DE69005156T2 - Zelle für Kapillar-Elektrophorese. - Google Patents

Description

• Die vorliegende Erfindung ist eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Identifizieren unbekannter Substanzen. Diese Erfindung betrifft insbesondere die Erkennung großer biologischer Materien, die in einer engen Kapillarbohrung elektrophoretisch getrennt werden und die dann erfaßt werden, indem man die Menge ultravioletter Strahlung mißt, die von den unbekannten Substanzen absorbiert wird, wenn sie durch eine neue Zelle laufen, die innerhalb der Kapillare untergebracht ist.
• Jüngste Entwicklungen in der Biotechnologie haben die Nachfrage von Forschungslaboratorien, gesundheitlichen Einrichtungen und Herstellern von Pharmazeutika nach Vorrichtungen beschleunigt, die in der Lage sind, genau und schnell extrem geringe Mengen anorganischer und organischer Substanzen zu identifizieren. Vorherige Techniken, die die Gas- und Flüssigkeitschromatographie umfassen, sind benutzt worden, um Proben zu überprüfen, deren molekulare Struktur relativ klein ist. Obwohl die Chromatographie erfolgreich eingesetzt werden kann, um Metalle, anorganische Mischungen und kleine organische Ionen auf zulösen, sind die sehr großen und außerordentlich komplexen Moleküle der Aminosäuren, Proteine, Peptide und DNA schwieriger in einer Probe mit unbekannter Zusammensetzung zu isolieren und zu entdecken. Ein weiterer ernsthafter Makel bei chromatographischen Verfahren ist das Dilemma, dem man gegenübersteht, wenn die unbekannte Probe besonders spärlich vorliegt, da die Chromatographie relativ große Mengen des Materials benutzt, das analysiert werden soll. Andere Unzulänglichkeiten, die man erfährt, wenn Flüssigkeitschromatographie durchführt wird, umfassen inkonsistente Muster der Lösemittelbewegung durch das System, die ungleichmäßige Strömungen erzeugt, welche "tote Bereiche" genannt werden, so wie unerwünschte laminare Vermischung entgegen der Volumenbewegung der Fluide.
• Die Elektrophorese ist eine weitere wohlbekannte Prozedur, die es dem Forscher oder Wissenschaftler ermöglicht, unbestimmte Materialien zu bewerten. Ein elektrisches Feld wird über die Länge eines Rohres oder einer Kapillare gelegt, das bzw. die eine Mischung der unbekannten Probe und eine nicht reaktive Flüssigkeit, die oftmals eine Pufferlösung genannt wird, enthält. Das elektrische Feld bewirkt, daß die Bestandteile der unbekannten Probe aufgrund der durch das Feld erzeugten elektrischen Anziehung durch die Kapillare wandern. Unterschiedliche Komponenten innerhalb der Probe jedoch werden aufgrund ihrer unterschiedlichen Schleppkräfte und unterschiedlicher elektrischer Nettoladungen mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten angezogen. Da einander unähnliche Substanzen nicht auf dieselbe Weise auf die Schleppkräfte und die elektrische Anziehung reagieren, werden sie zunehmend in verschiedene Zonen oder Gruppen getrennt, während sie durch die Kapillare fortschreiten. Jedes Band des Materials aus Bestandteilen, die die ursprüngliche ungetrennte Mischung unbekannten Materials bilden, läuft selbst durch die Kapillare. An einem bestimmten Punkt entlang dieses Rohres wird jedes Band untersucht und durch einen Detektor identifiziert. Ein Detektortyp für elektrophoretische Trennungen mißt die elektrische Leitfähigkeit der Bänder in der Kapillare. Ein alternatives Erfassungsschema ist ein Verfahren, das laserinduzierte Fluoreszenz genannt wird. Obwohl diese Technik hochempfindlich ist, ist sie teuer und darauf beschränkt, Verbindungen zu erfassen, die fluoreszieren oder die dazu angeregt werden können. Ein weiteres vorbekanntes System sondiert das unbekannte Material, indem Licht durch das Material gestrahlt und dann gemessen wird, wieviel Licht von dem Material absorbiert wird. Unglücklicherweise bietet der kurze und enge Weg, den das Licht durch die Kapillare läuft, nicht viele Gelegenheiten für die unbestimmte Probe, Photonen zu absorbieren. Die Kapillaren müssen sehr eng gehalten werden, so daß das gesamte Material darin sich leicht ohne Turbulenz oder Wirbelströme bewegen kann, die durch ein ungleichmäßiges radiales Aufheizen über ein größeres Rohr hinweg verursacht werden könnten. Als ein Ergebnis dieser Größeneinschränkung ist ein Hauptproblem, das diesen Ansatz schwer macht, die geringe Erfassungsempfindlichkeit.
• Sowohl die Applied Spectroscopy, Bd. 43, Nr. 2, Februar 1989, Seiten 196 - 201, "Attomole amino acid analysis (Aminosäureanalyse im Attomolbereich) ..." von M. Yu und N.J. Dovichi als auch die EP 0 216 600 A offenbaren ein Analysegerät, welches aufweist: eine relativ enge Kapillarbohrung, die ein Transportmedium enthält, welches eine Substanz trägt, die wenigstens einen Komponentenbestandteil aufweist; einen elektrischen Feldgenerator, der ein elektrisches Feld längs der Bohrung aufprägt; und eine Strahlungsquelle und einen Strahlungssensor, die gemeinsam die Wirkung auf Strahlung messen, die durch einen Abschnitt der Kapillarbohrung hindurchgeht.
• Die verwendeten Kapillarbohrungen sind gleichförmig, und dies erleichtert das Problem der Größeneinschränkung nicht.
• Demgemäß stellt die Erfindung eine Analysevorrichtung zur Verfügung, mit: einer relativ engen Kapillarbohrung, die ein Transportmedium enthält, welches eine Substanz trägt, die wenigstens einen Komponentenbestandteil aufweist; einem elektrischen Feldgenerator, der ein elektrisches Feld längs der Bohrung aufprägt, und einer Strahlungsquelle und einem Strahlungssensor, die zusammen die Wirkung auf Strahlung messen, die durch einen Abschnitt der Kapillarbohrung hindurchgeht, dadurch gekennzeichnet, daß der Abschnitt eine vergrößerte Zone aufweist, die eine Zelle bildet, angeordnet zwischen einem Injektionsende und einem Ausgangsende.
• Da sich die Technologie der genetischen Ingenieurswissenschaften weiterentwickelt, werden Diagnose- und Meßtechniken, die genauer, zuverlässiger und empfindlicher sind, zunehmend wertvoller. Arzte, klinisches Personal und Labortechniker brauchen leistungsfähigere Werkzeuge, um die Kompliziertheiten des genetischen Codes zu erforschen, um die Widerstandsfähigkeit und Brauchbarkeit pflanzlichen und tierischen Lebens dahingehend zu verbessern, die wachsende Weltbevölkerung zu ernähren, und schließlich, um Heilmittel für ererbte Behinderungen und gefürchtete Krankheiten zu entwickeln. Das Problem, ein hochempfindliches und genaues biologisches Erfassungs- und Analysesystem zur Verfügung zu stellen, das die Beschränkungen überwindet, die bekannte Geräte und Techniken beeinträchtigen, hat eine Hauptherausforderung an Gestalter und Innovatoren in der Technik der Biochemie dargestellt. Die Entwicklung eines leistungsfähigen, empfindlichen, erschwinglichen und unfehlbaren Systems zum Erfassen der Komponenten einer unspezifizierten biologischen Probe würde einen großen technologischen Fortschritt für die biochemische und biotechnologische Industrie bedeuten. Die verbesserte Leistungsfähigkeit, die erreicht werden könnte, wenn man eine solche innovative Vorrichtung verwendet, würde ein lang verspürtes Bedürfnis in dem Geschäftsbereich befriedigen und würde es Herstellern von Drogen, Arzneimitteln und biologischen Produkten ermöglichen, wesentliche Aufwendungen an Zeit und Geld zu sparen.
• Das Kapillarzonen-Elektrophorese-Zellsystem, das in dieser Patentanmeldung offenbart und beansprucht ist, bietet eine genaue Erfassung unbekannter biologischer Proben mit Empfindlichkeitswerten und Kostenbegrenzungen, die nicht erreichbar sind, wenn man herkömmliche Analyseverfahren verwendet. Der Schlüssel zu der verbesserten Leistungsfähigkeit, die erreicht wird, wenn die vorliegende Erfindung benutzt wird, ist eine neue Zelle, die integral innerhalb des Erfassungskreises der engen Kapillarbohrung gebildet ist. Das Kapillarzonen-Elektrophorese-Zellsystem ist fähig, injizierte Substanzen mit der bemerkenswerten Empfindlichkeitsschwelle einer Konzentration von einem Teil pro Million Teilen zu erfassen. Dieses Ziel wurde mit einem System erfüllt, das ökonomisch, leicht zu benutzen und hochgradig zuverlässig ist.
• Eine sehr kleine Kapillare mit einem Innendurchmesser ungefähr so dünn wie ein Haar leitet ein Trägerfluid von einem Injektionsende zu einem Ausgangsende. Beide Enden der Kapillare sind in Behälter gelegt, die auch das Trägerfluid enthalten, das üblicherweise eine Pufferlösung genannt wird. Beim Beginn des Trennens werden Mikrogramm einer unbekannten Substanz in das Injektionsende der Kapillare eingeführt. Ein elektrisches Feld wird dann in der Kapillare aufgeprägt. Aufgrund des elektrischen Feldes bewegen sich geladene Komponententeile der unbekannten Probe von einem Ende der Kapillare zu dem anderen Ende. Während der letzten Stufen ihrer Wanderung treten die unspezifizierten Bestandteile der Probe in eine eiförmige Zelle ein. Während sie in der Zelle sind, wird ultraviolettes Licht auf und durch die Zelle gerichtet. Ein Teil des Lichtes wird von der biologischen Probe absorbiert. Der Absorptionswert wird von einem Detektor gemessen und, aufgrund umfassenden und weit verfügbaren Wissens, das angibt, welche Typen von Substanzen unterschiedliche Lichtmengen absorbieren, wird eine Analyse der Probe erhalten.
• Das Kapillarzonen-Elektrophorese-Zellsystem der Anmelderin ist ein Diagnose- und Meßgerät, das eine bisher nicht erreichte Empfindlichkeit beim Erfassen der Bestandteilfaktoren mikroskopischer Proben bietet. Die in dieser Patentanmeldung beanspruchte Vorrichtung liefert ein wirksames, leistungsfähiges und mächtiges Werkzeug, das es Ingenieuren und Wissenschaftlern in der Industrie medizinischer Instrumente ermöglicht, eine Analyseausrustung zu bauen, die das Feld der Biotechnologie, das von kritischer Bedeutung ist, revolutionieren wird.
• Ein Verständnis weiterer Ziele und Aufgaben der vorliegenden Erfindung und ein vollständiges und umfassenderes Verstehen dieser Erfindung kann erreicht werden, indem man die folgende Beschreibung einer bevorzugten Ausführungsform studiert und indem man sich auf die beigefügten Zeichnungen bezieht.
• Figur 1 ist ein schematisches Schaubild, das ein Kapillarzonen-Elektrophorese-Zellsystem darstellt.
• Figur 2 ist eine Seitenansicht der Zelle, die die Linien des elektrischen Feldes und des Isopotentials zeigt.
• Figur 3 ist eine Seitenansicht der Zelle, die auch Bänder der gelösten Stoffe zeigt, die aus der Pufferlösung erzeugt werden, welche durch einen Strahl ultravioletter Strahlung strömt.
• Figur 4 ist ein schematischer Vergleich des Photonenflusses und der Weglänge durch drei Kapillarquerschnitte unterschiedlicher Größe.
• Figur 5 ist ein Vergleich normierter erfaßter Bänder, der die Verringerung des Rauschens zeigt, der durch das Verwenden aufeinanderfolgender größerer Zelldurchmessergrößen erreicht wird, die im Querschnitt in Figur 4 gezeigt sind.
• Figur 6 ist eine graphische Darstellung, die das Ansprechen des Detektors gegenüber der Konzentration eines erfaßten gelösten Stoffes auf zeichnet und welche die gewünschte lineare Kennlinie der vorliegenden Erfindung veranschaulicht.
• Figur 7 ist eine graphische Darstellung, die die Empfindlichkeit des Kapillarzonen-Elektrophorese-Zellsystems zeigt. Der scharfe Abfall in der Kurve von links nach rechts zeigt die abrupte Änderung der Extinktion eines Proteinäquivalents, das in der Zelle mit einem Konzentrationswert von nur einem Teil pro Million Teilen vorliegt.
• Figur 8 ist eine schematische Seitenansicht einer Glasdrehbank, die benutzt wird, um die neue Kapillarzonen-Elektrophoresezelle herzustellen.
• Figur 1 ist eine schematische Darstellung eines Kapillarzonen-Elektrophorese-(CZE)-Zellsystems, welches eine enge Kapillarbohrung 10 umfaßt, die ein Injektionsende 12, welches in einem Injektionsbehälter 14 liegt, hat. Die Kapillare 10 wird aus geschmolzenem Silika hergestellt und mißt etwa 50 Mikron längst ihres Innendurchmessers, obwohl Mikro-Kapillarbohrungen unterschiedlicher Größe von dem Erfinder ins Auge gefaßt werden. Der Injektionsbehälter 14 speist die Kapillare 10 mit einem elektrolytischen wässrigen Medium konstant-isokratischer Lösung, so wie einer einfachen Salz- oder Pufferlösung 15. Eine Probe 16 mit unbekannten Bestandteilen 17 wird in das Injektionsende 12 eingeführt, indem das Ende 12 zeitweilig in ein Probenröhrchen (nicht gezeigt) eingetaucht wird und in dem eine kleine Menge der Probe 16 durch die Anwendung von Spannung oder Druck in die Kapillare 10 gezogen wird. Eine Hochspannungs-Energieversorgung 12 wird an eine positive Elektrode 18 geschaltet, die in dem Injektionsbehälter 14 liegt. Ein Erdkabel 14 verbindet die Energieversorgung 22 mit einer negativen Elektrode 26, die auf ähnliche Weise in einem Ausgangsbehälter 28 gelegen ist. Ein Ausgangsende 30 der Kapillare 10 liegt in einem Ausgangsbehälter 28.
• Eine neue Zelle 32 ist innerhalb der Kapillare 10 gebildet und wird mit einer Quelle ultravioletten (UV) Lichtes 38 beleuchtet. In der Beschreibung und den Ansprüchen beziehen sich die Ausdrücke "Behältnis", "vergrößerte Zone" und "Zellbehältnis" auf die Zelle, wie sie in den Zeichnungen dargestellt ist und wie sie in der Beschreibung beschrieben ist. Ein Detektor 42 empfängt Licht von der Quelle 38, nachdem es durch die Zelle 32 gelaufen und von den Komponenten 17 irgendwelcher gelöster Stoffe 16 absorbiert ist, die in der Pufferlösung 15 getragen werden. Der Detektor 42 ist über Drähte 40 mit einer Ultraviolett-Extinktionsschaltung 34 verbunden. Messungen können durch einen Computer 44 oder einen Streifenschreiber (nicht gezeigt) interpretiert und angezeigt werden, der Signale von der Extinktionsschaltung 34 empfängt.
• Figur 2 zeigt eine Ausführungsform der neuen Zelle 32 in großen Einzelheiten. Der kleinste Durchmesser der Zelle 32 wird durch die Entfernung zwischen den Pfeilpaaren dargestellt, die mit "46" bezeichnet sind. Bei der besten Ausführungsform der Erfindung beträgt diese Abmessung 50 Mikrometer (Mikron) und paßt zu dem Innendurchmesser der engen Kapillarbohrung 10 und ist ein Teil der Kapillare 10. Der größte Durchmesser der Zelle 32 ist etwas größer als die Kapillare 10 und ist durch das Pfeilpaar, das mit "48" markiert ist, bezeichnet. Bei dieser Ausführungsform beträgt der maximale Durchmesser 48 der Zelle 32 einhundertfünfzig Mikrometer (einhundertfünfzig Mikron). Ein gekrümmter Abschnitt der Zelle 32 ist mit der Bezugsziffer 50 bezeichnet. Die Endpunkte des gekrümmten Abschnittes 50 der Zelle 32 sind durch Bezugsziffern 52 und 54 markiert. Eine Entfernung 56, die in dem oberen linken Teil der Figur 2 gezeigt ist, stellt die Projektion des gekrümmten Abschnittes 50 der Zelle 32 in Längsrichtung dar. Die Gesamtlänge der Zelle 32 wird durch Bezugsziffern 57 markiert, die am unteren Ende der Figur 2 auftreten. Horizontale Linien 58 veranschaulichen elektrische Feldlinien, die durch den Einfluß der Energieversorgung 22 und die Elektroden 18 und 26 erzeugt werden. Vertikale Linien 60 zeigen Linien gleichen Potentials. Bei dieser Darstellung ist das Volumen der Zelle 32 äquivalent dem Volumen von 1,6 mm der Kapillarlänge. Dieses Volumen wird in Nanolitern gemessen. Dieses bemerkenswert geringe Volumen, das von der Kapillarzonen-Elektrophoresezelle benutzt wird, bildet eine Verbesserung bei der Miniaturisierung von Zellen um volle drei Größenordnungen, die für die Erfassung durch Flüssigkeitschromatographie hergestellt werden.
• Figur 3 zeigt noch eine andere Ausführungsform der CZE-Zelle 32, die einen verlängerten Mittelabschnitt 61 hat, der sich in beide Richtungen auf einen engen Abschnitt 74 zu erstreckt. Der Außendurchmesser der Kapillare 10 wird durch die Bezugsziffer "62" angegeben. Ein Strahl ultravioletter Strahlung 64 wird auf das Zentrum der Zelle 32 gerichtet, so daß die Strahlungsachse 64 senkrecht zu der Längsachse der Kapillare 10 liegt. Die Wellenlänge der benutzten Strahlung liegt üblicherweise in dem Bereich von 200 bis 400 Nanometern (nm). Das Band an der rechten Seite des Zentrums der Zelle 32 stellt eine erste unterschiedliche Gruppe gelöster Stoffe oder Analyte 16 dar, die von links nach rechts wandert, die typischerweise ein Zehntel einer Volumeneinheit aufweist, die ein "Peak" genannt wird. Diese Bänder gelöster Stoffe, mit 66 und 68 bezeichnet, werden oftmals als "Fraktionen von Peaks" bezeichnet, da sie zusammen einem graphischen Peak oder Spitzen eines Elektropherogramms entsprechen, das anwachsende Werte der UV-Lichtabsorption entlang einer Abszisse anzeigt, die nach der Detektorspannung skaliert ist, und längs einer Ordinate, auf der Zeiteinheiten aufgetragen sind. Da jeder Bestandteil 17 einer unbekannten Probe 16 durch die Zelle 32 läuft, nimmt das von den Bestandteilen 17 absorbierte Licht zu und reduziert die Strahlungsmenge, die auf den Sensor 42 fällt. Die sich ergebende graphische Darstellung ist eine Anzahl Gauß'scher Verteilungen, die die Materialien in der Kapillare 10 identifizieren. Bei dieser Darstellung stellt jedes Band 66 und 68, das in Figur 3 gezeigt ist, ein Zehntel der Breite eines typischen engen Peaks dar.
• Die Figuren 4 (a), (b) und (c) zeigen Querschnitte dreier Kombinationen äußerer Kapillaren und eingeschlossener Zellen mit zunehmend größeren Durchmessern, die für das Leiten der Pufferlösung 15 und der gelösten Stoffe 16 verfügbar sind. Die Außendurchmesser 76, 78 und 80 der Kapillaren entsprechen einer 50 Mikron-Zelle 82, einer 150 Mikron-Zelle 84 bzw. einer 200 Mikron-Zelle 86. Die Querschraffur, die innerhalb jeder Zelle 82, 84 und 86 gezeigt ist, stellt die Flußdichte von Photonen dar, die die Zellen treffen, die für die Absorption zur Verfügung stehen. Die vergrößerte optische Weglänge, die durch die größeren Bohrungen geschaffen wird, trägt direkt zu einer Zunahme der Empfindlichkeit und einer begleitenden Abnahme der Rauschwerte bei. Die Empfindlichkeit nimmt mit dem Vielfachen der vergrößerten Photonenweglänge und um die Quadratwurzel der Querschnittsfläche des Weges zu, aufgrund des größeren Strahlungsflusses. Wenn die Zelle 82 in Figur 4 (a) als eine Referenz genommen wird, liefert die Zelle 84 eine Zunahme der Empfindlichkeit von 3 3 oder nahezu eine fünffache Verbesserung der Empfindlichkeit. Die 200 Mikron-Zelle 86 entwickelt eine Empfindlichkeitsleistung von mehr als achtmal derjenigen der Referenzzelle 32, aufgrund des Produktes der vergrößerten Weglänge, 4, und der größeren Strahlungsdichte 4. Die Verbesserung ist tatsächlich noch größer als dieser Wert, da die vorliegende Erfindung das Problem des Streulichtes vermeidet - ein Fluß, der um die Seiten der Zelle läuft -, das vorherige Zellen unverhältnismäßig benachteiligt.
• Die in Figur 5 dargestellten drei Kurven 88, 90 und 92 entsprechen den Ergebnissen beim Verwenden der in Figur 4 gezeigten Zellen 82, 84 und 86. Die drei Kurven sind normiert, um die fortschreitende Verringerung des Signalrauschens zu zeigen. Die Kurve 92, eine Folge davon, daß die 200 Mikron-Zelle 86 benutzt wurde, spiegelt einen wesentlich hinuntergedrückten Rauschwert wieder, verglichen mit Kurve 88, welche die Ergebnisse des Benutzens der Referenzzelle 82 aufzeigt, die nur 50 Mikron Weite hat. Ein Nachteil, der durch das Anheben der Größe der Zelle verursacht wird, ist das Verbreitern der Peaks. Die Figur 5 zeigt, daß die Breite des Peaks 92 geringfügig größer ist als die des Peaks 88. Der Grad des Verbreiterns, der bei diesem Beispiel erfahren wird, beträgt ungefähr zehn Prozent. Da die Auflösung des CZE-Detektors durch die Trennung zwischen den Peaks gemessen wird, setzen breitere Peaks die Leistungsfähigkeit des Systems herab. Die Verschlechterung um zehn Prozent, die hier sichtbar wird, ist jedoch relativ unbedeutend verglichen mit den zehnfachen Zuwächsen an Empfindlichkeit, die durch Verwenden der neuen CZE-Zelle erreicht werden, welche erhöhte optische Weglänge und Fluß liefert.
• Figur 6 zeigt die stark und wünschenswert lineare Kennlinie der vorliegenden Erfindung. Die Kurven 94 und 96 sind graphische Darstellungen des Ansprechens des Detektors in Millivolt (mV) für einen Probenabsorber DMSO. Die Kurve 94 wurde erzeugt, indem ein log-Verstärker in der Meßausrüstung verwendet wurde. Die Verwendung eines log-Verstärkers führt Rauschen in das System ein, jedoch zeigt die sich ergebende Zeichnung eine größere Linearität bei starken Konzentrationen. Die Kurve 96 wurde erzeugt, indem ein Linearverstärker benutzt wurde. Diese Meßart bietet geringeres Rauschen und höhere Empfindlichkeit. Eine log-Operation kann durchgeführt werden, nachdem die Signale über den Rauschwert der Schaltung verstärkt sind, um die Empfindlichkeit der Kurve 96 mit der Linearität der Kurve 94 zu kombinieren. Die erweiterte Linearität beider Kurven 94 und 96 ist weit größer als diejenige, die mit vorherigen Verfahren erreichbar ist, welche die Erfassung bei herkömmlichen Kapillaren ohne die neue Zelle 32, die in dieser Anmeldung beansprucht wird, verwenden, da die neue Zelle 32 dabei hilft, Streulicht zu eliminieren, das sonst die Seiten eines viel kleineren Targets umgehen würde und das nicht durch die gelösten Stoffe 16 laufen würde.
• Figur 7 zeigt die bemerkenswerten Ergebnisse, wenn man weniger als einen Teil mittleren Proteinäquivalents in eine Million Teile Pufferlösung bringt und die Mischung durch den Detektor laufen läßt. Der linke Teil der Kurve 98 ist eine Detektorausgabe, die einen ersten Extinktionswert der reinen Pufferlösung zeigt. Wenn das ein Teil zu einer Million Proteinäquivalent in die CZE-Zelle läuft, nimmt die Extinktion dramatisch zu, wie es durch die verringerte Detektorausgabe angezeigt wird, die in dem rechten Teil der Kurve gezeigt wird, mit 100 bezeichnet. Diese eine Zeichnung drückt anschaulich die Leistung der vorliegenden Erfindung aus, komplexe biologische Substanzen in geringen Konzentrationen zu erfassen.
• Figur 8 ist eine schematische Seitenansicht einer Zellen-Drehbank 102, die benutzt wird, um die neue CZE-Zelle 32 herzustellen. Die Drehbank 102 umfaßt eine Basis 104, in der der Motor 106 verankert ist, der durch eine Antriebswelle 107, getragen von Lagern 110, zum Antreiben von Zahnrädern 108 geschaltet ist. Die Antriebszahnräder 108 wiederum sind gekoppelt, um die Zahnräder 112 und 114 zu treiben, die auf sich drehenden Hohlwellen 113 angebracht sind, welche durch Lager 116 getragen werden. Spannbacken 118 sind auf den Hohlwellen 113 angebracht und schaffen eine Unterstützung für die Kapillare 120 an zwei Punkten. Die Kapillare 120 ist durch den Träger 122 verriegelt und wird von einem Paar Spannbacken 118 gehalten. Der Bediener der Drehbank 102 sieht einen Zentralbereich der Kapillare 126, der durch eine kleine Flamme erhitzt wird, durch ein Mikroskop 124. Mikro-Blasverfahren, die hinunterskalierte Versionen von Techniken sind, die dem Durchschnittsfachmann in der Technik der Glasherstellung wohlbekannt sind, wurden benutzt, um die CZE-Zellen 32 herzustellen. Die Kapillare 120 wird zunächst an einem Ende abgeschmolzen, und dann wird eine Spritze 128 an dem anderen Ende verwendet, um das Volumen darin auf zehn bis zwanzig Prozent Überdruck zusammenzudrücken. Eine Zelle 32 hoher Qualität kann gebildet werden, indem die Kapillare 10 drei oder vier Sekunden lang in einer 1,59 mm (1/16") - Gasflamme gedreht wird.
Betriebsweise des CZE-Systems
• Die bewegende Kraft, die die Trennung der Analyte bei der vorliegenden Erfindung vorantreibt, ist ein elektrisches Feld, das längs der Kapillare aufgeprägt wird. Eine Potentialdifferenz von 30 bis 50 Kilovolt bewirkt, daß Substanzen, die von dem Träger getragen werden, sich von einem Ende des Rohres zu dem anderen bewegen, jedoch hat die Bewegung selbst zwei Komponenten. Die deutlicher in Erscheinung tretende und leichter verständliche der beiden ist die elektrophoretische Migration. Elektrophorese bezeichnet den Prozeß, wenn sich geladene Moleküle in Richtung auf eine entgegengesetzt geladene Elektrode aufgrund der einfachen elektrischen Anziehung ungleicher Ladungen bewegt. Der zweite Grund für die Bewegung der Materialien durch das CZE-System ist ein Phänomen, das elektroosmotischer Fluß genannt wird. Wann immer eine Flüssigkeit in ein Glasrohr gebracht wird, neigen Moleküle in der Flüssigkeit, die eine negative Ladung haben, dazu, an den Wänden des Rohres anzukleben. Positive Ladungen verhalten sich nicht in dieser Weise. Dieses bevorzugte Ankleben oder die Adsorption negativ geladener Moleküle zieht eine dünne Schicht positiv geladener Moleküle über die gesamten Innenwände der Kapillare an. Das elektrische Feld zieht diese positiven Moleküle oder Ionen in Richtung auf die negative Elektrode am Ausgangsende der Kapillare. Die positiven Ionen schleppen weitere Moleküle mit sich, selbst solche, die eine neutrale oder negative Ladung haben. Das Ergebnis ist ein Strom aller Arten unterschiedlich geladener gelöster Stoffe, die sich in Richtung auf das Ausgangsende der Kapillare bewegen. Der elektroosmotische Fluß liefert die Pumpkraft, die Moleküle aller Ladungen in Richtung auf ein Ende des Systems bewegt.
• Die Stärke der elektroosmotischen Kraft, die den Volumenfluß in der Kapillare erzeugt, ist direkt proportional zu dem aufgegebenen elektrischen Feld. Innerhalb der CZE-Zelle ist das Feld geringer als die Stärke des Feldes in der Kapillare aufgrund des größeren Querschnitts leitenden Fluides innerhalb der Zelle. Da das Feld umgekehrt proportional zu der Fluidfläche ist, ist das Feld nur 1/16 so stark in einer Zelle, die einen Durchmesser hat, der viermal größer ist als der der Kapillare. In dieser Zelle ist die osmotische Kraft an der Kapillarwand innerhalb der Zelle auch sechzehnmal schwächer als die osmotische Kraft an den Wänden in dem Rest der Kapillare. Wenn der Fluß konstant wäre, würde diese Kraft zu klein sein und zu einem laminaren Fluß führen, bei dem gelöste Stoffe an dem Rand der Zelle hinter den gelösten Stoffen im Zentrum der Zelle nacheilen würden. Dieser ungleichmäßige Transport würde ein unerwünschtes Streuen der Peaks verursachen und würde die Leistungsfähigkeit des CZE-Systems herabsetzen. Als eine direkte Folge der Gestaltung der vorliegenden Erfindung tritt dieses Problem nicht auf. Da diese osmotische Volumenstromkraft in der Zelle abfällt, fällt auch die Stromgeschwindigkeit in der Zelle proportional zu der Querschnittsfläche der Zelle ab. Wenn der Volumenstrom sich in der Zelle verlangsamt, fallen damit auch die Kräfte, die ihn vorwärts treiben. Das außerordentlich vorteilhafte Resultat ist ein Kräfteausgleich auf die Bänder des Analyts und ein Fehlen von Kräften, die dazu neigen würden, die Bänder zu verzerren und die Peaks zu verbreitern.
Betrachtungen bezüglich der Gestaltungen - Turbulenz
• Eines der Hauptanliegen, denen Rechnung getragen wird, wenn die Zelle 32 gestaltet und hergestellt wird, ist das Verringern der Turbulenz. Ein bedeutendes Merkmal der Erfindung ist die schrittweise Krümmung der Zelle. Scharfe Kanten, Fittings, Dichtungen oder Verbindungen in dem Kapillarkreis, die bei Flüssigkeitschromatographiesystemen üblich sind, würden auch die Leistungsfähigkeit des Detektors verschlechtern und werden vermieden, indem sanft steigende Kurven und Übergänge geschaffen werden. Der gleichmäßige Strom, der sich aus dem sorgsamen Beachten dieser Gestaltungsbeschränkungen ergibt, verhindert die Turbulenz.
- Kapillargröße
• Die beiden Eigenschaften, die zu der Qualität einer Trennung von Materialien in der Kapillare beitragen sind Selektivität, die Fähigkeit, maßgeblich ähnliche gelöste Stoffe zu trennen, und Empfindlichkeit, der Grad, zu dem kleine Mengen gelöster Stoffe erfaßt werden können. Ein CZE-System kann empfindlicher gemacht werden, indem man den Durchmesser der Kapillare erhöht. Größere Kapillarbohrungen sind empfindlicher, da ihr größerer Durchmesser eine längere Weglänge für das Licht liefert, um durch sie hindurchzulaufen. Als eine Folge werden mehr Gelegenheiten geschaffen, daß der gelöste Stoff ultraviolette Strahlung absorbiert. Dieselben Systeme können selektiver gemacht werden, indem man den Durchmesser der Kapillare verringert. Kleine Kapillarbohrungen unterhalb von 50 Mikron im Durchmesser erfahren nicht die unerwünschten radialen Temperaturgradienten, die durch die außerordentliche Wärme geschaffen werden, die bei größeren Systemen erzeugt wird. Diese radialen Temperaturgradienten bewirken, daß der Analyt im Zentrum der Kapillare schneller wandert als der Analyt an dem Rand, was die Peaks verbreitert und die Auflösung herabsetzt. Die unerwünschten thermischen Gradienten beeinflussen die Moleküle der gelösten Stoffe nachteilig, wenn sie getrennt werden, indem die Schärfe der Grenzen der Bänder der gelösten Stoffe verkleinert wird, die sich in der Kapillare bilden. Wenn die Definition dieser Bänder gefährdet wird, werden die "Peaks" der gelösten Stoffe verbreitert und die Selektivität der Trennung wird verschlechtert. Das neue Verfahren und die Vorrichtung, die in dieser Patentanmeldung beansprucht und offenbart sind, lösen die einander widersprechenden Betrachtungen bei der Gestaltung bezüglich der Selektivität und Empfindlichkeit auf, indem überlegene Leistungsfähigkeit geschaffen wird, ohne daß man um ein Qualitätsmaß zugunsten des anderen handeln müßte.
- Vorteile gegenüber Zellen vom Flüssigkeitschromatographietyp
• Die vorliegende Erfindung bietet mehrere bedeutsame Verbesserungen gegenüber herkömmlichen Herstellungstechniken für Flüssigkeitschromatographiezellen. Die Flüssigkeitschromatographie (LC) ist durch eine Zellgröße begrenzt, die eintausendmal größer ist als bei der CZE, und durch eine Zellgeometrie, die Zellen mit scharfen Ecken erzeugt, die als "unüberstrichene Volumina" bekannt sind. Diese Taschen bewirken, daß gelöste Stoffe in der Zelle festhängen, erfaßte Peaks verbreitert werden und die Selektivität herabgesetzt wird. Ein weiterer Nachteil der LC-Zellen ist, daß der Fluß durch sie laminar ist - der Puffer im Zentrum der Zelle bewegt sich am schnellsten, während der Puffer am Rand an den Rändern der Zelle anhaftet. In der Theorie entwickelt der Fluß ein parabolisches Geschwindigkeitsprofil über das Rohr, in dem er strömt. Dieses nichtlineare Profil verschlechtert die Leistungsfähigkeit der Zelle, da die Form jedes Bandes gelöster Stoffe durch diesen ungleichmäßigen Fluß verzerrt ist. Die LC-Zelle muß daher nahezu eine Größenordnung kleiner sein als die kleinsten LC-Peakvolumina, so daß die Peaks nicht verbreitert werden und die Selektivität nicht geopfert wird.
• Das Kapillarzonen-Elektrophorese-Zellsystem liefert ein genaues, mächtiges und zuverlässiges Werkzeug für die Diagnose und Messung über ein breites Spektrum von Anwendungen in Medizin und bei der Herstellung. Diese Erfindung bildet einen großen Schritt vorwärts in den sich ununterbrochen entwickelnden Gebieten der Biotechnologie und der Chemie.

Claims (11)

1. Analysevorrichtung, mit einer relativ engen Kapillarbohrung (10), die ein Transportmedium (15) enthält, das eine Substanz (16) mit mindestens einem Komponentenbestandteil (17) transportiert, einem elektrischen Feldgenerator (18, 20, 22, 24, 26), der ein elektrisches Feld längs der Bohrung einprägt, und einer Strahlungsquelle (38) und einem Strahlungssensor (34, 40, 42), die gemeinsam die Wirkung auf eine Strahlung messen, welche durch einen Abschnitt der Kapillarbohrung hindurchgeht, dadurch gekennzeichnet, daß der Abschnitt eine vergrößerte Zone (32) aufweist, die eine Zelle bildet und zwischen einem Injektionsende (12) und einem Ausgangsende (30) angeordnet ist.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, bei der die Wirkung auf die Strahlung, die durch die vergrößerte Zone (32) hindurchgeht, von der Strahlungsquelle (38) und dem Sensor (34, 40, 42) gemessen wird.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, bei der die Bohrung (10) mit dem Transportmedium gefüllt ist, das eine Pufferlösung (15) mit einer Substanz (16) aufweist, die min destens einen Komponentenbestandteil (17) umfaßt, wobei die Strahlungsquelle und der Sensor in einem Ultraviolett-Absorbanz-Detektor (34) eingebaut sind, mit ferner einen Injektionsreservoir (14), das so angeordnet ist, daß es das Injektionsende (12) der Bohrung aufnimmt, und einem Ausgangsreservoir (28), das so angeordnet ist, daß es das Ausgangsende (30) der Bohrung aufnimmt, wobei das Injektions- und das Ausgangsreservoir (14, 28) die Pufferlösung oder die Substanz (16) enthalten können, und mit einer Leistungsversorgung (22), die mit einer ersten Elektrode (18) und einer zweiten Elektrode (26) verbunden ist.

4. Vorrichtung nach Anspruch 2 oder 3, bei der die Zelle (32) eine Zellenlänge (57) aufweist, die ungefähr gleich dem Innendurchmesser (48) der Zelle ist.

5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 2 bis 4, bei der die Zelle (32) einen gekrümmten Abschnitt mit einer Projektionslänge (56) des gekrümmten Abschnittes (50) hat, die innerhalb einer Größenordnung eines Außendurchmessers (58) der Zelle liegt.

6. Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei der die Kapillare (10) ultraviolett-durchlässig ist, die Zelle (32) einstückig mit der Kapillare ausgebildet ist, der elektrische Feldgenerator (18, 20, 22, 24, 26) als eine elektrophoretische Vorrichtung zum Bewegen von Bestandteilen der Substanz (16) durch die Kapillare wirkt, die Strahlungsquelle (38) einen Mittelteil der Zelle beleuchtet, und die Vorrichtung ferner eine Verstärkungseinrichtung (34, 44) aufweist, die auf den Strahlungssensor (34, 40, 42) anspricht, um ein elektronisches Ausgangssignal anzuzeigen, das die Konzentration der Substanz in der Zelle angibt.

7. Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei der der Strahlungssensor (42) eine Photodiode ist.

8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei der der Strahlungssensor (42) eine Photovervielfacher-Röhre ist.

9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei der der Strahlungssensor (42) eine Absorption von Ultraviolettlicht durch die Substanz (16) erfaßt.

10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei der der Strahlungssensor (42) von der Substanz (16) emittiertes Fluoreszenzlicht erfaßt.

11. Verfahren zum Identifizieren einer unbekannten Substanzprobe, mit den Verfahrensschritten: Vorsehen einer relativ engen Kapillarbohrung (10) mit einer Zelle (62), die eine vergrößerte Zone zwischen einem Injektionsende (12) und einem Ausgangsende (30) bildet, die im Vergleich zu der Bohrung einen relativ großen Querschnitt hat, und die ein Transportmedium (15) enthält, das mit einer Substanz (16) gemischt ist, welches mindestens einen Komponentenbestandteil (17) aufweist; Aufprägen eines elektrischen Feldes über der Bohrung, um das Transportmedium und die Substanz durch die Bohrung zu bewegen; Richten eines Strahlungsbündels in Richtung auf die Substanz, während diese durch die Zelle hindurchgeht; und Messen eines von der Substanz absorbierten Strahlungspegels, um den Komponentenbestandteil zu identifizieren.