DE60225699T2

DE60225699T2 - Nierenspezifischer urattransporter und dessen gen

Info

Publication number: DE60225699T2
Application number: DE60225699T
Authority: DE
Inventors: Hitoshi Sagamihara-shi ENDOU; Yoshikatsu Hachioji-shi KANAI; Atsushi Nishio-shi ENOMOTO
Original assignee: Human Cell Systems Inc
Current assignee: Human Cell Systems Inc
Priority date: 2001-09-21
Filing date: 2002-08-22
Publication date: 2009-04-23
Anticipated expiration: 2022-08-23
Also published as: CA2456172A1; EP1428880B1; US7510847B2; CA2456172C; HK1066241A1; US20040265819A1; US20070117162A1; JP3824899B2; EP1428880A4; ATE389720T1; EP1428880A1; DE60225699D1; WO2003027287A1; JP2003093067A; AU2002325545B2

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Gen, das am Transport von Harnsäure und deren Analoga oder am Austauschtransport von Harnsäure und einem anderen Anion teilhat, als auch ein Polypeptid, das durch das Gen codiert ist.
Hintergrund
Bei der menschlichen Rasse und bei Primaten ist Harnsäure, welche eine organische Säure ist, ein Endmetabolit im Purinstoffwechsel in Zellen, die hauptsächlich in der Niere ausgeschieden wird. Bei anderen Spezies als der menschlichen Rasse und den Primaten wird sie durch eine Wirkung von Uricase in der Leber zu Allantoin verstoffwechselt und in der Niere ausgeschieden. Daher scheint es bei den anderen Säugern so zu sein, dass die Auswirkungen einer dynamischen Abnormalität von Harnsäure, welche ein Zwischenprodukt in der Niere darstellt, auf den lebenden Körper gering sind. Der Verlust der Tätigkeit der Uricase im evolutionären Prozess scheint eine Ursache für die Tatsache zu sein, dass die menschliche Rasse seit Urzeiten aufgrund von Hyperurikämie an Gicht gelitten hat.
Beim Menschen entsteht, wenn eine verminderte Ausscheidung von Harnsäure in der Niere zu Hyperurikämie führt, mit hoher prozentualer Wahrscheinlichkeit eine Gicht, welche zu einem Risikofaktor für Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Bluthochdruck wird. Andererseits ist bekannt, dass ein Anstieg der Ausscheidung von Harnsäure in der Niere eine renale Hypourikämie verursacht. Obschon eine Abnormalität der Harnsäure-Kinetiken bei diesen Erkrankungen nicht offensichtlich ist, ist vorgeschlagen worden, dass Urattransporter in der Niere daran tief greifend beteiligt sind.
Die Harnsäure-Kinetiken in der Niere sind anhand von experimentellen Systemen unter Anwendung einer Perfusionsmethode an einem entnommenen Organ und ei nes Systems mit isolierten Zellmembranvesikeln untersucht worden. Beim Menschen ist nachgewiesen worden, dass Harnsäure frei durch den Nierenglomerulus passiert und daraufhin Mechanismen für die Reabsorption und Sekretion im proximalen Tubulus konvoluta greifen. Mittels der herkömmlichen Technik ist es jedoch schwierig gewesen, das Urattransportsystem über die Zellmembran im Detail zu analysieren, weshalb es wünschenswert geworden ist, den Transporter als solchen zu isolieren und zu analysieren.
Es ist bekannt, dass es einen bemerkenswerten Unterschied zwischen den Spezies hinsichtlich des Urattransports in der Niere gibt, und es Spezies gibt, bei denen die Sekretion dominant ist, wie etwa bei Schweinen und Kaninchen, und andere Spezies, bei denen die Reabsorption dominant ist, wie etwa bei Menschen, Ratten und Hunden. Von den Spezies mit Sekretionsdominanz scheidet das Schwein 200 bis 300% Harnsäure pro Einheit Nephron aus, wohingegen von den Spezies mit Harnsäure-Reabsorptionsdominanz der Mensch lediglich etwa 10% Harnsäure pro Einheit Nephron ausscheidet. Außerdem ist bekannt, dass die Reaktionen auf urikosurische (Harnsäureausscheidungs-)Beschleuniger und urikosurische Hemmer selbst unter den Spezies mit Reabsorptionsdominanz verschieden sind. Da demgemäß die Kinetiken der Harnsäure und die Reaktionen auf Wirkstoffe in der Niere in Abhängigkeit von den Spezies verschieden sind und die Harnsäure wechselseitig transportiert wird, ist es nicht einfach gewesen, eine molekulare Entität des Urattransporters zu isolieren, obschon dessen Existenz vorausgesetzt worden ist.
Unter den Urattransportern in der Niere sind die Transporter, die Harnsäure aus dem renalen tubulären Lumen reabsorbieren, bereits seit langem mittels eines experimentellen Systems unter Anwendung des Systems mit isolierten Zellmembranvesikeln untersucht worden. Für die Arzneimittel, die derzeit bei Patienten mit Hyperurikämie und Gicht eingesetzt werden, wird vorausgesetzt, dass der Transporter, welcher Harnsäure in der Niere reabsorbiert, gehemmt wird. Außerdem wird vorausgesagt, dass eine renale Hypourikämie durch eine genetische Abweichung dieses Transporters verursacht wird.
Vor kurzem ist in mehreren Experimenten gezeigt worden, dass die Transporter, die an der Reabsorption von Harnsäure beteiligt sind, Austauschtransporter von Harnsäure und verschiedenen Anionen sind. Von Pyrazinamid, das derzeit als der First-Line-Drug von den antituberkulösen Wirkstoffen eingesetzt wird, ist gezeigt worden, dass Pyrazincarboxylat, welches der Metabolit von Pyrazinamid ist, ein Austauschsubstrat dieses Austauschtransporters ist und die Reabsorption von Harnsäure erleichtert. Dies wird für die Ursache einer Hyperurikämie gehalten, die häufig bei den Patienten beobachtet wird, die den antituberkulösen Wirkstoff einnehmen.
Entsprechend wird von dem Transporter, der an der Reabsorption von Harnsäure in der Niere beteiligt ist, angenommen, dass er eine wichtige Rolle für die internen Kinetiken der Harnsäure spielt. Es ist vorausgesetzt worden, dass die Aufklärung seiner molekularen Entität zur Erhellung des Wirkmechanismus von urikosurischen Beschleunigern und der Ursache von renaler Hypourikämie, und somit zur Entwicklung neuer heilender Medikamente für Gicht, führt.
Wir haben zuvor organische Anionentransporter isoliert und darüber berichtet, nämlich OAT1 (organischer Anionentransporter) (Sekine, T. et al., J. Biol. Chem., 272:18526–18529, 1997), OAT2 (Sekine, T. et al., FEBS Letter, 429:179–182, 1998), OAT3 (Kusuhara, H. et al., J. Biol. Chem., 274:13675–13680, 1999) und OAT4 (Cha, S. H. et al., J. Biol. Chem., 275:4507–4512, 2000), die zentrale Rollen im Medikamententransport in der Niere, Leber, Gehirn, Plazenta und so weiter spielen. Diese Transporter, die zur OAT-Familie zählen, stellen jene Transporter dar, die zum Transportieren vieler organischer Anionen mit unterschiedlichen chemischen Strukturen fähig sind und die auch den Transport verschiedener anionischer Medikamente vornehmen.
WO 01/62923 beschreibt humane Transporter und Ionenkanäle (TRICH) und Polynukleotide, die TRICH identifizieren und codieren.
Roch-Ramel et al. (1994) American Journal of Physiology 266, F797–F805, beschreibt den Urattransport in der Brush-Border-Membran der menschlichen Niere.
Enomoto et al (2002) Nature 417, 447–52, beschreibt die molekulare Identifizierung eines renalen Urat-Anionenaustauschers, der die Uratspiegel im Blut reguliert.
Lipkowitz et al. (2001) Journal of Clinical Investigation 107, 1103–15, beschreibt die funktionelle Rekonstitution, das Membran-Targeting, die genomische Struktur und die chromosomale Lokalisation eines humanen Urattransporters.
Es war nicht offensichtlich, ob der Urattransporter zu der bekannten Transporterfamilie zählt, doch da Harnsäure eine dibasische Säure sowohl mit Pyrimidinstruktur als auch Imidazolstruktur ist und eines der organischen Anionen ist, wurde die Möglichkeit, dass der Urattransporter phylogenetisch zu der OAT-Familie zählt, vorausgesetzt. Innerhalb der OAT-Familie ist außerdem vorausgesetzt worden, dass, da OAT4 auf der Seite des renalen tubulären Lumens in der Niere vorliegt und das Vorhandensein des Transporters, der an der Reabsorption von Harnsäure beteiligt ist, ebenfalls auf der Seite des renalen tubulären Lumens angenommen wird, der Transporter dem OAT4 phylogenetisch ähnlich ist.
Aus diesen Tatsachen haben wir angenommen, dass der Urattransporter in der Niere zu der organischen Ionentransporter-Familie gehört.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung stellt eine Methode zum Nachweisen der Wirkung einer Substanz eines Subjekts bereit, umfassend das Kontaktieren der Substanz mit einem Protein und das Bestimmen, ob die Substanz den Transport von Harnsäure durch das Protein beeinflusst, wobei das Protein umfasst

(i) die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID NR. 2 oder
(ii) eine Aminosäuresequenz, die davon durch Deletion, Substitution oder Addition von 1 bis 110 Aminosäuren abgeleitet ist, oder
(iii) eine Aminosäuresequenz mit wenigstens 75% Homologie zu SEQ ID Nr. 2, und worin das Protein zum Transportieren von Harnsäure fähig ist.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die Ergebnisse der Analyse der Expression der Messenger-RNA des URAT1-Gens in verschiedenen organischen Geweben eines erwachsenen Menschen und eines Embryos mittels Northern Blotting.
2 zeigt das Ergebnis der Zeitabhängigkeit bei Harnsäureaufnahme-Experimenten durch Oozyten, die mit der cRNA des URAT1-Gens injiziert sind.
3 zeigt die Ergebnisse der Konzentrationsabhängigkeit bei Harnsäureaufnahme-Experimenten durch Oozyten, die mit der cRNA des URAT1-Gens injiziert sind.
4 zeigt die Ergebnisse der Untersuchung der Wirkungen von zugesetzten Salzen bei Harnsäureaufnahme-Experimenten anhand von Oozyten, die mit der cRNA des URAT1-Gens injiziert sind.
5 zeigt die Ergebnisse der pH-Abhängigkeit bei Harnsäureaufnahme-Experimenten anhand von Oozyten, die mit der cRNA des URAT1-Gens injiziert sind.
6 zeigt die Ergebnisse der Vorinkubation mit verschiedenen organischen Säuren bei Harnsäureaufnahme-Experimenten anhand von Oozyten, die mit der cRNA des URAT1-Gens injiziert sind.
7 zeigt das Ergebnis der Untersuchung der Auswirkung von vorab injizierter unmarkierter Milchsäure (100 mM, 10 nl) bei Harnsäureaufnahme-Experimenten anhand von Oozyten, die mit der cRNA des URAT1-Gens injiziert sind.
8 zeigt das Ergebnis der Untersuchung der Auswirkungen der Zugabe von verschiedenen organischen Säuren oder analogen Verbindungen davon zu dem System bei Harnsäureaufnahme-Experimenten anhand von Oozyten, die mit der cRNA des URAT1-Gens injiziert sind.
9 zeigt das Ergebnis der Untersuchung der Auswirkungen der Zugabe von Probenecid bei verschiedenen Konzentrationen zu dem System bei Harnsäureaufnahme-Experimenten anhand von Oozyten, die mit der cRNA des URAT1-Gens injiziert sind.
10 zeigt das Ergebnis der Untersuchung der Auswirkungen der Zugabe von Losartan bei verschiedenen Konzentrationen zu dem System bei Harnsäureaufnahme-Experimenten anhand von Oozyten, die mit der cRNA des URAT1-Gens injiziert sind.
11 zeigt die Exon-Intron-Struktur des URAT1-Gens im humanen Genom.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Wie oben beschrieben, isolierten die vorliegenden Erfinder vier organische Anionentransporter, OAT1, OAT2, OAT3 und OAT4. Sie weisen etwa 40% Homologie der Aminosäuresequenzen zueinander auf. Basierend auf diesen Sequenzen wurde die offengelegte Information des humanen Genomprojekts durchsucht und wurden vielfache neue Genfragmente mit einer Homologie zu OAT1, 2, 3 und 4 identifiziert. Aus diesen wurde ein neues Genfragment, das einer Genlocus-Position von OAT4 extrem nahe kommt, und eine Stelle, die ein Initiationscodon sein müsste, identifiziert. Ein Primer, der für die 5' Stromaufwärts-Region dieses Initiationscodons spezifisch ist, wurde hergestellt, und die Isolierung dieses neuen Gens wurde mittels der 3'-RACE-(3-Schnellamplifikation der cDNA-Enden)-Methode unter Verwendung von Messenger-RNA, die von verschiedenen Geweben des Menschen stammte, angestrebt. Als ein Ergebnis wurde ein neuer Klon (URAT1), der nie zuvor berichtet worden ist, mittels der 3'-RACE-Methode unter Verwendung von Messenger-RNA der menschlichen Niere identifiziert.
Der Urattransporter 1, URAT1, der vorliegenden Erfindung weist die Fähigkeit zum Transportieren von Harnsäure und ihren Analoga durch die Zellmembran von einer Seite zu der anderen Seite auf und ist außerdem ein URAT/Anion-Austauscher, indem er das Anion auf der anderen Seite der Zellmembran zu einem Austauschsubstrat macht.
Das Protein der vorliegenden Erfindung umfasst zum Beispiel solche mit einer Aminosäuresequenz, in der ein oder mehrere Aminosäuren deletiert, substituiert oder addiert sind in der Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID Nr. 1 dargestellt ist, und darüber hinaus eines mit der Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID Nr. 1 dargestellt ist. Die Aminosäuren könnten bis zu einem Umfang deletiert, substituiert oder addiert sein, bei dem die Urattransport-Aktivität nicht verloren geht, was typischerweise von 1 bis etwa 110 und vorzugsweise von 1 bis etwa 55 Aminosäuren umfasst. Solche Proteine weisen typischerweise bis zu 75% und vorzugsweise bis zu 90% homolo ge Aminosäuresequenzen zu der Aminosäuresequenz auf, die durch SEQ ID Nr. 1 dargestellt ist.
Bei der vorliegenden Erfindung kann die Isolierung des Gens mittels der 3'-RACE-Methode vorgenommen werden, indem typischerweise ein Primer aus etwa 30 Basen, die für ein Guanin- oder Cytosin-reiches Gen spezifisch sind, im 5'-Stromaufwärts des Initiationscodons hergestellt wird, eine reverse Transkription der von Gewebe stammenden Messenger-RNA unter Verwendung eines Oligo-dT-Primers mit einer Adaptorsequenz vorgenommen wird und anschließend eine PCR (Polymerase-Kettenreaktion) unter Verwendung der Adaptorsequenz und des Genspezifischen Primers durchgeführt wird. Es ist möglich, die Akkuratheit der PCR durch die Verwendung einer hitzeresistenten Polymerase mit höherer Genauigkeit weiter zu steigern.
Das URAT-Transportergen der vorliegenden Erfindung kann isoliert und erhalten werden durch Screening einer cDNA-Bibliothek, die unter Verwendung von Nierengeweben oder Zellen in einem geeigneten Säuger als einer Genquelle präpariert ist. Zu den Säugern zählt der Mensch, und außerdem nicht-menschliche Tiere wie ein Hund, Rind, Pferd, Ziege, Schaf, Affe, Schwein, Kaninchen, Ratte und Maus.
Das Screening und die Isolierung des Gens kann in geeigneter Weise mittels eines Homologie-Screenings und der PCR-Methode vorgenommen werden.
Für die resultierende cDNA ist es möglich, die Basensequenz mittels der herkömmlichen Methode zu bestimmen, die Translationsregion zu analysieren und die Aminosäuresequenz des Proteins, das dadurch, d. h. URAT1, codiert ist, zu bestimmen.
Es kann zum Beispiel anhand der folgenden Methode verifiziert werden, bei der das erhaltene Gen die cDNA des URAT-Transportergens ist, d. h. bei der ein Genprodukt, das durch die cDNA codiert ist, der Urattransporter ist. Die Fähigkeit zum Transport (Aufnahme) von Harnsäure in Zellen kann durch Einführen von cRNA (komplementäre RNA), die aus der erhaltenen URAT1 cDNA präpariert ist, in eine Oozyte zum Exprimieren und Messen der Aufnahme eines Substrats in die Zellen mittels des her kömmlichen Aufnahmeexperiments unter Verwendung von Harnsäure als dem Substrat bestätigt werden (Sekine, T. et al., Biochem. Biophis. Res. Commun., 251:586–591, 1998).
Auch kann die Transporteigenschaft und Substratspezifität von URAT1 durch Anwenden eines ähnlichen Aufnahmeexperiments auf exprimierende Zellen untersucht werden.
Weiterhin kann die Eigenschaft von URAT1, zum Beispiel die Eigenschaft, dass URAT1 den Transport bei Zeitabhängigkeit, Substratselektivität und pH-Abhängigkeit des URAT1 vornimmt, untersucht werden, indem ein ähnliches Aufnahmeexperiment bei den exprimierenden Zellen angewendet wird.
Homologe Gene und chromosomale Gene, die von den verschiedenen Geweben oder verschiedenen Organismen abgeleitet sind, können durch Screening geeigneter cDNA-Bibliotheken oder genomischer DNA-Bibliotheken isoliert werden, die aus den verschiedenen Genquellen unter Verwendung der cDNA des erhaltenen URAT1-Gens hergestellt wurden.
Auch kann das Gen aus der cDNA-Bibliothek mittels der herkömmlichen PCR-Methode unter Verwendung synthetischer Primer isoliert werden, die auf der Grundlage der Information zu der beschriebenen Basensequenz des Gens der vorliegenden Erfindung entworfen sind (der Basensequenz, dargestellt durch SEQ ID Nr. 1 oder einem Teil davon).
Die DNA-Bibliotheken, wie etwa eine cDNA-Bibliothek und genomische DNA-Bibliothek, können mittels der Methoden hergestellt werden, die beschrieben sind zum Beispiel bei "Sambrook, J., Fritsch E. F. und Maniatis, T., "Molecular Cloning" (veröffentlicht bei Cold Spring Harbor Laborstory Press, 1989)". Alternativ kann, wenn eine kommerziell verfügbare Bibliothek existiert, diese verwendet werden.
Um die Struktur des URAT1-Gens auf dem humanen Genom zu erhalten, wird die genomische DNA-Bibliothek unter Verwendung der erhaltenen cDNA des URAT1- Gens gescreent, und die erhaltenen Klone werden analysiert. Alternativ kann die Struktur auf der Grundlage der offengelegten Information zu den Ergebnissen der humanen Genomanalyse unter Verwendung eines Homologie-Suchprogramms gesucht werden.
Der Urattransporter (URAT1) der vorliegenden Erfindung kann mittels einer genetischen Rekombinationstechnologie unter Verwendung der cDNA, die den Urattransporter codiert, produziert werden. Zum Beispiel ist es möglich, eine DNA (cDNA etc.), die den Urattransporter codiert, in einen geeigneten Expressionsvektor zu inkorporieren und die resultierende rekombinierte DNA in entsprechende Wirtszellen einzuführen. Expressionssysteme (Wirtsvektorsystem) zur Erzeugung des Polypeptids umfassen die Expressionssysteme von Bakterien, Hefen, Insektenzellen und Säugerzellen. Um das funktionelle Protein zu erhalten, ist aus diesen die Verwendung der Insektenzellen und der Säugerzellen erwünscht.
Wird das Polypeptid zum Beispiel in den Säugerzellen exprimiert, so wird ein Expressionsvektor durch Einführen von DNA konstruiert, die den Urattransporter im Stromabwärts eines entsprechenden Promotors (z. B. SV40 Promotor, LTR Promotor, Elongations-1α-Promotor und ähnliches) in einem geeigneten Expressionsvektor (z. B. retroviraler Vektor), Papillomavirus-Vektor, Vaccinia-Virus-Vektor, SV40-Vektor und ähnliches) codiert. Als nächstes wird das Zielpolypeptid durch Transformieren entsprechender Tierzellen mit dem erhaltenen Expressionsvektor und Kultivieren der Transformanten in einem entsprechenden Medium erzeugt. Die Säugerzellen als den Wirten umfassen Zelllinien, wie Affen-COS-7-Zellen, Chinesischer Hamster CHO-Zellen, humane HeLa-Zellen und Primärkulturzellen, die von Nierengeweben abgeleitet sind, LLC-PK1-Zellen, die von der Schweineniere abgeleitet sind, OK-Zellen, die von der Beutelrattenniere abgeleitet sind, und S1-, S2- und S3-Zellen des proximalem Tubulus konvoluta, die von der Maus stammen.
Als der cDNA, die den Urattransporter URAT1 codiert, ist die Verwendung der cDNA mit der in Sequenz 1 gezeigten Basensequenz möglich, und außerdem ist das Designing einer DNA entsprechend der Aminosäuresequenz und die Verwendung der DNA, die das Polypeptid codiert, möglich, so dass keine Beschränkung auf die obige cDNA besteht. In diesem Falle sind 1 bis 6 Codons, die eine Aminosäure codieren, bekannt, und das verwendete Codon kann optional ausgewählt werden, doch ist das Designing einer Sequenz mit einer hohen Expression unter Berücksichtigung der Nutzung der Codonfrequenz in dem für die Expression verwendeten Wirt möglich. Die DNA mit der entworfenen Sequenz kann durch chemische Synthese der DNA, Fragmentierung und Bindung der obigen cDNA, partielle Modifikation der Basensequenz und ähnliches erhalten werden. Die künstliche partielle Modifikation und Mutagenese kann durch ortsspezifische Mutagenese-Methoden (Mark, D. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 18:5662–5666, 1984) unter Verwendung von Primern, einschließlich synthetischer Oligonukleotide, die die gewünschte Modifikation codieren, vorgenommen werden.
Die Nukleotide (Oligonukleotide oder Polynukleotide), die mit dem Urattransportergen der vorliegenden Erfindung unter einer stringenten Bedingung hybridisieren, können als Sonden zum Nachweis des Urattransportergens verwendet werden, und können außerdem zum Beispiel als Antisense-Oligonukleotide, Ribozyme und Decoys, um die Expression des Urattransporters zu modulieren, verwendet werden. Als solch ein Nukleotid ist zum Beispiel die Verwendung von Nukleotiden möglich, die typischerweise eine Teilsequenz von 14 oder mehr aufeinander folgenden Basen oder die komplementäre Sequenz dazu in der durch SEQ ID Nr. 1 dargestellten Basensequenz umfassen. Um die Hybridisation spezifischer zu machen, kann als der partiellen Sequenz eine längere Sequenz, z. B. eine Sequenz von 20 oder mehr Basen oder 30 oder mehr Basen, verwendet werden.
Auch ist zur Verwendung des Urattransporters der vorliegenden Erfindung oder des Polypeptids mit immunologischer Äquivalenz dazu der Erhalt von Antikörpern dazu möglich, wobei die Antikörper für den Nachweis und die Reinigung des Urattransporters genützt werden können. Der Antikörper kann unter Verwendung des Urattransporters der Erfindung, eines Fragments davon oder eines synthetischen Peptids mit der Teilsequenz davon und ähnliches als einem Antigen produziert werden. Der polyklonale Antikörper kann mittels der herkömmlichen Methode produziert werden, bei der das Antigen in das Wirtstier (z. B. Ratte oder Kaninchen) geimpft wird und das immunisierte Serum entnommen wird, und der monoklonale Antikörper kann mittels der herkömmlichen Technologie, wie etwa einer Hybridommethode, produziert werden.
Außerdem stellt die vorliegende Erfindung eine Screening-Methode einer Substanz mit urikosurisch beschleunigender Wirkung bereit. Das Protein der Erfindung dient zum Transport von Harnsäure in die Zellen und ist an der Reabsorption der Harnsäure tiefgreifend beteiligt. Wie in 6, 8, 9 und 10 gezeigt, ist es auch möglich, die Beschleunigung oder Hemmung der Wirkung für die Harnsäure-Aufnahme der Screening-Substanz in dem System zu quantifizieren, wobei das Protein der Erfindung durch Zugeben von Harnsäure zu dem System, weiterhin Hinzufügen der Screening-Substanz dazu und Vergleichen einer Harnsäure-Aufnahmemenge mit der in dem Falle ohne Zugabe der Screening-Substanz exprimiert wird. Wie in 6 und 8 gezeigt ist, haben die klinisch als urikosurische Beschleuniger verwendeten Substanzen die Aufnahme von Harnsäure in dem obigen experimentellen System deutlich gehemmt, womit gezeigt ist, dass das Screening der urikosurisch beschleunigenden Wirkung der Screening-Substanz in diesem System möglich geworden ist. Als den in diesem Screening-System verwendeten Zellen sind diese Zellen nicht auf die in den folgenden Experimenten verwendeten Oozyten beschränkt, und die Verwendung verschiedener lebender Zellen ist möglich, solange die Zellen das Protein der Erfindung exprimieren können.
Daher stellt die vorliegende Erfindung die Methode zum Durchmustern von Substanzen mit urikosurisch regulierender Wirkung unter Verwendung des Proteins der Erfindung bereit. Die urikosurisch regulierenden Wirkungen bestehen in der urikosurisch beschleunigenden Wirkung und der urikosurisch hemmenden Wirkung, wobei jene mit der urikosurisch beschleunigenden Wirkung für die Behandlung/Verhütung von Hyperurikämie und Gicht bevorzugt sind. Somit umfasst die bevorzugte urikosurisch regulierende Wirkung die urikosurisch beschleunigende Wirkung. Darüber hinaus stellt die vorliegende Erfindung urikosurische Regulatoren bereit, die mittels der obigen Screeningmethode gescreent werden. Der bevorzugte Harnsäure-Regulator umfasst einen urikosurischen Beschleuniger. Der mittels der Methode der Erfindung gescreente urikosurische Regulator kann die Aufnahme von Harnsäure durch den Urattransporter regulieren, der an dem Urattransport in die Niere beteiligt ist, und kann daher als ein aktiver Inhaltsstoff der Medikament für die Behandlung/Verhütung verschiedener Erkrankungen verwendet werden, die mit der Reabsorption von Harnsäure in Verbindung stehen, wie etwa Hyperurikämie und Gicht.
Es ist möglich, den erhaltenen aktiven Inhaltsstoff zu einer pharmazeutischen Zusammensetzung unter Verwendung eines pharmakologisch akzeptablen Trägers zu formulieren.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird anhand der nachstehenden Beispiele in größerer Ausführlichkeit beschrieben werden, wobei diese Beispiele aber die Erfindung nicht beschränken.
In den folgenden Beispielen wurden, sofern nicht anderweitig spezifiziert, die jeweiligen Manipulationen mittels der Methoden vorgenommen, die beschrieben sind bei "Sambrook, J., Fritsch E: F., und Maniatis, T., "Molecular Cloning" (veröffentlicht von Cold Spring Harbor Laborstory Press, 1989)", bzw. wurden, bei Verwendung von handelsüblichen Kits, diese gemäß den Anleitungen der kommerziell beziehbaren Artikel verwendet.
Beispiel 1: Isolierung der Nieren-spezifischen Urattransporter-(URAT1)-cDNA und deren Analyse
Auf der Grundlage der Basensequenz-Information von OAT1, OAT2, OAT3 und OAT4, die durch die vorliegenden Erfinder bereits isoliert wurden, wurden die offengelegten Analyseergebnisse des humanen Genomprojekts unter Verwendung des Homologie-Suchprogramms durchsucht. Als ein Ergebnis wurden vielfache neue Genfragmente mit Homologie zu OAT1, OAT2, OAT3 und OAT4 erhalten. Unter diesen wurde eines der neuen Genfragmente, das einer Genlocus-Position von OAT4 extrem nahe kommt, analysiert, und die Stelle, die das Initiationscodon sein müsste, wurde darin identifiziert. Dieses Initiationscodon wurde durch Vergleichen der neuen Genfragmente mit den Gensequenzen von OAT1 und OAT4 identifiziert.
Ein für die 5' Stromaufwärts-Region des vorhergesagten Initiationscodons spezifischer Primer wurde unter Verwendung von 28 Basen hergestellt, und die Isolierung dieses neuen Gens wurde mittels der 3'-RACE-(3'-Schnellamplifikation der cDNA-Enden)-Methode unter Verwendung von Messenger-RNA, die von verschiedenen Geweben des Menschen stammte, angestrebt. Als ein Ergebnis wurde ein Monoklon (URAT1) mittels der 3'-RACE-Methode unter Verwendung von Messenger-RNA der menschlichen Niere erhalten. Eine mittels der PCR-Methode erhaltene einzelne Bande wurde in den pCRII-TOPO-Vektor unter Anwendung einer TA-Kloniermethode subkloniert, und wurde weiter in den pcDNA 3.1(+)-Vektor subkloniert, welcher der Expressionsvektor war. Als ein Ergebnis wurde eine neue cDNA (URAT1 cDNA), die eine Urattransport-Aktivität aufweist, erhalten (für die Analyse der Transportfunktion siehe das Folgende).
Die Bestimmung der Basensequenz der cDNA (URAT1 cDNA), die anhand des obigen erhalten wurde, wurde unter Verwendung spezifischer Primer mittels eines automatischen Sequenzierers (hergestellt von Applied Biosystems) durchgeführt (beschrieben in SEQ ID Nr. 1).
Die Expression des URAT1-Gens wurde in verschiedenen Geweben des Menschen analysiert (Northern Blotting) (1). Volllängen-URAT1-cDNA wurde mit ³²P-dCTP markiert, und unter Verwendung dieser als einer Sonde wurde die Hybridisation unter Verwendung von Filtern (hergestellt von Clontech) unter Aufblotten von RNA, die aus verschiedenen menschlichen Geweben extrahiert war, durchgeführt. Die Hybridisation wurde über Nacht in einer Hybridisationslösung vorgenommen, die die markierte Volllängen-URAT1-cDNA umfasst, und die Filter wurden mit 0,1 × SSC, umfassend 0,1% SDS bei 65°C, gewaschen. Als ein Ergebnis des Northern Blotting wurde eine intensive Bande in dem Nierengewebe detektiert. In humanen embryonalen Geweben wurde die Bande in der Niere detektiert.
Beispiel 2: Analyse der Urattransporter-Funktionen
Aus einem Plasmid, umfassend URAT1 cDNA, wurde die cRNA (die zu der cDNA komplementäre RNA) in vitro unter Verwendung von T7 RNA Polymerase präpariert (siehe Sekine, T., et al., J. Biol. Chem., 272:18526–18529, 1997).
Die resultierende cRNA wurde in Oozyten des Krallenfroschs (Platanna) injiziert, und Aufnahme-Experimente der radiomarkierten Harnsäure in diese Oozyten wurden gemäß der bereits berichteten Methode durchgeführt (Sekine, T., et al., J. Biol. Chem., 272:18526–18529, 1997). Als ein Ergebnis wurde festgestellt, dass die Oozyten, in denen URAT1 exprimiert wurde, die Aufnahme von [¹⁴C]Harnsäure zeigten, wie in 2 gezeigt. Die Oozyten, in denen URAT1 exprimiert wurde, zeigten eine Zeitabhängigkeit in der Aufnahme der [¹⁴C]Harnsäure. Dies zeigte an, dass URAT1 nicht nur an Harnsäure gebunden wurde, sondern auch der Transporter war, um diese in die Zellen zu transportieren. Keine Aufnahme von [¹⁴C]PAH (Para-Aminohippursäure) und [¹⁴C]TEA (Tetraethylammonium), die ein repräsentatives Substrat der organischen Ionentransporter-Familie sind, wurde beobachtet (nicht gezeigt).
Ein dynamisches Michaelis-Menten-Experiment des Urattransports durch URAT1 wurde durchgeführt. Die Konzentrationsabhängigkeit der Harnsäure in dem Transport durch URAT1 wurde durch Untersuchen der veränderten Aufnahmemengen an Harnsäure bei verschiedenen Konzentrationen durch URAT1 untersucht. Das Aufnahme-Experiment der radiomarkierten Harnsäure wurde unter Verwendung von Oozyten durchgeführt, die mit URAT1 cRNA gemäß der oben beschriebenen Methode injiziert waren. Als ein Ergebnis (3) betrug der Km-Wert (Michaelis-Konstantzahl) der Harnsäure-Aufnahme etwa 372 ± 25 μM.
Die Wirkung der verschiedenen Elektrolyte auf den Urattransport durch URAT1 wurde untersucht (4). Wurde extrazelluläres Natrium durch Lithium, Cholin und N-Methyl-D-glucamin (NMDG) ersetzt, so war der Urattransport über URAT1 nicht verändert. Es wurde gezeigt, dass URAT1 der extrazelluläre Natrium-unabhängige Urattransporter war. Wurden extrazelluläre Kaliumionen vollständig durch Natrium ersetzt (0-K+ in 4) und wurde Natrium vollständig durch die Kaliumionen ersetzt (96 mM KCl), so war der Urattransport nicht ebenfalls verändert, was nachwies, dass URAT1 Zellmembranpotential-unabhängig war. Wurden extrazelluläre Chloridionen durch Gluconsäure ersetzt, so war die Aufnahme von Harnsäure signifikant erhöht. Aus dem experimentellen System unter Anwendung des Systems mit isolierten Zellmembranvesikeln wurde das Vorhandensein des Austauschers von Harnsäure und Chlorid auf der Seite des renalen tubulären Lumens in der menschlichen Niere gezeigt. Somit legt dieses experimentelle Ergebnis nahe, dass Chlorid das Austauschsubstrat von Harnsäure sein könnte.
Die pH-Abhängigkeit im Urattransport durch URAT1 wurde untersucht. Wie in 5 gezeigt, war, wenn der extrazelluläre pH angesäuert war, der Urattransport in der mit URAT1 cRNA injizierten Oozyte erhöht, doch scheint dies durch eine nichtspezifische Absorption von Harnsäure bei den mit Wasser injizierten Oozyten (Kontrolle) bewirkt zu sein. Der substantielle Urattransport (URAT1-Kontrolle) war in Abhängigkeit vom pH-Wert nicht verändert.
Beispiel 3: Untersuchung zum Austauschsubstrat von Harnsäure im Urattransporter
Ausgehend von dem experimentellen System unter Anwendung des Systems mit isolierten Zellmembranvesikeln wurde vorgeschlagen, dass Monocarboxylsäuren wie Milchsäure und Nikotinsäure das Austauschsubstrat von Harnsäure in dem Harnsäure/Anionenaustausch in der humanen Niere sein könnten. Um das Austauschsubstrat von Harnsäure in URAT1 zu untersuchen, wurden die Oozyten mit diesen Monocarboxylsäuren (1 mM), Para-Aminohippursäure und Ketoglutarsäure, vorinkubiert und anschließend der Transport der Harnsäure gemessen (6). Wurden die Oozyten mit 1 mM Pyrazincarboxylsäure und Nikotinsäure (3-Pyridincarboxylsäure) vorinkubiert, so war die Aufnahme von Harnsäure in den mit URAT1 cRNA injizierten Oozyten signifikant erhöht. Wurden die Oozyten dagegen mit Para-Aminohippursäure und Ketoglutarsäure vorinkubiert, die keine Monocarboxylsäuren sind, so war die Aufnahme von Harnsäure nicht erleichtert. Die obigen Ergebnisse zeigen, dass Monocarboxylsäuren wie Pyrazincarboxylsäure und Nikotinsäure das Austauschsubstrat von Harnsäure sind.
Wie in 6 war, wenn die Oozyten mit Milchsäure, die eine Monocarboxylsäure ist, vorinkubiert waren, die Aufnahme von Harnsäure nicht erleichtert. Es wurde angenommen, dass dies deshalb eintrat, weil die aufgenommene Milchsäure aus den Zellen heraus über einen anderen Weg als über URAT1 aufgrund der reichlichen Expression von endogenen Laktattransportern in den Oozyten transportiert wurde. Ebenso wurde angenommen, dass die geringe Affinität von Milchsäure zu URAT1, wie unten gezeigt, ebenfalls eine der Ursachen war. Daher wurden 100 nl an 100 mM nicht-radiomarkierter L-Milchsäure vorab in die Oozyten injiziert und daraufhin die Aufnahme der radiomarkierten Harnsäure beobachtet (7). Wurde Milchsäure vorab injiziert, so wurde eine signifikant hohe Aufnahme an Harnsäure im Vergleich zu dem Falle beobachtet, bei dem Wasser injiziert wurde. Selbst wenn Para-Aminohippursäure und Ketoglutarsäure injiziert wurden, wurde keine Veränderung im Vergleich zu dem Falle beobachtet, bei dem Wasser injiziert wurde (nicht gezeigt).
Aus den Ergebnissen in 6 und 7 ist URAT1 der Austauscher von Harnsäure und Monocarboxylsäure. Pyrazinamid, welches ein antituberkulöser Arzneistoff ist, wird zu Pyrazincarboxylsäure metabolisiert, welche dann in den Harn ausgeschieden wird, wobei es behauptetermaßen die Reabsorption von Harnsäure erleichtert. Das obige Ergebnis zeigt, dass als einer Folge des Austauschs von Harnsäure und Pyrazincarboxylsäure in URAT1 die Aufnahme von Harnsäure erleichtert ist. Demgemäß wurde der Mechanismus in der Verursachung einer Hyperurikämie nachgewiesen, bei welcher es sich um eine Nebenwirkung von Pyrazinamid handelt, das ein antituberkulöser Arzneistoff ist.
Beispiel 4: Durchmusterung auf die inhibitorische Substanz für den Urattransporter
Um die Substratselektivität von URAT1 in dem Aufnahme-Experimentsystem der [¹⁴C]Harnsäure durch die Oozyten, die mit URAT1 cRNA injiziert waren, weiter zu untersuchen, wurden dem System verschiedene Substanzen zugegeben und wurden ihre Wirkungen untersucht (inhibitorische Experimente). Das Aufnahme-Experiment von [¹⁴C]Harnsäure wurde unter Verwendung von Oozyten, die mit URAT1 cRNA injiziert waren, gemäß der oben beschriebenen Methode durchgeführt (8, 9 und 10). Die Aufnahme von 50 μM [¹⁴C]Harnsäure wurde unter der Bedingung von pH 7,4 in der Gegenwart und Abwesenheit der verschiedenen Verbindungen (unmarkiert) bei den in 8 gezeigten Konzentrationen gemessen. Als ein Ergebnis hemmten verschiedene Monocarboxylsäuren (L-Milchsäure, D-Milchsäure, Nikotinsäure, Pyrazincarboxylsäure) den Transport von [¹⁴C]Harnsäure durch URAT1 signifikant (8). Ketoglutarsäure, welches eine Dicarboxylsäure ist und welche das Austauschsubstrat von OAT1 sein könnte, hemmte unter der Bedingung von pH 7,4 nicht. Pyrazindicarboxylsäure, welche eine ähnliche Struktur zu Pyrazincarboxylsäure aufweist, zeigte eine etwas schwacher inhibierende Wirkung. Anionische und kationische Substanzen, wie etwa Para-Aminohippursäure und Tetraethylammonium, zeigten keinerlei inhibitorische Wirkung (8).
Für die Behandlung von Hyperurikämie verwendete Medikamente, wie etwa Probenecid, Benz-Bromaron, Sulfinpyrazon und Phenylbutazon, hemmten die Aufnahme von Harnsäure über URAT1 signifikant. Losartan, welches ein Arzneimittel für die Behandlung von Bluthochdruck ist und welches bekanntermaßen die urikosurisch beschleunigende Wirkung zeigt, hemmte die Aufnahme von Harnsäure durch URAT1, ebenso wie auch sein Metabolit, EXP-3174, signifikant. Aus den obigen Ergebnissen ist URAT1 eine Wirkstelle der repräsentativen urikosurischen Beschleuniger, die derzeit klinisch verwendet werden.
Die inhibitorischen Wirkungen auf die Aufnahme-Tätigkeit der Harnsäure über URAT1 wurden unter Verwendung von Probenecid und Losartan bei verschiedenen Konzentrationen untersucht (9 und 10). Ihre IC50-Werte betrugen etwa 50 μM bzw. 20 μM.
Beispiel 5: Strukturanalyse des URAT1-Gens
Die Struktur des URAT1-Gens in dem humanen Genom wurde analysiert. Die offengelegte Information der Ergebnisse der humanen Genomanalyse wurde unter Verwendung des Homologie-Suchprogramms durchsucht, und die Exon-Intron-Struktur des URAT1-Gens wurde nachgewiesen. Wie in 11 gezeigt, bestand das URAT1-Gen aus 10 Exons, wobei sich das Initiationscodon in dem ersten Exon befand.
Industrielle Anwendbarkeit
Der Nieren-spezifische Urattransporter der vorliegenden Erfindung, der Harnsäure selektiv transportiert, und sein Gen ermöglichen die in vitro-Untersuchung des Transports von Harnsäure und ihrer Analoga an die Stelle, an der der Transporter exprimiert wird, wobei, basierend auf der Studie, die internen Kinetiken der Verbindung vorausgesagt werden können. Harnsäure ist der Faktor, der an Hyperurikämie und Gicht tiefgreifend beteiligt ist, und es scheint so zu sein, dass die Erfindung bezüglich des Transporters zur Klärung der Pathogenese von Hyperurikämie und Gicht in der Zukunft beitragen wird. Der Transporter zeigt die Wirkung, Harnsäure in der Niere zu reabsorbieren, und es scheint, dass der Transporter zur Aufklärung des verursachenden Gens der renalen Hypourikämie, bei der der Reabsorptionsmechanismus der Harnsäure verloren gegangen ist, beitragen wird. Außerdem kann die Aufklärung der neuen Verbindungen, die die Funktion des Transporters hemmen, und der Kontrollfaktoren, die die Expression modulieren, zu der Entwicklung neuer therapeutischer Methoden für Hyperurikämie und Gicht beitragen. SEQUENZLISTE

Claims

Methode zum Nachweisen der Wirkung einer Substanz eines Subjekts, umfassend das Kontaktieren der Substanz mit einem Protein und das Bestimmen, ob die Substanz den Transport von Harnsäure durch das Protein beeinflusst, wobei das Protein umfasst (i) die Aminosäuresequenz, dargestellt durch SEQ ID NR. 2 oder (ii) eine Aminosäuresequenz, die davon durch Deletion, Substitution oder Addition von 1 bis 110 Aminosäuren abgeleitet ist, oder (iii) eine Aminosäuresequenz mit wenigstens 75% Homologie zu SEQ ID Nr. 2, und worin das Protein zum Transportieren von Harnsäure fähig ist.
Methode nach Anspruch 1, wobei das Protein von einem Menschen stammt.
Methode nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Protein von Organen, Geweben oder kultivierten Zellen stammt.
Verwendung eines Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zum Durchmustern auf Substanzen, welche die Harnsäure-Aufnahme durch das Protein beschleunigen oder hemmen.
Verwendung einer Nukleotidsequenz als einer Sonde zum Nachweisen eines Gens, das für ein Protein codiert, welches zum Transportieren von Harnsäure oder Austauschen von Harnsäure und eines anderen Anions fähig ist, wobei die Nukleotidsequenz eine Teilsequenz aus 14 oder mehr aufeinanderfolgenden Basen in der Basensequenz enthält, die durch SEQ ID Nr. 1 oder eine komplementäre Sequenz dazu dargestellt ist.
Verwendung einer Nukleotidsequenz zum Modulieren der Expression in vitro eines Gens, das für ein Protein codiert, welches zum Transportieren von Harnsäure oder Austauschen von Harnsäure und eines anderen Anions fähig ist, wobei die Nukleotidsequenz eine Teilsequenz aus 14 oder mehr aufeinanderfolgenden Basen in der Basensequenz enthält, die durch SEQ ID Nr. 1 oder eine komplementäre Sequenz dazu dargestellt ist.
Verwendung eines Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder eines spezifischen Antikörpers dazu in der Herstellung eines Medikaments zum Modulieren des in vivo-Transports von Harnsäure oder des in vivo-Austauschs von Harnsäure und eines anderen Anions.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei das Medikament zur Behandlung von Hyperurikämie oder Gicht ist.
Verwendung einer cDNA (komplementäre DNA), die für ein Protein codiert, wie in einem der Ansprüche 1 bis 3 definiert, in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Hyperurikämie oder Gicht.
Verwendung einer Nukleotidsequenz, wie in Anspruch 6 definiert, in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Hyperurikämie oder Gicht, durch Modulieren der Expression eines Gens, das für ein Protein codiert, welches zum Transportieren von Harnsäure oder Austauschen von Harnsäure durch ein anderes Anion fähig ist.