DE69007773T2

DE69007773T2 - Elektrophoretische Trennung in einem gelfreien Medium mittels gelösten Polymeren.

Info

Publication number: DE69007773T2
Application number: DE1990607773
Authority: DE
Inventors: Stellan Hjerten; Chen Jeng-Chyh; De Zhu Ming
Original assignee: Bio Rad Laboratories Inc
Current assignee: Bio Rad Laboratories Inc
Priority date: 1990-02-13
Filing date: 1990-02-13
Publication date: 1994-09-22
Anticipated expiration: 2010-02-14
Also published as: EP0442177B1; EP0442177A1; DE69007773D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft elektrophoretische Auftrennungen und Auftrennungen von Spezien in einer Probe auf der Basis der Molekülgröße.
Molekularsiebelektrophorese ist ein wirksames Verfahren, um makromolekulare gelöste Stoffe sowohl voneinander mit hoher Auflösung auf der Basis der Molekülgröße als auch von gelösten Stoffen mit geringerer Molekülgröße zu trennen. Die Gelmedien, in denen diese Auftrennungen stattfinden, erfordern jedoch sorgfältige Herstellung und spezielle Handhabungstechniken, wobei es Probleme bei der Reproduzierbarkeit und Stabilität gibt.
Andererseits ist für bestimmte Arten von Auftrennungen auch Kapillarfreizonenelektrophorese von Interesse, da sie die Verwendung von hohen Spannungen zuläßt, die den Vorteil relativ hoher Geschwindigkeit bieten. Weiters ermöglicht die geringe Größe der Kapillare die Auftrennung extrem kleiner Proben in einer Pufferlösung, ohne daß komplexe Medien, wie Gel oder Papier, verwendet werden, und im wesentlichen ohne Bandverbreiterung. Kapillarfreizonenelektrophorese ist besonders nützlich bei der Auftrennung kleiner Peptide und Proteine. Die Auftrennung tritt jedoch auf der Basis des Ladung/Masse-Verhältnisses ein, und aus diesem Grund lassen sich bestimmte Auftrennungen nach diesem Verfahren nur sehr schwer erreichen, insbesondere jene, an denen Polynukleotide mit hohem Molekulargewicht und viele mit SDS (Natriumdodecylsulfat) behandelte Proteine beteiligt sind.
Für Molekularsiebauftrennungen können Gelmedien in Kapillaren angeordnet werden, aber die Herstellung und Verwendung solcher Gels ist besonders problematisch, da sie bei jeder Verwendung physikalischen und chemischen Veränderungen unterliegen und daher für praktische Zwecke nur einmal verwendet werden können. Das beeinträchtigt die Reproduzierbarkeit der Auftrennungen und den Wirkungsgrad der Technik. Außerdem wirft es ernsthafte Probleme bei jenen Kapillaren auf, die in Patronen enthalten sind, die für die automatisierte Meßgeräteausrüstung bestimmt sind.
Nun ist entdeckt worden, daß Probenionen und insbesondere Biomoleküle auf der Basis der Molekülgröße durch Elektrophorese durch eine wässerige Lösung aus einem nicht-vernetzten Polymer mit einem/einer ausgewählten Molekulargewicht (oder Molekulargewichtsbereich) und Konzentration voneinander getrennt werden können. Das Molekulargewicht des Polymers wird wie nachstehend beschrieben ausgewählt, sodaß es dem Molekulargewichtsbereich der Probenionen so entspricht, daß die Migration der Probenionen durch die Lösung in variierenden Ausmaßen gehemmt wird. Makromolekulare Probenionen und andere biologische Spezien können somit voneinander und von Probenionen mit geringerer Größe getrennt werden, ohne daß ein Gel verwendet wird. Die Begriffe "Makromolekül" und "makromolekular" beziehen sich, wie hierin verwendet, auf Spezien mit einem Molekulargewicht von zumindest etwa 10.000.
Die gemäß vorliegender Erfindung verwendeten Polymeren sind im allgemeinen nicht-vernetzte Polymere. Es können verzweigte oder lineare bzw. geradkettige Polymere verwendet werden, wobei für viele Anwendungen lineare Polymere bevorzugt werden. Außerdem können die Polymeren neutral oder geladen sein, wobei für Anwendungen, bei denen Ladungsinteraktion zwischen den Probenionen und dem Polymer vermieden werden soll, neutrale bevorzugt werden.
Zellulosederivate sind in der Kapillarelektrophorese verwendet worden, um Elektroendosmose und andere Arten von Materialfluß durch eine Erhöhung der Viskosität der Pufferlösung zu unterdrücken, und um auch die Kapillare zu erhalten. Beispielsweise lehrt die JP-A-60259945 die Zugabe sehr kleiner Mengen Hydroxypropylmethylzellulose, um leitende Flüssigkeiten bei elektrophoretischer Analyse einzudicken. Die für diesen Zweck verwendeten Mengen sind jedoch klein, und es besteht keine nennenswerte Tendenz, die Probenionen während ihrer Migration zurückzuhalten oder ihre Auftrennung zu beeinflussen. Die vorliegende Erfindung beruht auf der Entdeckung, daß aufgelöste lineare Polymere im allgemeinen eine Molekulersiebungswirkung ergeben, wenn sie in bestimmten Mengen verwendet werden, wobei diese Mengen im allgemeinen höher als die Mengen der zum Unterdrücken des Materialflusses verwendeten Zellulosederivate sind.
Wässerige Medien mit aufgelösten Polymeren gemäß vorliegender Erfindung können für biomolekulare Auftrennungen im allgemeinen verwendet werden, sind aber von besonderer Nützlichkeit bei Auftrennungen, die in Kapillarsäulen mit hoher Spannung durchgeführt werden. d.h. bei Hochleistungselektrophorese. Die Verwendung von Polymeren auf diese Art ermöglicht die Auftrennung von Spezien mit variierendem Molekulargewicht bei unzureichender oder ohne Variation im Ladung/Masse-Verhältnis, und eignet sich für die einfache Herstellung der Auftrennungsmedien und hohe Reproduzierbarkeit.
Wie bei der oben angeführten bekannten Verwendung von Zellulosederivaten dienen die aufgelösten Polymeren aufgrund ihrer inhärenten Viskositätszunahme weiters dazu, den Materialfluß zu unterdrücken. Beispiele für spontan auftretenden Materialfluß sind Elektroendoosmose, hydrokinetischer Fluß (aufgrund hydrostatischer Gefälle) und Konvektion. Bei diesen Polymermengen schwankt die durch die Gegenwart der Polymeren verursachte Abnahme der Probenionmobilität jedoch sowohl mit der Größe und Konzentration des Polymers als auch mit der Größe des Probeions, ein Merkmal, das bei den geringen Mengen, in denen die Zellulosederivate zur Unterdrückung des Materialflusses verwendet worden sind, nicht auftritt.
Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der nachfolgenden Beschreibung klar werden.
Die in Verbindung mit vorliegender Erfindung verwendeten Polymeren müssen wasserlöslich sein und sind, wie oben angeführt, vorzugsweise linear.
Die Auswahl des Polymers ist optimal auf die im speziellen aufzutrennenden Probeionen abgestimmt. Das Molekulargewicht des Polymers ist beim Treffen dieser Auswahl von primärem Interesse. Im allgemeinen können Polymere mit stark unterschiedlichem Molekulargewicht verwendet werden. Die Auflösung bzw. Trennung der Probenionen verbessert sich jedoch im allgemeinen, wenn das Molekulargewicht des Polymers sich dem Molekulargewichtsbereich der Probenionen nähert. Die besten Ergebnisse werden mit Polymeren erhalten, deren durchschnittliches Molekulargewicht zwischen dem niedrigsten und dem höchsten Molekulargewichtswert der Probeionen liegt, und insbesondere mit Polymeren, deren Molekulargewichtsbereich den Molekulargewichtsbereich der Probenionen abdeckt (d.h. zumindest den gleichen Umfang wie dieser hat). Bei bevorzugten Ausführungsformen hat das Polymer ein durchschnittliches Molekulargewicht, das von etwa 10.000 bis etwa 2.000.000 beträgt und innerhalb des in etwa 0,1- bis etwa 200-fachen, mehr bevorzugt von etwa 0,2- bis etwa 20-fachen, und am meisten bevorzugt von etwa 0,5- bis etwa 2-fachen des durchschnittlichen Molekulargewichts der Probeionen liegt.
Innerhalb dieser Parameter kann der spezielle Polymertyp sehr unterschiedlich sein. Bei wässerigen Systemen sind Beispiele für lineare Polymere, die verwendet werden können, wasserlösliche Zellulosederivate und vollständig wasserlösliche Polyalkylenglykole. Spezifische Beispiele für derartige Zellulosederivate sind Natriumcarboxymethylzellulose, Natriumcarboxymethyl-2-hydroxyäthylzellulose, 2-Hyroxyäthylzellulose, 2-Hydroxypropylzellulose, Methylzellulose, Hydroxypropylmethylzellulose, Hydroxyäthylmethylzellulose, Hydroxybutylmethylzellulose und Hydroxyäthyläthylzellulose. Bevorzugte Zellulosederivate sind jene mit einem äußerst hydrophilen Charakter und folglich hoher Wasserlöslichkeit und minimaler Affinität zu den Probenionen. Methylzellulose wird besonders bevorzugt. Zellulosen werden im allgemeinen durch die Viskosität wässeriger Lösungen charakterisiert, in denen sie bei spezifizierten/-er Konzentrationen und Temperatur aufgelöst werden. Unter Berücksichtigung dieser Tatsache und je nach der Größe der Probenionen, die aufgetrennt werden sollen, kann das Zellulosederivat stark unterschiedlich sein, was dieses Viskositätsmerkmal betrifft. Beispielsweise können Zellulosederivate verwendet werden, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie, bei 25ºC gemessen, Viskositäten im Bereich von etwa 15 Zentipoise bis etwa 17.000 Zentipoise erzeugen, wenn sie mit 2 Gew.-% in Wasser aufgelöst werden, obwohl sie im Kontext der vorliegenden Erfindung in anderen Konzentrationen verwendet würden. Polymere wie diese sind nützlich beim Auftrennen von Polynukleotiden mit Ketten im Bereich von etwa 10 bis etwa 10.000 Basenpaaren. Bevorzugte Zellulosederivate zur Verwendung gemäß vorliegender Erfindung sind jene, die Viskositäten im Bereich von etwa 1.000 bis etwa 10.000 Zentipoise bei 25ºC gemessen hätten, wenn sie als 2%-ige wässerige Lösungen hergestellt würden. Es versteht sich, daß diese Viskositätsmerkmale lediglich als eine Angabe über das Molekulargewicht des Polymers gedacht sind, und nicht als die tatsächliche Viskosität bei der Verwendung im Kontext der vorliegenden Erfindung.
Bevorzugte Polyalkylenglykole sind Polyäthylenglykole mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von zumindest etwa 10.000. Besonders bevorzugt werden Polyäthylenglykole mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von zumindest etwa 20.000, am meisten bevorzugt zumindest etwa 30.000. Als Beispiel können Mischungen von Probenionen mit einem Molekulargewicht im Bereich von etwa 10.000 bis etwa 100.000 mit Polyäthylenglykolen mit einem Molekulargewicht im Bereich von etwa 10.000 bis etwa 100.000 aufgetrennt werden.
Beispiele für verzweigte Polymere, die gemäß vorliegender Erfindung verwendet werden können, sind lösliche Stärken und Stärkederivate. Ein spezifisches Beispiel ist Hydroxypropylstärke.
Es können auch Mischungen von Polymeren verwendet werden, bei denen unterschiedliche Molekulargewichtswerte absichtlich kombiniert sind. Das ist besonders nützlich beim Auftrennen von Probenmischungen mit einem großen Bereich von Molekulargewichtswerten, wodurch für Auftrennung über den gesamten Bereich gesorgt wird.
Die Verwendung geladener Polymere ist eine Möglichkeit, die dem System einen weiteren Auftrennungsparameter verleihen kann. Das ändert die Interaktion zwischen der Spezies und dem Polymer, und kann so je nach der speziellen Mischung von in der Probe vorhandenen Spezien und der Art der angestrebten Auftrennung zwischen diesen Spezien von Nutzen sein.
Die Menge an in der Auflösungslösung aufzulösendem Polymer kann stark variieren und jede Menge sein, die die Retentionszeit der Probenionen in so unterschiedlichem Ausmaß ausdehnt, daß wirksame Auftrennung auf der Basis der Molekulargröße erreicht wird. Klarerweise schwankt das mit verschiedenen Parametern des Systems, einschließlich beispielsweise der Säulenkonfiguration und -länge, dem Vorhandensein und der Wirkung anderer die Auftrennung beeinflussender Faktoren, wie Ladung und elektrophoretische Mobilität, der Molekularstruktur, der Grundviskosität und Interaktivität des Polymers selbst, und dem Bereich der und den Unterschieden zwischen den Molekulargewichtswerten der Probenionen. Das Ausmaß, bis zu dem die Retentionszeiten für die Probenionen ausgedehnt werden sollten, um die besten Ergebnisse zu erzielen, schwankt mit der Probenzusammensetzung und dem verwendeten Polymer. Bei Auftrennungen von makromolekularen Spezien bieten Erhöhungen der Retentionszeit von zumindest etwa 25%, vorzugsweise zumindest etwa 35%, und am meisten bevorzugt zumindest etwa 50%, die besten Ergebnisse. Bei Polyalkylenglykolen, insbesondere Polyäthylenglykolen, ergeben Konzentrationen von zumindest etwa 2 Gew.-%, vorzugsweise zumindest etwa 3%, und am meisten bevorzugt von etwa 3 bis etwa 30 Gew.-%, die besten Ergebnisse. Bei Zellulosederivaten betragen die bevorzugten Konzentrationen zumindest etwa 0,1 Gew.-%, wobei etwa 0,1 bis etwa 30 Gew.-% mehr bevorzugt und etwa 0,1 bis etwa 10 Gew.-% besonders bevorzugt werden.
Zur Durchführung der Auftrennungen gemäß vorliegender Erfindung können Arbeitsbedingungen und Verfahren eingesetzt werden, wie sie bei herkömmlichen elektrophoretischen Auftrennungen eingesetzt werden, einschließlich geeignet ausgewählter Puffersysteme. Die Erfindung ist von besonderer Nützlichkeit bei der Hochleistungselektrophorese, wie sie in Kapillaren durchgeführt wird. Bevorzugte Kapillaren sind jene mit einem Innendurchmesser von weniger als etwa 200 um, mehr bevorzugt weniger als etwa 100 um, und am meisten bevorzugt etwa 25 um bis etwa 50 um. Spannungen von zumindest etwa 1000 V werden bevorzugt, wobei zumindest etwa 3000 V besonders bevorzugt werden.
Die folgenden Beispiele dienen ausschließlich dem Zweck der Veranschaulichung und sollen die Erfindung weder in irgendeiner Weise definieren noch einschränken.
Bei jedem dieser Beispiele wurde Elektrophorese an einem HPE-100 Hochleistungselektrophoreseinstrument, einem Produkt der Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, California, durchgeführt. Es wurden Kapillarröhrchen mit 20 cm Länge und 25 um Innendurchmesser sowie 50 cm Länge und 50 um Innendurchmesser, beschichtet mit linearem Polyacrylamid, wie in der am 14. Juli 1987 an Hjerten ausgegebenen US-PS-4,680,201 beschrieben, verwendet. Es wurde eine Leitfähigkeitsbrücke Modell 31 von Yellow Springs Instrument Co., Yellow Springs, Ohio, verwendet, und die Detektion wurde durch UV-Absorption on-line in der Kapillare selbst durchgeführt. Die Hydroxypropylmethylzellulose wurde von Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, in Pulverform bezogen, spezifiziert durch ihre Viskosität bei Zubereitung als eine wässerige Lösung mit einer Konzentration von 2 Gew.-% und bei 25ºC gemessen. Die spezifizierten Viskositäten betrugen 15, 50, 100 und 4000 Zentipoise, und das pulverige Polymer wird in vorliegender Beschreibung aus Gründen der Zweckmäßigkeit als "15-Zentipoise", "50-Zentipoise-", "100-Zentipoise" und "4000-Zentipoise-Hydroxypropylmethylzellulose" bezeichnet. Die 4000-Zentipoise-Hydroxypropylmethylzellulose hatte schätzungsweise ein durchschnittliches Molekulargewicht von etwa 900.000. Die Methylzellulose wurde ebenfalls von Sigma Chemical Co. bezogen, war ebenso dahingehend spezifiziert, daß sie in einer 2%-igen wässerigen Lösung bei 25ºC eine Viskosität von 4000 Zentipoise erzeugt und wird in vorliegender Beschreibung auf ähnliche Art wie die Hydroxypropylmethylzellulose bezeichnet. Beim Myoglobin handelte es sich um Typ III vom Pferdeherz und beim Albumin um Rinderserumalbumin Fraktion V. Das Myoglobin, Albumin und die Substanz P (der im Gehirn und Verdauungstrakt festgestellte II-Aminosäurepeptidneurotransmitter) wurden ebenfalls von Sigma Chemical Co. bezogen. Die in Beispiel 4 verwendeten DNA-Fragmente waren eine als Low Range Size Standards verwendete Mischung, die von Bio-Rad Laboratories, Hercules, California stammte, und umfaßten Fragmente, die 88, 222, 249, 279, 303,634, 800, 1434 und 1746 Basenpaare enthielten.

BEISPIEL 1

Das vorliegende Beispiel demonstriert die Wirkung von Polyäthylenglykol (PEG) als gelöster Stoff in einem elektrophoretischen Medium, das zum Auftrennen von Myoglobin und Substanz P verwendet wird. Der erste Teil dieses Beispiels dient als ein Kontrolltest, der in Abwesenheit von PEG durchgeführt wurde, während der zweite die Wirkung zeigt, die PEG auf die Bestandteilauftrennung hat.

A. Elektrophorese ohne siebungsförderndes Polymer

Eine Probelösung wurde hergestellt, indem Substanz P und Myoglobin in 10 mM Phosphatpuffer mit pH 2,5 aufgelöst wurden, um Konzentrationen von 100 ug/ml Substanz P und 50 ug/ml Myoglobin zu erreichen. Eine 3 ul-Probe der Lösung wurde elektrophoretisch auf eine beschichtete 20 cm x 25 um Kapillarpatrone geladen, die mit der Pufferlösung gefüllt war. Elektrophorese wurde an der aufgeladenen Probe durchgeführt, indem eine Spannung von 8000 V über die Kapillare angelegt wurde, und zwar bei einer Detektion bei 200 nm mit einem Sensitivitätsbereich von 0,02 AUF (Einheiten dekadischer Extinktion, die dem Endausschlag auf dem Aufzeichnungsgerät entsprechen).
Das Myoglobin eluierte bei einer Retentionszeit von 2,8 Minuten und die Substanz P bei 3,3 Minuten. Es ist anzumerken, daß das Myoglobin rascher durch die Kapillare wanderte als die Substanz P.

B. Elektrophorese in Gegenwart von PEG

Der Versuch von Teil A wurde wiederholt, wobei der einzige Unterschied darin bestand, daß die Pufferlösung in der Kapillare weiters PEG mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von etwa 35.000 in einer Konzentration von 5 Gew.-% enthielt.
Die Probenbestandteile eluierten in einer umgekehrten Eluierungsreihenfolge und mit verlängerten Retentionszeiten. Die Substanz P eluiert zuerst bei 4,9 Minuten, gefolgt von Myoglobin bei 5,9 Minuten.

BEISPIEL 2

Dieses Beispiel veranschaulicht die Verwendung von PEG bei der elektrophoretischen Auftrennung des Monomers, Dimers und Trimers von Albumin. Der erste Teil dieses Beispiels ist ein Kontrolltest, während der zweite die Verwendung von PEG umfaßt.

A. Elektrophorese ohne siebungsförderndes Polymer

Eine Probe wurde hergestellt, indem Albumin als eine Mischung aus dem Monomer, Dimer und Trimer in 10 mM Phosphatpuffer mit pH 2,5 bis zu einer Gesamtalbuminkonzentration von 100 ug/ml aufgelöst wurde. Die Probe wurde unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1A auf die/der gleiche(n) Säule aufgeladen, laufen gelassen und nachgewiesen. Das Ergebnis war ein einzelner spitzer Peak bei einer Retentionszeit von 3,5 Minuten.

B. Elektrophorese in Gegenwart von PEG

Der Versuch von Teil A wurde unter Einschluß von PEG mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von etwa 35.000 bei einer Konzentration von 5 Gew.-% in der Säulenlösung durchgeführt. Monomer, Dimer und Trimer bildeten getrennte Peaks bei Retentionszeiten von 5,6 Minuten, 6,8 Minuten bzw. 7,7 Minuten.

BEISPIEL 3

Dieses Beispiel veranschaulicht mehrere Bedingungen, bei denen wasserlösliche Polymere in der Pufferlösung vorhanden waren, aber aufgrund unzureichender Polymermengen oder aufgrund von Polymerketten mit unzureichender Länge unvollständige oder keine Auftrennung auftrat.

A. Albumin mit 2% PEG mit einem Molekulargewicht von 35.000

Der Versuch von Beispiel 2B wurde wiederholt, wobei statt 5% 2% PEG verwendet wurden. Das Monomer wurde bei einer Retentionszeit von 3,7 Minuten und das Dimer bei 4,0 Minuten nachgewiesen, wobei der Trimerpeak nicht zu unterscheiden war. Der Monomer- und der Dimerpeak überlappten.

B. Albumin mit 5% PEG mit einem Molekulargewicht von 6000

Der Versuch von Beispiel 2B wurde wiederholt, wobei PEG mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 6000 anstelle von 35.000 verwendet wurde. Alle Albuminbestandteile passierten den Detektor als ein einzelner Peak bei einer Retentionszeit von 4,3 Minuten ohne Auftrennung zwischen den dreien.

C. Albumin und Myoglobin/Substanz P mit Hydroxypropylmethylzellulose mit 0,25% 4000-Zentipoise

Eine Lösung wurde hergestellt, indem 4000 Zentipoise-Hydroxypropylmethylzellulose in 0,1 M Phosphatpuffer mit pH 2,5 mit 0,25 Gew.-% aufgelöst wurde. Der Versuch von Beispiel 2B (Albuminprobe) wurde dann wiederholt, gefolgt vom Versuch von Beispiel 1B (Myoglobin und Substanz P enthaltende Probe), wobei in der Kapillare in jedem Fall anstelle der PEG-hältigen Pufferlösung diese Hydroxypropylmethylzellulose enthaltende Pufferlösung verwendet wurde.
Die Monomer-, Dimer- und Trimerbestandteile von Albumin passierten den Detektor gemeinsam als ein einziger Peak bei einer Retentionszeit von 3,1 Minuten. Beim Versuch mit Myoglobin/Substanz P wies das Myoglobin eine Retentionszeit von 3,1 Minuten und die Substanz P eine Retentionszeit von 3,7 Minuten auf, die im wesentlichen die gleichen sind und der gleichen Reihenfolge entsprechen, wie wenn kein Polymer in der Pufferlösung vorhanden war (Beispiel 1A).
Dieses Ergebnis weist darauf hin, daß die Siebungsdurchgänge um die 0,25%Hydroxypropylmethylzellulose zu groß waren, um irgendeine Wirkung auf das Protein zu haben, obwohl sie sehr wohl eine Siebungswirkung bei DNA haben können.

D. 10% Äthylenglykol und 10% Glycerin

Als das Monomer von PEG hat Äthylenglykol ähnliche Hydrophilieeigenschaften. Dieser Versuch zeigt, daß Äthylenglykol und sein Analog Glycerin (1,2,3-Propantriol), wie PEG, beide die Lösungsviskosität erhöhen, aber keines die Siebungswirkung erzeugt, die PEG zuzuschreiben ist. Viskositätssteigerungen an sich sind daher nicht für die Siebungswirkung verantwortlich.
Es wurden getrennte Lösungen hergestellt, von denen eine Äthylenglykol und die andere Glycerin, beide in einer Menge von 10 Gew.-%, in 0,1 M wässerigem Phosphatpuffer mit pH 2,5 enthielt. Zum Vergleich wurde eine dritte Lösung hergestellt, die 0,05% der 4000-Zentipoise-Hydroxypropylmethylzellulose-Lösung im gleichen Puffer enthielt. Die Menge der letzteren entspricht jener, die nach dem Stand der Technik zur Unterdrückung von Materialfluß eingesetzt wurde.
Unter Verwendung einer jeden der drei Lösungen wurde eine Probe, die das Albumin und die Fragmente von Substanz P mit einer Größe im Bereich von 4 bis 11 Aminosäuren enthielt, Elektrophorese unter Verwendung der gleichen Arbeitssäule und -bedingungen wie in Beispiel 2B unterworfen. Beim Vergleichslauf wurden die Substanz P-Fragmente in einzelne Peaks aufgetrennt, aber die Albuminbestandteile passierten den Detektor als ein einziger Peak bei einer Retentionszeit von 2,5 Minuten, was keine Auftrennung zwischen Monomer, Dimer und Trimer zeigt. Beim Versuch mit Äthylenglykol passierten alle Peaks den Detektor in der gleichen Reihenfolge wie beim Kontrollversuch, wieder ohne Auftrennung der Albuminbestandteile in getrennte Peaks. Die Albumin-Retentionszeit betrug 3,4 Minuten. Auch im Glycerinversuch passierten alle Peaks den Detektor in dergleichen Reihenfolge wie im Kontrollversuch, wieder ohne Auftrennung der Albuminbestandteile in getrennte Peaks. Die Albuminretentionszeit betrug 3,5 Minuten.

BEISPIEL 4

Dieses Beispiel veranschaulicht die Auftrennung von DNA-Fragmenten mit unterschiedlichen Längen unter Verwendung des Low Range DNA Size Standards von Bio-Rad Laboratories. Der erste Teil dieses Beispiels ist ein Kontrolltest, während der zweite die Verwendung von Hydroxypropylmethylzellulose bei einer Konzentration umfaßt, die hoch genug ist, um eine Siebungswirkung zu verursachen.

A. Elektrophorese ohne siebungsförderndes Polymer

Eine 3 ul-Probe der Mischung wurde elektrophoretisch auf eine 50 cm x 50 um Kapillare geladen, die mit einer Pufferlösung hergestellt aus 0,089 M tris-Borsäure, 0,002 M Äthylendiamintetraessigsäure und 0,1% Natriumdodecylsulfat mit einem pH-Wert von 8,0 gefüllt war.
Die Detektion wurde bei 260 nm mit einem Sensitivitätsbereich von 0,005 AUF durchgeführt. Die DNA-Fragmente in der Probe passierten den Detektor in drei überlappenden Peaks bei Retentionszeiten von etwa 5-7 Minuten, was auf eine schlechte, wenn überhaupt erfolgte Auftrennung der Fragmente hinweist.

B. Elektrophorese mit Hydroxypropylmethylzellulose in siebungsfördernder Menge

Der Versuch von Teil A des vorliegenden Beispiels wurde wiederholt, wobei der einzige Unterschied darin bestand, daß in der Pufferlösung zusätzlich 0,5% der 4000-Zentipoise-Hydroxypropylmethylzellulose enthalten waren. Das Ergebnis bestand in diesem Fall darin, daß die neun Größen von DNA-Fragmenten gut aufgetrennt waren, mit den in Tabelle I angeführten Retentionszeiten: Tabelle I ELEKTROPHORESE VON DNA-FRAGMENTEN Fragmentgröße Retentionszeit Basenpaare Minuten

BEISPIEL 5

Dieses Beispiel veranschaulicht die Auftrennung einer Mischung aus zumindest 15 Längen an DNA-Fragmenten, wobei sich die Längen beginnend mit 246 Basenpaaren um 123 Basenpaare unterscheiden. Methylzellulose wurde verwendet, um die Siebungswirkung zu erzielen.
Eine 3 ul-Probe der Mischung wurde elektrophoretisch auf eine 50 cm x 50 um-Kapillare geladen, die mit einer Pufferlösung hergestellt aus 0,089 M tris-Borsäure, 0,002 M Äthylendiamintetraessigsäure und 0,5% der 4000-Zentipoise-Methylzelluloselösung mit einem pH-Wert von 8,0 gefüllt war.
Die Detektion wurde bei 260 nm mit einem Sensitivitätsbereich von 0,005 AUF durchgeführt. Die Fragmente passierten den Detektor als getrennte Peaks mit den in Tabelle II angeführten Retentionszeiten: TABELLE II ELEKTROPHORESE VON DNA-FRAGMENTEN Fragmentgröße Retentionszeit Basenpaare Minuten

BEISPIEL 6

Dieses Beispiel demonstriert das Fehlen von Wirkung von 1% Hydroxypropylmethylzellulose auf die Mobilität kleiner Ionen, wobei ein Mengenbereich des Polymers eingesetzt wurde, der Mengen einschließt, die in den vorangehenden Beispielen siebungsfördernd sind. Der gelöste Stoff ist in diesem Fall Natriumchlorid.
Die in dieser Gruppe von Tests verwendeten Polymeren waren 15-Zentipoise-, 50-Zentipoise-, 100-Zentipoise- und 4000-Zentipoise- Hydroxypropylmethylzellulosen (HMCs). Jeder HMC-Typ wurde mit 1 Gew.-% sowohl in Wasser als auch in 20 mM wässeriger Natriumchloridlösung aufgelöst. Die Leitfähigkeiten der resultierenden Lösungen wurden dann als Anzeigen der Wirkung des Polymers auf die Mobilität der Natrium- und Chloridionen gemessen und verglichen. Die Ergebnisse sind die in nachstehender Tabelle III angeführten. TABELLE III LEITFÄHIGKEIT VON NaCl-LÖSUNGEN verwendeter HMC-Typ (Zentipoise) Leitfähigkeit in Wasser Leitfähigkeit in 20 mM NaCl
* Kontrolle: kein Polymer vorhanden
Der Mangel an Veränderlichkeit der Zahlen in der rechten Spalte zeigt an, daß die Mobilität der Natrium- und Chloridionen durch das Vorhandensein des Polymers nicht verändert wird.

Claims

1. Verfahren zum Auftrennen einer Mischung aus Probenionen mit unterschiedlichem Molekulargewicht in einer Probe in Bestandteile, wobei das genannte Verfahren das elektrophoretische Hindurchschicken der genannten Probe durch eine Trennsäule umfaßt, die eine gelfreie wässerige Lösung aus einem im wesentlichen linearen Polymer mit einem Molekulargewicht von 10.000 bis 2.000.000 enthält, wobei das genannte Molekulargewicht in einem Bereich von 0,1- bis zum 200-fachen des durchschnittlichen Molekulargewichts der genannten Probenionen in der genannten Mischung liegt, wobei die Konzentration des genannten Polymers in der genannten Lösung ausreicht, um die Retentionszeit der Probenionen in der genannten Trennsäule auf so unterschiedliche Ausmaße auszudehnen, daß wirksame Trennung auf Basis der Molekülgröße erreicht wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die genannten Probenionen makromolekulare Spezien sind und die genannte Konzentration des genannten Polymers ausreicht, um die Retentionszeit der genannten makromolekularen Spezien in der genannten Säule gegenüber der Retentionszeit, die in Abwesenheit des Polymers erreicht würde, um zumindest 50% zu erhöhen.

3. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das genannte Polymer ein durchschnittliches Molekulargewicht aufweist, das in einem Bereich vom 0,5- bis zum 2-fachen des Durchschnitts aus dem geringsten und dem höchsten Molekulargewicht der genannten Probenionen liegt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die genannte Trennsäule ein Kapillarröhrchen mit einem Innendurchmesser von 25 um bis 50 um ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die genannte Trennsäule ein Kapillarröhrchen mit einem Innendurchmesser von weniger als 100 um ist und das Hindurchgehen der Probe durch dieses hindurch erreicht wird, indem über das genannte Kapillarröhrchen eine Spannung von zumindest 3000 V angelegt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das genannte Polymer ein Polyäthylenglykol mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von zumindest 30.000 ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem die Konzentration des genannten Polymers in der genannten Lösung von 3 bis 30 Gew. -% beträgt.

8. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das genannte Polymer ein wasserlösliches Zellulosederivat ist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem das genannte wasserlösliche Zellulosederivat dadurch gekennzeichnet ist, daß die Viskosität einer 2%igen wässerigen Lösung davon bei 25ºC in einem Bereich von 1.000 Zentipoise bis 10.000 Zentipoise liegt und die Konzentration des genannten Polymers in der genannten Lösung zumindest 0,1 Gew.-% beträgt.

10. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Probenionen Polynukleotidketten umfassen, die jeweils von etwa 10 bis etwa 10.000 Basenpaaren enthalten, und worin das genannte im wesentlichen lineare Polymer aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Methylzellulose, Hydroxypropylmethylzellulose, Hydroxyäthylmethylzellulose und Hydroxybutylmethylzellulose besteht, wobei das genannte Polymer dadurch gekennzeichnet ist, daß die Viskosität einer 2%igen wässerigen Lösung davon bei 25ºC im Bereich von 1.000 Zentipoise bis 10.000 Zentipoise liegt und die Konzentration des genannten Polymers in der genannten Lösung von 0,1 bis 0,5 Gew.-% beträgt.