Hintergrund der Erfindung
1. Gebiet der Erfindung
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Die Erfindung betrifft ein von Luciola lateralis (HEIKE-
Leuchtkäfer) abgeleitetes Luciferase-Gen und eine neue
rekombinante DNA, die das Gen in ihr integriert enthält,
sowie ein Verfahren zur Herstellung einer Luciferase unter
Verwendung der rekombinanten DNA.
2. Beschreibung des Standes der Technik
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Luciferase von Leuchtkäfern der Gattung Luciola werden durch
Isolierung und Reinigung aus den gesammelten Leuchtkäfern der
Gattung Luciola erhalten [Proc. Natl. Acad. Sci., 74(7),
2799-2802 (1977)].
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Luciferasen sind sehr effektiv brauchbar, z.B. zur
quantitativen Bestimmung von ATP.
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Da die vorstehend beschriebenen Luciferasen von Insekten
abgeleitet sind, müssen deshalb Leuchtkäfer der Gattung
Luciola aus der Natur gesammelt werden, um Luciferasen
herzustellen; alternativ müssen solche Leuchtkäfer gezüchtet
werden, und die Luciferasen müssen aus den Leuchtkäfern
isoliert und gereinigt werden, was viel Zeit und Arbeit für
ihre Herstellung erfordert.
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Als Ergebnis verschiedener Untersuchungen, um die
vorstehenden Probleme zu lösen, haben die Erfinder der
vorliegenden Anmeldung gefunden, daß durch Herstellung einer
rekombinanten DNA durch Insertion von DNA, die ein von
Luciola lateralis abgeleitete Luciferase codierendes Gen
enthält, in eine Vektor-DNA und Züchtung eines Luciferase
bildenden Mikroorganismus der Gattung Escherichia, der die
rekombinante DNA trägt, in einem Medium Luciferase während
kurzer Zeit effizient hergestellt werden kann. Als Ergebnis
weiterer Untersuchungen an von Luciola lateralis abgeleitetem
Luciferase-Gen waren die Erfinder auch erfolgreich, indem sie
das erstemal ein von Luciola lateralis abgeleitetes
Luciferase-Gen isoliert und seine Struktur bestimmt haben.
Dadurch wurde diese Erfindung erreicht.
Zusammenfassung der Erfindung
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Erfindungsgemäß wird bereitgestellt:
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(1) Ein von Luciola lateralis abgeleitetes Luciferase-Gen,
das durch eine nachstehend beschriebene
Restriktionsenzymkarte definiert ist:
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worin EI Eco RI bedeutet, S Ssp I bedeutet, EV Eco RV
bedeutet, A Apa I bedeutet, und H Hpa I bedeutet.
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(2) Ein Luciferase-Gen gemäß (1), das die nachstehend
angegebene Aminosäuresequenz codiert:
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(3) Ein Luciferase-Gen gemäß (1) oder (2), das durch die
nachfolgend angegebene Nucleotidsequenz dargestellt
wird.
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Erfindungsgemäß wird also eine neue rekombinante DNA
bereitgestellt, die erhalten wurde durch Insertion eines
Gens, das für von Luciola lateralis abgeleiteter Luciferase
codiert, in eine Vektor-DNA. Erfindungsgemäß wird ferner ein
Verfahren zur Herstellung einer Luciferase bereitgestellt,
das die Kultivierung eines Mikroorganismus der Gattung
Escherichia, der eine rekombinante DNA trägt, die durch
Insertion eines für von Luciola lateralis abgeleitete
Luciferase codierenden Gens in eine Vektor-DNA erhalten
wurde, und Einsammeln der Luciferase aus der Kultur.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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Fig. 1 zeigt einen optimalen pH-Bereich für von Luciola
lateralis abgeleiteter Luciferase. Fig. 2 zeigt einen
stabilen pH-Bereich für von Luciola lateralis abgeleiteter
Luciferase. Fig. 3 zeigt eine Spaltungskarte von
rekombinanter Plasmid pALf3-DNA mit Restriktionsenzymen. Die
Fig. 4 zeigt eine Spaltungskarte von rekombinanter Plasmid
pGlf1-DNA mit Restriktionsenzymen. Die Fig. 5 zeigt eine
Spaltungskarte von rekombinanter Plasmid pHLf7-DNA mit
Restriktionsenzymen. Die Fig. 6 zeigt eine erfindungsgemäße
Nucleotidsequenz von von Luciola lateralis abgeleitetem
Luciferase-Gen. Die Fig. 7 zeigt eine erfindungsgemäße
Aminosäuresequenz eines von Luciola lateralis abgeleiteten
Luciferase-Gen translatierten Polypeptids. Die Fig. 8 zeigt
eine Nucleotidsequenz von von Luciola lateralis abgeleitetem
Luciferase-Gen und die entsprechende Aminosäuresequenz.
Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
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Nachfolgend wird die Erfindung detailliert beschrieben.
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Zur Untersuchung einer DNA, die ein für von Luciola lateralis
(HEIKE-Leuchtkäfer) abgeleitete Luciferase codierendes Gen
trägt, wird eine von Luciola cruciata (GENJI-Leuchtkäfer),
der ein zur gleichen Gattung gehörender Leuchtkäfer ist,
abgeleitete Luciferase codierendes Gen als Sonde verwendet;
ferner wird zur Untersuchung einer DNA, die ein für von
Luciola cruciata abgeleitete Luciferase codierendes Gen
trägt, eine DNA, die ein für von Photinus pyralis
(Amerikanischer Leuchtkäfer), der einer der Leuchtkäfer ist,
abgeleitete Luciferase codierendes Gen enthält, als Sonde
verwendet.
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Die Herstellung des Luciferase von Photinus pyralis
codierenden Gens wird nachfolgend zuerst beschrieben. Danach
wird die Herstellung des Luciferase aus Luciola cruciata
codierenden Gens beschrieben, und schließlich die Herstellung
des Luciferase aus Luciola lateralis codierenden Gens
beschrieben.
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Um die m-RNA aus dem hinteren Teil von Photinus pyralis, der
einer der Leuchtkäfer ist, herzustellen, kann m-RNA gemäß den
z.B. in Molecular Cloning, S. 196, Cold Spring Harbor
Laboratory (1982), Haruo Ozeki und Reiro Shimura, BUNSHI
IDENGAKU JIKKENHO (Experimental Molecular Genetics), S. 66-67
(1983), usw. beschriebenen Methoden erhalten werden.
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Die Konzentration von m-RNA, die für Luciferase aus der
erhaltenen m-RNA codiert, kann durch ein Verfahren
durchgeführt werden, das z.B. in Biomedical Research, 3, 534-
540 (1982) oder dergleichen beschrieben ist.
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In diesem Fall wird Anti-Luciferase-Serum für Luciferase
verwendet. Dieses Serum kann z.B. wie bei Yuichi Yamamura,
MEN-EKI KAGAKI (Immunochemistry), S. 43-50 (1973) usw.
beschrieben erhalten werden.
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Die Synthese von c-DNA aus der für Luciferase codierenden
m-RNA kann durch Verfahren, die z.B. in Mol. Cell Biol., 2,
161 (1982) und Gene, 25, 263 (1983) beschrieben sind,
durchgeführt werden.
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Die so erhaltene c-DNA wird dann z.B. in Plasmid pMCE10 DNA
integriert {Plasmid, hergestellt unter Verwendung von Plasmid
pKN305 [Plasmid mit einem Promotor von Escherichia coli
Tryptophan Operator, beschrieben in Agr. Biol. Chem., 50, 271
(1986)] und Plasmid pMC1843 [Plasmid enthaltend in
Escherichia coli β-Galactosidase-strukturelles Gen,
beschrieben in Methods in Enzymology, 100, 293-308 (1983)]}
usw., um verschiedene rekombinante Plasmid-DNAs herzustellen.
Unter Verwendung dieser DNAs wird die Transformation von
Escherichia coli (E. coli) DH1 (ATCC 33849), E. coli HB101
(ATCC 33694) usw. durch das Verfahren von Hanahan [DNA
Cloning, 1, 109-135 (1985)] durchgeführt, um verschiedene
Transformanten zu erhalten.
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Die in den so erhaltenen Transformanten enthaltenen
rekombinanten Plasmid-c-DNAs sind Plasmide, in denen c-DNA in
die Mitte von E. coli β-Galactosidase-strukturelles Gen
integriert wurde. Ein durch c-DNA codiertes Peptid wird als
mit β-Galactosidase fusioniertes Protein expressioniert.
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Um von den verschiedenen vorstehend beschriebenen
Transformanten für Luciferase codierende c-DNA zu bestimmen,
werden die Transformanten kultiviert, um Zellprotein zu
exprimieren. Durch Bestimmung, ob irgendein Protein-Crossing-
over-Anti-Luciferase-Serum vorhanden ist, kann seine
Bestimmung durchgeführt werden. Für die Bestimmung können
z.B. Verfahren verwendet werden, wie sie in Agric. Biol.
Chem., 50, 271 (1986) und Anal. Biochem., 112, 195 (1981)
beschrieben sind.
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Nach Markierung der c-DNA der unvcllständigen Luciferase mit
³²P durch das Verfahren der Nick-Translation [Molecular
Cloning, S. 109-112, Cold Spring Harbor Laboratory (1982) und
J. Mol. Biol., 113, 237-251 (1977)] kann dann unter
Verwendung des Verfahrens der Koloniehybridisierung [Protein,
Nucleic Acid & Enzyme, 26, 575-579 (1981)] ein Escherichia
coli-Stamm mit einer Plasmid-DNA, die Photinus pyralis-
Luciferase c-DNA mit 1,8 Kb enthält, als einer von Photinus
pyralis abgeleiteten c-DNA Library, hergestellt unter
Verwendung von Plasmid pUC19 DNA (hergestellt von Takara
Shuzo Co., Ltd.), als Vektor hergestellt werden.
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Um eine DNA, die das Gen, das für von Photinus pyralis
abgeleitete Luciferase codiert, enthält, aus der so
erhaltenen rekombinanten Plasmid-DNA zu erhalten, werden
Restriktionsenzyme, z.B. Eco RI und Cla I mit der Plasmid-DNA
bei Temperaturen von 30 bis 40ºC, vorzugsweise bei 37ºC, 1
bis 24 Stunden lang, vorzugsweise 2 Stunden lang, reagieren
gelassen; die nach Vervollständigung der Umsetzung erhaltene
Lösung wird einer Agarose-Gelelektrophorese [die in Molecular
Cloning, S. 150, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)
beschrieben wird] unterworfen, um die DNA zu erhalten, die
das Gen enthält, das für von Photinus pyralis abgeleitete
Luciferase codiert.
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Als nächstes wird nachfolgend die Herstellung des Gens, das
für von Luciola cruciata abgeleitete Luciferase codiert,
beschrieben.
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Die Herstellung der m-RNA des hinteren Teils von Luciola
cruciata und die Synthese von c-DNA aus der m-RNA können z.B.
auf im wesentlichen die gleiche Weise wie in der vorstehend
beschriebenen Herstellung der m-RNA von Photinus pyralis und
der Synthese der c-DNA durchgeführt werden.
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Die so erhaltene c-DNA wird dann in eine Vektor-DNA
integriert, z.B. in Plasmid pUC19 DNA (hergestellt von Takara
Shuzo Co., Ltd.) usw., um verschiedene rekombinante Plasmid-
DNAs zu erhalten. Unter Verwendung dieser DNAs wird eine
Transformation von E. coli DH1 (ATCC 33849), E. coli HB101
(ATCC 33694) usw. nach dem Verfahren von Hanahan [DNA-
Cloning, 1, 109-135 (1985)] durchgeführt, um verschiedene
Transformanten zu erhalten.
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Nach Markierung der c-DNA der von Photinus pyralis
abgeleiteten Luciferase mit ³²P nach der Methode der Nick-
Translation [Molecular Cloning, S. 109-112, Cold Spring
Harbor Laboratory (1982) und J. Mol. Biol., 113, 237-251
(1971)] kann dann unter Verwendung des Verfahrens der
Koloniehybridisierung [Protein, Nucleic Acid & Enzyme, 26,
575-579 (1981)] ein Escherichia coii-Stamm mit Plasmid-DNA,
die Luciola cruciata-Luciferase c-DNA mit 2,0 Kb enthält, aus
einer von Luciola cruciata abgeleiteten c-DNA Library
erhalten werden, die unter Verwendung von Plasmid pUC19 DNA
(hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) als Vektor
hergestellt wird.
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Um die gereinigte Plasmid-DNA zu erhalten, wird z.B. ein
Verfahren verwendet, das in Proc. Natl. Acad. Sci., 62, 1159-
1166 (1969) usw. beschrieben ist.
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Durch Einwirkenlassen von z.B. Restriktionsenzym, z.B. Pst I
(hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) bei einer Temperatur
von 30ºC bis 40ºC, vorzugsweise bei 37ºC, während 1 bis 24
Stunden, vorzugsweise während 2 Stunden, auf die gereinigte
Plasmid-DNA wird die resultierende, nach Vervollständigung
der Umsetzung erhaltene Lösung einer Agarose-
Gelelektrophorese unterworfen [die in Molecular Cloning, S.
150, Cold Spring Harbor Labcratory (1982) beschrieben ist],
um das die DNA enthaltende Gen, das für von Luciola cruciata
abgeleitete Luciferase codiert, zu erhalten.
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Als nächstes wird die erfindungsgemäße Herstellung des Gens,
das für von Luciola lateralis abgeleitete Luciferase codiert,
nachfolgend beschrieben.
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Zuerst wird als Quelle, von der die m-RNA, die für von
Luciola lateralis abgeleitete Luciferase codiert,
vorzugsweise der hintere Teil von Luciola lateralis
gesammelt, da die m-RNA im hinteren Teil dieses Leuchtkäfers
vorhanden ist.
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Die Herstellung von m-RNA aus dem hinteren Teil des
Leuchtkäfers und die Synthese der c-DNA aus der m-RNA können
z.B. in im wesentlichen der gleichen Weise wie in der
vorstehend beschriebenen Herstellung der m-RNA von Photinus
pyralis und der Synthese der c-DNA durchgeführt werden.
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Die so erhaltene c-DNA wird dann in eine Vektor-DNA
integriert, z.B. in Plasmid pUC119 DNA, usw., um verschiedene
rekombinamte Plasmid-DNAs zu erhalten. Unter Verwendung
dieser DNAs wird die Transformation von E. coli DH1 (ATCC
33849), E. coli HB101 (ATCC 33694) usw. nach dem Verfahren
von Hanahan [DNA Cloning, 1, 109-135 (1985)] durchgeführt, um
verschiedene Tranformanten zu erhalten.
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Nach Markierung der c-DNA der von Luciola cruciata
abgeleiteten Luciferase mit ³²P nach dem Verfahren der Nick-
Translation [Molecular Cloning, S. 109-112, Cold Spring
Harbor Laboratory (1982) und J. Mol. Biol., 113, 237-251
(1977)] kann unter Verwendung des Verfahrens der
Koloniehybridisierung [Protein, Nucleic Acid & Enzyme, 26,
575-579 (1981)] ein Escherichia coli-Stamm mit einer Plasmid-
DNA, die Luciola lateralis-Luciferase c-DNA mit 2,0 Kb
enthält, aus einer von Luciola lateralis abgeleiteten c-DNA
Library erhalten werden, die unter Verwendung von Plasmid
pUC119 DNA (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.)
hergestellt wurde.
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Um die gereinigte rekombinante DNA von dem so erhaltenen
Mikroorganismus zu erhalten, wird z.B. ein Verfahren
verwendet, das in Proc. Natl. Acad. Sci., 62 1159-1166 (1969)
usw. beschrieben wird.
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Durch Einwirkenlassen von 2 Einheiten des Restriktionsenzyms
Eco RI (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) bei einer
Temperatur von 30ºC oder höher, vorzugsweise bei 37ºC,
während 1 bis 4 Stunden, vorzugsweise während 2 Stunden, auf
die gereinigte, neue rekombinante DNA wird eine partielle
Digestion bewirkt. Das Digestionsprodukt wird dann einer
Agarose-Gelelektrophorese unterworfen, um 2000 bp DNA-
Fragment zu erhalten, das alle das für von Luciola lateralis
abgeleitete Luciferase codierende Gen enthält.
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Auf der anderen Seite wird eine Nucleotidsequenz dieses
Luciferase-Gens nach dem Verfahren, das im Beispiel unter
Punkt 18 angegeben ist, bestimmt. Die bestimmte
Nucleotidsequenz ist in Fig. 6 angegeben. Danach wird eine
Aminosäuresequenz des von der Nucleotidsequenz translatierten
Polypeptids identifiziert. Die Ergebnisse sind in Fig. 7
gezeigt.
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Das diese indentifizierte Aminosäuresequenz codierende Gen
ist ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
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Der vorstehend erwähnte Mikroorganismus wird dann in einem
Medium kultiviert und Luciferase aus der Kultur eingesammelt.
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Es kann irgendein Medium verwendet werden, sofern es
verwendet wird, um Mikroorganismen zu kultivieren, die zur
Gattung Escherichia gehören. Erwähnt werden können z.B. 1%
(G/V) Trypton, 0,5% (G/V) Hefeextrakt, 0,5% (G/V) NaCl und 1
mM Isopropyl-β-D-thiogalactosid, usw.
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Die Temperatur der Kultivierung liegt zwischen 30 und 40ºC,
und vorzugsweise bei ca. 37ºC, und die Zeitdauer der
Kultivierung beträgt z.B. 4 bis 8 Stunden, und vorzugsweise
ca. 4 Stunden.
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Die Zellen werden von der Kultur durch Zentrifugieren bei
8000 U.p.M. während ca. 10 Minuten gesammelt. Die erhaltenen
Zellen werden nach einem Verfahren homogenisiert, das z.B. in
Methods in Enzymology, 133, 3-14 (1986) beschrieben ist, um
eine rohe Enzymlösung zu erhalten.
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Die rohe Enzymlösung kann wie sie ist verwendet werden; wenn
erforderlich und gewünscht, kann die rohe Enzymlösung durch
Fraktionierung mit Ammoniumsulfat, hydrophobe Chromatographie
(z.B. unter Verwendung von BUTYL TOYOPEARL 650C, usw.),
Gelfiltration (unter Verwendung von z.B. Ultrogel AcA34,
usw.) gereinigt werden, wodurch eine gereinigte Luciferase
erhalten wird.
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Die physikochemischen Eigenschaften der so erhaltenen
Luciferase werden im nachfolgenden beschrieben.
(1) Wirkung
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Das Enzym katalysiert die Oxidation von Luciferin durch ein
Sauerstoffmolekül, wie dies durch die enzymatische
Reaktionsgleichung gezeigt wird:
Luciferin
Oxyluciferin
Pyrophosphorsäure
Licht
vorhandenes Enzym
(2) Substratspezifität
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Das Enzym wirkt nicht auf ADP, CTP, UTP und GTP.
(3) Optimaler pH-Wert, und pH-Bereich zur Stabilität
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Der optimale pH-Wert beträgt, wie in Fig. 1 gezeigt, 7,5 bis
9,5; er wurde gemessen, indem man die Reaktion unter
Verwendung von Luciferin als Substrat bei verschiedenen pH-
Werten von 25 mM Glycylglycinpufferlösung im Bereich von 6,5
bis 11,5 und bei einer Temperatur von 30ºC durchführte, und
die Lichtmenge (die Zahl der Photonen), die in 20 Sekunden
emittiert wurden, gemessen wurde. Der stabile pH-Bereich des
Enzyms ist, wie in Fig. 2 gezeigt, 6,0 bis 10,5, gemessen
durch Zugabe des Enzyms zu Pufferlösungen [25 mM
Phosphatpufferlösung (pH 4,6-8,0) und 25 mM
Glycin.Natriumchlorid-Natriumhydroxid-Pufferlösungen (pH 8, 0
bis 11,5), wobei jede Lösung Ammoniumsulfat bis zu einer
10%igen Sättigung enthielt], die Luciferin enthalten, und
Einwirkenlassen des Enzyms bei einer Temperatur von 0ºC
während 4 Stunden. In Fig. 2 zeigt - und Δ-Δ die Aktivität
im Falle der Verwendung der 25 mM Phosphatpufferlösungen bzw.
die Aktivität im Falle der Verwendung von 25 mM
Glycin.Natriumchlorid-Natriumhydroxidpufferlösungen.
(4) Messung des Titers
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Eine gemischte Luciferinlösung wird hergestellt durch Mischen
von 8 ml 25 mM Glycylglycinpufferlösung (pH = 7,8), 0,5 ml
Magnesiumsulfatlösung [eine Lösung, hergestellt durch Zugabe
von Magnesiumsulfat zu 25 mM Glycylclycinpufferlösung (pH =
7,8), mit einer Magnesiumsulfatkonzentration von 0,1 M] und
0,8 ml einer Luciferinlösung [eine Lösung hergestellt durch
Zugabe von Luciferin zu 25 mM Glycylglycinpufferlösung (pH =
7,8), mit einer Luciferinkonzentration von 1 mM].
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In eine Misching von 400 ul der so erhaltenen gemischten
Luciferinlösung und 10 ul der zu prüfenden Luciferase werden
80 ul einer ATP-Lösung [eine Lösung, hergestellt durch Zugabe
von ATP zu 25 mM Glycylglycinpufferlösung (pH = 7,8), mit
einer ATP-Konzentration von 10 mM] zugegeben. Gleichzeitig
mit dem Zugießen wird die Zahl der erzeugten Photonen durch
Zählung während 20 Sekunden mittels eines Luminometers
(LUMINESCENCE READER BLR-201, hergestellt von ALOKA Co.,
Ltd.) gemessen.
(5) Für die Wirkung geeigneter Temperaturbereich
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Wenn die Reaktion bei einem pH-Wert von 7,8 bei jeder
Temperatur durchgeführt wird und die Quantität und die
Lichtmenge (die Zahl der Photonen), die in 20 Sekunden
emittiert wird, gemessen wird, reicht der geeignete
Temperaturbereich für die Wirkung von 0º bis 50ºC.
(6) Bedingungen der Inaktivierung durch pH-Wert
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Bei pH-Werten von 5,0 oder niedriger und 12,0 oder höher ist
das Enzym nach 4 Stunden vollständig inaktiviert.
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Aus der vorhergehenden Beschreibung ist es ersichtlich, daß
erfindungsgemäß Gluciferase effizient in einer extrem kurzen
Zeit hergestellt werden kann durch Kultivierung des
Mikroorganismus, der zur Gattung Escherichia gehört, der die
rekombinante DNA enthält, die darin integriert das
erfindungsgemäße, von Luciola lateralis abgeleitete
Luciferase-Gen enthält. Die Erfindung ist deshalb vom
industriellen Standpunkt aus gesehen äußerst nützlich.
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Die Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die nachfolgenden
Beispiele ausführlicher beschrieben.
Beispiel
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In den nachfolgenden Punkten 1 bis 10 wird die Herstellung
von DNA, die ein Gen enthält, das für Luciferase von Photinus
pyralis als einem der Leuchtkäfer codiert (diese DNA wird als
Sonde zur Untersuchung der DNA, die ein Gen enthält, das für
Luciferase aus Luciola cruciata codiert, verwendet),
beschrieben. In den nachfolgenden Punkten 11 bis 13 wird die
Herstellung von DNA beschrieben, die ein Gen enthält, das für
von Luciola cruciata abgeleitete Luciferase codiert (diese
DNA wird als Sonde zur Untesuchung von DNA, die ein Gen, das
für Luciferase von Luciola lateralis codiert, verwendet)
1. Herstellung von m-RNA
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Unter Verwendung eines Mörsers und eines Pistills werden 1 g
des trockenen hinteren Teiles (hergestellt von Sigma Co.,
Ltd.) von Photinus pyralis als einem der Leuchtkäfer
sorgfältig gemahlen, und dazu 5 ml Lösungspuffer [20 mM
Trishydrochloridpuffer (pH = 7,4)/10 mM NaCl/3 mM
Magnesiumacetat/5% (G/V) Sucrose/1,2% (V/V) Triton X-100/10
mM Vanadylnucleosidkomplex (hergestellt von New England
Biolab Co., Ltd.)] zugegeben. Die Mischung wird auf die
vorstehend beschriebene Weise weiter vermahlen, um eine
Lösung zu ergeben, die den gemahlenen hinteren Teil von
Photinus pyralis enthält.
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In einen Schalenmischer (hergestellt von Nippon Seiki
Seisakusho) wurden 5 ml der so erhaltenen Lösung gegeben.
Nach Behandlung bei 5000 U.p.N. während 5 Minuten wurden zum
System 12 ml Guanidinisothiocyanatlösung (6M
Guanidinisothiocyanat/37,5 mM Natriumcitrat (pH 7,0)/0,75%
(G/V) Natrium N-laurylsarcosin/0,15 N β-Mercaptoethanol)
zugegeben. Die Mischung wurde mit dem vorstehend
beschriebenen Mischer hei 3000 U.p.M. 10 Minuten lang
behandelt. Die resultierende Lösung wurde unter Verwendung
einer dreifachen Gaze filtriert und ergab ein Filtrat. Das
Filtrat wurde langsam in Schichten in 4 Röhrchen einer
Ultrazentrifuge (hergestellt von Hitachi Koki Co., Ltd.)
gegossen, in denen vorher Schichten von je 1,2 ml von 5,7 M
Cäsiumchloridlösung eingegeben wurden. Unter Verwendung der
Ultrazentriftige (hergestellt von Hitachi Koki Co., Ltd.,
SCP55H) wurde die Zentrifugierung bei 30000 U.p.M. 16 Stunden
lang durchgeführt, um Niederschläge zu ergeben.
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Die erhaltenen Niederschläge wurde mit kaltem 70%igem (V/V)
Ethanol gewaschen und in 4 ml 10 mM Trispuffer [10 mM Tris-
Hydrochlorid (pH 7,4)/5 mM EDTA/1% Natriumdodecylsulfat]
suspendiert. Die gleiche Menge einer Mischung aus
n-Butanol und Chloroform im Verhältnis 1:4
(Volumenverhältnis) wurde zur Mischung zugegeben, um eine
Extraktion durchzuführen. Der Extrakt wurde bei 3000 U.p.M.
10 Minuten lang auf konventionelle Weise zentrifugiert, um in
eine wäßrige Phase und in eine organische Lösungsmittelphase
aufzutrennen. Zu der organischen Lösungsmittelphase wurden 4
ml des oben beschriebenen 10 mM Trispuffer zugegeben. Das
vorstehend beschriebene Verfahren zur Extraktion und Trennung
wurde zweimal wiederholt. Zu der erhaltenen wäßrigen Phase
wurde 3 M Natriumacetat (pH 5,2) in einer Menge von 1/10 und
eine zweifache Menge von kaltem Ethanol zugegeben. Nach
Stehenlassen bei einer Temperatur von -20ºC während 2 Stunden
wurde die Mischung bei 8000 U.p.M. 20 Minuten lang auf
konventionelle Weise zentrifugiert, um RNA abzuscheiden. Die
erhaltene RNA wurde in 4 ml Wasser gelöst. Nachdem die
vorstehend beschriebene Ausfällung mit Ethanol durchgeführt
wurde, wurde die erhaltene RNA in 1 ml Wasser gelöst, um 3,75
mg RNA zu ergeben.
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Durch Wiederholung des vorstehenden Verfahrens wurde eine
Gesamtmenge von 7 mg RNA hergestellt. Um m-RNA von der RNA zu
selektieren, wurden 7 mg RNA einer Oligo(dT)-Cellulose
(hergestellt von New England Biolab Co., Ltd.),
Säulenchromatographie unterworfen.
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Als Säule wurde eine 2,5 ml Terumo-Spritze (hergestellt von
Terumo Co., Ltd.) verwendet. Nach Quellenlassen von 0,5 g
Harz mit Elutionspuffer [10 mM Trishydrochloridpuffer (pH
7,6) 1 mM DETA/0,1% (G/V) Natriumdodecylsulfat] wurde das
Harz in die Säule eingebracht und mit Eindungspuffer [10 mM
Trishydrochlorid (pH 7,6)/1 mM EDTA/0,4 M NaCl/0,1% (G/V)
Natriumdodecylsulfat] equilibriert.
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Zu 7 mg RNA wurde die gleiche Menge Puffer [10 mM
Trishydrochlorid (pH 7,6) /1 mM EDTA/0,8 M NaCl/0,1% (G/V)
Natriumdodecylsulfat] zugegeben. Die Mischung wurde bei einer
Temperatur von 65ºC während 10 Minuten hitzebehandelt und
dann in Eiswasser gequencht. Nach Durchlaufen durch eine
Oligo(dT)-Cellulosesäule wurde das Harz mit Bindungspuffer
gewaschen, um ungebundene r-RNA und t-RNA vollständig
auszuwaschen. Ferner wurde m-RNA mit Elutionspuffer eluiert,
um 40 ug m-RNA zu ergeben.
2. Konzentration der Luciferase-m-RNA
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Als nächstes wurde die Luciferase-m-RNA durch Zentrifugation
mit einem Sucrosedichtegradienten konzentriert.
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Der Sucrosedichtegradient von 10 bis 25% (G/V) wurde
hergestellt, indem man 0,5 ml von 40% (G/V) Sucroselösung [50
mM Tris-hydrochloridpuffer (pH 7,5)/20 mM NaCl/1 mM EDTA/40%
(G/V) Sucrose] in ein Polyaramid-Röhrchen für Rotor SW41,
hergestellt von Beckmann Co., Ltd., einbrachte, wobei 2,4 ml
von je 25% (G/V), 20% (G/V), 15% (G/V) und 10% (G/V) der
Sucroselösung in Schichten aufeinanderlagen, und das System
wurde bei einer Temperatur von 4ºC 24 Stunden lang
stehengelassen. Zu dem Sucrosedichtegradient wurden 30 ug m-
RNA aufgeschichtet, um eine Schicht zu bilden. Unter
Verwendung eines SW41-Rotors, hergestellt von Beckmann Co.,
Ltd., wurde die Zentrifugation bei 30000 U.p.M. und bei einer
Temperatur von 18ºC während 18 Stunden auf konventionelle
Weise durchgeführt. Nach der Zentrifugierung wurde die
Franktionierung in je 0,5 ml durchgeführt, und m-RNA wurde
nach der Methode der Ethanolausfällung gewonnen. Die m-RNA
wurde in 10 ul Waser gelöst.
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Danach wurde das von der m-RNA codierte Protein untersucht,
wobei die an m-RNA aufkonzentrierte Fraktion von Luciferase
identifiziert wurde. 1 ml der fraktiomierten RNA, 9 ul von
retikulärem Kaninchenerythrocytenlysat (hergestellt von
Amersham Co., Ltd.) und 1 ul [³&sup5;S] Methionin (hergestellt von
Amersham Co., Ltd.) wurden vermischt und bei einer Temperatur
von 30ºC 30 Minuten lang reagieren gelassen. Zur
Reaktionsmischung wurden 150 ul NET-Puffer [150 mM NaCl/5 mM
EDTA/0,02% (G/V) NaN&sub3;/20 mM Tris-Hydrochloridpuffer (pH
7,4)/0,05% (G/V) Nonidet P-40 (hergestellt von Besesda
Research Laboratories Co., Ltd., oberflächenaktives Mittel)]
und 1 ul Anti-Luciferase-Serum (hergestellt wie nachfolgend
beschrieben) wurden zu der Mischung zugegeben. Nach
Stehenlassen während 30 Stunden bei einer Temperatur von 20ºC
wurden 10 mg Protein A Sepharose (hergestellt von Pharmacia
Fine Chemicals Inc.) zur Mischung zugegeben. Die
resultierende Mischung wurde dann bei 12000 U.p.M. eine
Minute lang auf konventionelle Weise zentrifugiert, um das
Harz zu gewinnen.
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Das gewonnene Harz wurde dreimal mit 200 ul NET-Puffer
gewaschen. Zum Harz wurden 40 ul Probepuffer für SDS-PAGE
[62,5 mM Tris-hydrochloridpuffer (pH 6,8)/10% (V/V)
Glycerin/2% (G/V) Natriumdodecylsulfat/5% (V/V) β-
Mercaptoethanol/0,02% (G/V) Bromphenolblau] zugegeben. Die
Mischung wurde bei einer Temperatur von 100ºC 3 Minuten lang
gekocht und bei 12000 U.p.M. eine Minute lang auf
konventionelle Weise zentrifugiert, um den Überstand zu
gewinnen. Die Gesamtmenge wurde auf 7,5% (G/V)
Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel aufgebracht.
-
Die Gelelektrophorese wurde nach der Methode von Lämmli
[Nature, 227, 680 (1970)] durchgeführt. Nach der
Elektrophorese wurde das Gel in 10% (V/V) Essigsäure 30
Minuten lang eingetaucht, um das Protein zu immobilisieren.
Dann wurde das Gel 30 Minuten lang in Wasser eingetaucht und
dann 30 Ninuten lang in 1 M Natriumsalicylatlösung, und dann
getrocknet, um ein trockenes Gel zu ergeben. Das trockene Gel
wurde einer Fluorographie unter Verwendung eines Röntgenfilms
(hergestellt von Fuji Photo Film Co., Ltd.; RX) unterworfen.
-
Nach dem vorstehenden Verfahren wurde die Bande des
Luciferase-Proteins auf dem Röntgenfilm nur in dem Fall
festgestellt, wenn RNA aus der Fraktion, in der die
Luciferase m-RNA vorhanden war, verwendet wurde, und die
Fraktion, worin Luciferase m-RNA konzentriert war, konnte
identifiziert werden.
3. Herstellung von Antiserum
-
Kaninchen-Anti-Luciferaseserum gegen gereinigte Luciferase
wurde nach dem folgenden Verfahren hergestellt.
-
Eine Luciferaselösung mit einer Konzentration von 3,2 mg/ml
[Lösung, erhalten durch Auflösen von Luciferase, hergestellt
von Sigma Co., Ltd., in 0,5 M Glycylglycinlösung (pH 7,8)],
und zwar 0,7 ml, wurde in einer gleichen Menge von
Freundschem kompletten Adjuvans suspendiert. 2,24 mg der
Suspension wurden als Antigen der Handfläche des Japanischen
Weißen Kaninchens mit einem Gewicht von 2 kg als Antigen
verabreicht. Nach 2-wöchiger Fütterung wurde die gleiche
Menge des Antigens wie die anfängliche Menge intrakutan in
den Rücken verabreicht. Nach Fütterung während einer weiteren
Woche wurde das gleiche Verfahren durchgeführt. Nach einer
weiteren Woche nach Fütterung wurde das gesamte Blut
gesammelt.
-
Das erhaltene Blut wurde bei einer Temperatur von 4ºC 18
Stunden stehengelassen und dann bei 3000 U.p.M. 15 Minuten
lang auf konventionelle Weise zentrifugiert, um Anti-
Luciferaseserum als Überstand zu ergeben.
4. Synthese von c-DNA
-
Die Synthese von c-DNA wurde unter Verwendung eines von
Amersham Co., Ltd. hergestellten Kits durchgeführt.
-
Unter Verwendung von 2 ug m-RNA, die wie vorstehend
beschrieben erhalten wurde, wurde die Synthese von c-DNA
gemäß den Verfahren durchgeführt, wie sie in Mol. Cell Biol.,
2, 161 (1982) und Gene, 25, 263 (1983) beschrieben sind. Als
Ergebnis wurden 300 ng doppelsträngiger c-DNA erhalten.
-
Diese c-DNA, 150 ng, wurden in 7 ul TE-Puffer [10 mM
Trishydrochloridpuffer (pH 7,5)/1 mM EDTA] gelöst. Zu der Lösung
wurden 11 ul einer Mischung [280 mM Natriumcacodylat (pH
6,8)/60 mM Tris-hydrochloridpuffer (pH 6,8)/2 mM
Kobaltchlorid] und 3,8 ul einer Tailing-Mischung [7,5 ul 10
mM Dithiothreitol/1 ul 10 ng/ml Poly(A)/2 ul 5 mM dCTP/110 ul
Wasser] zugegeben. Außerdem wurden 29 Einheiten terminaler
Transferase (hergestellt von Boehringer Mannheim GmbH) zur
Mischung zugegeben. Nach Umsetzung bei einer Temperatur von
30ºC während 10 Minuten wurden 2,4 ul 0,25 M EDTA und 2,4 ul
10% (G/V) Natriumdodecylsulfat zur Mischung zugegeben, um die
Reaktion zu unterbrechen.
-
Die Lösung, in der die Reaktion unterbrochen wurde, wurde
einer Behandlung zur Proteinentfernung unter Verwendung von
25 ul wassergesättigtem Phenol unterworfen. Dann wurden 25 ul
4 M Ammoniumacetat bzw. 100 ul kaltes Ethanol zu der
gewonnenen wäßrigen Phase zugegeben. Die Mischung wurde bei
einer Temperatur von -70ºC 15 Minuten lang stehengelassen und
bei 12000 U.p.M. 10 Minuten lang zentrifugiert, um c-DNA zu
gewinnen. Die c-DNA wurde in 10 ul Puffer gelöst, um eine c-
DNA-Lösung zu ergeben.
-
Wie vorstehend beschrieben, wurden 100 ng von c-DNA mit einem
Deoxycytidin-Schwanz beobachtet.
5. Herstellung von in einem Vektor verwendeter rekombinanter
Plasmid pMCE10 DNA
-
Plasmid pKN305 DNA, hergestellt nach der von T. Masuda et
al., Agricultural Biological Chemistry, 50, 271-279 (1986)
beschriebenen Methode unter Verwendung von Plasmid pBR325
(hergestellt von BRL Co.) und Plasmid pBR322 DNA (hergestellt
von Takara Shuzo Co., Ltd.) und pMC14O3-3 DNA (beschrieben in
der japanischen Patentveröffentlichung KOKAI 61-274683)
wurden zu je 1 ug zu 10 ul einer Mischung [50 mM
Trishydrochloridpuffer (pH 7,5)/10 mM MgCl&sub2;/100 mM NaCl/1 mM
dithiothreitol] zugegeben. Ferner wurden 2 Einheiten von je
Hind III und Sal I (beide hergestellt von Takara Shuzo Co.,
Ltd.) zur Mischung zugegeben. Durch Umsetzung bei einer
Temperatur von 37ºC während einer Stunde wurde eine Spaltung
bewirkt. Die Extraktion mit Phenol und Ausfällung mit Ethanol
wurden auf konventionelle Weise durchgeführt, um
Niederschläge zu ergeben. Die Niederschläge wurden in 10 ul
Ligationspuffer [20 mM NgCl&sub2;/66 mM Tris-hydrochloridpuffer
(pH 7,6) /1 mM ATP/15 mM Dithiothreitol] gelöst, um eine
Lösung zu ergeben. Außerdem wurde eine Einheit T4 DNA Ligase
(hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) dazugegeben, um eine
Ligation bei einer Temperatur von 20ºC während 4 Stunden
durchzuführen. Dann wurde unter Verwendung dieser
Reaktionslösung E. coli JM101 (ATCC 33876) gemäß dem
Transformationsverfahren tranformiert, das in [J.
Bacteriology, 119, 1072-1074 (1974)] beschrieben ist. Durch
Prüfung auf chemische Widerstandsfähigkeit
(Ampicillinwiderstandsfähigkeit und Tetracyclinsensitivität)
und β-Galactosidaseaktivität wurde ein Transformat erhalten.
Die im Stamm enthaltene rekoinbinante Plasmid-DNA wurde mit
pMCElo bezeichnet. E. coli JM101 Stamm, der diese
rekombinante Plasmid DNA pMCE10 DNA enthielt, wurde in einem
Medium, das sich aus 1% (G/V) Trypton, 0,5% (G/V)
Hefeextrakt, und 0,5% (G/V) Natriumchlorid zusammensetzte,
bei einer Temperatur von 37ºC 16 bis 24 Stunden lang
kultiviert. Zwanzig Milliliter der so erhaltenen Kulturlösung
von E. coli JM101 (pMCE10) wurden auf 1 Liter des Mediums
inokuliert, gefolgt von einer Schüttelkultivierung bei einer
Temperatur von 37ºC während 3 Stunden. Nach Zugabe von 0,2 g
Chloramphenicol wurde die Kultivierung bei der gleichen
Temperatur weitere 20 Stunden lang fortgesetzt, um eine
Kulturlösung zu ergeben.
-
Danach wurde die Kulturlösung bei 6000 U.p.M. 10 Minuten lang
auf konventionelle Weise zentrifugiert, um 2 g nasse Zellen
zu ergeben. Nachdem die Zellen in 20 ml 350 mM
Trishydrochloridpuffer (pH 8,0), der 25% (G/V) Sucrose enthielt,
suspendiert wurden, wurden 10 mg Lysozym, 8 ml 0,25 M EDTA-
Lösung (pH 8,0) und 8 ml 20% (G/V) Natriumdodecylsulfat zur
Suspension zugegeben. Die Mischung wurde bei einer Temperatur
von 60ºC 30 Minuten lang gehalten, und ergab eine
Lysatlösung.
-
Zur Lysatlösung wurden 13 ml 5 M NaCl-Lösung zugegeben. Die
Mischung wurde bei einer Temperatur von 4ºC 16 Stunden lang
behandelt und dann bei 15000 U.p.M. auf konventionelle Weise
zentrifugiert, um einen Extrakt zu ergeben. Der Extrakt wurde
einer Phenolextraktion unterworfen und eine Ethanolausfällung
auf konventionelle Weise durchgeführt, um Niederschläge zu
ergeben.
-
Die Niederschläge wurden dann unter vermindertem Druck auf
konventionelle Weise getrocknet und in 10 mM
Trishydrochloridpuffer (pH 7,5), der 1 mM EDTA enthielt, gelöst.
Zu der Lösung wurden ferner 6 g Cäsiumchlorid und 0,2 ml
Ethydiumbromidlösung (10 mg/ml) zugegeben. Die resultierende
Mischung wurde einer equilibrierten
Dichtegradientzentrifugationsbehandlung unter Verwendung
einer Ultrazentrifuge bei 39000 U.p.M. während 42 Stunden auf
konventionelle Weise unterworfen, um rekombinante Plasmid
pMCE10 DNA zu isolieren. Nach Entfernung des Ethydiumbromids
unter Verwendung von n-Butanol wurde eine Dialyse gegen 10 mM
Tris-hydrochloridpuffer (pH 7,5), der 1 mM EDTA enthielt,
durchgeführt, um 500 ug gereinigte rekombinante Plasmid
pMCE10 DNA zu erhalten.
6. Herstellung der Vektor DNA
-
Die so erhaltene rekombinante Plasmid pMCE10 DNA, 15 ug,
wurde in 90 ul TE-Puffer, wie unter Punkt 4 beschrieben,
gelöst. Nachdem 10 ul Med-Puffer [100 mM
Trishydrochloridpuffer (pH 7,5)/10 mM MgCl&sub2;/10 mM
Dithiothreitol/500 mM NaCl] zur Lösung zugegeben wurden,
wurden 30 Einheiten Restriktionsenzym Acc I (hergestellt von
Takara Shuzo Co., Ltd.) zur Mischung zugegeben. Die
Spaltungsbehandlung wurde bei einer Temperatur von 37ºC eine
Stunde lang durchgeführt, und ergab das Spaltungsprodukt. Zum
Spaltungsprodukt wurden 100 ul wassergesättigtes Phenol
zugegeben, wodurch das Protein entfernt wurde. Dann wurde die
wäßrige Phase gewonnen und eine 1/10-fache Menge 3 M
Natriumacetat (pH 7,5) und eine 2-fache Menge kaltes Ethanol
zur wäßrigen Phase zugegeben. Nach Stehenlassen bei einer
Temperatur von -70ºC während 15 Minuten wurde die Mischung
bei 12000 U.p.M. 10 Minuten lang zentrifugiert, um DNA zu
gewinnen.
-
Diese DNA wurde in 10 ul TE-Puffer gelöst und 15 ul einer
Mischung [280 mM Natriumcacodylat (pH 6,8)/60 mM
Trishydrochloridpuffer (pH 6,8)/2 mM Kobaltchlorid] wurden zu der
Lösung zugegeben. Dann wurden 5 ul einer Tailing-
Lösungsmischung (unter Punkt 4 beschrieben) (5 mM dGTP wurde
verwendet) zur Mischung zugegeben. Danach wurden 5 Einheiten
terminale Transferase (hergestellt von Takara Shuzo Co.,
Ltd.) zugegeben, um bei einer Temperatur von 37ºC während 15
Minuten zu reagieren. Durch Nachbehandlung auf eine ähnliche
Weise wie die unter Punkt 4 beschriebene c-DNA-Tailing-
Reaktion wurde DNA mit dem Deoxyguanosin-Schwanz an der Acc
I-Stelle der rekombinanten Plasmid pMCE10 DNA hergestellt.
-
Auf der anderen Seite wurde DNA mit dein Deoxyguanosin-Schwanz
an der Pst I-Stelle der Plasmid pUC19 DNA ebenfalls zur
gleichen Zeit hergestellt.
-
Zu einer Lösung von 30 ug Plasmid pUC19 DNA (hergestellt von
Takara Shuzo Co., Ltd.) in 350 ul TE-Puffer wurden 40 ul Med-
Puffer und 120 Einheiten Restriktionsenzym Pst I (hergestellt
von Takara Shuzo Co., Ltd.) zugegeben. Nach
Spaltungsbehandlung bei einer Temperatur von 37ºC während
einer Stunde wurde DNA durch Phenolbehandlung zur Entfernung
des Proteins und Ethanolfällung auf konventionelle Weise
gewonnen.
-
Die erhaltene DNA wurde in 35 ul TE-Puffer gelöst. Zu der
Lösung wurden 50 ul einer Mischung [280 mM Natriumcacodylat
(pH 6,8)/60 mN Tris-hydrochloridpuffer (pH 6,8)/1 mM
Kobaltchlorid], 19 ul der Tailing-Mischung (die dGTP anstelle
von dCTP enthielt), beschrieben in Punkt 4, und 60 Einheiten
terminaler Transferase (hergestellt von Takara Shuzo Co.,
Ltd.) zugegeben. Nach Umsetzung bei einer Temperatur von 37ºC
während 10 Minuten wurde DNA gewonnen durch Phenolbehandlung
zur Entfernung von Protein und die Ethanolausfällung auf
konventionelle Weise.
7. Annealing und Transformation
-
Die so synthetisierte c-DNA, 15 ng, und 200 ng der Vektor-DNA
wurde in 35 ul Annealing-Puffer [10 mM
Trishydrochloridpuffer (pH 7,5)/100 mM NaCl/1 mM EDTA] gelöst.
Die Lösung wurde bei einer Temperatur von 65ºC 2 Minuten lang
stehengelassen, bei einer Temperatur von 46ºC 2 Stunden, und
bei einer Temperatur von 37ºC eine Stunde, und bei einer
Temperatur von 20ºC 18 Stunden, um c-DNA und Vektor-DNA zu
annealen.
-
Unter Verwendung der annealten DNA wurde E. coli DH1-Stamm
(ATCC 33849) nach dem Verfahren von Hanahan transformiert
[DNA Cloning, 1, 109-135 (1985)], um eine c-DNA-Bank
herzustellen, die Plasmid pUC19 DNA bzw. rekombinante Plasmid
pNCE10 DNA als Vektoren enthielt.
8. Untersuchung von Luciferase c-DNA
-
Die Acc I-Stelle der rekombinanten Plasmid pMCE10 DNA ist an
einer Stelle vorhanden, die für E. coli B-Galactosidasegen
codiert. Eine in diese Stelle eingeführte c-DNA bildet
deshalb ein fusioniertes Protein mit β-Galactosidase.
Außerdem wurde ein Promotor von β-Galactosidasegen der
rekombinanten Plasmid pMCE10 DNA in einen Promotor von E.
coli Tryptophangen, wie vorstehend beschrieben, überführt.
96 Kolonien c-DNA mit rekombinanter Plasmid pMCE10 DNA als
Vektor wurden einer Schüttelkultivierung in 10 ml M9 Casamino
acid medium [Molecular Cloning, 440-441. Cold Spring Harbor
Laboratory (1982)], mit Thiamin (10 ug/ml) ergänzt, bei einer
Temperatur von 37ºC 10 Stunden lang einer
Schüttelkultivierung unterworfen. Nach Sammeln der Zellen auf
konventionelle Weise wurden die Zellen in 200 ul des
Probenpuffers für SDS-PAGE, wie unter Punkt 2 beschrieben,
suspendiert. Die Suspension wurde bei einer Temperatur von
100ºC 5 Minuten lang gekocht. Diese Suspension, 40 ul, wurde
auf konventionelle Weise einer Elektrophorese unter
Verwendung von 7,5% (G/V) Polyacrylamidgel unterworfen. Nach
Vervollständigung der Elektrophorese wurde das auf dem Gel
entwickelte Protein auf ein Nitrocellulosefilter mittels der
Western Blot Methode transferiert [Anal. Biochem., 112, 195
(1981)]. Dieses Nitrocellulosefilter wurde mit dem Anti-
Luciferaseserum unter Verwendung von Immun-blot Assay Kit
(hergestellt von Biorad Co.) angefärbt. Das Verfahren wurde
gemäß der Instruktion von Biorad Co. durchgeführt.
-
D.h., das Nitrocellulosefilter wurde in 100 ml
Blockierungslösung [eine Lösung, erhalten durch Auflösen von
3% (G/V) Gelatine im TBS-Puffer (20 mM
Trishydrochloridpuffer/500 mM NaCl (pH 7,5))] bei einer
Temperatur von 25ºC während 30 Minuten geschüttelt. Danach
wurde das Nitrocellulosefilter in 25 ml primäre
Antikörperlösung
[Lösung, erhalten durch Auflösen von 1% (G/V) Gelatine in
TBS-Puffer und Verdünnen des Luciferase-Antiserums mit der
resultierenden Lösung] überführt und bei einer Temperatur von
25ºC 90 Minuten lang geschüttelt, die dann in 100 ml Tween-20
Waschlösung [Lösung erhalten durch Auflösen von 0,05% (G/V)
Tween-20 in TBS-Puffer] überführt und bei einer Temperatur
von 25ºC 10 Minuten lang geschüttelt wurde. Dieses Verfahren
wurde zweimal wiederholt. Dann wurde das so erhaltene
Nitrocellulosefilter in 60 ml sekundäre Antikörperlösung
überführt [Lösung, erhalten durch Auflösen von Anti-
Kaninchen-Antikörper, markiert mit Meerrettich-Peroxidase
(hergestellt von Biorad Co.) mit einer Lösung von 1% (G/V)
Gelatine in TBS-Puffer auf 3000-fache Verdünnung (V/V)]. Nach
Schütteln bei einer Temperatur von 25ºC während 60 Minuten
wurde das Nitrocellulosefilter mit 100 ml Tween-20
Waschlösung gewaschen. Das vorstehend beschriebene Verfahren
wurde zweimal wiederholt. Das so erhaltene
Nitrocellulosefilter wurde in 120 ml Farbbildungslösung
[Lösung, erhalten durch Mischen einer Lösung von 60 mg 4-
Chlor-1-naphthol in 20 ml kaltem Methanol und einer Lösung
von 60 ul 30% (V/V) wäßrigem Wasserstoffperoxid in 100 ml
TBS-Puffer], um bei einer Temperatur von 25ºC während 10
Minuten eine Farbe auszubilden.
-
Ahnliche Verfahren wurden mit 4 Gruppen, mit 96 Kolonien pro
Gruppe, durchgeführt. In zwei Gruppen wurden mit Luciferase-
Antiserum angefärbte Proteinbande festgestellt. Danach wurden
96 Kolonien, die zu den zwei Gruppen gehörten, in 8 Gruppen
mit je 12 Kolonien unterteilt und ein ähnliches Verfahren
wiederholt. Ein Protein, das mit Anti-Luciferase reagierte,
wurde in einer Gruppe festgestellt. Schließlich wurde im
Hinblick auf die 12 Kolonien, die in dieser Gruppe enthalten
waren, jede Kolonie auf ähnliche Weise behandelt, wobei eine
Protein-produzierende Kolonie, die mit Luciferase-Antiserum
reagierte, identifiziert wurde. Nach dem vorstehenden
Verfahren wurden 2 Kolonien, die Luciferase c-DNA enthielten,
erhalten. Aus den 2 Kolonien wurde Plasmid DNA nach dem
Verfahren, das in Punkt 5 beschrieben wurde, hergestellt. Die
erhaltenen rekombinanten Plasmid DNAs wurden mit pALf2B8 bzw.
pALf3A6 bezeichnet.
9. Untersuchung von großer Luciferase c-DNA - Herstellung
von c-DNA Sonde
-
In 330 ul TE-Puffer wurden 100 ug rekombinantes Plasmid,
pALf3A6 DNA, gelöst. Zu der Lösung wurden 40 ul Low Puffer
[100 mM Tris-hydrochloridpuffer (pH 7,5) /100 mM Mg Cl&sub2;/10 mM
Dithiotreitol], 130 Einheiten Pst I (hergestellt von Takara
Shuzo Co., Ltd.) und 120 Einheiten Sac I (hergestellt von
Boehringer Mannheim GmbH) zugefügt, um bei einer Temperatur
von 37ºC während 1,5 Stunden eine Spaltung zu bewirken.
-
Die Gesamtmenge an DNA wurde durch Elektrophorese und unter
Verwendung von 0,7% (G/V) Agarosegel aufgetrennt. Die
Agarosegel-Elektrophorese wurde gemäß dem Verfahren von T.
Maniatis et al., Molecular Cloning, S. 156-161, Cold Spring
Harbor Laboratory (1984) durchgeführt. Die Luciferase c-DNA
enthaltende DNA-Bande wurde herausgeschnitten und in ein
Dialysegefäß gegeben. Nach Ergänzung mit 2 ml TE-Puffer wurde
das Dialysegefäß verschlossen und DNA aus dem Gel in den
Puffer durch Elektrophorese eluiert. Ein äquivalentes Volumen
von wassergesättigtem Phenol wurde zu dieser Lösung
zugegeben. Nach Schütteln wurde die wäßrige Phase gewonnen,
und die DNA durch Ausfällung mit Ethanol auf konventionelle
Weise gewonnen.
-
10 ug des erhaltenen DNA-Fragments wurden in TE-Puffer
gelöst, und 16 ul Med-Puffer und 64 Einheiten Sau 3 AI
(hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) wurden zur Lösung
zugegeben. Nach Umsetzung bei einer Temperatur von 37ºC
während 2 Stunden wurde die gesamte Menge einer
Elektrophorese unter Verwendung von 5% (G/V) Polyacrylamidgel
unterworfen, wobei die DNA-Fragmente isoliert wurden. Die
Polyacrylamidgel-Elektrophorese wurde gemäß dem Verfahren von
A. Maxam durchgeführt [Methods in Enzymology, 65, 506
(1980)]. Nach der vorstehend beschriebenen Methode wurde ein
DNA-Fragment von 190 bp isoliert, um 1 ug Sau3 AI Luciferase
c-DNA-Fragment zu ergeben.
-
Unter Verwendung von [α-³²P] dCTP (hergestellt von Amersham
Co.) wurde 1 ug dieser Luciferase c-DNA gemäß dein Verfahren
der Nick-Translation markiert. Das Verfahren der Nick-
Translation wurde unter Verwendung eines Kits durchgeführt,
der von Takara Shuzo Co., Ltd. gemäß dem in J. Mol. Biol.,
113, 237-251 (1977) und Molecular Cloning, S. 109-112, Cold
Spring Harbor Laboratory (1982) beschriebenen Verfahren
hergestellt wurde.
10. Untersuchung von großer Luciferase c-DNA
- Koloniehybridisierung
-
Unter Verwendung des Luciferase c-DNA-Fragments, markiert mit
³²P, hergestellt nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren,
als Sonde wurde eine c-DNA-Bank des hinteren Teiles von
Photinus pyralis, worin rekombinante Plasmid pUC19 DNA ein
Vektor war, durch Koloniehybridisierung untersucht
[(Protein, Nucleic Acid and Enzyme, 26, 575-579 (1981)], um
Kolonien mit Luciferase c-DNA zu ergeben. Rekombinante
Plasmid DNA, die in einer der Kolonien vorkam, wurde mit
pALf3 bezeichnet und Plasmid DNA wurde nach dem Verfahren,
wie unter Punkt 5 beschrieben, hergestellt. E. coli,
enthaltend rekombinante Plasmid DNA, wurde mit E. coli DH 1
(pALf3) bezeichnet. Der Transformant wurde als ATCC 67462
hinterlegt.
-
Die vorstehend beschriebene rekorrWinante Plasmid pALf3 DNA
wurde einer einzelnen Digestion und einer doppelten Digestion
unter Verwendung von Xba I, Hind III, BamH I, Eco RI und Pst
I (alle hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) unterworfen.
Die erhaltenen DNA-Fragmente wurden durch Agarosegel-
Elektrophorese an mobilen Mustern analysiert. Durch Vergleich
der erhaltenen mobilen Muster mit Standard-mobilen Mustern
von DNA-Fragmenten, die durch Digestion von λ-Phage-DNA
(hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) mit Hind III
erhalten wurden, wurde die Größe der in pALf3 eingefügten
c-DNA mit 1700 bp ermittelt. Eine Restriktionsenzymkarte des
vorstehend beschriebenen Plasmids ist in Fig. 3 dargestellt.
11. Herstellung von m-RNA von Luciola cruciata
-
Zehn Gramm lebender Luciola cruciata (GENJI-Leuchtkäfer,
vertrieben von Seibu Department Store) wurden in eine Ultra-
Niedertemperaturgefriertruhe gegeben und eingefroren. Jeder
hintere Teil wurde mit Scheren abgeschnitten. Zu 2 g der
erhaltenen hinteren Teile wurden 18 ml
Guanidinisothiocyanatlösung zugegeben. Gemäß dem unter Punkt
1 beschriebenen Verfahren wurden 1,1 mg RNA hergestellt.
Gemäß dem in Punkt 1 beschriebenen Verfahren wurden 1,1 mg
dieser RNA einer Säulenchromatographie (Oligo(dT)-Cellulose)
unterworfen, um 3β ug m-RNA des hinteren Teils von Luciola
cruciata zu erhalten.
12. Herstellung der c-DNA-Bank von Luciola cruciata,
hinterer Teil
-
Die Synthese von c-DNA wurde unter Verwendung eines Kits, der
von Amersham Co. gemäß dem von Amersham Co. angegebenen
Verfahren, das in Mol. Cell Biol., 2, 161 (1982) und Gene,
25, 263 (1983) beschrieben ist, durchgeführt.
-
Aus 2 ug Luciola cruciata-Hinterteil-RNA wurden 0,9 ug
doppelsträngiger c-DNA synthetisiert. Unter Verwendung der
unter Punkt 4 beschriebenen Methode wurde ein Schwanz von
Polydeoxycytidin zu 0,3 ug dieser c-DNA zugegeben.
-
Diese c-DNA, 20 ng, und 500 ng pUC19 Plasmid, hergestellt wie
in Punkt 6 beschrieben, worin ein Polyguanisin-Schwanz zu der
Pst I-Stelle zugefügt wurde, wurden gemäß dem in Punkt 7
beschriebenen Verfahren annealt. E. coli DH 1-Stamm (ATCC
33849) wurde durch annealte DNA nach der Methode von Hanahan
transforiniert [DNA Cloning, 1, 109-135 (1985)], wodurch eine
c-DNA-Bank von Luciola cruciata-Schwanz gebildet wurde.
13. Untersuchung von Luciferase c-DNA, abgeleitet von
Luciola cruciata
-
In 90 ul TE-Puffer wurden 10 ug rekombinante Plasmid pALf3
DNA, wie in Punkt 10 erhalten, gelöst und 10 ul Med-Puffer,
25 Einheiten Restriktionsenzym Eco RI und 25 Einheiten
Restriktionsenzym Cla I (beide hergestellt von Takara Shuzo
Co., Ltd.) wurden zu der Lösung zugegeben. Die Reaktion wurde
bei einer Temperatur von 38ºC während 2 Stunden durchgeführt,
um DNA zu spalten. Aus der gespaltenen rekombinanten Plasmid
pALf3 DNA wurde 800 bp Eco RI/Cla I DNA-Fragment, das
Luciferase c-DNA, abgeleitet von Photinus pyralis
(Amerikanischer Leuchtkäfer) enthielt, gemäß dem unter Punkt
9 beschriebenen Verfahren unter Verwendung von Agarosegel-
Elektrophorese isoliert. So wurden 1 ug Eco RI/Cla 1 DNA-
Fragment erhalten. Unter Verwendung von
[α-³²P] dCTP (hergestellt von Amersham Co.), wurde 1 ug
dieser DNA mit ³²P gemäß dem Verfahren der Nick-Translation,
beschrieben unter Punkt 9, markiert. Unter Verwendung von Eco
RI/Cla I DNA-Fragment, markiert mit ³²P, als Sonde wurde eine
c-DNA-Bank von Luciola cruciata, hinterer Teil, durch
Koloniehybridisierung, wie unter Punkt 10 beschrieben,
untersucht, um E. coli mit Luciferase c-DNA, abgeleitet von
Luciola cruciata, zu selektieren. Verschiedene Kolonien von
E. coli, die zur Hybridisierung mit der Sonde fähig waren,
wurden erhalten. Rekombinante Plasmid DNA einer dieser
Kolonien wurde mit pGLf1 bezeichnet. Die rekombinante Plasmid
DNA wurde gemäß dem unter Punkt 5 beschriebenen Verfahren
isoliert.
-
Die vorstehend beschriebene rekombinante Plasmid pGLf1 DNA
wurde einer einzelnen Digestion und einer doppelten Digestion
unter Verwendung von Hpa I, Hind III, Eco RV, Dra I, Afl II,
Hinc II, Pst I (alle hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.)
und Ssp I (hergestellt von New England Biolab Co.)
unterworfen. Die erhaltenen DNA-Fragmente wurden durch
Agarosegel-Elektrophorese an mobilen Mustern analysiert.
Durch Vergleich der erhaltenen mobilen Muster mit
Standardmobilen Mustern eines DNA-Fragments, das durch Digestion von
λ-Phage DNA (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) mit Hind
III erhalten wurde, wurde die Größe der in pGLf1 eingeführten
c-DNA mit 2000 bp ermittelt. Eine Restriktionsenzymkarte des
vorstehend beschriebenen Plasmids ist in Fig. 4 dargestellt.
14. Herstellung von m-RNA von Luciola lateralis
-
Fünf Gramm lebender Luciola lateralis (HEIKE-Leuchtkäfer,
vertrieben von Kawahara Choju Trading Co., Ltd.) wurden in
eine Ultraniedertemperaturgefriertruhe gegeben und
eingefroren. Jedes Hinterteil wurde mit Scheren
abgeschnitten. Zu 1 g der erhaltenen Hinterteile wurden 18 ml
Guanidinisothiocyanatlösung zugegeben. Gemäß der in Punkt 1
beschriebenen Methode wurden 340 ug RNA hergestellt. Gemäß
der in Punkt 1 beschriebenen Methode wurden 340 ug der RNA
einer Säulenchromatographie (Oligo(dT)-Cellulose)
unterworfen, um 6 ug m-RNA aus dem Hinterteil von Luciola
lateralis zu erhalten.
15. Herstellung von c-DNA-Bank von Luciola lateralis,
Hinterteil
-
Die Synthese von c-DNA wurde unter Verwendung eines von
Amersham Co. vertriebenen Kits durchgeführt.
-
Unter Verwendung von 2,0 ug einer wie vorstehend erhaltenen
m-RNA, wurde c-DNA gemäß dem von Amersham Co. angegebenen
Verfahren, das in Mol. Cell Biol., 2, 161 (1982) und Gene,
25, 263 (1983) beschrieben ist, synthetisiert. Als Ergebnis
wurden 250 ng doppelsträngiger c-DNA erhalten.
-
Die so erhaltene c-DNA, 250 ng, wurde einer Methylierung an
der Stelle des Restriktionsenzyms Eco RI unter Verwendung von
c-DNA Cloning Kit hergestellt von Amershaim Co., nach der
Vorschrift von Amershan Co., unterworfen. Außerdem wurde Eco
RI Linker an beide Termini der c-DNA angeheftet.
-
Nach Zugabe von 1 ul Med-Puffer [100 mM
Trishydrochloridpuffer (pH 7,5)/100 mM MgCl&sub2;/10 mM
Dithiothreitol/500 mM NaCl] zu einer Lösung von 100 ng von
Plasmid puC119 DNA (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.)
in 8 ul Wasser wurden 10 Einheiten Restriktionsenzym Eco RI
(hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) zur Mischung
zugegeben. Eine Spaltungsbehandlung wurde bei einer
Temperatur von 37ºC während einer Stunde durchgeführt.
-
Danach wurden 1 ul 1M Tris-hydrochloridpuffer (pH 8,0) und
0,3 Einheiten (1 ul) alkalische Phosphatase (hergestellt von
Takara Shuzo Co., Ltd.) zum Spaltungsprodukt zugegeben und
die Mischung einer enzymatischen Reaktion bei einer
Temperatur von 65ºC während einer Stunde unterworfen, um eine
Dephosphorylierung der Termini des Spaltproduktes zu
bewirken. Nachdem 12 ul wassergesättigtes Phenol zu dem
dephosphorylierten Produkt zugefügt wurden, um Protein zu
entfernen, wurde 1 ul 3M Natriumacetat (pH 5,8) bzw. 26 ul
kaltes Ethanol zu der gewonnenen wäßrigen Phase zugegeben.
Die Mischung wurde bei einer Temperatur von -70ºC 15 Minuten
stehengelassen. Nach Zentrifugationsbehandlung bei 12000
U.p.M. während 5 Minuten mit einer Spuren-
Zentrifugiermaschine (hergestellt von TOMI SEIKO K.K.,
MRX-150) wurde DNA gewonnen.
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Die so erhaltene DNA wurde mit Restriktionsenzym Eco RI
gespalten, und seine Enden wurden dephosphoriliert. Die
resultierende Plasmidvektor pU119 DNA, 100 ng, wurde mit 250
ng c-DNA, wie in Punkt 15 hergestellt, gemischt. Nach
Suspendierung der Mischung in 8 ul Wasser wurden 1 ul
Ligationspuffer [200 mM MgCl&sub2;/660 mM Tris-hydrochloridpuffer
(pH 7,6)/10 mM ATP/150 mM Dithiothreitol] zur resultierenden
Mischung zugegeben. Außerdem wurde eine Einheit T4 DNA-Ligase
(hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) dazugegeben und die
Mischung bei einer Temperatur von 16ºC 16 Stunden lang
stehengelassen, wodurch Ligation des Plasmidvektors und der
c-DNA durchgeführt wurde, um das Reaktionsprodukt zu ergeben.
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Unter Verwendung dieses Reaktionsproduktes wurde E. coli DH1
(ATCC 33849) Stamm nach der Methode von Hanahan [DNA Cloning,
1, 109-135 (1985)] zur Herstellung einer c-DNA-Bank, die aus
dem Hinterteil von Luciola lateralis abgeleitet war, und
Plasmid pUC119 DNA als Vektor enthielt, transformiert.
16. Untersuchung von Luciferase c-DNA, abgeleitet von
Luciola lateralis
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In 90 ul TE-Puffer wurden 10 ug rekombinante Plasmid pGLf1
DNA, erhalten wie in Punkt 13 beschrieben, gelöst und 10 ul
Med-Puffer, 25 Einheiten Restriktionsenzym Pst I (hergestellt
von Takara Shuzo Co., Ltd.) zur Lösung zugefügt. Die Reaktion
wurde bei einer Temperatur von 37ºC während 2 Stunden
durchgeführt, um DNA zu spalten. Aus der gespaltenen
rekombinanten Plasmid pGLf1 DNA wurde 2000 bp von Pst I DNA-
Fragment, enthaltend von Luciola cruciata abgeleitetes
Luciferase c-DNA-Teil, gemäß dem unter Punkt 9 beschriebenen
Verfahren unter Verwendung von Agarosegel-Elektrophorese
isoliert. So wurde 1 ug Pst I DNA-Fragment erhalten. Unter
Verwendung von [α-³²P] dCTP (hergestellt von Amersham Co.)
wurden 1 ug dieser DNA mit ³²P gemäß dem Verfahren der Nick-
Translation, beschrieben unter Punkt 9, markiert. Unter
Verwendung des Pst DNA-Fragments, markiert mit ³²P, als
Sonde, wurde eine c-DNA-Bank von Luciola lateralis-Hinterteil
durch Koloniehybridisierung, wie in Punkt 10 beschrieben,
untersucht, um so E. coli mit Luciferase c-DNA, abgeleitet
von Luciola lateralis, zu selektieren. Es wurden verschiedene
Kolonien von E. coli, die zur Hybridisierung mit der Sonde
fähig waren, erhalten. Das in einer dieser Kolonien
vorhandene Plasmid DNA wurde mit pHLf7 bezeichnet. Die
rekombinante Plasmid DNA wurde gemäß des in Punkt 5
beschriebenen Verfahrens isoliert.
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Die so erhaltene E. coli DH1 (pHLf7) wurde im Fermentation
Research Institute, the Agency of Industrial Science and
Technology, Japan, unter dem Budapester Vertrag mit der
Hinterlegungsnr. FERM BP-1917 hinterlegt.
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Die vorstehend beschriebene rekombinante Plasmid pHLf7 DNA
wurde einer einzelnen Digestion und einer doppelten Digestion
unter Verwendung von Hpa I, Ecc RV, Apa I, Hind III und Eco
RI (alle hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) und Ssp I
(hergestellt von New England Biolab Co.) unterworfen. Die
erhaltenen DNA-Fragmente wurden durch Agarosegel-
Elektrophorese an mobilen Mustern analysiert. Durch Vergleich
der erhaltenen mobilen Mustern mit Standard-mobilen Mustern
eines DNA-Fragments, das durch Digestion von λ-Phage DNA
(hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) mit Hind III
erhalten wurde, wurde die Größe des Gens, das von Luciola
lateralis abgeleitete Luciferase codiert, mit 2000 bp
ermittelt. Eine Restriktionskarte des vorstehend
beschriebenen Plasmids ist in Fig. 5 dargestellt.
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Einer Lösung von 10 ug rekombinanter Plasmid pHLf7 DNA in 45
ul TE-Puffer wurden 5 ul Med-Puffer und 2 Einheiten
Restriktionsenzym Eco RI (hergestellt von Takara Shuzo Co.,
Ltd.) zugefügt. Die Mischung wurde bei einer Temperatur von
37ºC während 2 Stunden reagieren gelassen, um ein partielles
Digestionsprodukt von DNA zu ergeben.
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Dann wurde das partielle Digestionsprodukt einer Agarosegel-
Elektrophorese, wie unter Punkt 9 beschrieben, unterworfen,
und 1 ug Eco RI-Fragment mit 2000 bp, das alle Gene, die von
Luciola lateralis abgeleitete Luciferase codieren, isoliert.
17. Kultivierung von E. coli DH1 (pHLf7) (FERM BP-1917) und
Herstellung der rohen Enzymlösung
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E. coli DH1 (pHLf7) (FERM BP-1917) wurde einer
Schüttelkultivierung in 3 ml LB-amp Medium [1% (G/V)
Bactotrypton, 0,5% (G/V) Hefeextrakt, 0,5% (G/V) NaCl und
Ampicillin (50 ug/ml)] bei einer Temperatur von 37ºC während
18 Stunden unterworfen. Diese Kulturlösung, 0,5 ml, wurde auf
10 ul des vorstehend genannten LB-amp Mediums inokuliert und
dazu 1 mM Isopropyl-β-D-thiogalactosid zugegeben. Nach
Schüttelkultivierung bei einer Temperatur von 37ºC während 4
Stunden wurde die Kultur einer Zentrifugation bei 8000 U.p.M.
während 10 Minuten unterworfen, um 20 mg feuchte Zellen zu
ergeben.
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Die gewonnenen Zellen wurden in 0,9 ml eines Puffers,
zusammengesetzt aus 0,1 M KH&sub2;PO&sub4; (pH 7,8), 2 mM EDTA, 1 mM
Dithiothreitol und 0,2 mg/ml Protaminsulfat, suspendiert.
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Ferner wurden 100 ul einer Lösung von 10 mg/ml Lysozym zur
Suspension zugegeben. Die Mischung wurde 15 Minuten in Eis
stehengelassen. Danach wurde die Suspension in einem
Methanol/Trockeneis-Bad eingefroren und dann bei einer
Temperatur von 25ºC bis zum vollständigen Auftauen
stehengelassen. Durch Durchführung einer Zentrifugierung bei
12000 U.p.M. während 5 Minuten wurden ferner 1 ml der rohen
Enzymlösung als Überstand erhalten.
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Die Bestimmung der Luciferase-Aktivität in der so erhaltenen
rohen Enzymlösung wurde nach der nachstehend beschriebenen
Methode durchgeführt. Die Ergebnisse sind in der
nachfolgenden Tabelle 1 angegeben.
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Die Messung der Luciferase-Aktivität in der erhaltenen rohen
Enzymlösung wurde durchgeführt, indem man die erzeugten
Photonen gemäß der Methode von Kricka [Archives of
Biochemistry and Biophysics, 217, 674 (1982)] zählte.
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D.h., 260 ul von 25 mM Glycylglycinpuffer (pH 7,8), 16 ul 0,1
M Magnesiumsulfat und 24 ul 1 mM Luciferin (hergestellt von
Sigma Inc.) und 10 ul der rohen Enzymlösung wurden gemischt.
Dann wurden 100 ul von 20 mM ATP zur Mischung zugegeben. Die
Zahl der erzeugten Photonen wurde während 20 Sekunden
zusammengezählt. Die zusammengezählten Werte sind in der
nachfolgenden Tabelle 1 angegeben. Für Vergleichszwecke wurde
die Luciferase-Aktivität auch mit Plasmid pUC119 DNA-
tragendem E. coli DH1-Stamm [E. coli DH1 (pUC119)] gemessen.
Die Ergebnisse sind ebenfalls in der nachfolgenden Tabelle 1
angegeben.
Tabelle 1
Probe
Zahl der Photonen/ml Kulturlösung
E. coli (DH1 (pHLf7) (erfindungsgemäß)
E. coli DH1 (pUC119) (Kontrolle)
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Aus der vorstehenden Tabelle wird es klar, daß die Zahl der
Photonen in E. coli DH1 (pFILf7), die das rekombinante Plasmid
pHLf7, die das erfindungsgemäße Luciferase-Gen enthält, im
Vergleich zur Kontrolle erhöht ist, und deshalb in den
erfindungsgemäß verwendeten E. coli-Zellen Luciferase
produziert wird.
18. Analyse der Nucleotidsequenz von Luciferase c-DNA,
abgeleitet von Luciola lateralis
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Rekombinante Plasmid pHLf7 Dna, 10 ug, wurden mit dem
Restriktionsenzym Eco RI (hergestellt von Takara Shuzo Co.,
Ltd.) gespalten, um 2,0 ug von 1,7 Kb DNA-Fragment und 0,5 ug
von 0,3 Kb DNA-Fragment zu ergeben, die Luciferase c-DNA
enthalten. Diese DNA-Fragmente wurden an der Eco RI-Stelle
der Plasmid pUC118 DNA (hergestellt von Takara Shuzo Co.,
Ltd.) subkloniert, und ergaben 4 Plasmide, pHLf11, pHLf12,
pHLf13 und pHLf14, basierend auf Unterschieden in der Art der
eingefügten Fragmente (1,7 Kb und 0,3 Kb) und auf der
Orientierung der Einführung (das 1,7 Kb-Fragment wurde an
pHLf11 und pHLf12 subkloniert, und das 0,3 Kb-Fragment an
pHLf13 und pHLf14).
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Die Spaltungsbehandlung der rekombinanten Plasmid pHLf7 DNA
und Plasmid pUC118 DNA mit Eco RI (Verfahren wie in Punkt 6
beschrieben), die Isolierung des Luciferase c-DNA-Fragments
unter Verwendung der Agarosegel-Elektrophorese (Verfahren wie
unter Punkt 9 beschrieben), die Ligation von Plasmid puC119
DNA und des Luciferase c-DNA-Fragments (Verfahren beschrieben
unter Punkt 5), die Transformation von E. coli JM101 Stamm
(ATCC 33876) unter Verwendung der
Ligationsreaktionsflüssigkeit (Vefahren wie unter Punkt 5
beschrieben) und die Herstellung der rekombinanten Plasmide
pHLf11, pHLf12, pHLf13 und pHLf14 (Verfahren wie unter Punkt
5 beschrieben) wurden gemäß den in den Klammern beschriebenen
Verfahren durchgeführt.
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Unter Verwendung der rekombinanten Plasmid DNAs pHLf11,
pHLf12, pHLf13 und pHLf14 wurden Plasmid DNAs, in die
verschiedenen Deletionen in die Luciferase c-DNA eingeführt
wurden, unter Verwendung eines Deletions-Kits zur Killo-
Sequenzierung (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) gemäß
dem Verfahren von Henikoff [Gene, 28, 351-359 (1984)]
hergestellt. Diese Plasmid DNAs wurden in E. coli JM101 Stamm
(ATCC 33876) nach der unter Punkt 5 beschriebenen Methode
eingeführt. Durch Infizierung des so erhaltenen E. coli mit
Helfer-Phage M13K07 (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.)
wurde eine einzelsträngige DNA gemäß dem Verfahren von
Messing [Methods in Enzymology, 101, 20-78 (1983)]
hergestellt. Die Sequenzierung mit der erhaltenen
einzelsträngigen DNA wurde nach dem vorstehend beschriebenen
Verfahren von Messing unter Verwendung eines M13 Sequenzier-
Kits (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) durchgeführt.
Gel-Elektrophorese zur Analyse einer Nucleotidsequenz wurde
unter Verwendung von 8%igem (G/V) Polyacrylamidgel
(hergestellt von Fuji Photo Film Co., Ltd.) durchgeführt. Die
Nucleotidsequenz der erhaltenen c-DNA, die für von Luciola
lateralis abgeleitete Luciferase codiert, ist in Fig. 6
dargestellt. Die Fig. 7 zeigt eine Aminosäuresequenz des von
der c-DNA translatierten Polypeptids, und die Fig. 8 zeigt
eine der c-DNA in der Aminosäuresequenz entsprechende
Sequenz.