DE69007716T2

DE69007716T2 - Feste Träger aus quaternisierter PEI-Kieselsäure für die Chromatographie.

Info

Publication number: DE69007716T2
Application number: DE69007716T
Authority: DE
Inventors: Sunil V Kakodkar; Hugh E Ramsden
Original assignee: JT Baker Inc
Current assignee: Avantor Performance Materials LLC
Priority date: 1989-08-07
Filing date: 1990-08-06
Publication date: 1994-07-14
Anticipated expiration: 2010-08-07
Also published as: ATE103507T1; JPH0377058A; CA2022741A1; EP0416748A1; DE69007716D1; JP2603150B2; EP0416748B1; CA2022741C

Description

Diese Erfindung betrifft neue feste Verbundphasen-Siliciumdioxid-Produkte, ihre Verwendung bei der Trennung und Reinigung von Proteinen, besonders basischen Proteinen bei hohem pH-Wert und die Herstellung der Verbundphasenprodukte. Insbesondere betrifft diese Erfindung Verbundphasen-Siliciumdioxid- Produkte mit quaternisiertem, nicht vernetztem Polyethylenimin, ihre Verwendung als Festphasenträger zur Säulenfüllung bei der Flüssigchromatographie zur Trennung und Reinigung von Proteinen, besonders von basischen Proteinen mit isoelektrischen Punkten bei hohem pH-Wert, und die Herstellung der festen Träger.
Vor kurzem sind neue Verbundphasenprodukte mit nicht vernetztem, kovalent gebundenem Polyethyleniminopropyltrimethoxysilankieselgel (PEI-PrSi-Kieseigel) und Glasteilchen mit bestimmten Polyethyleniminopropyltrimethoxysilan-Poren (PEI-PrSi-CPG) zur Säulenchromatographie von Hugh Ramsden in seinem US-Patent 4540486, erteilt am 40. September 1985, als zur Trennung und Analyse von Proteingemischen brauchbar beschrieben worden.
Obwohl gefunden wurde, daß solche Verbundphasenprodukte mit PEI-PrSi-Kieselgel und PEI-PrSi-CPG als feste Phasen zur Säulenfüllung bei der Flüssigchromatographie zur Trennung und Reinigung von Proteinen ganz brauchbar sind, waren diese neuen Verbundphasen keine ausreichend starken Kationenaustauscher für bestimmte Proteine, insbesondere Proteine mit niedrigen isoelektrischen Punkten, daß heißt unter etwa 5. Folglich wurden neue Sulfonsäurederivate von N-acylierten Verbundphasen-Siliciumdioxiden mit kovalent gebundenem, nicht vernetztem Polyethylenimin oder Glasteilchen mit bestimmten Poren bereitgestellt, wie in den US-Patenten 4661248 und 4721573 von Hugh Ramsden und David Nau, die am 25. April 1987 bzw. 26. Januar 1985 erteilt wurden, offenbart ist.
Jedoch weder die ursprünglichen Verbundphasenprodukte mit nicht vernetztem, kovalent gebundenem PEI-PrSi-Kieselgel oder PEI-PrSi-CPG noch die Sulfonsäurederivate des N-acylierten PEI-PrSi-Kieselgels oder PEI-PrSI-CPG's sind zum Binden und Trennen basischer Proteine bei einem hohen pH-Wert, wie Cytochrom, Lysozym und dergleichen, besonders brauchbar. Die Festphasenträger der Patente von Ramsden und Nau sind bei niedrigem pH-Wert brauchbare kationische Austauscher. Die Festphasenträger mit PEI-PrSi-Kieselgel und PEI-PrSi-CPG des vorstehend erwähnten Ramsden-Patents sind schwache Anionenaustauscher, die nur bei einem pH-Wert von etwa 8,5 und darunter binden, und es wird erforderlich, die Oberfläche eines solchen Trägers zur Reinigung basischer Proteine zu titrieren oder protonieren.
Deshalb ist es wünschenswert, daß ein Träger auf Feststoffbasis, der ein starker Anionenaustauscher ist, zur Chromatographie von Proteinen verfügbar ist, der für eine schnelle Äquilibrierung empfänglich sein soll und der keine Titration des Trägers benätigt, der eine hohe Kapazität bei hohem pH- Wert aufweist und die Fähigkeit besitzt, basische Proteine mit isoelektrischen Punkten bei hohem pH-Wert, d.h. einem pH-Wert von über etwa 9, zu binden.
Es ist auch wünschenswert, daß ein geeignetes Verfahren zur Herstellung solch eines starken Anionenaustauschers verfügbar ist, mit dem er ohne irgendwelche umfangreichen Produktnebenreaktionen, die für die Oberfläche des festen Verbundphasenträgers schädlich sein würden, erzeugt werden kann.
Feste Verbundphasenträger, die starke Anionenaustauscher für die Chromatographie sind, insbesondere für die Chromatographie basischer Proteine bei hohem pH-Wert, werden durch quaternisierte Verbundphasenprodukte mit PEI-PrSi-Kieselgel und PEI-PrSi-CPG bereitgestellt.
Die neuen Festphasenträger mit quaternisiertem Polyethylenimin werden durch ein Verfahren hergestellt, bei dem das PEI-PrSi-Kleselgel und PEI-PrSi-CPG einer reduktiven Alkylierung durch eine Eschweiler-Clarke-Reaktion unterworfen werden, um theoretisch alle primären und sekundären Amine der Verbundphasen mit PEI-PrSi-Kieselgel und PEI-PrSi-CPG in tertiäre Amine umzuwandeln, gefolgt von der Umsetzung der tertiären Amine des Produkts mit einem Quaternisierungsreagens, wie einem Methylhalogenid, vorzugsweise Methylchlorid, wobei die gewünschten neuen Festphasenanionenaustauscher mit quaternisiertem Polyethylenimin erzeugt werden.
Die festen Träger auf Siliciumdioxidbasis mit kovalent gebundenem, nicht vernetztem Polyethylenimin, die zur Bereitstellung der neuen quaternisierten Festphasenprodukte dieser Erfindung eingesetzt werden, sind die Umsetzungsprodukte von Polyethyleniminopropyltrimethoxysilan mit körnigem Kieselgel oder Glasteilchen mit bestimmten Poren, die für die Zwecke der vorliegenden Erfindung durch die allgemeine Formel:
Siliciumdioxid-PrSi-PEI
gekennzeichnet werden. Der in dieser Erfindung verwendete Begriff Siliciumdioxid-PrSi-PEI meint den festen Verbundphasenträger mit kovalent gebundenem, nicht vernetztem Polyethylenimin, der das Umsetzungsprodukt von (1) entweder a) körnigem Kieselgel mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von etwa 1 bis 200, vorzugsweise 3 bis 70 um, und einer durchschnittlichen Porengröße von etwa 0 bis 100 (0 bis 1000), vorzugsweise etwa 5 bis 100 nm (50 bis 1000 Angström-Einheiten), oder b) Glasteilchen mit bestimmten Poren mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von etwa 1 bis etwa 200 um und einer durchschnittlichen Porengröße von etwa 0, vorzugsweise etwa 4 nm (40) bis etwa 100 nm (1000 Angsträm-Einheiten) mit (2) Polyethyleniminopropyltrimethoxysilan mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von etwa 400 bis etwa 1800 ist. Solche Produkte mit Siliciumdioxid-Prsi-PEI und ihre Herstellung sind in dem vorstehend erwähnten US-Patent 4540486 offenbart und beansprucht. Solche Produkte sind zur Zeit bei J. T. Baker Inc. als BAKERBOND Säulenchromatographiematrizen erhältlich.
Die neuen Festphasenchromatographieträger dieser Erfindung sind quaternisierte Träger mit Siliciumdioxid-PrSi-PEI, bei denen die primären und sekundären Aminogruppen der Polyethylenimin-(PEI)-Einheit in tertiäre Aminogruppen umgewandelt und die tertiären Aminogruppen anschließend mit einem geeigneten Quaternisierungsreagens, das die tertiäre Aminogruppe der PEI-Einheit quaternisieren kann, quaternisiert worden sind.
Folglich können die auf quaternisiertem PEI basierenden Chromatographieträger dieser Erfindung durch die idealisierte allgemeine Formel
Siliciumdioxid-PrSi-(PEI&spplus;) X&supmin;
dargestellt werden, wobei:
Siliciumdioxid-PrSi-PEI wie vorstehend definiert ist,
das +-Zeichen bedeutet, daß alle Aminogruppen der PEI- Einheit durch Alkylierungszusatz von bis zu zwei linearen Alkylresten mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen zu jedem Aminostickstoff in tertiäre Aminogruppen umgewandelt worden sind, und wobei mindestens etwa 30% der tertiären Aminogruppen der PEI- Einheit durch Zusatz eines weiteren linearen Alkylrests mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen zu den Aminostickstoffatomen der tertiären Aminogruppen quaternisiert worden sind,
und X&supmin; ein beliebiges geeignetes Anion bedeutet, aber vorzugsweise ein Chlor-, Brom- oder Jodatom und am stärksten bevorzugt ein Chloratom darstellt. Das PEI ist im allgemeinen zu etwa 30% bis 80% oder mehr der Theorie quaternisiert und ist normalerweise zu etwa 60% bis etwa 70% quaternisiert.
Die direkte Alkylisierungsmethylierung von Siliciumdioxid- PrSi-PEI mit einem Alkylhalogenid, wie Methyljodid, ist nicht zur Herstellung der neuen Festphasenträger mit quaternisiertem Polyethylenimin dieser Erfindung geeignet, weil sich das Alkylhalogenid mit primären und sekundären Aminen unter Bildung N-alkylierter Arten und auch der entsprechenden Säure, zum Beispiel Jodwasserstoffsäure umsetzt, wenn Methyljodid als Alkylierungsmittel eingesetzt wird. Diese Säure würde mit dem Alkylhalogenid zur Quaternisierung konkurrieren und ein unerwünschtes Gemisch alkylierter quaternärer und protonierter quaternärer Produkte erzeugen. Außerdem wurde beobachtet, daß eine solche Umsetzung nicht schnell zum Abschluß kam und stark unterschiedliche Umsetzungsprodukte erzeugte.
Es wurde entdeckt, daß wenn alle primären und sekundären Amine in der PEI-Einheit zuerst durch eine Eschweiler- Clarke-Reaktion in tertiäre Amine umgewandelt werden, deren Produkte durch weitere Umsetzung mit einem geeigneten Quaternisierungsmittel schnell in die gewünschten Verbundphasenprodukte mit quaternisiertem Polyethylenimin dieser Erfindung umgewandelt werden können.
Vorzugsweise werden die primären und sekundären Amine der PEI-Einheit einer reduktiven Alkylierung, vorzugsweise einer Methylierung, in einer Eschweiler-Clarke-Reaktion unter Verwendung von Formaldehyd und Ameisensäure in einem geeigneten Lösungsmittel, wie zum Beispiel entionisiertem Wasser oder Acetonitril, vorzugsweise Acetonitril unterworfen. Die Umsetzung wird im allgemeinen über einen Zeitraum von bis zu etwa 2 bis 3 Stunden bei einer Temperatur von bis zu etwa 80º durchgeführt. Obwohl Formaldehyd und Ameisensäure die bevorzugten Umsetzungspartner für diese reduktive Methylierung sind, ist es auch möglich, Formaldehyd mit Natriumcyanoborhydrid oder Natriumborhydrid in Trifluoressigsäure oder Acetonitril einzusetzen.
Die Siliciumdioxid-PrSi-PEI-Umsetzungspartner, bei denen die primären und sekundären Amine in tertiäre Amine umgewandelt worden sind, werden dann vorzugsweise mit Methylchlorid unter Verwendung eines geeigneten Lösungsmittels, vorzugsweise Acetonitril, bei einer Temperatur von etwa 80º oder mehr und unter Druck, zum Beispiel unter einem Druck von etwa 200 bis 400 psi (140,62 x 10³ bis 281,24 x 10³ kg/m²) über einen Zeitraum von bis zu etwa 30 Stunden quaternisiert. Im allgemeinen werden mindestens etwa 30% und vorzugsweise etwa 60% oder mehr der Theorie der PEI-Einheit quaternisiert.
Die bevorzugten quaternisierten Derivate dieser Erfindung sind diejenigen, bei denen das körnige Kieselgel mit PEI- PrSi-Kieselgel einen durchschnittlichen Teilchendurchmesser von etwa 5 bis etwa 70 um und eine durchschnittliche Porengröße von etwa 5 (50) bis etwa 100 nm (1000 Angström-Einheiten) aufweist und die Polyethyleniminopropyltrimethoxysilan-Einheit ein durchschnittliches Molekulargewicht von etwa 400 bis etwa 1200 aufweist und bei denen etwa 60% oder mehr, vorzugsweise etwa 60% bis 70% der Theorie der PEI-Aminogruppen quaternisiert sind.
Die neuen quaternisierten Derivate der festen Träger auf Siliciumdioxidbasis mit kovalent gebundenem, nicht vernetztem Polyethylenimin dieser Erfindung sind besonders brauchbar als starke Anionenaustauscher zur Säulenchromatographie mit einer hohen Kapazität bei hohem pH-Wert, d.h. einem pH-Wert von über etwa 9, mit der Fähigkeit, basische Proteine, wie zum Beispiel Cytochrom, Lysozym und dergleichen, mit isoelektrischen Punkten über einem pH-Wert von etwa 9 zu binden. Die quaternisierten Produkte erfordern keine Titration, um verwendbar zu sein, und werden schnell äquilibriert. Diese festen Träger trennen basische Proteine mit gut definierten Peaks und guter Selektivität und weisen eine hohe Kapazität bei hohem pH-Wert auf, die eine quantitative Wiederfindung des Proteins ermöglicht. Die neuen Verbundphasenprodukte sind besonders als Füllmaterial für die Säulenchromatographie brauchbar und sind besonders bei einer modernen HPLC-Apparatur geeignet. Das Füllmaterial kann aus verschiedenen Korngrößen bestehen, zum Beispiel von etwa 50 bis etwa 600 Mesh.
Gemäß dieser Erfindung werden deshalb zur Flüssigchromatographie geeignete Chromatographie-Säulen bereitgestellt, gefüllt (als feste Phase) mit dem quaternisierten, kovalent gebundenen, nicht vernetzten Polyethylenimin-Umsetzungsprodukt aus körnigem Kieselgel mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von etwa 1 bis etwa 200, vorzugsweise etwa 3 bis etwa 70 um und einer durchschnittlichen Porengröße von etwa 0 bis etwa 100 (1000), vorzugsweise etwa 5 (50) bis etwa 100 nm (1000 Angström-Einheiten), oder Glasteilchen mit bestimmten Poren mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von etwa 1 bis etwa 200, vorzugsweise etwa 37 bis etwa 177 um, und einer durchschnittlichen Porengröße von etwa 0 bis etwa 800 (8000), vorzugsweise etwa 4 (40) bis etwa 100 nm (1000 Angström-Einheiten) mit Polyethyleniminopropyltrimethoxysilan mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von etwa 400 bis etwa 1800.
Die Produkte, ihre Herstellung und Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung werden durch die folgenden erläuternden Beispiele veranschaulicht, aber nicht beschränkt.
In den folgenden Beispielen sind, sofern nicht anders angegeben, all Prozentangaben Gewichtsprozente und die Temperaturen sind in Grad C angegeben. Der eingesetzte Umsetzungspartner mit PEI-PrSi-Kieselgel ist das J. T. Baker Inc., BAKERBOND Kieselgel-Produkt Nr. 7264-R mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von etwa 40 um, sofern nicht anders angegeben. Die Beispiele 1 bis 12 veranschaulichen die Umwandlung primärer und sekundärer Amingruppen in PEI-PrSi-Kieselgel in tertiäre Amingruppen.

BEISPIEL 1

Einer Aufschlämmung von 15 Gramm PEI-PrSi-Kieselgel in 50 ml entionisiertem Wasser in einem 250 ml-Rundkolben wurden 1,75 ml Formaldehyd und 3,5 ml Ameisensäure zugesetzt. Zusätzliche 45 ml Wasser wurden zugesetzt und die Suspension wurde etwa fünf Stunden auf ein Dampfbad bei einer Temperatur von etwa 98 - 100º gesetzt. Das Produkt wurde abfiltriert, dann mit 2 x 250 ml entionisiertem Wasser, 1 x 250 ml Aceton und 2 x 250 ml Chloroform gewaschen und dann etwa vier Stunden bei etwa 80º getrocknet. Die Elementaranalyse des PEI-PrSi- Kieselgels, bei dem die primären und sekundären Aminogruppen reduktiv zu tertiären Aminen methyliert worden sind, war folgendermaßen: C = 6,7, H = 1,61, N = 2,32, C/N = 2,88.

BEISPIEL 2

Zu 100 ml Trifluoressigsäure in einem mit einem Kühler, einem Rührer, einem Thermometer und einer Stickstoffzuleitung ausgerüsteten Dreihalsrundkolben, durch ein Eisbad auf 0 - 5º abgekühlt, wurden 11,34 g Natriumborhydrid zugesetzt. Es fand eine stark exotherme Umsetzung statt und die Temperatur stieg auf etwa 25º, aber es wurde nicht zugelassen, daß sie 25º überstieg. Nach Abschluß der Natriumborhydridzugabe wurden 7,0 g Paraformaldehyd zugesetzt und das Eisbad wurde entfernt und das Gemisch wurde etwa 10 Minuten gerührt. Dann wurden 15 g PEI-PrSi-Kieselgel in weniger als etwa 5 Minuten zugesetzt und man ließ das Gemisch auf Raumtemperatur erwärmen. Nach etwa vier Stunden wurde Wasser zugesetzt, um das Umsetzungsgemisch zu verdünnen, das dann abfiltriert und mit 2 x 250 ml entionisiertem Wasser gewaschen wurde. Es nahm mehr als 24 Stunden bis zum Abschluß der Filtration in Anspruch und das Produkt zeigte sich gallertartig.
Das feste Produkt wurde etwa 10 Minuten in 200 ml 1 molarem Natriumcarbonat bei Raumtemperatur suspendiert, abfiltriert, mit 2 x 250 ml entionisiertem Wasser und 2 x 250 ml Aceton gewaschen. Elementaranalyse: 3 = 6,85, H = 1,86, N = 2,60, C/N = 2,63.

BEISPIEL 3

Zu 15 g PEI-PrSi-Kieselgel, das in einen mit einem Kühler und einem mechanischen Rührer ausgerüsteten Dreihalsrundkolben eingebracht war, wurden 100 ml Acetonitril zugesetzt, gefolgt von 9 ml Formaldehyd. Die Suspension wurde gerührt und 2,31 g Natriumcyanoborhydrid wurden in einer Portion zugesetzt. Nach etwa zwei Stunden wurde die Umsetzung unterbrochen, das Umsetzungsgemisch abfiltriert, mit 2 x 250 ml entionisiertem Wasser und 2 x 200 ml Methanol gewaschen und dann etwa vier Stunden bei etwa 50 getrocknet. Elementaranalyse: C = 7,55, H = 1,87, N = 2,72, C/N = 2,77.

BEISPIEL 4

Einem 15 g PEI-PrSi-Kieselgel enthaltenden Dreihalskolben wurden 200 ml Acetonitril zugesetzt, gefolgt von 5 ml Formaldehyd und 3 ml Ameisensäure. Das Gemisch wurde mechanisch gerührt und auf etwa 60º erhitzt. Das Gemisch wurde etwa 19 Stunden bei 60º gerührt. Das Gemisch wurde dann auf Raumtemperatur abgekühlt, abfiltriert, mit 2 x 250 ml entionisiertem Wasser und 2 x 250 ml Methanol gewaschen.
Eine ungewöhnlich langsame Filtration fand statt. Das Vakuum wurde etwa 60 Stunden behalten. Die zweite Methanolwäsche wurde nicht vollständig abfiltriert. Der gesamte Feststoff wurde mit Methanol aufgeschlämmt und dekantiert. Danach wurde er wieder abfiltriert, mit 1 x 250 ml Methanol und 2 x 250 ml Aceton in einer weiteren allgemein langsamen Filtration gewaschen und dann etwa vier Stunden bei etwa 80º getrocknet. Elementaranalyse: C = 7,73, H = 1,96, N = 2,41, C/N = 3,20.

BEISPIEL 5

Einem 15 g PEI-PrSi-Kieselgel (0,023 g/Stickstoffatom) enthaltenden Dreihalskolben wurden 200 ml entionisiertes Wasser zugesetzt. Diesem folgte ein Zusatz von 5 ml Formaldehyd und 3 ml Ameisensäure. Das Gemisch wurde gerührt und etwa 18 Stunden auf etwa 98º erhitzt. Danach wurde das Umsetzungsgemisch auf Raumtemperatur abgekühlt, langsam abfiltriert, mit 1 x 250 ml entionisiertem Wasser und 3 x 250 ml Methanol gewaschen und dann etwa vier Stunden bei etwa 80 getrocknet. Elementaranalyse: C = 6,41, H = 1,72, N = 2,07, C/N = 3,09.

BEISPIEL 6

Zu 15 g PEI-PrSi-Kieselgel (0,023 g/Stickstoffatom) in einem 250 ml-Dreihalsrundkolben, der mit einem Kühler, Rührer und Thermometer ausgerüstet war, wurden 150 ml Acetonitril zugesetzt, gefolgt von 2 ml Formaldehyd und 3,5 ml Ameisensäure. Das Gemisch wurde auf etwa 81º erhitzt und bei dieser Temperatur etwa fünf Stunden gehalten, dann auf Raumtemperatur abgekühlt, abfiltriert, mit 3 x 250 ml entionisiertem Wasser und 13 x 250 ml Methanol gewaschen. Das Produkt wurde dann etwa vier Stunden bei etwa 80º getrocknet. Elementaranalyse: C = 7,46, H = 2,02, N = 2,51, C/N = 2,97.

BEISPIEL 7

Zu 20 g PEI-PrSi-Kieselgel in einem mit einem Rührer, Kühler und Thermometer ausgerüsteten Dreihalskolben wurden 100 ml Acetonitril zugesetzt, gefolgt von 2,62 ml Formaldehyd (37 %ige Lösung) und 3 ml Ameisensäure (88 %ige Lösung). Dann wurden 30 ml Acetonitril zugesetzt und das Erhitzen wurde begonnen. Nachdem die Temperatur 50 erreicht hat, wurde das Reaktionsgemisch etwa 5 Stunden bei dieser Temperatur gehalten. Das Produkt wurde abfiltriert, mit 3 x 250 ml entionisiertem Wasser und 3 x 250ml Methanol gewaschen und dann etwa vier Stunden bei etwa 80º getrocknet. Elementaranalyse: C = 7,99, H = 1,48, N = 2,59, C/N = 3,08.

BEISPIEL 8

Die Herstellung des Beispiels 7 wurde wiederholt, nur daß das Umsetzungsgemisch etwa 21 Stunden auf etwa 80º erhitzt wurde. Das Umsetzungsgemisch wurde dann langsam abfiltriert mit 3 x 250 ml entionisiertem Wasser und 3 x 250 ml Methanol gewaschen und etwa vier Stunden bei etwa 80º getrocknet. Elementaranalyse: C = 7,95, H = 1,62, N = 2,58, C/N = 3,05.

BEISPIEL 9

Die Herstellung des Beispiels 7 wurde noch einmal wiederholt, nur daß das Umsetzungsgemisch etwa eineinhalb Stunden auf etwa 80º erhitzt, abfiltriert, mit 3 x 250 ml entionisiertem Wasser und 3 x 250 ml Methanol gewaschen wurde. Das Produkt wurde dann etwa vier Stunden bei etwa 80º getrocknet. Elementaranalyse: C = 8,0%, H = 1,70 , N = 2,56%, C/N = 3,12.

BEISPIEL 10

Die Herstellung des Beispiels 7 wurde noch einmal wiederholt, nur daß die Umsetzungspartner gemischt und etwa 22 Stunden in einem Schüttelbecher bei Raumtemperatur gehalten wurden. Das Umsetzungsgemisch wurde dann abfiltriert, mit 3 x 250 ml entionisiertem Wasser und 3 x 250 ml Methanol gewaschen und etwa vier Stunden bei etwa 80º getrocknet. Elementaranalyse: C = 7,19, H 1,49, N = 2,61, C/N = 2,75.

BEISPIEL 11

Einem 40 g PEI-Prsi-Kieselgel (0,076 g/Stickstoffatom) enthaltenden 500 ml-Dreihalsrundkolben wurden 200 ml Acetonitril zugesetzt, gefolgt von einem Zusatz von 5,25 ml Formaldehyd (37 %ige Lösung) und 6 ml Ameisensäure (88 %ige Lösung). Dann wurden dem Umsetzungsgefäß 100 ml Acetonitril zugesetzt und das Gemisch wurde auf etwa 80º erhitzt und etwa 3 Stunden bei dieser Temperatur gehalten. Das Umsetzungsgemisch wurde dann abfiltriert, mit 4 x 250 ml entionisiertem Wasser und 3 x 250 ml Methanol gewaschen und etwa vier Stunden bei etwa 80º getrocknet. Elementaranalyse: C = 7,53, H = 1,69, N = C,/N = 3,00.

BEISPIEL 12

Das Produkt des Beispiels 11 (20 g), 200 ml entionisiertes Wasser und 2,5 ml Triethylamin wurden in einem Dreihalsrundkolben, der mit einem Rührer, einem Kühler und einem Thermometer ausgerüstet war, gemischt und auf etwa 60º erhitzt und etwa 19 Stunden bei dieser Temperatur gehalten. Dann wurde das Umsetzungsgemisch abfiltriert, mit 3 x 250 ml entionisiertem Wasser und 3 x 250 ml Methanol gewaschen und etwa vier Stunden bei etwa 80º getrocknet. Elementaranalyse: C = 7,56, H = 1,61, N = 2,56, C/N = 2,95.
Die pH-Werte der Verbundphasen (5 %ige Lösung oder 1 g Verbundphase in 20 ml entionisiertem Wasser) der beiden Beispiele 11 und 12 wurden gemessen. Der pH-Wert wurde gemessen, indem zuerst eine Kalibrierung mit zwei Punkten durchgeführt wurde.
Der pH-Wert des Produkts des Beispiels 11 (vor dem Waschen mit Triethylamin) war 5,05. Der pH-Wert des Produkts des Beispiels 12 (nach dem Waschen mit Triethylamin) war 5,27. Diese Ergebnisse zeigen die mögliche Anwesenheit von Formiatsalzkomplexen in Beispiel 11, die das scheinbare C/N-Verhältnis erhöhen. Jedoch zeigt das C/N-Verhältnis nach dem Waschen mit Triethylamin vollständige Methylierung an.
Die Quaternisierung der festen PEI-PrSi-Siliciumdioxid- Träger, bei denen die primären und sekundären Aminogruppen in tertiäre Amingruppen umgewandelt worden sind, wird durch die folgenden Beispiele 13 bis 18 veranschaulicht.

BEISPIELE 13 - 16

Die erschöpfend methylierten Produkte der Beispiele 1, 4, 5 und 6 wurden jeweils der folgenden Bearbeitung unterworfen. Das Produkt aus dem Beispiel wurde in die Glasausfütterung eines Autoklaven eingebracht, 100 ml Acetonitril wurden zugesetzt und die Glasausfütterung wurde in einen 3-Liter- Schüttelautoklav eingebracht. Zusätzliche 100 ml Acetonitrit wurden außerhalb der Glasausfütterung zugesetzt, um innerhalb der Ausfütterung einen Volumenverlust durch Verdampfung zu verhindern. Der Autoklav wurde mit Helium (3 x 300 psi) und dann Methylchlorid (1 x 60 psi) gespült. Der Autoklav wurde mit zwei Sperrventilen zum Zylinder offengelassen, um ein Zurückschlagen in den Zylinder zu verhindern. Der Enddruck war 80 psi (56,248 x 10³ kg/m²). Das Umsetzungsgemisch wurde auf etwa 80 erhitzt und wurde etwa 24 Stunden geschüttelt. Die quaternisierten Produkte wurden etwa 4 Stunden bei etwa 80º getrocknet und analysiert. Die Ergebnisse der Analyse sind in der folgenden Tabelle 1 angegeben. Tabelle 1 Vor Quaternisierung Nach Quaternisierung Beispiel Nr. Umsetzungspartner Beispiel Nr. Elementaranalyse

BEISPIEL 17

In einem 12 g des erschöpfend methylierten Produkts des Beispiels 9 und 150 ml Acetonitril enthaltenden Bombenumsetzungsgefäß wurde das Rühren begonnen und das Gemisch einmal mit Methylchlorid gespült. Nach Äquilibrieren wurde die Methylchloridzufuhr abgestellt und das Erhitzen begonnen, bis eine konstante Temperatur von 80º erhalten wurde. Das Umsetzungsgemisch wurde etwa 19 Stunden bei dieser Temperatur und bei einem Druck von etwa 200 psi (140,62 x 10³ kg/m²) gehalten; danach wurde das Erhitzen abgebrochen und man ließ das Umsetzungsgemisch auf Raumtemperatur abkühlen. Das Produkt wurde abfiltriert, mit 2 x 150 ml Acetonitril und 2 x 150 ml Methanol gewaschen und etwa vier Stunden bei etwa 80º getrocknet.

BEISPIEL 15

Eine andere Quaternisierungsumsetzung wurde in einer mit Beispiel 17 identischen Umsetzung durchgeführt, nur daß 15 g des erschöpfend methylierten, mit Triethylamin gewaschenen Produkts des Beispiels 12 statt des Produkts des Beispiels 9 als Umsetzungspartner eingesetzt wurden.
Die Analyse der quaternisierten Produkte des Beispiels 17 und 15 lieferte die in Tabelle 2 angegebenen Ergebnisse. Tabelle 1 Vor Quaternisierung Nach Quaternisierung Beispiel Nr. Umsetzungspartner Beispiel Nr. Elementaranalyse

BEISPIEL 19

Eine analytische Standardsäule (4,6 mm Innendurchmesser x 50 mm Länge) wird bei hohem Druck (7500 psi) mit einem quaternisierten Derivat des PEI-PrSi-Kieselgels (etwa 5 um), das durch ein wie in Beispiel 13 beschriebenes Verfahren als Verbundphase erhalten wurde, aufgeschlämmt gefüllt. Die Aufschlämmung besteht aus etwa 1,0 Gramm des quaternisierten Derivats des PEI-PrSi-Kieselgels in 10 ml Methanol. Nach Pumpen der Aufschlämmung in die Säule werden dann zusätzliche 100 ml Methanol bei demselben Druck durch die Säule gepumpt. Die Chromatographie einer Proteinprobe, die 7 mg Gesamtprotein (Cytochrom C - Pferdeherz Typ VI; Chymotrypsinogen A - Rinderpankreas; Carboanhydrase - Rindererythrocyten; Conalbumin II - Kuhmilch; Ovalbumin - Hühnerei; β-Lactoglobulin B - Kuhmilch und β-Lactoglobulin A - Kuhmilch) enthielt, wurde auf der Säule mit einem Anfangspuffer (A) von 25 mM Tris bei einem pH- Wert von 7,7 und einem Elutionspuffer (B) von 2 M NH&sub4;OAc bei einem pH-Wert von 5,8 mit einem linearen Gradienten von 100% A zu 100% B über 30 Minuten bei einer Flußrate von 2,0 ml/min bei einem Unterstützungsdruck von 2757,9 kPa (400 psi) durchgeführt. Die Proteine wurden durch UV-Extinktion bei 250 nm bei 0,5 AUFS nachgewiesen. Das Probenvolumen war 100 Mikroliter und bestand aus 7 mg Gesamtprotein in Puffer A. Jedes Protein eluierte als konzentriertes Band, gut von einander getrennt. Typische Massenwiederfindungen für die einzelnen Proteine waren größer als fünfundneunzig Prozent der ursprünglichen Menge in der Probe.

Claims

1. Quaternisiertes Derivat von Verbundphasen-Siliciumdioxid mit kovalent gebundenem, nicht vernetztem Polyethylenimin der Formel

Siliciumdioxid-Prsi-(PEI&spplus;)X&supmin;

wobei Siliciumdioxid-Prsi-PEI die kovalent gebundene, nicht vernetzte Polyethylenimin-Verbundphase ist, erhältlich durch Umsetzen von (1) Siliciumdioxid, nämlich körnigem Kieselgel oder Glasteilchen mit bestimmten Poren, welches einen durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 1 bis 200 um und eine durchschnittliche Porengröße von C bis 100 nm (0 bis 1000 Å) aufweist mit (2) Polyethyleniminopropyltrimethoxysilan mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 400 bis 1800;

das +-Zeichen bedeutet, daß alle Aminogruppen der PEI- Einheit mindestens tertiäre Aminogruppen mit zwei linearen C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylgruppen sind und mindestens 30 % der tertiären Aminogruppen durch eine weitere lineare C&sub1;-C&sub4;- Alkylgruppe quaternisiert sind; und

X&supmin; ein Anion bedeutet.

2. Derivat nach Anspruch 1, wobei X Cl, Br oder I bedeutet.

3. Derivat nach Anspruch 2, wobei X Cl bedeutet.

4. Derivat nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die PEI-Einheit zu mindestens 60 % der Theorie quaternisiert ist.

5. Derivat nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Siliciumdioxid körniges Kieselgel mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 3 bis 70 um und einer durchschnittlichen Porengröße von 50 bis 1000 Å (5 bis 100 nm) ist oder aus Glasteilchen mit bestimmten Poren mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 1 bis 200 um und einer durchschnittlichen Porengröße von 40 bis 1000 Å (4 bis 100 nm) besteht.

6. Derivat nach Anspruch 5, wobei das Siliciumdioxid körniges Kieselgel ist.

7. Derivat nach Anspruch 5 oder 6, wobei das körnige Kieselgel einen durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 5 bis 70 um und die Polyethyleniminopropylsilan-Einheit ein durchschnittliches Molekulargewicht von 400 bis 1200 aufweist.

8. Festphasenextraktionsverfahren zur Reinigung und Trennung von Proteinen mit einem isoelektrischen Punkt über einem pH-Wert von 9, wobei die Festphase ein Derivat nach einem der Ansprüche 1 bis 7 ist.

9. Verfahren zur Herstellung eines Derivats nach einem der Ansprüche 1 bis 7, umfassend:

(1) reduktive Alkyllerung der primären und sekundären Aminogruppen der PEI-Einheit eines Verbundphasen-Siliciumdioxids mit kovalent gebundenem nicht vernetztem Siliciumdioxid-Prsi-PEI, zur Umwandlung der primären und sekundären Aminogruppen in tertiäre Aminogruppen und

(2) Quaternisieren von mindestens 30 % der tertiären Aminogruppen der Siliciumdioxid-PrSi-PEI-Verbundphase.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die primären und sekundären Aminogruppen reduktiv mit Formaldehyd und Ameisensäure alkyliert werden, und die tertiären Aminogruppen durch Umsetzen mit Methylchlorid quaternisiert werden.