zytologischen Proben.
Der Nachweis der Überexpression von p16^INK4a in biologischen Proben hat sich als brauchbarer Marker zum Nachweis von anogenitalen Läsionen, wie zum Beispiel Karzinomen des Gebärmutterhalses (siehe WO 0001845; KLAES, Rüdiger, et al. Overexpression of p16(INK4A) as a specific marker for dysplastic and neoplastic epithelial cells of the cervix uteri.. Int. J. Cancer. 2001, Band 92, S. 276–284. ) herausgestellt. Das Verfahren basierend auf p16^INK4a-spezifischer immunochemischer Färbung ermöglicht eine sensible und spezifische Identifikation von dysplastischen Zellen in Gewebesektionen und in zytologischen Proben.
Bei immunohistochemischen Untersuchungen von Gewebe, können dysplastische und neoplastische Zellen mit einem p16^INK4a-spezifischen antikörper-vermittelten Färbeverfahren gefärbt werden. Die histologische Diagnose neoplastischer Läsionen kann so durch ein Färbeverfahren unterstützt werden, basierend auf einem molekularen Marker, der charakteristisch für die Transformation von Zellen in anogenitalen Läsionen ist. Die Diagnose, ob Zellen neoplastisch sind oder nicht, basiert in diesen Verfahren nicht nur auf die p16^INK4a-spezifische Färbung sondern stützt sich auch auf die histologische Information.
Dies beruht auf der Tatsache, dass in ungefähr 20–30% der Proben metaplastische Zellen eine Immunoreaktivität mit p16^INK4a spezifischen Antikörpern aufweisen und so im Verlauf der Verfahren gefärbt werden. Dennoch unterscheidet sich das Färbemuster dieser metaplastischen Zellen von dem der neoplastischen Läsionen. Metaplastische Zellen verursachen ein ungleichmäßiges oder fokales Färbemuster, wohingegen neoplastische Läsionen diffuse Färbemuster verursachen. Des Weiteren ist die Färbeintensität metaplastischer Zellen überwiegend geringer als die der neoplastischen Zellen.
Bei den üblichen Verfahren, die bei Screeningtests für die Früherkennung von Dysplasien und/oder Neoplasien eingesetzt werden, werden keine histologisch basierenden Tests verwendet, sondern werden eher auf zytologische Testverfahren gestützt. Jedoch besonders in Fällen, wo keine histologische Information bezüglich der Gewebearchitektur verfügbar ist, wie z. B. in zytologischen Untersuchungen, kann die alleinige Untersuchung auf p16^INK4a Überexpression zu falsch positiven Ergebnissen führen. Dies beruht auf der Tatsache, dass diese Fraktionen von metaplastischen Zellen, die p16^INK4a in nachweisbar erhöhten Levels exprimieren, nicht mittels eines histologischen Kriteriums unterschieden werden können.
Der Prozentanteil von Zellen, die eine Überexpression von p16^INK4a aufweisen, steigt im Verlauf der Entstehung von Dysplasien. In neoplastischen oder präneoplastischen Stadien, wenn nur eine begrenzter Population von neoplastischen oder präneoplastischen Zellen in der Probe präsent ist, kann die Immunoreaktivität von p16^INK4a schwach sein. Diese schwache Immunoreaktivität kann ungefähr den gleichen Level aufweisen, wie der Level, der durch metaplastische Zellen verursacht wird. In späteren Stadien der Dysplasien ist die gesamte Immunoreaktivität von p16^INK4a stärker und deswegen sind neoplastische Läsionen leicht von Metaplasien zu unterscheiden, sogar in einem zytologischen Testformat. Dies könnte zu Fällen führen, wo die Anwesenheit von metaplastischen Zellen, die p16^INK4a exprimieren mit der Anwesenheit von neoplastischen Zellen verwechselt werden könnte und so ein falsch positives Ergebnis produziert wird.
Besonders bei Screeningtests, bei denen der Nachweis früher Stadien von Neoplasien wünschenswert ist, ist dieser Zustand sehr unbefriedigend. Dies ist vor allem deswegen der Fall, da sich die p16^INK4a basierende Diagnose als wertvolles Hilfsmittel in histologischen Untersuchungen herausgestellt hat und die Anwendung in zytologisch basierten Screeningverfahren könnte diese etablierten Verfahren verbessern.
Um falsch positive Ergebnisse in zytologischen Testformaten zu verringern und somit die Zuverlässigkeit von p16^INK4a-vermittelten Diagnosen von anogenitalen Läsionen weiter zu verbessern, wäre ein Verfahren zur Unterscheidung der Metaplasien von neoplastischen und dysplastischen Läsionen wünschenswert. Ein Verfahren zur Unterscheidung von Metaplasien von neoplastischen und präneoplastischen Läsionen wird im Rahmen der Ausführungsformen aufgezeigt, die gemäß der vorliegenden Erfindung beansprucht werden.
Zur Unterstützung der Unterscheidung der Metaplasien von neoplastischen Läsionen in Testverfahren, basierend auf der Überexpression von p16^INK4a, wäre ein Markermolekül wünschenswert, welches in neoplastischen und/oder präneoplastischen Zellen und Geweben exprimiert wird, und welches nicht gleichzeitig mit p16^INK4a-Genprodukten in einer einzigen metaplastischen Zelle exprimiert wird.
Eine Lösung des im Stand der Technik vorliegenden Problems liefern die Verfahren, die gemäß dieser Erfindung beansprucht werden. Im Verlauf der Versuche, die zu der vorliegenden Erfindung führten, haben die Erfinder herausgefunden, dass eine Kombination des Nachweises der Anwesenheit oder Abwesenheit und/oder des Levels von p16^INK4a in Kombination mit mindestens einem Marker für Zellproliferation wie z. B. Ki67, Ki-S2, mcm5 oder MCM2 das in der Technik vorliegende Problem lösen könnte.
Der Stand der Technik stellt einige Dokumente zur Verfügung, welche die Verwendung einer Kombination molekularer Marker zur verbesserten Diagnose von Dysplasien betreffen. In WO 0208764 wird ein Verfahren zur verbesserten Diagnose zervikaler Malignitäten unter Verwendung einer Kombination eines HPV Markers und eines Markers für Proliferation oder virale Aktivität offenbart. p16^INK4a wird im Zusammenhang mit dieser Erfindung als ein Marker für virale Aktivität, der mit HPV Markern kombiniert werden soll erwähnt.
In EP 1217377 wird ein Verfahren zum automatisierten Nachweis zervikaler bösartiger Tumore offenbart, vermittelt durch den Nachweis von mehr als einem Markermolekül. Manche definierten Markerkombinationen werden innerhalb des Dokuments genannt. Es gibt keine Offenbarung in diesem Dokument bezüglich der Auswahl geeigneter Marker für eine Kombination. Der Zweck der Kombination in dieser Anmeldung ist die verbesserte Zuverlässigkeit der automatisierten Analyse von Färbemustern in biologisch-zytologischen Proben. Dieses Dokument erwähnt eine Kombination von p16^INK4a mit anderen Tumormarkern.
WO 02059616 offenbart ein Verfahren zum Nachweis von Zellzyklusstörungen zur verbesserten Diagnose zervikaler bösartiger Erkrankungen. Das Dokument offenbart, dass dysplastische Zellen Störungen der Zellzykluskontrolle aufweisen und daher durch Nachweis von Zyklin E Proteinen zusammen mit Post G1 Substanzen in Zellen identifiziert werden können.
Jeffrey Keating offenbart in "Ki67, Cyclin E, and p16^INK4a Are Complimentary Surrogate Biomarkers for human papilloma Virus-Related Cervical Neoplasia" ( KEATING, Jeffrey, et al. Ki67, Cyclin E, and p16INK4a are complimentary Surrogate Biomarkers for human papilloma Virus-Related Cervical neoplasia. American Journal of Surgical Pathology. 2001, Band 25, Nr. 7, S. 884–891. ) die Komplementarität des Einsatzes von p16^INK4a, Ki67 und Cyclin E bei der Diagnose von zervikalen Dysplasien. Das Dokument bezieht sich auf die Probleme jedes einzelnen Markers beim Nachweis von Dysplasien und kommt zu dem Schluss dass p16^INK4a in Kombination mit Zyklin E besonders bei der Untersuchung zytologischer Proben geeignet sein kann, die Probleme der einzelnen Markermoleküle zu überwinden. Es enthält jedoch keine Offenbarung, die den Einsatz von p16^INK4a in Kombination mit einem für proliferierende Zellen charakteristischen Marker, wie zum Beispiel Ki67, lehrt. Das Dokument lehrt nicht die Kombination von p16^INK4a zum Einsatz bei diagnostischen Verfahren; die Offenbarung bezieht sich vielmehr auf einen begrenzten Einsatz von Ki67 in zervikalen Differenzialdiagnosen und leitet somit weg vom Einsatz dieses Markers bei der Diagnose von zervikalen bösartigen Erkrankungen.
Der Stand der Technik weist keine Offenbarung auf, die den Einsatz einer Kombination von p16^INK4a mit einem für die Zellproliferation charakteristischen Marker zum Einsatz in einem diagnostischen Verfahren zur verbesserten Unterscheidung von p16^INK4a positiven nichtdysplastischen Zellen von p16^INK4a positiven Dysplasien lehrt.
WO 02059616 gibt keinen Hinweis auf den Einsatz von p16^INK4a zum Nachweis von dysplastischer Zellproliferation. Im Dokument EP 1217377 wird lediglich die Automation eines Analyseprozesses gelehrt, jedoch nicht der Einsatz einer Kombination von Tumormarkern im Verlauf des Nachweises. Es gibt keine Offenbarung, die sich auf den Vorteil von Kombinationen für spezifische Unterscheidungszwecke wie die Unterscheidung dysplastischer Zellen von beispielsweise metaplastischen Zellen in zervikalen Proben bezieht.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung strebten danach, das nach dem Stand der Technik vorliegende Problem zu überwinden, dass p16^INK4a, welches in verschiedenen Dysplasien überexprimiert wird, auch in manchen anderen nichtdysplastischen Zellen nachgewiesen werden kann. Die Unterscheidung zwischen nichtdysplastischen p16^INK4a positiven Zellen und dysplastischen Zellen, die p16^INK4a überexprimieren, kann auf die Proliferationeigenschaften der jeweiligen Zellen gestützt werden. In normal kontrollierten Zellen inhibitiert p16^INK4a CDK4 und inhibitiert somit die Proliferation. Im Gegensatz dazu wird diese Regulierung in dysplastischen Zellen beeinträchtigt. Somit führt p16^INK4a trotz seines ungewöhnlich hohen Expressionslevel nicht zu einer Inhibition der Zellproliferation.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben herausgefunden, dass dysplastische Zellen von Zellen, welche eine kontrollierte Zellproliferation aufweisen, durch den gleichzeitigen Nachweis von p16^INK4a und einem für die Zellproliferation charakteristischen Marker unterschieden werden können. Aufgrund der Tatsache, dass in normalen Zellen erhöhte Level von p16^INK4a die Zellproliferation inhibitieren, können Zellen, die p16^INK4a überexprimieren als dysplastisch bezeichnet werden, vorausgesetzt sie weisen die Eigenschaften für aktive Zellproliferation auf.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Unterscheidung von neoplastischen, präneoplastischen und/oder dysplastischen Läsionen von nichtdysplastischen Zellen, die einen erhöhten Level von p16^INK4a aufweisen, in biologischen Proben in einem histologischen oder zytologischen Testverfahren, basierend auf dem Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit von Zellen, die das p16^INK4a Gen und Zellproliferationsmarker in besagen biologischen Proben gleichzeitig exprimieren. Geeignete Marker für die Zellproliferation können zum Beispiel Ki67, Ki-S2, Ki-S5, MCM5 oder MCM2 sein. In einer Ausführungsform der Erfindung können Protein oder mRNA der Marker für Zellproliferation als ein Marker zur Unterscheidung von Metaplasien von frühen dysplastischen oder präneoplastischen Läsionen in Proben dienen.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung soll ein Verfahren liefern, zur Unterscheidung dysplastischer Zellen, die INK4a Genprodukte überexprimieren, von anderen Zellen, die INK4a Genprodukte in einem nachweisbaren Level exprimieren, in biologischen Proben, umfassend die Bestimmung der Co-Expression von mindestens zwei Markermolekülen in mindestens einer einzelnen Zelle in einem zytologischen oder histologischen Testverfahren, wobei mindestens ein Markermolekül ein Expressionsprodukt ist, das durch INK4a Gene kodiert wird, und mindestens ein weiteres Markermolekül ein Zellproliferationsmarker ist, wobei die Überexpression von mindestens einem INK4a Genprodukt und die Expression von mindestens einem Marker für aktive Zellproliferation in einem nachweisbaren Level innerhalb besagter einzelner Zelle hinweisend für den dysplastischen Zustand der Zelle ist, und wobei die Überexpression von mindestens einem INK4a Genprodukt und die Expression von mindestens einem Marker für Seneszenz, terminale Zelldifferenzierung, Apoptose oder Zellzyklusarrest in einem nachweisbaren Level innerhalb besagter einzelner Zelle hinweisend für den nicht-dysplastischen Zustand der Zelle ist.
Ein zweiter Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein Testkit zur Bestimmung von Dysplasien in Proben gemäß dem hier offenbarten Verfahren, umfassend die Komponenten aus den Kitansprüchen.
Während der Versuche, die zu der vorliegenden Erfindung führten wurde herausgefunden, dass unter bestimmten Umständen nichtdysplastische Zellen eine Immunoreaktivität für p16^INK4a aufweisen können. Die Erfinder haben herausgefunden, dass diese Zellen, die eine geordnete Zellproliferationskontrolle als Reaktion auf den erhöhten Level von p16^INK4a Genprodukten aufweisen, einem Wachstumsarrest unterliegen. Somit zeigen diese einzelnen Zellen keine Immunoreaktivität für Marker für Zellproliferation. Im Gegensatz hierzu weisen transformierte Zellen, die p16^INK4a überexprimieren eine dysregulierende Zellproliferationskontrolle auf und reagieren auf den erhöhten Level von p16^INK4a nicht durch das Aussetzen der Zellproliferation. Die Erfinder haben daher herausgefunden, dass der gleichzeitige Nachweis von p16^INK4a und Markern für die Zellproliferation zur Unterscheidung dysplastischer Zellen von arretierten Zellen, die p16^INK4a überexprimieren, wie z. B. metaplastischen Zellen, dienen kann.
Die Entdeckung, dass die Überexpression von p16^INK4a in verschiedenen Dysplasien auch in manchen anderen, nichtdysplastischen Zellen nachgewiesen werden kann, hat die Erfinder des vorgestellten Verfahrens dazu geführt eine Technik zur Unterscheidung zwischen nichtdysplastischen p16^INK4a positiven Zellen und dysplastischen Zellen, die p16^INK4a überexprimieren zu entwickeln, basierend auf den Proliferationseigenschaften der jeweiligen Zellen. Während in normal kontrollierten Zellen p16^INK4a CDK4 inhibiert und somit auch die Zellproliferation, ist dies in dysplastischen Zellen nicht der Fall. So führt p16^INK4a in dysplastischen Zellen trotz seines ungewöhnlich hohen Expressionslevel nicht zu einer Inhibition der Zellproliferation.
Das hier offenbarte Verfahren basiert auf der Tatsache, dass durch den gleichzeitigen Nachweis eines p16^INK4a Genproduktes wie z. B. p16^INK4a mit einem Marker, der für Zellproliferation charakteristisch ist, dysplastische Zellen von Zellen unterschieden werden können, die normal kontrollierte Zellproliferation aufweisen.
Der Begriff Marker sowie Markermoleküle im Allgemeinen soll sich hier auf Proliferationsmarker-Genexpressionsprodukte sowie auf p16^INK4a Genexpressionsprodukte beziehen.
Die Bezeichnungen innerhalb dieses Textes für Gene können sich teilweise auf Gene oder Proteine beziehen wie diese in einem beliebigen Organismus entdeckt wurden. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung soll sich die Bezeichnung auf das jeweilige Homologe der genanten Marker in dem Organismus beziehen, welcher innerhalb eines hier offenbarten Verfahrens untersucht wird. In bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist dieser Organismus ein Säugetier und in einer Ausführungsform ein menschliches Wesen. In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sollen die bezeichneten Marker die menschlichen Homologe der jeweiligen bezeichneten Marker sein.
Im Allgemeinen wird während des gesamten Textes die Bezeichnung "(Zell)Proliferationsmarker" oder "Marker für Zellproliferation" in ihren verschiedenen grammatikalischen Formen verwendet, um Proteine sowie Nukleinsäuremarker zu bezeichnen. Falls der Proteinname eines Markers wie z. B. „Replikationsprotein" hier gebraucht wird, soll dies metonymisch zu verstehen sein und sich auch auf das Protein und die Nukleinsäuremarkermoleküle, die das jeweilige Protein kodieren beziehen.
Ein geeigneter Marker gemäß der vorliegenden Erfindung kann jedes Molekül sein, das von einem Gen transkribiert wird oder jedes Molekül, das von einem solchen Traskript translatiert wird. So können Genprodukte im Sinne der vorliegenden Erfindung, Polynukleotide wie z. B. DNA oder RNA und Polypeptide wie z. B. Proteine, Proteoglykane, Peptide etc. umfassen. Expressionsprodukte im Sinne der vorliegenden Erfindung sollen jedes beliebige Transkript eines Genlocus sowohl forward als auch reverse umfassen, einschließlich beliebiger reading frames und Splicevarianten. Expressionsprodukte in Sinne der vorliegenden Erfindung sollen demnach alle alternativen Produkte umfassen, die durch die Nukleinsäuren eines bestimmten Genlocus kodiert werden.
INK4a kodierte Genprodukte im Sinne der vorliegenden Erfindung soll jede beliebige mRNA sein, die vom INK4a Genlokus transkribiert wird oder ein beliebiges Polypeptid, das von einer solchen mRNA translatiert wird. In einer Ausführungsform der Erfindung können die Expressionsprodukte, die durch das INK4a Gen kodiert werden, ein molekulares Gewicht von ungefähr 5 bis 40 kDa oder jedes beliebige Gewicht dazwischen und vorzugsweise ungefähr 10 bis 20 kDA oder jedes beliebige Gewicht dazwischen und bestenfalls ungefähr 14 bis ungefähr 19 kDA oder jedes beliebige Gewicht dazwischen aufweisen.
INK4a Genprodukte, die geeignet sind für die Methode gemäß der vorliegenden Erfindung, können beispielsweise Genprodukte wie z. B. p16^INK4a oder p14ARF umfassen.
Die Bezeichnung "(Zell)Proliferationsmarker" oder "Marker für Zellproliferation" im Sinne der vorliegenden Erfindung soll jedes Markermolekül umfassen, das in der Technik als charakteristisch für den Zellproliferationsstatus bekannt ist. Der Proliferationsstatus kann z. B ein Status aktiv proliferierender Zellen, verzögerter Zellproliferation, arretierter Zellproliferation, seneszenter Zellen, terminal differenzierter Zellen oder ein Status von Apoptose etc. sein. In einer Ausführungsform der Erfindung ist der Zellproliferationsmarker ein Markermolekül, das für aktive Zellproliferation charakteristisch ist. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung kann das Proliferationsmarkermolekül ein Molekül sein, das für arretierte, terminal differenzierte, seneszente oder apoptotische Zellen charakteristisch ist.
In bestimmten Ausführungsformen können Proliferationsmarker im Sinne der vorliegenden Erfindung Gene umfassen, die an der DNA Replikation beteiligt sind, wie z. B. Proteine des Prä-Initiationskomplex oder der Replikationsgabel. Solche Moleküle können z. B. Helikasen, wie eukaryontische Helikasen oder MCM Proteine (MCM2, MCM3, MCM4, MCM5, MCM6, MCM7), Proteine TP wie in WO 0050451 und WO 0217947 offenbart (auch bezeichnet als HELAD1, Pomfil2, Unc-53), Kinasen oder Phosphatasen, die am Replikationsprozess beteiligt sind wie z. B. CDC6, CDC7 Protein Kinase, Dbf4, CDC14 Protein Phosphatase, CDC45 und MCM10 umfassen. Des Weiteren können Proliferationsmarker Proteine umfassen, die an der prozessiven Replikationsgabel beteiligt sind, wie z. B. PCNA oder DNA Polymerase Delta, das Replikationsprotein A (rpA), der Replikationsfaktor C (rfC) sowie FEN1.
In anderen Ausführungsformen können die Proliferationsmarker Moleküle umfassen, die für die Erhaltung der Zellproliferation notwendig sind, wie z. B. Ki67, Ki-S5 oder Ki-S2. In dieser Ausführungsform können Proteine zum Beispiel über den Zeitraum des gesamten Zellzyklus präsent sein. Sie eignen sich dazu, ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung durchzuführen, vorausgesetzt dass sie charakteristisch für aktive Zellproliferation sind und nicht signifikant in arretierten, terminal differenzierten, apoptotischen oder seneszenten Stadien der Zellen exprimiert werden. Ki67, Ki-S2 und Ki-S5 im Sinne der vorliegenden Erfindung sollen die Proteinmarkermoleküle bezeichnen, die durch die jeweiligen Antikörper nachgewiesen werden, sowie die Nukleinsäuren, welche diese Antigene kodieren.
In einer weiteren Ausführungsform können die Zellproliferationsmarker gemäß der vorliegenden Erfindung Markermoleküle sein, die charakteristisch für verzögerte oder ausbleibende Zellproliferation sind, wie z. B. Seneszenzmarker, Zellzyklusarrestmarker, Marker, die charakteristisch für terminal differenzierte Zellen sind oder Apoptosemarker. Solche Moleküle umfassen z. B. p21, p27, Caspasen, BAD, CD95, Fas-Ligand, Parp-Proteine etc.
Unterscheidung im Sinne der vorliegenden Erfindung soll eine Beurteilung umfassen, wie eine Probe klassifiziert werden soll. In einer Ausführungsform der Erfindung betrifft die Unterscheidung eine Beurteilung, ob ein Gewebe oder Komponenten davon dysplastisch oder nicht dysplastisch ist. So ist hier die Unterscheidung eine Beurteilung über die Wachstumseigenschaften von Zellen in einer biologischen Probe.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die Unterscheidung den Nachweis der Expression eines INK4a Genproduktes und den gleichzeitigen Nachweis der Expression eines Markers der charakteristisch für aktive Zellproliferation ist. In diesem Fall sind Zellen, die beide Markermoleküle coexprimieren als dysplastisch zu klassifizieren.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die Unterscheidung den Nachweis eines INK4a Genproduktes und den gleichzeitigen Nachweis der Expression eines Markers, der charakteristisch für arretierte, ausbleibende oder verzögerte Zellproliferation ist. In diesem Fall sind Zellen, die beide Markermoleküle coexprimieren als nicht dysplastisch zu klassifizieren.
In bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird es von Nutzen sein, die Anwesenheit oder Abwesenheit und/oder den Level von mehr als zwei Markermolekülen nachzuweisen. In einer Ausführungsform wird ein INK4a Genexpressionsprodukt zusammen mit zwei oder mehreren Markern für Zellproliferation nachgewiesen. Dies kann von Nutzen sein, um die Identifikation von Proliferationseigenschaften der Zellen, die das INK4a Genprodukt exprimieren zu verbessern. Manche Proliferationsmarker sind auf spezifische Phasen des Zellzyklus begrenzt oder sind nur in geringer Menge in Zellen präsent. Aufgrund dieser Tatsache kann in manchen Fällen der Nachweis von proliferierenden Zellen, die INK4a Genprodukte exprimieren, durch den Nachweis von zwei oder mehrerer Proliferationsmarker verbessert werden.
In solchen Fällen können zum Beispiel ein Proliferationsmaker, der während des gesamten proliferativen Zellzyklus exprimiert wird und Marker, die charakteristisch für spezifische Zellzyklusphasen sind gleichzeitig nachgewiesen werden. Zum Beispiel können Ki67, Ki-S5 oder Ki-S2 zusammen mit MCM5, MCM2, PCNA, rpA, rfC etc. nachgewiesen werden. In anderen Fällen können z. B. Proteine, die an der DNA Replikation beteiligt sind zusammen mit Ki67, Ki-S5 oder Ki-S2 nachgewiesen werden. In einem weitern Fall kann Ki67 zusammen mit Ki-S2 nachgewiesen werden. Es muss dazu gesagt werden, dass diese Beispiele keine ausschließlichen Kombinationsmöglichkeiten sein sollen und auch verschiedene andere Kombinationen von Proliferationsmarkern ebenso geeignet für das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung sind.
Gegebenenfalls können auch Kombinationen von zwei oder mehreren Zellproliferationsmarkern für ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. In einer anderen Ausführungsform können zwei oder mehrere Markermoleküle, die in großen Teilen des Zellzyklus oder sogar im ganzen Zellzyklus nachweisbar sind oder auch aktiv proliferierende Zellen gemäß dem hier offenbarten Verfahren nachgewiesen werden. Eine Kombination aus mehr als einem Zellproliferationsmarkermolekül kann generell geeignet sein, um die Sensitivität des Nachweises von Proliferatioseigenschaften der Zellen zu verbessern.
In bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kann eine Kombination darüber hinaus andere Markermoleküle als Marker umfassen, wie zum Beispiel Seneszenzmarkermoleküle, Marker für arretierte Zellen, Marker für terminal differenzierte Zellen, Marker für apoptotische Zellen, Marker für virale Infektionen oder für virale Aktivität in Zellen oder zellzyklusregulierende Proteine. In bestimmten Ausführungsformen kann in Verbindung mit HPV-assoziierten Dysplasien, ein Nachweis von HPV-assoziierten Markermolekülen oder Marker für virale Aktivität dienlich für die Erkennung einer Dysplasie sein. Die Verfahren, die geeignet für den Nachweis einer HPV Infektion in Proben sind, sind dem Fachmann bekannt. Diese Verfahren können Methoden unter Einsatz von Sonden, die spezifisch für HPV Agenzien sind, umfassen, oder Nukleinsäureamplifikationsreaktionen einsetzen. Der Nachweis einer viralen Infektion kann gleichzeitig oder nacheinander mit dem Nachweis von INK4a und Proliferationsmarkermolekülen durchgeführt werden.
Dysplastisch im Sinne der vorliegenden Erfindung soll sich auf leichte bis starke Dysplasien und deren Vorläuferstadien beziehen, sowie auf Karzinome, wie Karzinome In-Situ oder invasive Karzinome und disseminierte Tumorzellen. So soll dysplastisch hier auch frühe sowie Vorläuferstadien von Dysplasien und Karzinomen umfassen.
Zellen, die INK4a Genprodukte überexprimieren ohne dysplastisch zu sein (hier nichtdysplastisch), können hier z. B metaplastische Zellen, seneszente Zellen, terminal differenzierte Zellen oder Zellen, die in bestimmten Stadien des Zellzyklus erhöhte Level des INK4a Genprodukts aufweisen, umfassen. In bestimmten Zellen können erhöhte Level von INK4a Genprodukten sogar als Reaktion auf externe Signale wie Hormone, Transmitter etc. hervorgerufen werden. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfassen die nichtdysplastischen Zellen, die INK4a Genprodukte überexprimieren z. B. metaplastische Zellen, endometriale Zellen etc.
Das Verfahren zum Nachweis des Expressionslevel von INK4a kodierten Genprodukten und/oder der Proliferationsmarker-Genprodukte ist gemäß der vorliegenden Erfindung ein beliebiges Verfahren, welches sich beispielsweise eignet, (sich aber nicht notwendigerweise eignen muss), um sogar sehr kleine Mengen von spezifischen biologischen Molekülen in biologischen Proben nachzuweisen. Die Nachweisreaktion gemäß der vorliegenden Erfindung ist entweder ein Nachweis auf der Ebene von Nukleinsäuren oder Polypeptiden.
Ein Markermolekül ist im Sinne der vorliegenden Erfindung nachweisbar, wenn der Marker im Verlauf eines geeigneten Nachweisverfahrens nachgewiesen wird, wie z. B. bei einer In-Situ Hybridisierung, einer immunochemischen Färbung, einem Hybrid Capture Assay etc.. Der Expressionslevel eines Markermoleküls kann unter Einsatz geeigneter Reporterreaktionen wie z. B. einer Chromogen- oder Fluoreszenz-basierten immunchemischen Färbung oder einem In-Situ Hybridisierungsverfahren für mikroskopische oder automatisierte Analysen nachweisbar gemacht werden. Dem Fachmann bekannte geeignete Verfahren zur Verbesserung des Reportersignals können im Verlauf eines Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Demnach ist der Marker nachweisbar, wenn die Färbung die jeweilige Hintergrundfärbung überflüssig macht, die schon an sich beim immunochemischen Färbeverfahren erzielt wurde um signifikante Färbeergebnisse hervorzurufen.
Die Markermoleküle können unter Einsatz von Reagenzien, die diese Moleküle spezifisch erkennen nachgewiesen werden. Die Nachweisreaktion für die INK4a Genprodukte und/oder die Proliferationsmarker-Genprodukte können eine oder mehrere Reaktionen mit Nachweisagenzien umfassen, die entweder die ursprünglichen Markermoleküle erkennen, oder die vorherigen Moleküle, die eingesetzt wurden, um andere Moleküle zu erkennen.
In bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können eine oder mehrere Sonden für den Nachweis eines einzigen Markermoleküls eingesetzt werden. Zum Beispiel können zwei oder mehrere verschiedene Bindungsagenzien (z. B. Antikörper) oder Oligonukleotidsonden, die gegen ein einziges Markermolekül gerichtet sind (gegebenenfalls gegen verschiedene Epitope oder verschiedene Sequenzen) im Verlauf des hier offenbarten Verfahrens eingesetzt werden.
Der Nachweis der verschiedenen Genprodukte kann in einem Reaktionsgefäß oder Behälter oder in verschiedenen Behältern gleichzeitig oder zeitlich nacheinander durchgeführt werden. Demnach können die verschiedenen Genprodukte gleichzeitig in einer Zelle nachgewiesen werden, die beide Produkte coexprimiert. Andererseits können Zellen, welche die Genprodukte coexprimieren für getrennte Nachweisreaktionen eingesetzt werden (räumlich oder zeitlich getrennt), um jeden einzelnen Marker in den Zellen nachzuweisen. In einer anderen Ausführungsform könnten Zellen den einen oder den anderen Marker exprimieren. Der Nachweis der Markermoleküle in den verschiedenen Zellen kann ebenso gleichzeitig oder zeitlich und/oder räumlich getrennt durchgeführt werden.
Die Nachweisreaktion kann weiterhin eine Reporterreaktion umfassen, welche die Anwesenheit oder Abwesenheit und/oder den Level des Markermolekül-Genprodukts angibt. Die Reporterreaktion kann zum Beispiel eine Reaktion sein, die eine farbige Verbindung produziert, oder eine biolumineszente Reaktion, eine Fluoreszenz-Reaktion oder generell eine strahlenabgebende Reaktion etc.
In bestimmten Ausführungsformen können Markermoleküle von Agenzien erkannt werden, die verschiedene Reportersignale produzieren, so dass die Signale, die sich auf die Markermoleküle beziehen unterschieden werden könnten. In einer Ausführungsform der Erfindung wird der Nachweis der Expression der zwei oder mehreren INK4a Genprodukte und/oder Proliferationsmarker-Genprodukte gleichzeitig durchgeführt. In diesem Fall kann die Reporterreaktion zum Beispiel verschiedene Fluoreszenzmarkierungen für die verschiedenen nachgewiesenen Moleküle hervorrufen.
Jedoch muss im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung nicht notwendigerweise beantwortet werden, ob der eine oder andere Proliferationsmarker oder das INK4a-Marker Genprodukt in den Zellen exprimiert wird. In bestimmten Ausführungsformen ist die Frage, ob irgend ein Proliferationsmarker und/oder INK4a Genprodukt exprimiert wird. Im Verlauf der Versuche kann ein Verfahren ausgewählt werden, das die gleichen Fluoreszenzsignale als Hinweis für die Anwesenheit eines Proliferationsmarkers gibt. Dieses Verfahren eignet sich dafür, die Empfindlichkeit des Nachweises der Zellproliferationseigenschaften zu verbessern (verschiedene Marker, die charakteristisch für aktive Zellproliferation sind). Gegebenenfalls kann das Verfahren eingesetzt werden, um ein nachweisbares Signal für drei, vier oder sogar mehrerer Markermoleküle, die charakteristisch für die Zellproliferation sind zu produzieren. Entsprechend kann dies unter bestimmten Umständen auch für INK4a Genexpressionsprodukte zutreffen. Gegebenenfalls können verschiedene Färbesignale für verschiedene Proliferationsmarkermoleküle wünschenswert sein. Die Verfahren können den Bedürfnissen des jeweiligen Versuchs entsprechend eingesetzt werden.
In bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kann eine Kombination aus einem oder mehreren (z. B. zwei verschiedenen) INK4a Genprodukten mit einer Kombination von einem oder mehrerer, z. B. ein Set von zwei, drei, vier, fünf oder sogar mehrerer Marker für Zellproliferation nachgewiesen werden. Gegebenenfalls kann der Nachweis der Markermoleküle für Zellproliferation nur ein Reportersignal liefern. In anderen Fällen kann jeder einzelne Marker für Zellproliferation ein spezifisches Reportersignal produzieren oder Gruppen von Markermolekülen können spezifische Reportersignale produzieren.
Signale zum Anzeigen der Anwesenheit von Immunoreaktivität können chromogene Signale sein, die durch verschiedene in der Technik bekannte Verfahren produziert werden. Alternativ oder sogar in Kombination können Fluoreszenzsignale eingesetzt werden. Geeignete Reportersignale umfassen Fluoreszenzmarkierungen wie Fluorescein, Rhodamin etc.
Geeignete Formate für die Nachweisreaktion gemäß der vorliegenden Erfindung können Blot-Techniken, wie Western-Blot, Southern-Blot, Northern Blot oder immunozytochemische oder immunohistochemische Verfahren sein. Die Blot-Techniken sind in der Technik dem Durchschnittsfachmann bekannt und können zum Beispiel als Elektro-Blot, Semidry-Blot, Vakuum-Blot oder Dot-Blot durchgeführt werden. Immunozytochemische/histochemische Färbeverfahren sind dem Fachmann bekannt und können einen Bindungsagens-vermittelten Nachweis von Polypeptiden sowie In-Situ Hybridisierungstechniken umfassen. Beide verschiedenen Techniken können sogar gleichzeitig angewandt werden. In bestimmten Ausführungsformen kann Hybrid Capture von Nukleinsäuren für den Nachweis eingesetzt werden. Eine Amplifikationsreaktion kann auch für den Nachweis von Nukleinsäuremolekülen z. B. geeignet sein.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird der Nachweis des Levels von INK4a und/oder Proliferationsmarker-Genprodukten durch den Nachweis der jeweiligen in der Probe anwesenden Nukleinsäuren (z. B. mRNA) oder Fragmente davon durchgeführt. Die Mittel zum Nachweis von Nukleinsäuremolekülen sind dem Fachmann bekannt. Das Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren kann zum Beispiel durch eine Bindereaktion des nachzuweisenden Moleküls an komplementäre Nukleinsäuresonden, Proteine mit Bindeeigenschaft für die Nukleinsäuren oder an jegliche andere Gebilde, die spezifisch besagte Nukleinsäuren erkennen und binden durchgeführt werden. In einer Ausführungsform kann eine In-Situ Hybridisierung von Oligonukleotidsonden an Nukleinsäuren in einer Probe für den Nachweis von Expressionsprodukten oder Markern eingesetzt werden.
Sonden im Sinne der vorliegenden Erfindung können beliebige Agenzien sein, die spezifisch an ein Molekül binden. Im Falle von Nukleinsäuren kann eine Sonde ein Oligonukleotid sein, das an eine bestimmte Sequenz hybridisiert. In einer Ausführungsform kann die Sonde z. B. ein Primer sein. Beim Nachweis von Polypeptiden oder Proteinen kann die Probe im Sinne der vorliegenden Erfindung z. B ein Bindungsagens wie beispielsweise ein Antikörper sein. In bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können die Sonden eine nachweisbare Markierung tragen. Die Markierung kann aus einer Gruppe ausgewählt werden, die aus Radioisotopen, biolumineszenten Verbindungen, chemilumineszenten Verbindungen, fluoreszenten Verbindungen, Metallchelaten, oder Enzymen besteht. Sonden können in jeglichem in der Technik bekannten Nachweisverfahren eingesetzt werden, wie z. B bei einem In-Situ Hybridisierungsverfahren, bei Hybrid Capture Assays, bei immunochemischen Färbereaktionen oder bei Blot-Techniken etc..
Dieses Verfahren kann sowohl in-vitro als auch direkt in-situ durchgeführt werden, z. B. im Verlauf einer nachweisenden Färbereaktion. Eine anderer Möglichkeit zum Nachweis der Marker RNAs in einer Probe, die in der vorliegenden Erfindung durchgeführt wird, ist eine Nukleinsäure-Amplifikations-Reaktion, die quantitativ ausgeführt werden kann, wie z. B. die Polymerase-Kettenreaktion. In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zum Beispiel kann RealTime-RT PCR eingesetzt werden, um den Level der Marker mRNAs in Proben von Dysplasien oder Tumoren (Zell- oder Gewebeproben) zu messen.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der Nachweis des Levels von INK4a und/oder Proliferationsmarker-Genprodukten durchgeführt, indem man den Expressionslevel eines Proteins oder von Fragmenten bestimmt. Die Bestimmung des Marker-Genprodukts auf der Proteinebene kann zum Beispiel in einer Reaktion ausgeführt werden, die ein Bindungsagens beinhaltet, das spezifisch für den Nachweis des bestimmten Markerpolypeptid ist.
Die Bindungsagenzien können in vielen verschiedenen Nachweistechniken eingesetzt werden, wie z. B. beim Western-Blot, bei ELISA oder bei der Immunoprezipitation. Generell kann ein Nachweis auf der Ebene von Polypeptidbindeagenzien sowohl in-vitro als dirket in-situ zum Beispiel im Verlauf einer immunochemischen Färbereaktion durchgeführt werden. Es kann ein beliebig anderes Verfahren zum Nachweis der Menge von bestimmten Polypeptiden in biologischen Proben gemäß der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden.
Die immunozytochemischen Bildverfahren im Sinne der vorliegenden Erfindung können z. B. die Färbung von zytologischen oder histologischen Präparationen mit chromogenen oder Fluoreszenzfarbstoffen beinhalten. Die Färbung kann beispielsweise die Bindung der Moleküle umfassen, die durch ein erstes Bindungsagens nachgewiesen werden sollen, welches wiederum selbst durch ein sekundäres Bindungsagens nachgewiesen wird, das markiert werden kann. Das erste Bindungsagens kann in bestimmten Ausführungsformen eine Nukleinsäure oder ein proteinbindendes Agens (z. B. ein Antikörper) sein. Das sekundäre Bindungsagens kann beispielsweise ein sekundärer Antikörper sein, der das erste Bindungsagens erkennt.
Es können beliebige in der Technik bekannte Verfahren zur Durchführung von zytochemischen oder histochemischen Färbungen im Verlauf des hier offenbarten Verfahrens eingesetzt werden.
Bindungsagenzien zum Nachweis des Levels von INK4a Polypeptiden wie p16^INK4a oder p14ARF Polypeptiden und Proliferationsmarker-Polypeptiden wie z. B. MCM5, MCM2, Ki67, Ki-S5, PCNA oder Ki-S2 Polypeptiden können Antikörper und antigenbindende Fragmente, bifunktionale Hybridantikörper, Peptidomimetics, die minimale antigenbindende Epitope enthalten oder Anti-Culline (Anti-Caline^®) etc. umfassen.
Ein Antikörper oder antigenbindendes Agens soll spezifisch reagieren, wenn es in einem nachweisbaren Level mit einem hier offenbarten Protein reagiert und nicht signifikant mit anderen Proteinen reagiert. Die Antikörper, die gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, können monoklonale oder polyklonale Antikörper sein. Im Sinne der vorliegenden Erfindung soll die Bezeichnung „Antikörper" oder „monoklonaler Antikörper" intakte Moleküle sowie Antikörperfragmente beinhalten. Darüber hinaus beinhalten Antikörper, die gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können chimere Antikörper, Single-Chain Antikörper und humanisierte Antikörper.
Gemäß der vorliegenden Erfindung können Bindungsagenzien isoliert oder in Kombination eingesetzt werden. Durch Kombination ist es möglich einen höheren Sensitivitätsgrad zu erreichen. Die Bezeichnung Antikörper bezieht sich bevorzugt auf Antikörper, die im Wesentlichen aus konzentrierten monoklonalen Antikörpern mit verschiedenen Epitopspezifitäten sowie aus verschiedenen monoklonalen Antikörperpräparaten bestehen.
Monoklonale Antikörper werden mithilfe antigenenthaltender Fragmente des Polypeptids dieser Erfindung generiert, unter Einsatz einer beliebigen Vielfalt von Techniken, die dem Durchschnittsfachmann bekannt sind, wie z. B. Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. In einer solchen Technik wird ein Immunogen, welches das Antigenpolypeptid oder einen synthetischen Teil davon enthält, zunächst einer beliebige großen Vielfalt von Säugetieren (wie z. B. Mäusen, Ratten, Hasen, Schafen und Ziegen) injiziert. Bei diesem Schritt können die Polypeptide dieser Erfindung als das Immunogen ohne Modifikation dienen. Alternativ, besonders bei relativ kurzen Polypeptiden, kann eine höhere Immunreaktion ausgelöst werden, wenn das Polypeptid mit einem Trägerprotein verbunden wird, wie z. B. Bovinem Serum Albumin oder Napfschnecken Hämozyanin. Das Immunogen wird in den Tierwirt injiziert, vorzugsweise gemäß einem vorher festgelegten Zeitplan, der eine oder mehrere Boost-Immunisierungen einschließt, und den Tieren wird periodisch Blut entnommen. Polyklonale Antikörper, die spezifisch für das Polypeptid sind, können dann von diesem Antiserum durch z. B. eine Affinitätschromatographie unter Einsatz des Polypeptids, das an einen geeigneten Feststoff gekoppelt ist, gereinigt werden.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung muss nicht notwendigerweise beantwortet werden, ob der eine oder andere Proliferationsmarker in den Zellen exprimiert wird. In bestimmten Ausführungsformen kann die wichtigste Frage sein, ob irgendein Proliferationsmarker exprimiert wird. Daher wurde im Verlauf der Versuche ein Verfahren ausgewählt, welches das gleiche Fluoreszenzsignal als Hinweis auf die Anwesenheit eines Proliferationsmarker abgibt. Dieses Verfahren eignet sich dazu, die Sensitivität des Nachweises von Zellproliferationseigenschaften zu verbessern. Gegebenenfalls kann das Verfahren eingesetzt werden, um ein nachweisbares Signal für drei, vier oder sogar noch mehr für die Zellproliferation charackteristische Markermoleküle abzugeben. Analog hierzu kann das gleiche unter bestimmten Umständen für INK4a Genexpressionsprodukte gelten. Es muss dazu gesagt werden, dass gegebenenfalls verschiedene Färbesignale für verschiedene Proliferationsmarkermoleküle wünschenswert sein können.
Die INK4a Genprodukte und/oder Proliferationsmarker-Genprodukte können gemäß der vorliegenden Erfindung gleichzeitig nachgewiesen werden. In diesem Zusammenhang soll „gleichzeitig" im Sinne der vorliegenden Erfindung entweder wörtlich im gleichen Augenblick oder während des gleichen Testverfahrens bedeuten, wobei die einzelnen Schritte des Nachweises vorübergehend konsekutiv sind.
Das Nachweisverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung kann des Weiteren ein zytochemisches Färbeverfahren beinhalten, welches eine chromogene oder Fluoreszenzfärbung von Zellen oder Zellkompartimenten liefert. Solche Färbeverfahren sind dem Fachmann bekannt und können beispielsweise das Färben von azidophilen oder basophilen Strukturen oder von subzellularen Regionen (z. B. den Nukleus, die Mitochondrien, den Golgi, das Zytoplasma etc.) in zytologischen Proben umfassen. Es können Fluoreszenzfarbstoffe wie DAPI, Quinacrin, Chromomyzin, etc. eingesetzt werden. Des weiteren können chromogene Farbstoffe wie Azan, Acridin-Orange, Hematoxylin, Eosin, Sudan-Rot, Thiazin-Färbungen (Toluidin-Blau, Thionin) eingesetzt werden. In weiteren Ausführungsformen können Färbeverfahren wie z. B. die Pap-Färbung, Giemsa-Färbung, Hematoxylin-Eosin-Färbung, van-Gieson-Färbung, Schiff-Färbung, Färbung durch Metallpräzipitate, (wie z. B. Silber in Färbeverfahren mit Silbernitraten) oder unlösliche Farbstoffe wie Trunbulls-Blau (oder andere unlösliche Metallzyanide) etc. im Sinne der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Natürlich sind die genannten Farbstoffe und Färbeverfahren Beispiele für anwendbare Verfahren und es können beliebige andere in der Technik bekannte Verfahren im Sinne der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden.
Die Färbeverfahren können chromogene Färbungen für lichtmikroskopische Untersuchungen oder eine Fluoreszenzfärbungen zur Untersuchung unter fluoreszenz-mikroskopischen Bedingungen produzieren. In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können strahlenabgebende Verfahren, Verfahren unter Einsatz von Substanzen, welche die Strahlentransmission beeinträchtigen oder anderen Kontrastmedien zum Abbilden der zytologischen Bedingungen in einer Probe (z. B. die Bewirkung eines optischen Eindrucks durch beispielsweise (mikro-)autoradiographische oder (mikro-)radiographische Bildgenerierung) im Sinne der vorliegenden Erfindung von Nutzen sein.
Alle Färbe- und Bildverfahren können zur Analyse nicht nur in mikroskopischen Verfahren eingesetzt werden, sondern auch in automatisierten Analyseverfahren wie z. B bei der Flowzytometrie, der automatisierten (computerisierten oder computerunterstützten) Analyse oder auch bei jedem anderen Verfahren zur Analyse von gefärbten zytologischen Proben.
Die Analyse der Färbe- oder Bildergebnisse der verschiedenen Verfahren kann in einzelnen Analyseschritten oder in verschiedenen aufeinanderfolgenden Schritten durchgeführt werden. Zum Beispiel kann die lichtmikroskopische Untersuchung einer Probe vor oder nach der fluoreszenzmikroskopischen Untersuchung der Probe durchgeführt werden. Bei der Fluoreszenzmikroskopie kann die Analyse verschiedener Färbungen mit verschiedenen Abregungswellenlängen gleichzeitig oder nacheinander erfolgen. Andere Bildverfahren können gleichzeitig oder nach den genannten Verfahren erfolgen.
Unter gewissen Umständen können sich Kombinationen aus verschiedenen Färbeverfahren angezeigt sein. Zum Beispiel in Fällen, bei denen keine zufriedenstellenden Färbeergebnisse durch immunchemische Färbung erzielt werden können, kann sich die zusätzliche Anwendung von allgemeinen Färbetechniken eignen.
Eine Probe gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung kann eine beliebige Probe umfassen, die Zellen enthält. Proben können Sekrete, Abstriche, Körperflüssigkeiten, und Zell- oder Gewebeproben umfassen.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfassen Proben Zellen des Anogenitaltraktes, des Respirationstraktes oder der Haut und deren Anhangsgebilde. In bestimmten Ausführungsformen können die Zellen Zellen des Gebärmutterhalses, der Vagina, der Vulva, des Penis, des Anus, des Rektum, des Bronchialbaums, der Lunge, des Bauchfellraums, des Hals-Nasenraums, der Mundhöhle oder der Haut sein. In bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kann die Probe eine histologische Probe, eine Biopsie oder eine zytologische Probe wie z. B. ein Ausstrich, ein Abstrich, eine Spülung, oder eine Körperflüssigkeit, die Zellen enthält (Sputum, ein Sekret, Speichel etc.) umfassen. In bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können die Proben Zellen enthalten, die durch den Papillomavirus infiziert sind. Die Proben können in bestimmten Ausführungsformen zervikale Abstriche, bronchioalveolare Lavagen etc. umfassen.
In bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kann die Probe als ein Monolayer- oder Dünnschichtpräparat einer zytologischen Probe hergestellt werden. Die jeweiligen Verfahren zur Herstellung von Monolayer- oder Dünnschichtpräparaten in der Zytologie sind dem Fachmann bekannt. In einer Ausführungsform kann die Präparation zum Beispiel die ThinPrep Technologie umfassen. Andere Verfahren umfassen konventionelle Ausstriche oder Verfahren, bei denen Zellsuspensionen zur Präparation der zytologischen Proben verwendet werden.
Die Aufarbeitung einer Probe kann zum Beispiel die Gewinnung einer Gewebeprobe, einer Körperflüssigkeitsprobe oder einer Zellprobe eines Patienten umfassen. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Präparation der Probe auch verschiedene Schritte weiterer Probenaufarbeitung umfassen, wie z. B. das Herstellen von Schnitten, von Zellsuspensionen, das Auftragen oder Applizieren der zu untersuchenden Zellen auf Objektträger, die Präparation von Gewebearrays, die Isolation von Polypeptiden oder Nukleinsäuren, die Präparation von festphasenfixierten Peptiden oder Nukleinsäuren, die Präparation von Beads, Membranen oder Objektträgern, an die die zu bestimmenden Moleküle kovalent oder nicht-kovalent gekoppelt sind.
In bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kann das Verfahren in automatisierter Weise erfolgen. Die Automatisierung des Verfahrens kann durch automatisiertes Färben und automatisierte mikroskopische Analyse von histologischen oder zytologischen Proben auf einer festen Oberfläche erreicht werden. In einer weitern Ausführungsform kann die Automatisierung eine flowzytometrische Analyse der Färbung von Zellen in einer Lösung umfassen.
Die dysplastischen Läsionen, auf welche das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung angewandt werden kann, umfassen beliebige dysplastische Läsionen, die durch die Überexpression von INK4a Genprodukten wie z. B. p16^INK4a oder p14ARF charakterisiert sind. In bestimmten Ausführungsformen sind diese Läsionen mit Infektion durch Papillomavirus, wie z. B. HPV, assoziierte Dysplasien. In einer Ausführungsform kann das HPV ein Hochrisiko-HPV-Subtyp wie HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV56, HPV58, HPV59, HPV66, HPV68 etc. sein. In einer Ausführungsform umfassen die dysplastischen Läsionen, die gemäß der vorliegenden Erfindung nachgewiesen werden können, anogenitale Läsionen, Läsionen des Respirationstrakts, Läsionen des Kopfes und des Halses oder Läsionen der Haut und deren Anhangsgebilde. Solche Läsionen können z. B. Dysplasien des Anus oder des Rektum, der Vulva, der Vagina, der Gebärmutter oder des Penis, des Bronchialbaums, der Lunge, der Mundhöhle oder des Hals-Nasenraums umfassen.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Testkit zur Durchführung des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung. Das Kit kann beispielsweise ein diagnostisches Kit oder ein Forschungskit sein.
Somit umfasst ein Kit gemäß der vorliegenden Erfindung: Mindestens eine oder mehrere Sonden zum Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit und/oder des Levels der Überexpression von mindestens einem INK4a Genprodukt und mindestens einem Zellproliferationsmarker-Genprodukt in biologischen Proben, wobei die Kitkomponenten so zur Verfügung gestellt werden, dass ein gleichzeitiger Nachweis von mindestens einem INK4a Genprodukt und mindestens einem Zellproliferationsmarker-Genprodukt in einer einzigen Zelle der Proben möglich ist, und wobei mindestens zwei unterscheidbare nachweisbare Signale erzeugt werden, mindestens ein nachweisbares Signal hinweisend für den Level der Expression von mindestens einem INK4a Genprodukt ist, und mindestens ein anderes nachweisbares Signal hinweisend für den Level der Expression von mindestens einem Zellproliferationsmarkergen ist.
Die Reagenzien zum Nachweis der Markergenprodukte können jedes Agens enthalten, welches das Markergenprodukt binden kann. Solche Reagenzien können Proteine, Polypeptide, Nukleinsäuren, Peptid-Nukleinsäuren, Glykoproteine, Proteoglykane, Polysaccharide oder Lipide beinhalten.
Die Proben des INK4a Genprodukts und des Proliferationsmarker-Genprodukts zur Durchführung einer positiven Kontrolle können beispielsweise Nukleinsäuren in geeigneter Form, wie in Lösung oder Salz, Peptide in geeigneter Form, Gewebesektionsproben oder positive Zellen beinhalten.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird der Nachwies der Markergenprodukte auf der Ebene von Polypeptiden durchgeführt. In dieser Ausführungsform können die Bindungsagenzien zum Beispiel Antikörper sein, die spezifisch für die Markergenprodukte oder deren Fragmente sind.
In einer weiteren Ausführungsform des Testkits, wird der Nachweis der Markergenprodukte auf der Ebene von Nukleinsäuren durchgeführt. In dieser Ausführungsform der Erfindung kann das Reagenz zum Nachweis zum Beispiel eine Nukleinsäurensonde sein oder ein Primer, der reverskomplementär zu der besagen Markernukleinsäure ist.
Das zu lösende Problem war, ein Verfahren zur Unterscheidung zwischen dysplastischen Zellen und anderen Zellen, ohne bösartiges Wachstumspotenzial zu liefern. Das Verfahren kann in allen Stadien von Dysplasien angewandt werden und kann besonders in frühen Stadien von Nutzen sein, wenn zytologische Diagnostikverfahren basierend auf der Überexpression von p16^INK4a weitere Informationen zur Identifizierung von metaplastischen Zellen benötigen.
Darüber hinaus liefert die vorliegende Erfindung ein Kit zur Durchführung des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung:
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1: FLUORESZENZFÄRBUNG EINER HISTOLOGISCHEN PROBE DES GEBÄRMUTTERHALSES;
1 zeigt die Färbung einer hochgradigen Dysplasie mit Antikörpern, die gegen p16^INK4a gerichtet sind, für Details des Versuchs siehe Beispiel 1; die Immunoreaktivität für p16^INK4a verursacht grüne Fluoreszenz. Fast alle Zellen der Läsion sind weitestgehend im Zytoplasma und im Zellkern positiv gefärbt.
2: FLUORESZENZFÄRBUNG EINER HISTOLOGISCHEN PROBE DES GEBÄRMUTTERHALSES;
2 zeigt die Färbung einer hochgradigen Dysplasie mit Antikörper, die gegen Ki67 gerichtet sind, für Details des Versuchs siehe Beispiel 1; die Immunoreaktivität für Ki67 verursacht rote Fluoreszenz. Viele Zellen der Dysplasie weisen eine nukleare Positivität für Ki67 auf.
3: FLUORESZENZDOPPELFÄRBUNG EINER HISTOLOGISCHEN PROBE DES GEBÄRMUTTERHALSES;
3 zeigt die Färbung einer hochgradigen Dysplasie mit Antikörpern, die gegen Ki67 und p16^INK4a gerichtet sind; für Details des Versuchs siehe Beispiel 1; die Immunoreaktivität für Ki67 verursacht rote Fluoreszenz, die Immunoreaktivität für p16^INK4a verursacht grüne Fluoreszenz, durch Überlagerung von roter und grüner Fluoreszenz entsteht gelbe Fluoreszenz.
4: FLUORESZENZFÄRBUNG EINER HISTOLOGISCHEN PROBE DES GEBÄRMUTTERHALSES;
4 zeigt die Färbung einer Plattenepithel-Metaplasie mit Antikörpern, die gegen Ki67 gerichtet sind, für Details des Versuchs siehe Beispiel 1, die Immunoreaktivität für Ki67 verursacht grüne Fluoreszenz. Manche Zellen der Metaplasie sind weitestgehend im Zytoplasma und im Zellkern positiv gefärbt.
5: FLUORESZENZFÄRBUNG EINER HISTOLOGISCHEN PROBE DES GEBÄRMUTTERHALSES;
5 zeigt die Färbung einer Plattenepithel-Metaplasie mit Antikörpern, die gegen Ki67 gerichtet sind; für Details des Versuchs siehe Beispiel 1, die Immunoreaktivität für Ki67 verursacht rote Fluoreszenz. Viele Zellen der Plattenepithel-Metaplasie zeigen eine nukleäre Positivität für Ki67. Bereiche, die p16^INK4a positiv exprimieren, weisen keinerlei positive Färbung für Ki67 auf, was auf eine fehlende Expression des Antigens in diesem Bereich hinweist.
6: FLUORESZENZDOPPELFÄRBUNG EINER HISTOLOGISCHEN PROBE IM GEBÄRMUTTERHALS;
6 zeigt die Färbung einer hochgradigen Dysplasie mit Antikörpern, die gegen Ki67 und p16^INK4a gerichtet sind, für Details des Versuchs siehe Beispiel 1; die Immunoreaktivität für Ki67 verursacht rote Fluoreszenz, die Immunoreaktivität für p16^INK4a verursacht grüne Fluoreszenz; durch Überlagerung von roter und grüner Fluoreszenz entsteht gelbe Fluoreszenz. Bereiche, die p16^INK4a positiv exprimieren, weisen keinerlei positive Färbung für Ki67 auf, was auf eine fehlende Expression des Antigens in diesem Bereich hinweist. Keine Zellen in der Probe verursachen gelbe Fluoreszenz.
Die folgenden Beispiele dienen ausschließlich der Veranschaulichung und sollen nicht den Umfang der hier offen gelegten Erfindung einschränken. Zur Veranschaulichung der hier offengelegten Verfahren werden histologische Proben verwendet. Die histologischen Präparationen tragen dazu bei, zu beurteilen, ob die Zellen, die auf die eine oder andere Weise gefärbt sind als dysplastisch oder metaplastisch zu klassifizieren sind. Die Verfahren können leicht durch angemessene Änderungen der Vorgehensweise mit zytologischen Proben durchgeführt werden. Diese Änderungen sind dem Fachmann bekannt.
Beispiel 1: IMMUNOFLUORESZENZNACHWEIS DER OBEREXPRESSION VON P16^INK4A UND KI – 67 IN PROBEN DES GEBÄRMUTTERHALSES (DOPPELFÄRBUNG)
Schnittpräparate formalinfixierter, paraffineingebetteter Gewebeproben des Gebärmutterhalses wurden immunofluoreszent mit Antikörpern gefärbt, die für p16^INK4a und Ki67 spezifisch sind.
Die Gewebeschnitte wurden durch Inkubation in einer absteigenden Reihe von Xylol/Ethanol rehydriert und in Aquabidest überführt. Die Antigendemaskierung wurde mit 10 mM Zitratpuffer (pH 6.0) für p16^INK4a und Ki67 durchgeführt. Dafür wurden die Objektträger in einem Wasserbad bei 95°C–98°C für 40 min erhitzt. Die Objektträger wurden für 20 Minuten auf RT abgekühlt und dann mit Waschpuffer gewaschen (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20/DakoCytomation: code no.: S3006).
Um eine nichtspezifische Bindung des Sekundärantikörpers zu verhindern (Spezies: Ziege) wurden die Proben mit 10% Ziegenserum 30 min bei RT inkubiert.
Die Objektträger wurden dann mit den Primärantikörpern, Maus-Anti-Human-p16^INK4a Antikörpern (3.48 μg/ml) und Kaninchen-Anti-Ki67 (1 : 25) 30 min bei RT inkubiert, die Objektträger wurden dann mit Waschpuffer gespült und für 5 Minuten in ein frisches Pufferbad überführt. Überschüssiger Puffer wurde abgesaugt und jede Probe wurde mit 200 μl des Sekundärreagenz bedeckt, das den Alexa Fluor^®488 konjugierten Ziege-Anti-Maus Antikörper, bzw. den Alexa Fluor^®546 konjugierten Ziege-Anti-Kaninchen Antikörper enthält und dann 30 min bei RT inkubiert. Die Objektträger wurden zweimal wie zuvor gewaschen und direkt mit einem speziellen Eindeckmedium für Fluoreszenz eingedeckt.
Die mikroskopische Untersuchung der Objektträger zeigt, dass Zellen, die immunoreaktiv mit p16^INK4a und mit Ki67 sind, nur in Proben gefunden werden können, die mikroskopisch als Proben dysplastischer Läsionen identifiziert werden können. Zellen, die durch die p16^INK4a spezifische Reaktion gefärbt wurden und von den Metaplasien stammen, wurden nicht durch die für Ki67 spezifische Reaktion gefärbt. Die mikroskopische Untersuchung der Färbung des Zellproliferationsmarkers zeigt, dass metaplastische Zellen, die p16^INK4a überexprimieren nicht immunoreaktiv mit den gegen Ki67 gerichteten Antikörpern sind. Proben, die dysplastische Gewebebereiche enthalten, enthalten im Gegensatz dazu Zellen, die mit Ki67 und mit p16^INK4a spezifischen Antikörpern immunoreaktiv sind. So konnten im Gegensatz zu Dysplasien bei Metaplasien keine Zellen doppelt mit Ki67 und p16^INK4a spezifischen Antikörpern gefärbt werden.
Die 1–6 zeigen die Färbeergebnisse einer hochgradigen Dysplasie des Gebärmutterhalses und einer Plattenepithel-Metaplasie mit Antikörpern, die gegen Ki67 und p16^INK4a gerichtet sind. Die Immunoreaktivität für Ki67 verursacht rote Fluoreszenz, die Immunoreaktivität für p16^INK4a verursacht grüne Fluoreszenz und die Überlagerung von roter und grüner Fluoreszenz verursacht gelbe Fluoreszenz. Bei der dysplastischen Probe (1–3) wiesen viele Zellen der Dysplasie eine nukleäre Positivität für Ki67 auf, sowie eine Positivität für p16^INK4a und verursachen so gelbe Fluoreszenz (siehe 3). Im Gegensatz dazu wiesen in den metaplastischen Proben (4–6) die Bereiche, die p16^INK4a positiv exprimieren, keine positive Färbung für Ki67 auf, was auf die fehlende Expression des Antigens in diesem Bereich hinweist. Die Doppelfärbung kann in der Probe (6) beobachtet werden und damit verursachen keine Zellen eine gelbe Fluoreszenz.
Die Ergebnisse zeigen, dass es durch die Doppelfärbung von Zellen mit Ki67-spezifischen Reagenzien ermöglicht wird, Metaplasien, die p16^INK4a überexprimieren von Dysplasien zu unterscheiden.
Beispiel 2: NACHWEIS VON ZELLEN, DIE P14ARF UND MCM2 COEXPRIMIEREN IN PROBEN DES GEBÄRMUTTERHALSES DURCH IN-SITU HYBRIDISIERUNG
In einer In-Situ Färbereaktion kann der Level von p16^INK4a und MCM2 bei Ausstrichen des Gebärmutterhalses semiquantitativ analysiert werden. Die Färbereaktion wurde wie folgt durchgeführt:
Zur Rehydrierung wurden die sprayfixierten Ausstriche in frischem 50%igen EtOH auf einem Schüttler inkubiert. Der PEG Film, der durch die Fixierung produziert wurde, wurde durch intensives Spülen entfernt. Anschließend wurden die Ausstriche in Aquabidest gespült. Die Ausstriche wurden für 10 Minuten bei 37°C mit Proteinase K (10 μg/ml in PBS) inkubiert. Dann wurden die Objektträger mit Waschpuffer gewaschen (PBS/0.1% Tween20) und zum Schluss wurde der Bereich, der die Zellen enthält mit einem Fettstift umkreist.
Das Hybridisierungsgemisch wurde durch Mischen von 50 μl fertigem Hybridisierungspuffer (DAKO A/S, Glostrup, Dänemark) mit ungefähr 5–10 pmol der Sonden zubereitet. Die Sonden sind Biotin- und Digoxygenin-markierte Oligonukleotide von Sequenzen, die komplementär zu den jeweiligen mRNAs sind.
Das Hybridisierungsgemisch wurde auf 95°C erhitzt und anschließend auf 37°C äquilibriert. Nach dem Kochen wurden die Ausstriche mit 50 μl des Hybridisierungsgemischs für 4 Stunden bei 42°C inkubiert. Die Proben wurden in einem Überschuss an Waschpuffer zweimal in 2 × SSC für 15 Minuten bei 37°C gewaschen und einmal 15 min bei 37°C in 1 × SSC. Dann wurden die Ausstriche zweimal bei Raumtemperatur in 2 × SSC gespült. Nach dieser Waschprozedur wurden die Schnitte 30 Minuten mit Blockingpuffer (NEN, Blockingbuffer) bei Raumtemperatur inkubiert. Danach folgte eine einstündige Inkubation mit einer 1 : 1000 verdünnten (in Blockingpuffer, siehe oben) Strepavidin gekoppelten Alkalischen Phosphatase und mit monoklonalen Maus HRP-markierten Anti-Digoxygenin Antikörpern (erhalten von Molecular Probes). Die Ausstriche wurden dann zweimal 10 Minuten bei Raumtemperatur in 1 × PBS/0,1 Triton X-100 gewaschen gefolgt von einem Waschschritt mit 1 × PBS, 50 mM MgCl₂ (pH 2,9) für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Danach wurde die Färbereaktion mit ELF97 Phosphat (erhalten von Molecular Probes) für 10 Sekunden bis 7 Minuten bei Raumtemperatur durchgeführt. Das Überschusssubstrat wurde 10 Minuten bei Raumtemperatur dreimal mit 1 × PBS/0,1% Triton X-100 gewaschen. In einem zweiten Färbeschritt wurde der Ausstrich mit Tyramides-Alexa-Fluor 594 10 Sekunden bis 7 Minuten inkubiert. Das Überschusssubstrat wurde dreimal 10 Minuten bei Raumtemperatur mit 1 × PBS/0,1% Triton X-100 gewaschen. Zum Schluss wurden die Ausstriche in H₂O_dest. eingetaucht und mit Fluoreszenz Eindeckmedium (DakoCytomoation) eingebettet. Dann konnten die gefärbten Dissektionen durch Fluoreszenzmikroskopie analysiert werden.
Die mikroskopische Untersuchung der Objektträger zeigte, dass Zellen, die p16^INK4a und auch MCM2 exprimieren, nur in Proben gefunden werden können, die mikroskopisch als Proben dysplastischer Läsionen identifiziert werden können. Zellen, die durch die p16^INK4a spezifische Reaktion gefärbt wurden und als Metaplasien identifizierbar waren, wurden nicht durch die MCM2 spezifische Reaktion gefärbt. Die mikroskopische Untersuchung der mRNA Hybridisierung zeigte, dass metaplastische Zellen, die p16^INK4a überexprimieren nicht signifikant mRNA von MCM2 exprimieren. Dysplastische Zellen im Gegensatz dazu konnten durch In-Situ Hybridisierung mit Sonden, die spezifisch für MCM2 sind und mit Sonden, die gegen p16^INK4a gerichtet waren gefärbt werden. Daher konnte im Gegensatz zu dysplastischen Zellen, in metaplastischen Zellen keine Doppelfärbung mit den Ki67 und p16^INK4a spezifischen Sonden entdeckt werden.
Die Ergebnisse zeigen, dass es die Doppelfärbung der Zellen mit MCM2 spezifischen Reagenzien erlaubt, Metaplasien, die p16^INK4a überexprimieren von Dysplasien zu unterscheiden.
Beispiel 3: IMMUNOFLUORESZENZNACHWEIS DER OBEREXPRESSION VON P16^INK4A UND KI-S2 IN PROBEN DES GEBÄRMUTTERHALSES (DOPPELFÄRBUNG)
Merckofix^® fixierte zytologische Proben (konventionelle Ausstriche und flüssigkeitsbasierte Zytologie (ThinPrep^®)) des Gebärmutterhalses wurden mit für p16^INK4a und Ki-S2 spezifischen Antikörpern immunofluoreszent gefärbt.
Die konventionellen Ausstriche und flüssigkeitsbasierten zytologischen Proben (ThinPrep^®) wurden in Ethanol (50%) 10 Minuten rehydriert und in Aquabidest überführt. Die Antigenrückdemaskierung wurde mit 10 mM Zitratpuffer (pH 6.0) für p16^INK4a und Ki67 durchgeführt. Dafür wurden die Objektträger in einem Wasserbad 40 Minuten bei 95°C–98°C erhitzt. Die Objektträger wurden dann 20 Minuten bei Raumtemperatur abgekühlt, in Waschpuffer gewaschen (50 mM Tris-HCl, 15 mM NaCl, 0.05% Tween 20 /DakoCytomation: code no.: S3006) und zum Schluss wurden die Proben mit einem Fettstift umkreist.
Um eine nichtspezifische Bindung des Sekundärantikörpers (Gattung: Ziege) zu vermeiden, wurden die Proben mit 10% Ziegenserum 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
Die Objektträger wurden dann mit den Primärantikörpern, dem Maus-antihuman-p16^INK4a Antikörper (Klon E6H4) (3.48 μg/ml) und dem Kaninchen anti Ki-S2 (1 : 25) 30 Minuten bei RT inkubiert, danach mit Waschpuffer gespült und 5 Minuten in ein frisches Pufferbad überführt. Überschüssiger Puffer wurde abgsaugt und die Probe wurde mit 200 μl des Sekundärreagenz, welches Alexa Fluor^®488 konjungierte Ziege anti-Maus Antikörper und Alexa Fluor^®546 konjungierte Ziege anti-Kaninchen Antikörper enthält bedeckt und dann 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Objektträger wurden zweimal wie zuvor gewaschen und direkt mit einem speziellen Eindeckmedium für Fluoreszenz eingedeckt.
Die mikroskopische Untersuchung der Objektträger zeigt, dass Zellen, die mit p16^INK4a und Ki-S2 immunoreaktiv sind, mikroskopisch als dysplastische Zellen identifiziert werden können. Zellen, die durch die p16^INK4a spezifische Reaktion gefärbt wurden und nicht durch die Ki-S2 spezifische Reaktion, können durch einen erfahrenen Pathologen als entweder metaplastisch oder endometrialen Ursprungs klassifiziert werden. Die mikroskopische Untersuchung der Färbung der Zellproliferationsmarker zeigt, dass metaplastische Zellen, die p16^INK4a überexprimieren, nicht immunoreaktiv mit den gegen Ki-S2 gerichteten Antikörpern sind. Dysplastische Zellen im Gegensatz sind immunoreaktiv mit Ki-S2 und mit Antikörpern, die gegen p16^INK4a gerichtet sind. Daher können im Gegensatz zu dysplastischen Zellen in Metaplasien keine Zellen mit Ki-S2 und p16^INK4a spezifischen Antikörpern doppelt gefärbt werden.
Die Ergebnisse zeigen, dass durch die Doppelfärbung von Zellen mit Reagenzien, die für Ki-S2 spezifisch sind ermöglicht wird, metaplastische Zellen, die p16^INK4a überexprimieren von dysplastischen Zellen zu unterscheiden.
Beispiel 4: IMMUNOFLUORESZENZNACHWEIS DER ÜBEREXPRESSION VON P16^INK4A, KI67 UND PCNA IN BRONCHOALVEOLARLAVAGE PROBEN VON PERSONEN MIT DIAGNOSTIZIERTEM KLEINZELLIGEM LUNGENKREBS (DOPPELFÄRBUNG)
Zellen in Bronchoalveolarlavage Proben von Patienten wurden gemäß der ThinPrep^® Technologie präpariert. Merckofix^® fixierte zytologische Proben der Lavagen von Patienten mit diagnostiziertem kleinzelligem Lungenkrebs wurden immunofluoreszent mit Antikörpern gefärbt, die spezifisch für p16^INK4a, Ki67 und PCNA sind.
In diesem Versuch wurde ein Verfahren eingesetzt, welches nicht zwischen der Färbung unterscheidet, die von der Immunoreaktivität gegen die zwei Proliferationsmarker PCNA und Ki67 stammt. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung muss nicht unbedingt beantwortet werden, ob der eine oder andere Proliferationsmarker in den Zellen exprimiert wird. Die wichtigste Frage ist, ob irgendein Proliferationsmarker exprimiert wird.
Im Verlauf des Versuchs wurde ein Verfahren gewählt, welches das gleiche Fluoreszenzsignal als Hinweis auf die Anwesenheit eines Proliferationsmarkers erzeugt. Dieses Verfahren eignet sich dazu die Sensitivität des Nachweises der Zellproliferationseigenschaften zu verbessern. Gegebenenfalls kann das Verfahren eingesetzt werden, um ein nachweisbares Signal für drei, vier oder sogar für mehrere Markermoleküle, die für die Zellproliferation charakteristisch sind zu liefern. Analog dazu kann das gleiche unter bestimmten Umständen für INK4a Genexpressionsprodukte gelten. Es muss dazu gesagt werden, dass gegebenenfalls verschiedene Färbesignale für verschiedene Proliferationsmarkermoleküle wünschenswert wären. Die Verfahren können den Bedürfnissen des jeweiligen Versuchs entsprechend eingesetzt werden.
Die Gewebesektionen wurden durch Inkubation in Xylol und abgestuftem Ethanol rehydriert und in Aquabidest transferiert. Die konventionellen Ausstriche und flüssigkeitsbasierten zytologischen Proben (ThinPrep^®) wurden 10 Minuten in Ethanol (50%) rehydriert und in Aquabidest transferiert. die Antigenrückgewinnung wurde für p16INK4a, Ki67 und PCNA mit 10 mM Zitratpuffer (pH 6.0) durchgeführt. Dazu wurden die Objektträger für 40 Minuten bei 95°C–98°C in einem Wasserbad erhitzt. Die Objektträger wurden 20 Minuten auf RT abgekühlt, in Waschpuffer gewaschen (50 mM Tris-HCl, 15 mM NaCl, 0.05% Tween 20/DakoCytomation: code no.: 3006) und zum Schluss wurden die Proben mit einem Fettstift umkreist.
Um eine nichtspezifische Bindung des Sekundärenantikörpers (Gattung: Ziege) zu vermeiden, wurden die Proben mit 10% Ziegenserum 30 Minuten bei RT inkubiert.
Die Objektträger wurden dann mit den Primärantikörpern, dem Maus-antihuman-p16^INK4a Antikörper (3.48 μg/ml) und dem Kaninchen anti-PCNA (1 : 25) 30 Minuten bei RT inkubiert, danach mit Waschpuffer gespült und 5 Minuten in ein frisches Pufferbad gesetzt. Überschüssiges Puffer wurde abgesaugt und die Probe wurde mit 200 μl des Sekundärreagenz, welcher Alexa Fluor^®488 konjungierte Ziege anti-Maus Antikörper und Alexa Fluor^®546 konjungierte Ziege anti-Kaninchen Antikörper enthält bedeckt und dann 30 Minuten bei RT inkubiert. Die Objektträger wurden zweimal wie zuvor gewaschen und direkt mit einem speziellen Eindeckmedium für Fluoreszenz eingedeckt.
Die mikroskopische Untersuchung der Objektträger zeigt, dass Zellen, die mit p16^INK4a und Ki-67 oder PCNA immunoreaktiv sind, mikroskopisch als Zellen kleinzelligen Lungenkrebses identifiziert werden können. Zellen, die durch die p16^INK4a spezifische Reaktion gefärbt wurden und von Metaplasien stammen, wurden nicht durch die für Ki67 und PCNA spezifische Reaktion gefärbt. Die mikroskopische Untersuchung der Färbung der Zellproliferationsmarker zeigt, dass metaplastische Zellen, die p16^INK4a überexprimieren, nicht immunoreaktiv mit den gegen Ki67 und PCNA gerichteten Antikörpern sind. Proben, die dysplastische Zellen enthalten, enthalten im Gegensatz dazu Zellen, die immunoreaktiv mit Ki67/PCNA und mit gegen p16^INK4a gerichteten Antikörpern sind. Daher können im Gegensatz zu Dysplasien in Metaplasien keine Zellen mit Ki-67 und PCNA und p16^INK4a spezifischen Antikörpern dreifach gefärbt werden. Die Ergebnisse zeigen, dass durch die Dreifachfärbung von Zellen mit Reagenzien, die für Ki-67/PCNA spezifisch sind ermöglicht wird, nichtdysplastische Zellen, die p16^INK4a überexprimieren von Dysplasien zu unterscheiden.
Beispiel 5: DURCHFLUSSZYTOMETRISCHER NACHWEIS VON DYSPLASTISCHEN ZELLEN DURCH GLEICHZEITIGEN NACHWEIS VON MCM5 MRNA, DES P14ARF PROTEINS UND KI67 PROTEINS IN ZELLEN ZERVIKALEN URSPRUNGS
Zytologische Proben (Zellsuspensionen in PBS, pH 7,4) des Gebärmutterhalses wurden fluoreszent mit für p14ARF und Ki-67 spezifischen Antikörpern und Oligosonden für MCM-5 gefärbt und wurden durch eine Dreifarben-Fluoreszenz-FACS Analyse ausgewertet.
Die Zellen wurden zentrifugiert, der Überschuss abgegossen und fixiert und mit 100 ml Permeafix (Ortho Diagnostic, Raitan, NJ, USA) eine Stunde bei Raumtemperatur permeabilisiert. Die Zellen wurden in sterilem PBS, pH 7,4 gewaschen, pelletiert und in 100 ml Permeafix eine Stunde bei Raumtemperatur resuspendiert. Die Zellen wurden in sterilem PBS, pH 7,4 gewaschen, pelletiert und in sterilem PBS resuspendiert. Sie wurden mit PE-konjungierten anti-p14ARF Antikörpern und PE-CY5-konjungierten anti-Ki-67 Antikörpern eine Stunde bei +4°C inkubiert. Die Zellen wurden in sterilem PBS gewaschen, durch Zentrifugation pelletiert und dann erneut zweimal in Standard-Saline-Citrat (SSC) gewaschen. Nach dem Zentrifugieren wurde das Zellpellet in Hybridisierungslösung (2 × SSC, 30% Formamid, beschallter Heringssperma DNA, Hefetransfer DNA), enthaltend 500 ng von 5-Carboxy-Fluorescein, doppelend-markierten, MCM5-spezifischen Olinukleotidsonden, resuspendiert. Die interzelluläre Hybridisierung wurde bei 42°C eine Stunde durchgeführt, gefolgt von aufeinanderfolgenden Waschungen in 2 × SSC, 0,5% Triton X-100 und 1 × SSC, 0,5% Triton X-100 bei 42°C. Die Zellen wurden für die Analyse in PBS, pH 8,3 resuspendiert und auf einem Durchflusszytometer (FACScan, Becton Dickinson, IS) analysiert. Für jede Analyse wurden 30.000 – 100.000 Schleusungsvorgänge aufgenommen. Die Datenanalyse wurde mit CellQuest (Becton Dickinson, IS) durchgeführt.
Die Durchflusszytometer Analyse zeigt, dass Zellen, die mit p14ARF und auch mit Ki-67 immunoreaktiv und/oder für Oligosonden von MCM5 reaktiv sind, nur in Proben von Patienten mit dysplastischen Zervixläsionen identifiziert werden konnten. Proben von Frauen ohne dysplastische Läsion zeigten keine gleichzeitige Färbung von p14ARF und Ki67 oder MCM5. Die Ergebnisse zeigen, dass durch die Doppel- oder Dreifachfärbung von Zellen mit Reagenzien, die für Ki67 und/oder MCM5 spezifisch sind, ermöglicht wird, p14ARF überexprimierende, nichtdysplastische Zellen von p14ARF überexprimierenden, dysplastischen Zellen zu unterscheiden.

Claims

Verfahren zur Unterscheidung dysplastischer Zellen, die INK4a Genprodukte überexprimieren, von anderen Zellen, die INK4a Genprodukte in einem nachweisbaren Level exprimieren, in biologischen Proben, umfassend die Bestimmung der Co-Expression von mindestens zwei Markermolekülen in mindestens einer einzelnen Zelle in einem zytologischen oder histologischen Testverfahren, wobei mindestens ein Markermolekül ein Expressionsprodukt ist, das durch INK4a Gene kodiert wird, und mindestens ein weiteres Markermolekül ein Zellproliferationsmarker ist, wobei die Überexpression von mindestens einem INK4a Genprodukt und die Expression von mindestens einem Marker für aktive Zellproliferation in einem nachweisbaren Level innerhalb besagter einzelner Zelle hinweisend für den dysplastischen Zustand der Zelle ist, und wobei die Überexpression von mindestens einem INK4a Genprodukt und die Expression von mindestens einem Marker für Seneszenz, terminale Zelldifferenzierung, Apoptose oder Zellzyklusarrest in einem nachweisbaren Level innerhalb besagter einzelner Zelle hinweisend für den nicht-dysplastischen Zustand der Zelle ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei ein Set von zwei oder mehreren Zellproliferationsmarkern nachgewiesen wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei mindestens ein INK4a Genprodukt ein molekulares Gewicht zwischen 13 und 19 kDa hat.
Verfahren gemäß der Ansprüche 1 bis 3, wobei mindestens ein INK4a Genprodukt aus einer Gruppe umfassend p16^INK4a und p14ARF ausgewählt ist.
Verfahren gemäß einem beliebigen der vorgehenden Ansprüche, wobei mindestens ein Zellproliferationsmarker aus einer Gruppe umfassend für die Aufrechterhaltung der Zellproliferation erforderliche Proliferationsmarker, an der DNA Replikation beteiligte Proliferationsmarker, Proliferationsmarker, die ein Mitglied der prozessiven Replikationsgabel sind oder diese kodieren, Seneszenzmarker, Zellzyklusarrestmarker und Apoptosemarker, ausgewählt ist.
Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei das Genprodukt, das für die Aufrechterhaltung der Zellproliferation erforderlich ist, ein Molekül ist, ausgewählt aus einer Gruppe umfassend Ki67 Moleküle, Ki-S5 Moleküle und Ki-S2 Moleküle.
Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei das Genprodukt, das an der DNA Replikation beteiligt ist, ausgewählt ist aus einer Gruppe umfassend Helikasen oder Untereinheiten davon, Zellteilungszyklusmoleküle (cdc), Phosphatasemoleküle und Kinasemoleküle.
Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei die Helikasen oder Untereinheiten davon ausgewählt sind aus einer Gruppe enthaltend MCM2, MCM3; MCM4, MCM5, MCM6, MCM7 und HELAD1.
Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei die cdc Moleküle, Kinasen und Phosphatasen ausgewählt sind aus einer Gruppe enthaltend CDC6, CDC7 Protein Kinase, Dbf4, CDC14 Proteinphosphatase, CDC45 und MCM10.
Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei die Moleküle, die an der prozessiven Replikationsgabel beteiligt sind, aus einer Gruppe umfassend PCNA und POLD ausgewählt sind.
Verfahren gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1–10, wobei das Genprodukt ein Polypeptid oder ein Nukleinsäuremolekül ist.
Verfahren gemäß einem beliebigen der vorgehenden Ansprüche, wobei zusätzlich mindestens ein weiteres Markermolekül zur Verbesserung der Diagnose- oder Prognosestellung nachgewiesen wird.
Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei das weitere Markermolekül mindestens ein weiteres Proliferationsmarkermolekül ist.
Verfahren gemäß Anspruch 12 oder 13, wobei das weitere Markermolekül ausgewählt ist aus einer Gruppe umfassend Seneszenzmarker, Apoptosemarker, Zellzyklusarrestmarker, Marker für terminate Zelldifferenzierung, Marker für virale Infektion, Marker für virale Aktivität, zellzyklusregulierende Proteine, für die Aufrechterhaltung von Zellproliferation erforderliche Genprodukte, an der DNA Replikation beteiligte Genprodukte, Genprodukte, die ein Teil der prozessiven Replikationsgabel sind.
Verfahren gemäß einem beliebigen der vorgehenden Ansprüche, wobei zusätzlich ein zytologisches Färbeverfahren unter Einsatz mindestens eines Farbstoffs ausgewählt aus einer Gruppe umfassend DAPI, Quinacrin, Chromomyzin, Azan, Acridin-Orange, Hematoxylin, Eosin, Sudan-Rot, Toluidin-Blau, und Thionin, oder eine Färbemethode ausgewählt aus einer Gruppe umfassend Pap-Färbung, Giemsa-Färbung, Hematoxylin-Eosin-Färbung, van-Gieson-Färbung, Schiff-Färbung, Färbung durch Metallpräzipitate, Turnbulls-Blau-Färbung und Färbung durch Metallzyanide angewendet wird.
Verfahren gemäß einem beliebigen der vorgehenden Ansprüche, wobei die dysplastischen Zellen Krebszellen oder Zellen einer Krebsvorstufe sind.
Verfahren gemäß Anspruch 16, wobei die dysplastischen Zellen Zellen einer Papillomvirus assoziierten Dysplasie sind.
Verfahren gemäß Anspruch 17, wobei das Papillomvirus ein Hochrisiko-HPV, ausgewählt aus einer Gruppe umfassend HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV56, HPV58, HPV59, HPV66 und HPV68 ist.
Verfahren gemäß einem beliebigen der Ansprüche 16 bis 18, wobei die Läsion aus einer Gruppe umfassend Läsionen des Anogenitaltraktes, Läsionen des Respirationstraktes und Läsionen der Haut und deren Anhangsgebilde ausgewählt ist.
Verfahren gemäß Anspruch 17 oder 19, wobei die Läsion aus einer Gruppe umfassend die Läsionen des Gebärmutterhalses, Läsionen der Vagina, Läsionen der Vulva, Läsionen des Penis, Läsionen des Anus, Läsionen des Rektum, Läsionen des Bronchialbaums, Läsionen der Lunge, Läsionen des Bauchfellraums, Läsionen des Hals-Nasenraums, Läsionen der Mundhöhle oder Läsionen der Haut ausgewählt wird.
Verfahren gemäß einem beliebigen vorgehenden Anspruch, wobei die biologische Probe eine Probe ist, die Zellen enthält, welche vom Anogenitaltrakt, vom Respirationstrakt oder von der Haut und deren Anhangsgebilden stammen.
Verfahren gemäß Anspruch 21, wobei die Zellen Zellen sind, die vom Gebärmutterhals, von der Vagina, der Vulva, dem Penis, dem Anus, dem Rektum, dem Bronchialbaum, der Lunge, dem Hals-Nasenraum, der Mundhöhle oder der Haut stammen.
Verfahren gemäß einem beliebigen der vorgehenden Ansprüche, wobei die biologische Probe ein zytologisches oder histologisches Präparat ist.
Verfahren gemäß einem beliebigen der vorgehenden Ansprüche, wobei der Nachweis der INK4a Genprodukte und/oder der Zellproliferationsmarkermoleküle mit mindestens einer Sonde durchgeführt wird, die mindestens eines der jeweiligen nachzuweisenden Moleküle erkennt.
Verfahren gemäß Anspruch 24, wobei mindestens eine Sonde eine nachweisbare Markierung trägt.
Verfahren gemäß Anspruch 25, wobei mindestens eine Markierung aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Radioisotopen, biolumineszenten Verbindungen, chemilumineszenten Verbindungen, fluoreszenten Verbindungen, Metallchelaten, oder Enzymen besteht.
Verfahren gemäß einem beliebigen der Ansprüche 24 bis 26, wobei mindestens eine Sonde ein Protein und/oder eine Nukleinsäure ist.
Verfahren gemäß Anspruch 27, wobei mindestens eine Sonde ein Antikörper ist, der gegen ein INK4a kodiertes Genprodukt oder ein Zellproliferationsmarker-Genprodukt gerichtet ist.
Verfahren gemäß Anspruch 28, welches ein immunozytochemisches Färbeverfahren umfasst.
Verfahren gemäß der Ansprüche 25 oder 26, wobei mindestens eine Sonde eine Nukleinsäure ist, die spezifisch an ein INK4a-Genprodukt oder ein Zellproliferationsmarker-Genprodukt hybridisiert.
Verfahren gemäß Anspruch 30, welches eine In-Situ Hybridisierungsreaktion umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 30, welches eine Nukleinsäureamplifikationsreaktion umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 32, wobei die Nukleinsäureamplifikationsreaktion PCR, NASBA oder LCR ist.
Verfahren gemäß einem beliebigen der vorgehenden Ansprüche, wobei Nachweisreaktionen mit Nukleinsäuresonden und Polypeptidsonden gleichzeitig durchgeführt werden.
Ein Kit zur Durchführung eines Verfahrens gemäß einem beliebigen der vorgehenden Ansprüche, welches ein diagnostisches Kit oder ein Forschungskit ist, umfassend mindestens eine oder mehrere Sonden zum Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit und/oder des Levels der Überexpression von mindestens einem INK4a Genprodukt und mindestens einem Zellproliferationsmarker-Genprodukt in biologischen Proben, wobei die Kitkomponenten so zur Verfügung gestellt werden, dass ein gleichzeitiger Nachweis von mindestens einem INK4a Genprodukt und mindestens einem Zellproliferationsmarker-Genprodukt in einer einzigen Zelle der Proben möglich ist, und wobei mindestens zwei unterscheidbare nachweisbare Signale erzeugt werden, mindestens ein nachweisbares Signal hinweisend für den Level der Expression von mindestens einem INK4a Genprodukt ist, und mindestens ein anderes nachweisbares Signal hinweisend für den Level der Expression von mindestens einem Zellproliferationsmarkergen ist.
Ein Kit gemäß Anspruch 35, wobei die INK4a Genprodukte aus einer Gruppe umfassend p16^INK4a und p14ARF ausgewählt sind.
Ein Kit gemäß der Ansprüche 35 oder 36, wobei die Zellproliferationsmarker-Genprodukte ausgewählt sind aus einer Gruppe enthaltend CDC6, MCM3, MCM3, MCM4, MCM5, MCM6, MCM7, CDC7 Proteinkinase, Dbf4, CDC14 Proteinphosphatase, CDC45 und MCM10, Ki67, Ki-S2, PCNA oder POLD.
Das Kit gemäß der Ansprüche 35 bis 37 weiterhin umfassend mindestens Eins der Folgenden: (a) eine p16^INK4a probe zur Durchführung einer positiven Kontrollreaktion (b) eine p14ARF Probe zur Durchführung einer positiven Kontrollreaktion (c) eine Ki67 Probe zur Durchführung einer positiven Kontrollreaktion (d) eine Ki-S2 Probe zur Durchführung einer positiven Kontrollreaktion (e) eine MCM5 Probe zur Durchführung einer positiven Kontrollreaktion (f) eine MCM2 Probe zur Durchführung einer positiven Kontrollreaktion (g) eine PCNA Probe zur Durchführung einer positiven Kontrollreaktion (h) Reagenzien zum Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit und/oder des Levels von p16INK4a (i) Reagenzien zum Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit und/oder des Levels von p14ARF (j) Reagenzien zum Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit und/oder des Levels von Ki67 (k) Reagenzien zum Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit und/oder des Levels von Ki-S2 (l) Reagenzien zum Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit und/oder des Levels von MCM5 (m) Reagenzien zum Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit und/oder des Levels von MCM2 (n) Reagenzien zum Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit und/oder des Levels von PCNA (o) eine oder mehrere Proben von INK4a Genprodukten zur Durchführung positiver Kontrollreaktionen (p) eine oder mehrere Proben von Zellproliferationsmarker-Genprodukten zur Durchführung positiver Kontrollreaktionen (q) eine oder mehrere Reagenzien zum Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit und/oder des Levels anderer INK4a Genprodukte (r) und eine oder mehrere Reagenzien zum Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit und/oder des Levels anderer Zellproliferationsmarker-Genprodukte.