DE68914871T2

DE68914871T2 - Verfahren zur Bestimmung von mikro-organismen.

Info

Publication number: DE68914871T2
Application number: DE68914871T
Authority: DE
Inventors: Hoegaerden Michel Van
Original assignee: Chemunex SA
Current assignee: Chemunex SA
Priority date: 1988-03-08
Filing date: 1989-03-08
Publication date: 1994-08-11
Anticipated expiration: 2009-03-09
Also published as: JPH02503747A; FR2628531B1; ES2055801T3; WO1989008714A1; FR2628531A1; EP0333560A1; ATE105023T1; DE68914871D1; EP0333560B1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum quantitativen Absuchen auf Mikroorganismen, selbst wenn sie in extrem geringer Menge vorhanden sind, in einem Medium in flüssigem, halbflüssigem, geliertem oder pastösem Zustand.
Unter extrem geringer Menge versteht man im Sinne der vorliegenden Erfindung eine Anzahl von Mikroorganismen, die gleich eins sein kann.
Die rasche qualitative und quantitative Analyse auf das Vorhandensein von Mikroorganismen, wie Bakterien, Hefen, Schimmelpilzen und Parasiten, in Lebensmittelprodukten, Hygieneprodukten oder Flüssigkeiten sowie die Überwachung eines Fermentationsverfahrens im Verlauf dessen Durchführung erwiesen sich in den verschiedenen betroffenen Industriezweigen als sehr nützlich und wichtig.
Üblicherweise wird als Nachweistechnik die Züchtung einer Probe des zu testenden Produkts verwendet. Dieses Nachweisverfahren besitzt den Nachteil, daß es lange Zeit zur Durchführung benötigt, wenn sich die ggf. vorhandenen Mikroorganismen mit einer Verzögerung von 2 bis 30 Tagen entwickeln. Außerdem ist die Zählung der Mikroorganismen nach diesem Verfahren absolut nicht genau und erlaubt nur eine angenäherte Bewertung der Anzahl der zu Beginn vorhandenen Mikroorganismen. Mikroorganismen können mit diesem Verfahren nur teilweise identifiziert werden.
Man kennt ebenso eine andere Nachweistechnik durch die Bildanalyse, aber diese ist, wie sie bis jetzt durchgeführt wird, kostspielig und schwierig durchzuführen. In der Tat muß man, um zu einer korrekten Zählung oder einem empfindlichen Nachweis der in der Probe vorhandenen Mikroorganismen zu kommen, alle Probenfelder analysieren, was diese Recherche sehr zeitaufwendig macht.
Es ist ebenfalls bekannt, die Zellen, insbesondere von Mikroorganismen, mit chemischen oder biologischen Farbstoffen zu markieren, insbesondere mit Farbstoffen der Nucleinsäuren, die am häufigsten die abgestorbenen Zellen und nicht die lebenden Zellen markieren oder mit Fluorochromen, wie Fluoresceinderivate und Phycoerythrinderivate, die seit vielen Jahren durch ihre Kopplung an Antikörper verwendet werden.
Die Verwendung von fluoreszierend gemachten polyspezifischen oder monospezifischen Antikörpern ist im Stand der Technik beschrieben, insbesondere von der Anmelderin in der FR-A-2 598 513, die polyspezifische Antihefen und Antischimmelpilz-Antikörper betrifft.
Jedenfalls machen diese fluoreszierenden Antikörper alle Zellen fluoreszierend, unabhängig davon, ob sie lebend oder tot sind, was einen wichtigen Nachteil darstellt, sei es zur selektiven Bestimmung des Vorhandenseins einer lebenden Verunreinigung in einem Lebensmittelprodukt oder Hygieneprodukt, sei es zur Bestimmung der Entwicklung oder des guten Verlaufs eines Fermentationsverfahrens.
Andere Farbstoffe wurden ebenfalls in der Literatur beschrieben, insbesondere Carboxyfluoresceindiacetat (CFDA) und Fluoresceindiacetat (FDA), wobei das letztere zum Nachweis von Bakterien, die in einer gewissen Anzahl von Artikeln (T.H. Chrzanowski et al., "Applicability of the fluorescein diacetate method of detecting active bacteria in fresh water", erschienen 1984 in Microbial Ecology (10 : 179 - 185), B. Lundgren "Fluorescein diacetate as a stain of metabolically active bacteria in soil", erschienen in OIKOS, 1981 (36 : 17 - 22, Jarnagin et al., "The use of fluorescein diacetate and ethidium bromide as a stain for evaluating viability of mycobacteria", erschienen in Stain Technolog., 1980 (55, 4, 253 - 158), Schnurer J. et al. "Fluroescein diacetate hydrolysis as a measure of total microbial activity in soil and litter", erschienen in Applied Environm. Microbiol., 1982 (43, 6, 1256 - 1261), Sontag), die diese Farbstoffe und ihren Wirkmechanismus beschreiben beschrieben ist, verwendet wurden. Jedenfalls handelt es sich im allgemeinen um ein Abschätzverfahren oder es werden auch, wenn das Verfahren quantitativ ist, zusammen ein chemischer Farbstoff für Nucleinsäuren verwendet. Dies sind Verfahren, die zur Reihenanalyse wenig geeignet sind.
Die Nachweistechniken aus dem Stand der Technik erlauben nicht den selektiven Nachweis von lebenden Mikroorganismen, insbesondere, wenn sie in sehr geringer Menge vorhanden sind.
Die WO-A-8 605 206 beschreibt beispielsweise ein Verfahren zur Bewertung der Konzentration von Mikroorganismen, die in einer Probe vorhanden sind, unter Bezugnahme auf eine Standardpopulation: Dabei führt man durch Spalten mit Hilfe eines für die Mikroorganismen geeigneten Enzyms eines nicht-fluoreszierenden Farbstoffs, der zuvor zugesetzt worden war, eine Induktion einer Fluoreszenz durch und mißt die von der Gesamtheit der Mikroorganismen emittierte gesamte Fluoreszenz, wobei dieses Verfahren nicht den Nachweis von Konzentrationen unter 10² Zellen/ml erlaubt.
Folglich liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum Absuchen, zum Nachweis und zur Zählung von Mikroorganismen bereitzustellen, das sehr rasch und leicht durchzuführen ist, empfindlich, spezifisch und billig ist und die fast stückweise Zählung der Mikroorganismen erlaubt.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Mikroorganismen, die normalerweise vorhanden sind oder ggf. als Verunreinigungen in einem komplexen Medium in flüssigem, halbflüssigem, geliertem oder pastösem Zustand vorhanden sind, insbesondere Lebensmittelprodukte, Hygieneprodukte oder biologische Flüssigkeiten, wobei das Verfahren die Stufen der Probengewinnung und der Zugabe eines positiven Lebensfähigkeitsmarkers mit der Eignung, lebende Mikroorganismen zu markieren, ausgewählt aus nicht-fluoreszierenden oder wenig fluoreszierenden Substanzen, die in den Mikroorganismus eindringen, umfaßt, wobei die Substanzen dann so gespalten oder modifiziert werden, daß sie ein fluoreszierendes Produkt liefern, wobei das Produkt in seinem größeren Teil oder vollständig im Inneren des Mikroorganismus eingeschlossen ist, dadurch gekennzeichnet, daß man
A) zur spezifischen und selektiven Markierung der Mikroorganismen
a) die Mikroorganismen durch Filtration und/oder Zentrifugation einer Probensuspension, die im Falle einer flüssigen Ausgangsprobe direkt erhalten wurde oder durch Inkontaktbringen der Probe mit einem Puffer zur Einstellung des pH-Werts des Mediums auf einen alkalischen pH-Wert im Falle einer halbflüssigen oder pastösen Ausgangsprobe, erhalten wurde, abtrennt;
b) intracellulär die Mikroorganismen durch 5- bis 10-minütige Inkubation bei 37ºC mit mindestens einem positiven Lebensfähigkeitsmarker markiert,
c) die in b) erhaltene Probe mit Ultraschall 10 s lang behandelt, um die Mikroorganismen zu vereinzeln, und
B) zur Zählung der fluoreszierend gemachten Mikroorganismen,
d) die in c) erhaltene Probe durch ein Durchflußcytometer leitet und
e) mit Hilfe des Durchflußcytometers jeden markierten Mikroorganismus durch Messung der von jedem der Mikroorganismen emittierten intracellulären Fluoreszenz/Fluoreszenzen zählt.
Unter Mikroorganismen versteht man im Sinne der Erfindung insbesondere Bakterien, Hefen, Schimmelpilze und Parasiten.
Unter positivem Marker der Lebensfähigkeit versteht man eine Substanz, die nur die lebenden Zellen und nicht die abgestorbenen Zellen färbt und dessen Farbintensität der Zellen proportional ihrer Stoffwechselaktivität ist.
Die Lebendfarbstoffe im Sinne der vorliegenden Erfindung sind Farbstoffe von Nucleinsäuren und vereinigen sich mit dem genetischen Material sowohl der lebenden als auch der abgestorbenen Zellen.
Als nicht-beschränkende Beispiele für Lebendfarbstoffe kann man Ethidiumbromid, Propidiumiodid, Mythramycin A, DAPI, den Farbstoff, der unter dem Namen Hoechst 33258 vertrieben wird, den Farbstoff, der unter dem Namen Hoechst 33342 vertrieben wird, nennen.
Die Durchflußcytometrie, die an sich bekannt ist, ist in zahlreichen Dokumenten, insbesondere in der EP-A-177 718 beschrieben.
Die Kombination der erfindungsgemäßen Mittel besitzt den Vorteil, daß sie die Durchführung von Reihenbestimmungen, die rasch durchzuführen sind, zuverlässig sind, sowie fast stückweise Zählungen erlauben. Es handelt sich nicht um ein Verfahren zur Bewertung der Konzentration unter Bezugnahme auf eine Standardpopulation, es ist somit nicht notwendig, die Art oder Gattung des Mikroorganismus vor der Analyse zu kennen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens wird der Puffer zur Einstellung des pH-Werts als Medium zur Solubilisation verwendet.
Gemäß einer noch weiteren bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens umfaßt die vorausgehende Behandlung weiterhin die Wirkung geeigneter Enzyme.
Die Behandlung (vor und nach der Markierung) erlaubt die Vereinzelung der Zellen, die anfänglich Kolonien bilden und erhöht so die Empfindlichkeit der Detektion.
Der positive Lebensfähigkeitsmarker wird aus nicht-fluoreszierenden oder wenig fluoreszierenden Substanzen ausgewählt, die in den Mikroorganismus eindringen, wobei die Substanzen dann so gespalten oder modifiziert werden, daß sie ein fluoreszierendes Produkt ergeben, wobei das Produkt zu seinem Hauptteil oder vollständig im Inneren des Mikroorganismus eingeschlossen wird.
Die erfindungsgemäßen Lebensfähigkeitsmarker werden aus der Gruppe, umfassend FDA, 6-CFDA, 5-CFDA, Fluoresceindilaurat, 5,6-CFDA-N-Hydroxysuccinimidester, Fluoresceindipropionat, Fluoresceindi-β-D-galactosid, 3- O-Methylfluoresceinphosphat, 2',7'-Bis(carboxyethyl)-5(6)-carboxyfluoresceinpentaacetoxyester (BCECF/AM), Azidofluoresceindiacetat, 4-Methylumbelliferylacetat, 4-Methylumbelliferyl-β-D-galactosid, 4-Methylumbelliferyl-α-D-mannopyranosid, 4-Methylumbelliferylnonanoat, 4-Methylumbelliferylphosphat, 7-Alanin-4-aminomethylcumarin, 7-Glycin-4-aminomethylcumarin, 7-Prolin-4-aminomethylcumarin, 7-Valin-4-aminomethylcumarin, 7- Glycyl-L-prolin-4-aminomethylcumarin, 1,4-Diacetoxy-2,3-dicyanobenzol (ABD), Hydroethidin, Resorufinacetat, ausgewählt.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens werden die Mikroorganismen weiterhin einer zusätzlichen Markierung mit mindestens einer Substanz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus anderen positiven Markern der Lebensfähigkeit, Vitalfarbstoffen, fluoreszierend gemachten Antikörpern und fluoreszierend gemachten Nucleinsäuresonden unterworfen.
Gemäß dieser zuletzt genannten, bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens werden die Antikörper aus polyclonalen und/oder monoclonalen mono- oder polyspezifischen Antihefe- und/oder Antibakterien- und/oder Antischimmelpilzen- und/oder Antiparasiten-Antikörpern und polyclonalen und/oder monoclonalen mono- oder polygenerischen Antihefen- und/oder Antibakterien- und/oder Antischimmelpilzen- und/oder Antiparasiten-Antikörpern ausgewählt.
Erfindungsgemäß werden die verwendeten Antikörper durch einen geeigneten Fluorochrom fluoreszierend gemacht.
Die Aufgabe der Lebensfähigkeitsmarker ist die selektive Markierung lebender Mikroorganismen.
Die Aufgabe der Antikörper ist die spezifische Markierung eine Art oder Gattung von Mikroorganismen unabhängig davon, ob er lebend oder abgestorben ist.
Das erfindungsgemäße Bestimmungsverfahren kann vorteilhafterweise in einer Vorrichtung, umfassend ein Durchflußcytometer mit einer Meßzelle, umfassend eine Durchflußmeßkammer, durch die die Probe des Produkts oder zu analysierenden Flüssigkeit hindurchfließt und eine Aufzeichnungsvorrichtung für die von den Mikroorganismen emittierten Fluoreszenzsignale, durchgeführt werden, wobei die Meßzelle mit einer Spülvorrichtung für die Meßkammer versehen ist, die durch die Wirkung des Rückzugs der Probe durch den Probeneinlaß oder unter Wirkung eines geeigneten externen elektronischen Befehls in Wirkung tritt.
Außer den vorstehend genannten Vorrichtungen umfaßt die Erfindung noch weitere Vorrichtungen, die aus der nachstehenden Beschreibung hervorgehen, die sich auf die Ausführungsbeispiele des erfindungsgemäßen Verfahrens unter Bezugnahme auf die beigefügten Figuren, die die Fig. 1 bis 12 als Diagramme erläutern, bezieht.
Es ist jedoch zu verstehen, daß die Beispiele die Figuren und die entsprechenden Beschreibungsteile nur der näheren Erläuterung des Gegenstands der Erfindung dienen und in keiner Weise eine Beschränkung davon darstellen.

Beispiel 1: Suche nach Hefen, die Joghurt verunreinigen.

Je nach der/den Art/Arten der zu untersuchenden Hefe ist es möglich, den Lebensfähigkeitsmarker und/oder die für die Hefe am geeignetsten Antihefe-Antikörper auszuwählen.
Der Joghurt wird mittels geeigneter Reagentien, wie EDTA-Carbonatpuffer, pH 9,0, solubilisiert. Das Produkt wird 5 min lang mit 1500 g zentrifugiert. Der Bodensatz wird in Natriumchlorid in einer Konzentration von 9 g/l aufgenommen. Fluoresceindiacetat, ggf. an geeignete fluoreszierende Antihefen-Antikörper gebunden, wird zugesetzt. Eine 5- bis 10-minütige Inkubation bei 37ºC erlaubt den Ablauf der chemischen Reaktionen. Die Suspension wird 10 s lang mit Ultraschall beschallt. Die so erhaltene Suspension wird dann direkt in den Teilchenzähler für eine kontinuierliche Durchflußanalyse in einem Volumen, das zwischen 0,2 und 2 ml variiert, geleitet. Es ist möglich, in signifikantem Ausmaß, fast stückweise die fluoreszierend gemachten Mikroorganismen zu zählen oder zu numerieren (Fig 1, 2 und 3).
Die Fig. 1, 2 und 3 zeigen Histogramme der in dem Joghurt gezüchteten Hefenpopulation.
Auf der Abszisse ist der Fluoreszenzkanal, der die Lichtintensität wiedergibt, aufgetragen und auf der Ordinate die Anzahl der Zellen pro Kanal.
Im Falle der Fig. 1 handelt es sich um Hefen der Gattung Saccharomyces, im Falle der Fig. 2 handelt es sich um Hefen der Gattung Rhodotorula und im Falle der Fig. 3 handelt es sich um Debaryomyces hansenii.

Beispiel 2: Suche nach Hefen, die Joghurt mit Fruchtmark verunreinigen.

Im Falle, in dem die Probe aus Joghurt mit Fruchtmark besteht, werden Enzyme zugesetzt, um die Solubilisation der Probe zu begünstigen.
Die Probe wird wie in Beispiel 1 behandelt, außer, daß vor der Zugabe des Farbstoffs und/oder des Antikörpers Pectinase zugesetzt wird, um die Solubilisation zu begünstigen. Die enzymatische Reaktion läuft durch 5-minütiges Inkubieren der Joghurtprobe in Gegenwart des Enzyms bei 37ºC ab.
Die Fig. 4 (Naturjoghurt) und 5 (Fruchtjoghurt) zeigen vergleichbare Ergebnisse zwischen dem erfindungsgemäßen Verfahren und dem klassischen Kulturverfahren auf Petrischalen.
Diese Figuren zeigen auf der Abszisse die Ergebnisse, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten wurden (Log (Ausschläge/ml) und auf der Ordinate die Ergebnisse, die in dem klassischen Verfahren erhalten wurden (Log (Hefen/ml)). Man beobachtet eine sehr gute Korrelation zwischen den zwei Verfahren.

Beispiel 3: Suche nach Bakterien in Bier oder in Kulturmedien, die der Fermentation von rekombinanten Organismen dienen (Produktion von Medikamenten beispielsweise).

Typischerweise werden 50 ml Zellsuspension zentrifugiert. Der Bodensatz wird, wie in Beispiel 1 angegeben, resuspendiert. Die Verfahrensabfolge ist ähnlich, wobei die Lebensfähigkeitsmarker oder Antikörper immer dem spezifischen Problem angepaßt sind. Wenn also der Lebensfähigkeitsmarker eine Fluoreszenz in Grün besitzt, werden die Antikörper mit einem Fluorochrom mit Emission im roten Bereich, beispielsweise Phycoerithrin, markiert. Es ist in diesem Fall auch möglich, eine Zählung der doppelmarkierten Mikroorganismen durchzuführen, was die Identifizierung des Mikroorganismus unter gleichzeitiger Bestimmung seiner Lebensfähigkeit und seiner Vitalität erlaubt.
Die Fig. 6 zeigt ein Histogramm der Bakterienpopulation der Gattung Lactobacillus, die in einer natürlich verunreinigten Bierprobe nachgewiesen wurden. Es wurde auf der Abszisse der Fluoreszenzkanal aufgetragen und auf der Ordinate die Anzahl der Teilchen pro Kanal. Die am meisten fluoreszierenden Teilchen sind diejenigen, die einen sehr aktiven Metabolismus zeigen.

Beispiel 4: Suche nach Bakterien und/oder Hefen in Fertigprodukten (beispielsweise Tomatenmark, Mayonnaise, Sauce Bearnaise etc.).

Nach einer wäßrigen Extraktion dieser Produkte wird die so erhaltene Suspension grob durch ein 15 um Filter beispielsweise filtriert. Das filtrierte Produkt wird so wie in dem vorstehenden Beispiel 1 angegeben zentrifugiert. Der Rest des Verfahrens ist ähnlich, wobei immer die Möglichkeit besteht, zwei Lebensfähigkeitsmarker mit einer Fluoreszenz im grünen und zwei monoclonale Antikörper mit einer Fluoreszenz im roten Bereich mit verschiedenen Wellenlängen, beispielsweise im Gemisch, zu verwenden. Die Vorrichtung umfaßt also eine Messung von drei Parametern, was die Unterscheidung oder Zählung oder Numerierung so präzise nahe zu stückweise gleichzeitig der lebenden Hefen einer gegebenen Art, der abgestorbenen Hefen der gleichen Art, der lebenden Bakterien einer gegebenen Art, der abgestorbenen Bakterien der gleichen Art, der Gesamtzahl der lebenden Hefen anderer Arten und der Gesamtzahl der lebenden Bakterien anderer Arten erlaubt.
Die Fig. 7 zeigt ein Histogramm einer Population von Candida parapsilosis, die eine Sauce Bearnaise verunreinigen. Es wurde auf der Abszisse der Fluoreszenzkanal aufgetragen und auf der Ordinate die Anzahl der Mikroorganismen pro Kanal.

Beispiel 5: Suche nach der Gesamtzahl der Bakterien in Rohmilch.

Die Rohmilch wird behandelt, um die Caseinmizellen zu zerstören und wird anschließend zentrifugiert. Der Bodensatz wird in einen Puffer, wie in Beispiel 1 beschrieben, aufgenommen, wobei zusätzlich mehrere Tropfen eines geeigneten Detergenses wie Tween 20 zugesetzt werden. Die Verfahrensfolge ist ähnlich. Jedenfalls können sich alle somatischen Zellen der Milch färben. Man nimmt dann eine gleichzeitige Messung und Zählung der Fluoreszenz und der Größe der Teilchen durch Impedanzmessung vor, was die Unterscheidung der Bakterien (weniger als 1 mm groß) von den somatischen Zellen (etwa 10 um oder größer) erlaubt.

Beispiel 6: Suche nach pathogenen Bakterien in menschlichen biologischen Flüssigkeiten, wie der Cerebrospinalflüssigkeit oder Urin.

Der vorzeitige Nachweis einer Meningokokken-Meningitis kann direkt aus der Cerebrospinalflüssigkeit durch Zentrifugation und Anfärben des Bodensatzes durch spezifische, im Handel erhältliche, monoclonale Antikörper durchgeführt werden. Die Züchtung des spezifischen Mikroorganismus ist nicht mehr notwendig, da die Empfindlichkeit der Vorrichtung ausreichend ist. Der positive Lebensfähigkeitsmarker wird gleichzeitig verwendet, um den metabolischen Zustand der Zellen festzustellen. Auf ähnliche Weise können Bakterien (Bakteriämie) oder Parasiten im Urin beispielsweise untersucht werden.
Die Fig. 8 zeigt den Nachweis und die Zählung der Enterokokken in einer Urinprobe.

Beispiel 7: Rasche Zählung der Hefen in einer Braupfanne.

Die Hefensuspension, die in einer Braupfanne vorhanden ist, wird in NaCl auf 9 g/l so verdünnt, daß eine Zelldichte zwischen 5000 und 50.000/ml erhalten wird. Eine Lösung eines adäquaten Lebensfähigkeitsmarkers wird in einer Konzentration von 1 % zugesetzt. Eine 5-minütige Inkubation bei 45ºC färbt die Hefen an, die man dann präzise stückweise mit einer erfindungsgemäßen Vorrichtung in weniger als 1 min zählen oder numerieren kann.

Beispiel 8: Rasche Zählung von Hefen in einem Sauerteig.

Man geht wie in Beispiel 7 vor.

Beispiel 9: Keimtest der Schimmelpilzsporen und rasche Zählung der gekeimten Sporen.

Die nützlichen Schimmelpilze werden allgemein in lyophilisiertem Zustand der käseverarbeitenden Industrie geliefert. Ihre Keimung und die Verzögerung bis zu ihrem Erhalt können dadurch bestimmt werden, daß man sie auf einen Keimungspuffer gibt, der für das Aufblähen ihrer Wände günstig ist, insbesondere phosphatgepufferte Kochsalzlösung, die mit einer energetischen Substanz, wie Glukose, Saccharose, Fructose etc., versetzt ist oder ggf. ein Nährmedium.
Nach 4- bis 6-stündiger Inkubation macht die Aufblähung der Sporenwände sie für die Lebensfähigkeitsmarker permeabel, die so wie in Beispiel 7 verwendet werden.
Die Analyse der Probe in der erfindungsgemäßen Vorrichtung erlaubt nach einer adäquaten Verdünnung mit einer Verzögerung im Bereich 1 min die Bestimmung des Prozenzsatzes der gekeimten Sporen und ihrer Gesamtzahl.

Beispiel 10: Verfolgung der Züchtung einer Hefenpopulation und der sich daraus ergebenden Fermentation.

Eine Hefenpopulation wird in Bierwürze in einer Konzentration von 10&sup6; Zellen/ml inokuliert. Eine Lösung des Lebensfähigkeitsmarkers, der die Hefen spezifisch markiert, wird in einer Konzentration von 1 % zugesetzt. Eine 5-minütige Inkubation bei 45ºC färbt die Hefen an, die man anschließend mit Hilfe eines geeigneten Durchflußcytometers zählen kann. In diesem Falle kann man einerseits bestimmen, daß die Anzahl der lebensfähigen Zellen abnimmt und andererseits, daß die mittlere Stoffwechselaktivität der Population ansteigt (mittlere Intensität der Fluoreszenz auf den Histogrammen): Die Gesamtaktivität der Population steigt (geglückte Fermentation), selbst wenn die Anzahl der Zellen nicht steigt (Anzahl gegeben durch die klassischen Verfahren) (Fig. 9).
Die Fig. 9 zeigt die Entwicklung der Lebensfähigkeit und der Vitalität einer Hefenpopulation (Saccharomyces cerevisiae) in einer Bierwürze bei 10 bis 12ºC im Verlauf der Zeit.
Die Fig. 9a ist eine Entwicklungskurve der Zahl der Zellen im Verlauf der Zeit. Eine Probenvorabnahme und eine Zählungen wurden zur Zeit Null (Fig. 9b), nach 20 h (Fig. 9c, nach 60 h (Fig. 9d) und nach 160 h (Fig. 9e) durchgeführt. Man sieht, daß die Anzahl der Zellen im Verlauf der Zeit abnimmt, während sich die Histogramme nach rechts verschieben, was eine Zunahme der Lebensfähigkeit der vorhandenen Zellen zeigt.

Beispiel 11: Vorfolgung der Wirkung einer thermischen Behandlung auf eine Hefenpopulation durch Züchtung in Bierwürze.

Eine Hefenpopulation wird einem thermischen Schock bei 60ºC während 5 min unterworfen (Fig. 10). In dieser Fig. 10 sind auf der Abszisse verschiedene Stämme von Saccharomyces cerevisiae (A, B, C, D) dargestellt, wobei I und II zwei verschiedene Bierwürzen bedeuten, und auf der Ordinate ist die Konzentration der Zellen/ml dargestellt.
Die Populationen werden vor und nach der Behandlung analysiert: erfindungsgemäßes Verfahren: vor der Behandlung: Säule 1; nach der Behandlung: Säule 2 (Antwort in 15 min); Methylenblau-Verfahren: vor der Behandlung: Säule 3; nach der Behandlung: Säule 4 (Antwort in etwa 30 min) und Züchtungsverfahren auf Petrischalen: Säule 5 (Antwort in 3 Tagen). Es wird festgestellt, daß die Entsprechung erfindungsgemäßes Verfahren/Methylenblau-Verfahren vor der thermischen Behandlung, aber nicht nach der thermischen Behandlung zufriedenstellend ist, wobei die verwendete Referenz das Züchtungsverfahren auf Schalen war. Das Ergebnis wird mit einer beträchtlich verringerten Verzögerung erhalten.

Beispiel 12: Suche nach Hefen und Bakterien im Orangensaft.

Die jeweiligen spezifischen Lebensfähigkeitsmarker der Bakterien und der Hefen werden gleichzeitig dem Bodensatz der Zentrifugation von 10 ml pulpehaltigem Orangensaft zugesetzt.
Nach einer 10-minütigen Inkubation bei 40ºC wird die Probe in ein erfindungsgemäßes Cytometer geleitet. Die Fig. 11 erläutert das Ergebnis einer Analyse, in der der linke Gipfel die Bakterienpopulation und der rechte Gipfel die Hefenpopulation zeigt. Die Vorrichtung erlaubt die Bestimmung der Gesamtzahlen der Zellen in jedem Gipfel (Fig. 11).

Beispiel 13: Suche nach einer Bakterienverunreinigung in einem kosmetischen Produkt.

Es wird eine Behandlung und eine Färbung vorgenommen, die dem vorstehend beschriebenen Verfahren ähnlich sind. Die Fig. 12 zeigt das Ergebnis, das mit einem kontaminierten Produkt erhalten wurde. Wenn das Produkt nicht kontaminiert ist, wird kein Fluoreszenzsignal, also ein negatives Ergebnis beobachet.

Claims

1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Mikroorganismen, die normalerweise vorhanden sind oder gegebenenfalls als Verunreinigungen in einem komplexen Medium in flüssigem, halbflüssigem, geliertem oder pastösen Zustand, insbesondere in Lebensmittelprodukten, Hygieneprodukten oder biologischen Flüssigkeiten, vorhanden sind, wobei das Verfahren die Stufen Gewinnung der Probe und Zugabe eines positiven Lebensfähigkeitsmarkers mit der Eignung, lebende Mikroorganismen zu markieren, ausgewählt aus nicht-fluoreszierenden oder wenig fluoreszierenden Substanzen, die in den Mikroorganismus eindringen, wobei die Substanzen dann so gespalten oder modifiziert werden, daß sie ein fluoreszierendes Produkt ergeben, welches dann in seinem Hauptteil oder vollständig im Inneren des Mikroorganismus eingeschlossen wird, umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß man

A. zur spezifischen und selektiven Markierung der Mikroorganismen

a) die Mikroorganismen durch Filtration und/oder Zentrifugation einer im Falle einer flüssigen Ausgangsprobe direkt erhaltenen oder im Falle einer halbflüssigen oder pastösen Ausgangsprobe durch Inkontaktbringen der Probe mit einem Puffer zur Einstellung des pH-Werts des Mediums auf einen alkalischen pH-Wert erhaltenen Probensuspension abtrennt;

b) intrazellulär die Mikroorganismen durch fünf- bis zehnminütige Inkubation mit mindestens einem positiven Lebensfähigkeitsmarker bei 37ºc markiert;

c) die in b) erhaltene Probe mit Ultraschall zehn Sekunden lang behandelt, um die Mikroorganismen zu vereinzeln; und

B. zur Zählung der fluoreszierend gemachten Mikroorganismen

d) die in c) erhaltene Probe durch ein Durchflußzytometer leitet; und

e) mit Hilfe des Durchflußzytometers jeden markierten Mikroorganismus zählt, indem man die intrazelluläre(n) Fluoreszenz(en), die von jedem der Mikroorganismen emittiert wird bzw. werden, mißt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Puffer zur Einstellung des pH- Werts als Medium zur Solubilisation verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorbehandlung weiterhin die Wirkung geeigneter Enzyme umfaßt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroorganismen weiterhin zusätzlich mit mindestens einer Substanz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus anderen positiven Lebensfähigkeitsmarkern, Vitalfarbstoffen, fluoreszierend gemachten Antikörpern und fluoreszierend gemachten Nucleinsäuresonden markiert werden.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikörper aus polyclonalen und/oder monoclonalen, mono- oder polyspezifischen, Anti- Hefen- und/oder Anti-Bakterien- und/oder Anti-Schimmelpilze- und/oder Anti-Parasiten-Antikörpern und polyclonalen und/oder monoclonalen mono- oder polygenerischen Anti- Hefen- und/oder Anti-Bakterien- und/oder Anti-Schimmelpilze- und/oder Anti-Parasiten-Antikörpern ausgewählt sind.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die verwendeten Antikörper durch einen geeigneten Fluorochrom fluoreszierend gemacht werden.