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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur
Wiedergewinnung von Mikroorganismen, die eine
Eiskristallbildungsaktivität aufweisen, aus einem Medium mit den
Mikroorganismen, in getrockneter Form.
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In der US-Patenschrift 4 200 228 wird ein Verfahren zur
Herstellung von Schnee beschrieben, bei dem Mikroorganismen in
Tröpfchen eingeschlossen sind, die in die Luft versprüht
werden. Der Mikroorganismus, der verwendet wird, ist von dem
Typ, von dem bekannt ist, daß er eine Eiskristallbildung
fördert. Als Ergebnis hiervon kann Schnee bei Temperaturen
erzeugt werden, die viel höher liegen als die Temperaturen, bei
denen eine Schneebildung normalerweise möglich ist. Ein
typischer Mikroorganismus, der in diesem Verfahren verwendet
werden kann, ist ein Pseudomonad und insbesondere pseudomonas
syringae.
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Es ist offensichtlich, daß wenn dieses Verfahren in einem
beliebigen Maßstabe durchgeführt wird, große Mengen an
Mikroorganismen benötigt werden. Weiterhin ist es wünschenswert, daß
die Mikroorganismen in einer trockenen Form erhalten werden, so
daß die Aufbewahrung und der Transport des Materials
erleichtert wird.
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Die Wachstumsbedingungen für Mikroorganismen, die eine
Eiskristallbildungsaktivität aufweisen, sind bekannt.
Beispielsweise wird von Maki und Willoughby in einer Arbeit mit
dem Titel "Bacteria as Biogenic Sources of Freezing Nuclei", J.
Applied Meteorology 17 1049-1053 beschrieben, daß die
Mikroorganismen, wie z.B. Pseudomonas syringae in einer Koser-
Citratbrühe bei einer Temperatur unterhalb 20ºC, d.h. bei 5ºC
gezüchtet werden. Es wird ferner angegeben, daß wenn die
Kulturen bei Temperaturen oberhalb 20ºC gezüchtet werden, sehr
wenig Gefrierkeime erzeugt werden.
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Was den Wiedergewinnungsprozeß anbelangt, wird in dieser
Literaturstelle beschrieben, daß konzentrierte Kulturen, die
mit Formalin behandelt worden sind, gefriergetrocknet werden.
Es werden keine Details angegeben.
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Gemäß einer anderen Literaturstelle werden die
Mikroorganismen in einem Trypton-Hefeextrakt-Glycerin-Medium mit einem
pH-Wert von 7,0 gezüchtet. (Koxloff, Schofield und Lute, "Ice
Nucleating Activity of Pseudomonas syringae and Erwinia
herbicola", J. Bacter. 153 Seiten 222-231 (1983)). In dieser
Literaturstelle werden die Mikroorganismen nicht in trockener
Form wiedergewonnen und die Suspensionen werden direkt auf ihre
Aktivität getestet. Es wird bemerkt, daß die
Eiskristallbildungsaktivität in der Suspension nicht stabil ist und über
Nacht abnimmt.
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Werden die bekannten Verfahren zur Herstellung von großen
Volumina der Mikroorganismen angewandt, so wird eine geringere
als die gewünschte Eiskristallbildungsaktivität erreicht.
Selbst dann, wenn bei der Fermentation eine hohe Aktivität in
der Fermentationssuspension erzeugt wird, geht viel von der
Aktivität während der Trocknung von großen Volumina des
Materials verloren. Das Endergebnis ist ein Verfahren, daß
nicht dazu geeignet ist, kommerzielle Mengen des
Mikroorganismen zu vertretbaren Kosten zu erzeugen.
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Im Hinblick auf dieses Bedürfnis wurde ein Verfahren zur
Wiedergewinnung von Eiskristalle bildenden Mikroorganismen
entwickelt, das auf die Aufrechterhaltung des größten Teiles
der Eiskristallbildungsaktivität (INA) hinzielte. Dieses
Verfahren wird in der US-Patentschrift 4 706 463 vom 17.
November 1987 beschrieben und beansprucht. In diesem Verfahren
wird das Medium zunächst abgekühlt und daraufhin konzentriert.
Nach der Konzentrierung wird das Medium gefroren, indem das
Konzentrat in eine cryogene Flüssigkeit eingebracht wird. Die
dabei anfallenden Pellets werden dann gefriergetrocknet.
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Das Verfahren, das in der oben erwähnten Patentschrift
beschrieben wird, ist in seiner Durchführung sehr kostspielig.
So werden große Vo1umina an kostspieliger cryogener Flüssigkeit
benötigt. Weiterhin ist die Gefriertrockungsstufe kostspieliger
als erwünscht. Infolgedessen besteht die Aufgabe, die durch die
vorliegende Erfindung gelöst werden soll, darin, eine weniger
kostspieligere Alternative zu dem bekannten mit einer cryogenen
Flüssigkeit arbeitenden Gefriertrockungsprozeß bereitzustellen.
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Die vorliegenden Erindung stellt ein Verfahren zur
Wiedergewinnung eines Mikroorganismus, der eine
Eiskristallbildungsaktivität aufweist, aus einem Fermentationsmedium bereit. Das
Verfahren weist die gleichen Kühl und Konzentrierungsstufen
des bekannten Verfahrens auf, jedoch wird das Konzentrat dann
unter bestimmten Bedingungen sprühgetrocknet. Dies bedeutet,
daß gemäß der vorliegenden Erfindung das Verfahren die
folgenden Stufen aufweist:
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a) Einstellen der Temperatur des Mediums auf 15ºC oder
weniger,
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b) Erzeugung eines Konzentrates des Mikroorganismus,
vorzugsweise mit einem Wassergehalt von 15-27%, unter
Aufrechterhaltung der Temperatur bei 15ºC oder weniger,
und
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c) Sprühtrocknung des Konzentrates unter Aufrechterhaltung
der Produkttemperatur bei weniger als 50 C.
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Das Verfahren der vorliegenden Erfindung eignet sich dazu,
die Eiskristallbildungsaktivität (INA) nach der Trocknung einer
beliebigen Suspension, die den Mikroorganismus enthält,
aufrechtzuerhalten. Wie oben angegeben, sind
Fermentationsverfahren für diese Mikroorganismen gut bekannt.
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Ein besonders bevorzugtes Verfahren wird in der
Europäischen Patentanmeldung Nr. 87113772.5-2105 mit dem Titel
"Fermentation of Microorganisms Having Ice Nucleating Activity"
beschrieben. Weitere Verbesserungen in dem
Fermentationsverfahren für diesen Typ von Mikroorganismen werden in der
Europäischen Patentanmeldung Nr. 87118942.9-2105 mit dem Titel
"Fermentation of Microorganisms having Ice Nucleating Activity
Using a Defined Medium" sowie in der Europäischen
Patentanmeldung Nr. 88103346.8-2105 mit dem Titel "Fermentation of
Microorganisms Having Ice Nucleating Acitivity using a
Temperature Change" beschrieben.
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Jeder Mikroorganismus, der eine
Eiskristallbildungsaktivität aufweist, kann nach dem Verfahren der vorliegenden
Erfindung wiedergewonnen werden. Zu geeigneten Mikroorganismen
gehören Pseudomonads, z.B. P.svringae und p.fluorscens,
P.coronafaciens und P.pisi. Zu anderen Mikroorganismen, die
sich für das Vefahren der vorliegenden Erfindung eignen,
gehören Erwinia herbicola. Der zum gegenwärtigen Zeitpunkt
bevorzugte Mikroorganismus ist P.syringae, ATCC Nr. 53 543,
niedergelegt am 23. September 1986 nach dem Budapester Abkommen
bei der American Type Culture Collection in Rockville,
Maryland, USA.
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Das vorliegende Verfahren zur Wiedergewinnung der
Mikroorganismen führt zu einem akzeptablen Verlust an INA beim
Trocknen, unter Bereitstellung eines Verfahrens, das nicht
kostspielig ist und leicht durchführbar. Beim Verfahren der
vorliegenden Erfindung ist es wichtig, die Temperatur des
Mikroorganismus während des Verfahrens so niedrig wie praktisch
möglich zu halten. Das gegenwärtig bevorzugte Verfahren besteht
darin, zunächst die Temperatur des Fermentationsmediums auf
unterhalb 15ºC zu bringen. Das Medium wird dann konzentriert zu
einem trockenem Feststoff mit einer Gewichtskonzentrations von
vorzugsweise zwischen 15 und 27% und in besonders vorteilhafter
Weise 22%, während die Temperatur unterhalb 15ºC gehalten wird.
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Die Konzentrierung des Mediums vor der Sprühtrocknung kann
nach jeder beliebigen Methode erfolgen, z.B. durch Filtration
oder Zentrifugation. Eine Vollmantelzentrifuge oder eine
kontinuierlich arbeitende Scheibenzentrifuge können verwendet
werden.
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Gemäß der vorliegenden Erfindung wird das konzentrierte
Medium sprühgetrocknet, so daß die Produkttemperatur nicht über
50ºC ansteigt. Wird die Produkttemperatur bei höheren
Temperaturen gehalten, so geht der größte Teil der Fermentor-INA
verloren, wie es in dem später folgenden Vergleichsbeispiel 4
gezeigt wird. Wird die Temperatur, bei der das Produkt aufbewahrt
wird, vermindert, so trocknet das Produkt langsamer, so daß der
Durchsatz einer Sprühtrocknungsvorrichtung vermindert wird.
Infolgedessen liegt der bevorzugte Temperaturbereich zwischen
30ºC und 50ºC.
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Es war überraschend festzustellen, daß dieses
Temperaturempfindliche Produkt erfolgreich einer Sprühtrocknung
unterworfen werden kann. Bei Gefriertrocknungsversuchen mit dem
vorhergehenden Verfahren wurde festgestellt, daß die
Produkttemperatur unterhalb von etwa 25ºC gehalten werden muß und
vorzugsweise unterhalb 15ºC. Wird die Produkttemperatur so
niedrig in einer Sprühtrocknungsvorrichtung gehalten, so ist
die Produktivität der Trocknung zu gering, um von größerem
Interesse zu sein. Es war besonders überraschend festzustellen,
daß dieses Produkt die INA beibehält, wenn es
Trocknungstemperaturen im Bereich van 30ºC bis 50ºC unterworfen wird.
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Jede übliche Sprühtrocknungsvorrichtung läßt sich zur
Durchführung des Verfahrens der Erfindung verwenden. In einer
typischen Sprühtrocknungsvorrichtung wird das zu trocknende
Produkt in Form von kleinen Tröpfchen in eine Kammer versprüht,
die ein großes Gasvolumen enthält. Die Gaseinlaßtemperatur und
die Strömungsgeschwindigkeit des Produktes, das getrocknet
werden soll, können gesteuert werden, um die gewünschte
Produkttemperatur bereitzustellen, wozu bekannte Methoden
angewandt werden können.
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Das konzentrierte Medium kann in dem Sprühtrockner unter
Anwendung üblicher Methoden atomisiert werden. Druckdüsen, zwei
Flüssigkeitsdüsen und Zentrifugalscheibenkönnen beispielsweise
verwendet werden. Das Gas in der Kammer kann in zweckmäßiger
Weise Luft sein oder ein anderes Gas, z.B. Stickstoff. Das
Produkt kann unter Anwendung bekannter Methoden, z.B. eines
Zyklon-Abscheiders gewonnen werden. Bezüglich einer weiteren
Diskussion der Einzelheiten der Sprühtrocknung wird verwiesen
auf die Literaturstelle von Perry und Chilton, Herausgeber
"Chemical Engineers Handbook", 5. Ausgabe, Seiten 20-58 und
folgende, Verlag McGraw Hill Book Company, 1973.
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In den unten folgenden Beispielen wurde die INA nach
üblichen Methoden berechnet. Die INA wurde bestimmt durch
Plazierung einer Vielzahl von Mikroorganismen enthaltenden
Wassertröpfchen (10&supmin;¹) auf eine mit Paraffin beschichtete
Aluminiumfolie. Die Folie wurde bei -5ºC aufbewahrt, indem sie auf ein
konstantes Temperaturbad gebracht wurde. Details dieses
Verfahrens finden sich in der Literatur, beispielsweise in einer
Arbeit von Vali, " Quantitative Evaluation of Experimental
Results on the Heterogenous Freezing of Sypercooled Liguids",
J. Atoms Sci., 28, Seiten 402-409 (1971). Die INA, die in den
Beispielen angegeben wird, ist die Anzahl von
Eiskristallzentren pro Gramm trockenen Mikroorganismus. Im
vorliegenden Falle wird die INA, die unter Verwendung einer
Probe direkt aus dem Fermentor ohne Trocknung gemessen wurde,
als "Fermentor INA" bezeichnet, und die INA des
wiedergewonnenen getrockneten Produktes wird als " Wiedergewonnene INA"
bezeichnet.
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Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung weiter
veranschaulichen.
Beipiel 1:
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Pseudomonas syringae ATCC 53, 543 wurde auf eine
Agar-Platte gestrichen, die ein Nährmedium mit Mannitol, Hefeextrakt
und Magnesiumsulfat enthielt. Nach 48 h bei 26ºC wurden fünf
Platten dazu verwendet, um ein 10 l fassenden Fermentor zu
inokulieren, der ebenfalls ein ähnliches Medium enthielt.
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Nach 12 h bei 26ºC wurden diese flüssigen Keime zur
Inokulierung von 1001 eines Fermentationsmediums, wie in
Tabelle I angegeben, verwendet.
Tabelle I
Komponente
Anfangs Konzentration
Mannitol
Hefeextrakt
Magnesiumsulfat
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Die Fermentationstemperatur wurde auf 21ºC eingestellt.
Während der Fermentations wurde der pH-Wert mit 4N
Schwefelsäure und 2N Natriumhydroxid gesteuert. Die Säure wurde
zugesetzt, wenn der pH-Wert sich einem Wert von 6,6 näherte und die
Base wurde zugesetzt, wenn sich der pH-Wert einem Wert von 5,6
näherte. Der gelöste Sauerstoff wurde bei einer Sättigung von
größer als 30% gehalten. Das Antischaummittel wurde bei Bedarf
zur Steuerung des Schäumens zugesetzt.
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Nach 24 h erreichte die Zellmasse 18 g trockene
Zellen/Liter. Die Fermentor-INA betrug 1,51 x 10¹¹.
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Die Fermentationsbrühe wurde auf eine Temperatur von 5ºC
abgekühlt und zentrifugiert, wobei die Temperatur bei 5ºC
gehalten wurde. Die Feststoffe wurden abgetrennt und bis zu
einem Feststoffgehalt von 20% in einem Phosphatpuffer mit einem
pH-Wert von 7, 0 aufgeschlämmt.
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Die Aufschlämmung wurde in einen Sprühtrockner vom
Laboratoriumsmaßstab, Hersteller Niro, Columbio, Maryland,
unter Verwendung von Stickstoff bei 118ºC gepumpt. Die
Pumpengeschwindigkeit betrug 30 ml/min und die Auslaßtemperatur
und infolgedessen die Produkttemperatur betrug 50ºC. Die
wiedergewonnene INA betrug 0,57 x 10¹¹.
Beispiel 2:
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Beispiel 1 wurde wiederholt, mit der Ausnahme jedoch, daß
die maximale Produkttemperatur während der Sprühtrocknung bei
etwa 41ºC lag. Dies wurde erreicht durch Verwendung einer
Gastemperatur von 80ºC und einer Pumpengeschwindigkeit von 20
ml/min. Die wiedergewonnene INA betrug 1,29 x 10¹¹.
Beispiel 3:
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Beispiel 1 wurde wiederholt, mit der Ausnahme jedoch, daß
die maximale Produkttemperatur während der Sprühtrocknung bei
36ºC lag. Erreicht wurde dies mit einer Gastemperatur von 80ºC
und einer Pumpengeschwindigkeit von 25 ml/min. Die
wiedergewonnene INA lag bei 1,51 x 10¹¹ und war somit gleich der
Fermentor-INA.
Beispiel 4:
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Dies Beispiel ist ein Vergleichsbeispiel.
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Beipiel 1 wurde wiederholt, mit der Ausnahme jedoch, daß
die maximale Produkttemperatur während der Sprühtrocknung bei
68ºC lag. Erreicht wurde dies bei einer Gastemperatur von 118ºC
und einer Pumpengeschwindigkeit von 7 ml/min. Die
wiedergewonnene INA betrug 0,13 x 10¹¹. Dies entspricht weniger als 10%
der Fermentor-INA.