DE69031682T2

DE69031682T2 - Thionin Färbungstechnik

Info

Publication number: DE69031682T2
Application number: DE69031682T
Authority: DE
Inventors: Petrus S Oud; David J Zahniser
Original assignee: Cytyc Corp
Current assignee: Cytyc Corp
Priority date: 1990-03-07
Filing date: 1990-12-27
Publication date: 1998-03-05
Anticipated expiration: 2010-12-28
Also published as: JP3069667B2; EP0445434A2; DE69031682D1; EP0445434B1; EP0445434A3; US5168066A; JPH0658926A

Description

Bereich der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft die Analyse von Zellen-Material. Speziell betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Färben von Zellen für eine zytologische oder histologische Analyse unter Ausbilden eines Kontrasts zwischen dem Kern-Anteil der Zelle und dem Zytoplasma-Anteil. Die Analyse kann automatisiert oder manuell durchgeführt werden.

Hintergrund der Erfindung

Eine traditionelle mehrfarbige Färbung ist zum Färben von Zellabstrichen für bestimmte zytologische Analysen wünschenswert. Dies ist vorteilhaft, da der Kern und das Zytoplasma der gefärbten Probe unterschiedlich gefärbt sind. In einem bevorzugten Färbeverfahren ist das Zytoplasma transparent, während der Kern transparent bis opak ist. Dieses Färbemuster erlaubt dem Zytologen, Zellen zu unterscheiden, die morphologisch anormal sind. Außerdem sehen Zytologen die Verschiedenheit von Farben der traditionellen Färbungen, speziell die Papanicolaou-Färbung, als hilfreich zur Reduzierung der Spannung für das Auge und zur Unterstützung der Diagnose an.
Jedoch sind die traditionellen Färbungen einschließlich der Papanicolaou-Färbung für ein automatisiertes System schwierig zu analysieren. Die Unterschiede von Farben im Zytoplasma nach Anfärbung mit traditionellen Farbstoffen, die für das menschliche Auge klar zu unterscheiden sind, lassen sich nicht einfach mit automatisierten Systemen analysieren, da sie in unterschiedlichen Graden einen Kontrast mit der traditionellen Hämatoxylin- Anfärbung des Kerns ergeben. Der variable Kontrast macht eine automatisierte Analyse unzuverlässig.
Eine Anzahl von Forschern hat Algorithmen in dem Versuch entwickelt, eine automatische Analyse von Zellen zu erreichen, die mit der Papanicolaou-Färbung gefärbt sind. Die meisten Verfahren schließen die Verwendung verschiedener instrumenteller Artefakte ein, beispielsweise von Licht verschiedener Farben, Filtern und Farbfernseh-Kameras. Viele erfordern einen hohen Grad an ausgeklügelter Vorgehensweise, die in Bezug auf Hardware und Software kostenaufwendig ist. Außerdem hat sich herausgestellt, daß diese Ansätze nicht genau und zuverlässig genug sind, um in klinischen zytologischen und histologischen Diagnosen in weitem Umfang angewendet zu werden.
In dem Dokument "Analytical and Quantitative Cytology and Histology, Band 11, Nummer 2, April 1989" werden die charakteristischen Färbe-Eigenschaften einer standardisierten Thionin-Eosinsäure-Färbung mit denjenigen der herkömmlichen Hämatoxylin-Eosin- Verfahrensweise verglichen.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Analyse von Zellen zu schaffen, bei dem die Zellen mit mehreren Farbstoffen gefärbt werden und der Kern- Anteil sowohl bei einer Analyse mit einer automatisierten Apparatur als auch bei einer Analyse mit manueller Handhabung und Beobachtung klar von dem Zytoplasma-Anteil unterscheidbar ist.
Es ist eine weitere Aufgabe, ein Verfahren zur Analyse von Zellen zu schaffen, bei dem die charakteristischen Eigenschaften der gefärbten Zellen exakt sowohl bei manuellen Verfahrensweisen als auch bei automatisierten Verfahrensweisen der Analyse bestimmt werden können.
Andere Aufgaben der Erfindung sind zum Teil offensichtlich und werden zum Teil nachfolgend offenbar.

Zusammenfassung der Erfindung

Das Verfahren zur Analyse von Zellen in Übereinstimmung mit der Erfindung kann verwendet werden als Teil eines automatisierten Analyse-Systems und bei manueller Analyse. Es umfaßt das Färben eines Zellen-Materials mit einem Thionin-Farbstoff, der einen klaren Kontrast zwischen dem Kern-Anteil und dem Zytoplasma-Anteil bei Bestrahlung mit Infrarot-Energie ergibt. In einem weiteren Schritt wird das Zellen-Material mit einem Farbstoff gegengefärbt, der infrarotes Licht in einem Umfang absorbiert, der von der Absorption des Thionin-Farbstoffs unterscheidbar ist. Ein anderer Schritt schließt das Bestrahlen des gefärbten Zellen-Materials mit Energie im Infrarot-Bereich des Spektrums ein, und ein weiterer Schritt schließt das Abbilden des gefärbten Zellen-Materials mit der Abgabe-Energie aus der Wechselwirkung der Infrarot-Energie mit dem gefärbten Zellen- Material ein.
Die Verbesserung dieses Verfahrens gegenüber dem Stand der Technik schließt das Bestrahlen des Zellen-Materials, das vorher mit dem Thionin-Farbstoff gefärbt wurde, mit Energie im Infrarot-Bereich des Spektrums ein. Es wurde nun gefünden, daß eine mildsaure, organische Thionin-Färbeverbindung stark absorbierend im Infrarot-Bereich des Spektrums sein kann, wenn sie an Kern-Material gebunden wird. Dies ermöglicht es, daß physiologische Paramenter der individuellen Zell-Komponenten, d.h. Größe, Konfiguration und Struktur, unterschieden und unter Infrarot-Bestrahlung analysiert werden. Der Abbildungsschritt schließt vorzugsweise den Nachweis der abgegebenen Energie mit einer für Licht empfindlichen, optoelektronischen Wandler-Vorrichtung ein, die Photovervielfacher, Festkörper-Photodetektoren, Detektor-Anordnungen und Fernsehkameras ein schließen kann. Der Abbildungschritt schließt vorzugsweise das digitale Darstellen des gewandelten Bildes zur computerisierten Analyse und pathologischen Diagnose des gefärbten Zellen-Materials ein.
Der im Ralimen des Verfahrens der vorliegenden Erfindung verwendete Thionin-Farbstoff besteht aus einem Thionin-Salz, das vorzugsweise Thioninacetat ist, einem organischen Lösungsmittel, das vorzugsweise ein Alkohol mit niedrigem Molekulargewicht und noch mehr bevorzugt Methanol ist, und einem Puffer für den pH-Wert. Ein bevorzugter Puffer für den pH-Wert wird hergestellt mit Eisessig und destilliertem Wasser unter Zugabe von 5N NaOH bis auf einen pH-Wert von etwa 4,9.
Der Thionin-Farbstoff wird in Kombination mit einer Gegenfärbung verwendet, die den Zytoplasma-Anteil unter sichtbarem Licht sichtbar macht. In einer praktischen Anwendung der Erfindung wird das Zellen-Material mit der Thionin-Verbindung gefärbt, in einem Alkohol mit niedrigem Molekulargewicht gespült und anschließend mit einer traditionellen Papanicolaou-Färbung gegengefärbt. Bei einer anderen praktischen Anwendung der Erfindung ist die Gegenfärbung ein Farbstoff des Eosin-Typs. Der Papanicolaou-Farbstoff erzeugt bei Anwendung auf Zellen, die mit dem Thionin-Farbstoff gefärbt sind, mehrfarbige Zellen, die bei Färben mit dem traditionellen Papanicolaou-Farbstoff allein erhalten werden. Diese spezielle Kombination der Thionin-Farbung mit der Papanicolaou Färbung liefert ein System, das nützlich sowohl für die visuelle Analyse durch einen Menschen als auch für eine automatisierte Analyse ist. Außerdem kann die automatisierte Analyse und Charakterisierung der Zelle durchgeführt werden, ohne daß die Notwendigkeit einer kostenaufwendigen Verwendung von Hardware und/oder Software besteht. Das Zytoplasma kann unter sichtbarem Licht analysiert werden, und der Kern kann bei Infrarot-Belichtung analysiert werden.
Ein ähnlicher Vorteil wird erhalten bei Färben der Zellen zuerst mit einem Thionin- Farbstoff und anschließend mit einem Gegenfarbstoff, der ein Farbstoff des Eosin-Typs ist. Diese Thionin-Eosin-Färbung ersetzt die traditionelle H-E-Färbung (Hämatoxylin- Eosin-Färbung) im histologischen Bereich durch eine solche, die dieselben visuellen Effekte ergibt wie die H-E-Färbung und die den zusätzlichen Vorteil einer Unterscheidung des Kerns vom Zytoplasma unter Infrarot-Licht aufweist. Die Einbeziehung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung in herkömmliche Gegenfärbungs-Verfahren wie beispielsweise Verfahren unter Verwendung des Papanicolaou-Farbstoffs und des Farbstoffs des Eosin-Typs führt zu sichtbaren Färbemustern, die den Zytologen vertraut sind.
Die Kombination hat den zusätzlichen Vorteil, daß sie in einem automatisierten Zellenanalyse-System verwendet werden kann und zuverlässige und exakte Ergebnisse liefert, die in pathologischen Verfahren verwendet werden können, einschließlich beispielsweise dem Nachweis von Cervix-Krebs.

Kurze Beschreibung der Figuren

Für ein besseres Verständnis der Natur und der Aufgaben der Erfindung sollte auf die folgende detaillierte Beschreibung, zusammengenommen mit den beigefügten Figuren, Bezug genommen werden. In den Figuren zeigen:
- Figur 1 ein Fließschema, das die Färbungstechnik der vorliegenden Erfindung zeigt;
- Figur 2 eine Graphik, die die dekadische Extinktion und Wellenlänge des Thionin-Farbstoffs allein und des an den Kern gebundenen Thionin-Farbstoffs zeigt;
- Figur 3 ein Fließschema, das die Färbeteclinik der vorliegenden Erfindung zeigt, in der ein Gegenfarbstoff des Papanicolaou-Typs verwendet wird; und
- Figur 4 ein Fließschema, das die Färbetechnik der vorliegenden Erfindung zeigt, bei der ein Gegenfarbstoff des Eosin-Typs verwendet wird.

Detaillierte Beschreibung

Ein Verfahren zum Färben von Zellen-Material gemaß der Erfindung liefert einen verbesserten Kontrast zwischen Kern und Zytoplasma. Das Verfahren erzeugt die herkömmlichen, in mehreren Farben gefärbten Zellen, die für eine manuelle Analyse geeignet sind, und ist in hohem Maße wirksam in automatisierten Analyse-Systemen. Das Verfahren umfaßt die Schritte, daß man das Zellenmaterial mit einem Thionin-Farbstoff färbt, mit einem Gegenfarbstoff färbt und das mit dem Thionin-Farbstoff gefärbte Material mit Energie im Infrarot-Bereich des Spektrums bestrahlt, sowie das gefärbte Zellen-Material bildmaßig abbildet.
Bei einer praktischen Durchführungsform der Erfindung werden die Zellen durch das in Figur 1 dargestellte Verfahren hergestellt. Die Zellen werden auf einem Glasträger fixiert (Schritt 10), in zwei Alkohol-Bädern gespült (Schritt 12) und mit einem Thionin-Farbstoff gefärbt (Schritt 14). Die gefärbten Zellen werden in Alkohol-Bädern gespült (Schritt 16) und mit einem Gegenfarbstoff gefärbt (Schritt 18). Nach dem Gegenfärben werden die gefärbten Zellen in Alkohol gespült (Schritt 20) und in Xylol gespült (Schritt 22), bevor ein Deckglas aufgebracht wird (Schritt 24).
Die Zellen werden zuerst auf dem Trägerglas unter Verwendung von Alkohol oder anderen Verfahren, wie sie im Stand der Technik bekannt sind, fixiert (Schritt 10). Anschließend wird zur Vorbereitung des Färbe-Schritts das Trägerglas zehumal jeweils in zwei Bäder mit einer hohen Konzentration an Alkohol mit niedrigem Molekulargewicht eingetaucht (Schritt 12), der bevorzugt Methanol ist. Die Zellen werden in einer Thionin- Färbelösung gefärbt (Schritt 14), und zwar für eine Zeit, die ausreichend zum Einarbeiten des Thionin-Farbstoffs in die Kerne ist, typischerweise etwa 30 min. Nach Spülen durch zehninaliges Eintauchen jeweils in drei Bäder mit einer hohen prozentualen Konzentration an Alkohol mit niedrigem Molekulargewicht (Schritt 16) werden die Zellen mit einem Gegenfarbstoff gefärbt (Schritt 18). Mit anderen Worten: Die Zellen werden mit einem oder mehreren Farbstoffen gefärbt, die primär vom Zytoplasma aufgenommen werden.
Bei Kombination mit einem Kern-Material und bei dem leicht sauren pH-Wert, vorzugsweise bei einem pH-Wert von etwa 6,45, absorbiert ein Thlonin-Farbstoff Infrarot-Licht. Der Gegenfarbstoff wird so ausgewählt, daß er bei einer Wellenlänge absorbiert, die verschleden ist von derjenigen des mit einem Thionin-Farbstoff gefärbten Zellen-Maten als. Nach Färben und Gegenfärben wird das Trägerglas durch Eintauchen in zwei bis vier weitere Bäder mit hoher prozentualer Konzentration an einem Alkohol mit niedrigem Molekulargewicht (Schritt 20) und in zwei oder mehr Xylol-Spülbäder (Schritt 22) gespült, bevor ein Deckglas aufgebracht wird (Schritt 24). Die Zellen sind nun fertig für eine Analyse (Schritt 26).
Bei Betrachtung unter sichtbarem Licht sind die Kerne der Zellen transparent bis opak und sind tief-blau gefärbt. Das Zytoplasma ist transparent und in mehreren Farben gefärbt, wobei das spezielle Farbmuster von dem verwendeten Gegenfarbstoff abhängt. Wenn Zellen auf diese Weise gefärbt werden, ist das Farbmuster den Zytologen vertraut, so daß einer Analyse in einfacher Weise manuell durch Anschauen, d. h. durch einen Menschen, durchgeführt werden kann. Das Verfahren hat den zusätzlichen Vorteil, daß bei Anschauen unter Infrarot-Licht jeder Kern opak ist und das Zytoplasma nahezu unsichtbar ist. Wenn das Zytoplasma nahezu unsichtbar ist, wird ein Überlappen von Zellen nicht mit Kernen verwechselt, und es kann ein akurater Zell-Count auf manuellem oder computerisiertem Wege erreicht werden.
Festkörper-Fernsehkameras und andere optoelektrische Wandler, die für Infrarot-Energie empfindlich sind, werden im nächsten Schritt (26) verwendet, um die von den gefärbten Zellen abgegebene Energie bildmäßig abzubilden. Das Bild kann für eine vollständig automatisierte Analyse digital dargestellt werden und kann auch auf einem Anzeige- Monitor angeschaut werden. Die Kern-Komponenten der Zelle sind unterscheidbar, und die Zellen können gemessen und klassifiziert werden, z.B. als bösartig oder als gutartig.
Es wird angenommen, daß der Thionin-Farbstoff und das Verfahren des Färbens in erster Linie verantwortlich für dieses Phänomen sind. Es ist nicht bekannt, daß Thionin allein Infrarot-Licht absorbiert. Genauso wenig ist es bekannt, daß dies passiert, wenn Thionin als Farbstoff zugemischt wird oder als stark saurer Kern-Farbstoff an den Kern in einer Reaktion des Feulgen-Typs gebunden wird. Es wurde jedoch gefünden, daß ein Tnionin- Farbstoff in einer gepufferten Lösung mit einem selektiven sauren Bereich sich nur an den Kern bindet und stark absorbierend im nahe-infraroten Bereich wird. Wie in Figur 2 bei der Kurve 28 gezeigt wird, weist ein Thionin-Farbstoff selbst eine maximale Absorption bei 600 nm (sichtbares rotes Licht) auf und ist im Bereich um 680 nm nahezu transparent. Wenn der Farbstoff jedoch an den Kern gebunden wird, verschiebt sich das Absorptionsspektrum bzw. die Extinktion in den Bereich längerer Wellenlängen, wie durch Kurve 30 gezeigt wird. Die Spitzen-(Peak-)Absorption bleibt bei etwa 600 nm, jedoch absorbiert der an einen Kern gebundene Thionin-Farbstoff auch im nahe-infraroten Bereich, und bei 780 nm erreicht die Absorption des gefärbten Kerns 60 bis 70 % des Peak-Wertes.
Der Thionin-Farbstoff für die praktische Anwendung der vorliegenden Erfindung kann im wesentlichen ein Thionin-Salz, ein organisches Lösungsmittel und ein Puffer für den pH Wert sein. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Thionin-Farbstoff aus etwa 80 Teilen einer Lösung A und 20 Teilen einer Lösung B (1x Puffer) oder B&sub1; (4x Puffer) hergestellt, wobei die Herstellung gemäß der Liste der folgenden Tabelle I erfolgt. Lösung A wird hergestellt unter Rühren über Nacht und anschließendes Filtrieren über ein Whatmann Nr. 5-Filterpapier oder durch ein äquivalentes Verfahren. Tabelle I
Der pH-Wert der Tllionin-Lösung liegt vorzugsweise bei etwa 6 bis 7. Ein Thionin- Farbstoff, der aus 80 Teilen der Lösung A und 20 Teilen der Lösung B oder B&sub1; hergestellt ist, ist schwach sauer und hat einen pH-Wert von 6,4 ± 0,1. Ein Farbstoff, der aus 80 Gewichtsteilen der Lösung A und 20 Gewichtsteilen der Lösung B&sub1; hergestellt ist, weist einen geringfügig weniger sauren pH-Wert von 6,43 auf.
Die praktische Durchführung der Erfindung kann klarer aus den folgenden nicht-beschränkenden Beispielen ersehen werden.

Beispiel 1

Farbstoff des Papanicolaou-Typs

Eine bevorzugte praktische Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Erfindung kombiniert die Thionin-Färbung mit der vertrauten Gegenfärbung des Papanicolaou-Typs und ermöglicht so eine wirksame automatisierte Analyse. Die resultierenden, mit mehreren Farben gefärbten Zellen sind unter sichtbarem Licht den Zytologen vertraut. Die traditionelle Papanicolaou-Färbung ist in automatisierten Systemen schwierig zu analysie ren, und zwar weil die Vielzahl der Farben, die sie mit dem Zytoplasma erzeugt, z. B. blau, grün, rot und orange, in variierendem Grad in Kontrast mit der blauen Färbung steht, die traditionell zum Färben des Kerns verwendet wird. Wenn diese blaue Färbung in Übereinstimmung mit der Erfindung weggelassen wird und durch die Thionin-Färbung mit ihrer einzigartigen Absorption im Infrarot-Bereich ersetzt wird, ist ein zuverlässiges und exaktes automatisiertes Auseinanderhalten, d. h. Lökalisierung und Kategorisierung des Kerns, relativ einfach. Das Zytoplasma wird unter sichtbarem Licht analysiert, und das Auseinanderhalten erfolgt unter Infrarot-Licht, für das Festkörper-Fernsehkameras, Festkörper-Photodedektoren und andere optoelektrische Wandler-Vorrichtungen speziell empfindlich sind. Das resultierende Bild kann digital aufgezeichnet werden, und eine zytologische Analyse kann per Computer durchgeführt werden. Da die Färbung unter sichtbarem Licht wie die vertraute Papanicolaou-Färbung erscheint, können Zytologen die computerisierte Analyse überwachen.
Wie in Figur 3 gezeigt, werden die Zellen auf dem Trägerglas (Schritt 32) fixiert. Anschließend werden die Zellen in zwei getrennten Alkohol-Bädern gespült (Schritt 34), bevor sie mit einem Thionin-Farbstoff gefärbt werden (Schritt 36). Die gefärbten Zellen werden in drei getrennten Alkohol-Bädern gespült (Schritt 38), mit dem 0G6-Gegenfarbstoff gefärbt (Schritt 40) und in zwei Alkohol-Bädern gespült (Schritt 42), bevor sie mit einer EA-Lösung gefärbt werden (Schritt 44). Nach dem Färben werden die Zellen in vier separaten Alkohol-Bädern gespült (Schritt 46), gefolgt von drei Spülvorgängen mit Xylol (Schritt 48). Das Abdecken mit einem Deckglas oder ein anderes Verfahren der permanenten Fixierung (Schritt 50) vervollständigen das Färbeverfahren. Nach dem Färben werden die gefärbten Zellen mit infrarotem Licht bestrahlt, um den Kern getrennt sichtbar zu machen (Schritt 52). Dem Schritt des Abbildens (Schritt 54) folgt ein Schritt der digitalen Erfassung (Schritt 56) für eine automatisierte Analyse.
Bei dieser bevorzugten Ausführungsform werden die Zellen auf dem Trägerglas unter Verwendung einer alkoholischen Fixier-Lösung oder anderer im Stand der Technik bekannter Verfahren fixiert (Schritt 32). Die Zellen werden gespült, indem man das Trägerglas zehnmal jeweils in zwei getrennte Bäder mit 80 % igem Methanol eintaucht (Schritt 34), bevor man mit dem Thionin-Farbstoff färbt, der nach der obigen Verfahrensweise hergestellt wurde. Nach dem Schritt des Färbens für etwa 30 min in dem Thionin- Bad (Schritt 36) werden die Trägergläser gespült, indem man sie zehnmal jeweils in drei separate Bäder mit 95 %igem Ethanol eintaucht (Schritt 38) und bevor man sie mit der 0G6-Lösung färbt (Schritt 40). Der 0G6-Farbstoff ist in diesem technischen Bereich bekannt und wird allgemein bei Papanicolaou-Färbungen verwendet. Ein im Handel erhältlicher 0G6-Farbstoff ("SP"; Firma Baxter) funktioniert gut, oder der Farbstoff kann vorzugsweise hergestellt werden durch Zusammenmischen der in Tabelle II aufgelisteten Komponenten: Tabelle II
Nach Färben in der 0G6-Lösung für 1 min wird das Trägerglas gespült, indem man es zehnmal jeweils in zwei Bäder mit 95 %igem Ethanol eintaucht (Schritt 42), bevor das Material in einer EA-Lösung gefärbt wird (Schritt 44). Diese Lösung ist ebenfalls in diesem technischen Bereich zur Verwendung bei dem Papanicolaou-Färbeverfahren wohlbekannt und kann entweder im Handel erworben werden (EA 50; Firma Baxter) oder hergestellt werden durch Mischen der in Tabelle III aufgelisteten Komponenten: Tabelle III
Nach Färben in der EA-Lösung für die Zeit von 3 min wird das Trägerglas gespült, indem man es zehnmal jeweils in vier getrennte Bäder mit 95 %igem Ethanol eintaucht (Schritt 46). Dem folgen drei Spülungen mit Xylol (Schritt 48). Anschließend wird das Trägerglas mit einem Deckglas oder einem anderen Mittel zum permanenten Fixieren abgedeckt, wie es in diesem technischen Bereich bekannt ist (Schritt 50).
Nach dem Färben werden die Zellen mit infrarotem Licht bestrahlt, um den Kern getrennt sichtbar zu machen (Schritt 52). Die abgegebene Energie wird für eine zytologische Analyse bildmaßig aufgezeichnet (Schritt 54). Das Bild kann digitalisiert werden, und die Analyse wird per Computer durchgeführt (Schritt 56).

Beispiel II

Thionin-Eosin-Farbstoff

Im Rahmen der zweiten bevorzugten Ausführungsform wird ein Gegenfarbstoff des Eosin- Typs verwendet. Bei gemeinsamer Verwendung ersetzt die Thionin-Eosin-Färbung die im histologischen Bereich standardmäßig verwendete Färbung, nämlich die H-E-Färbung (Hämatoxylin-Eosin-Färbung), durch eine Färbung, die leicht mit einem automatisierten System zu analysieren ist.
Die Schritte des Fixierens, Spülens und Färbens mit dem Thionin-Farbstoff sind dieselben Schritte, wie sie oben beschrieben wurden, und diese sind in Figur 4 unter den Schritten 58 bis 62 gezeigt. Nach dem Schritt des Färbens mit dem Thionin-Farbstoff werden die Zellen gespült, indem man sie zehnmal jeweils in drei Bäder mit 95 %igem Ethanol eintaucht (Schritt 64). Die Zellen werden in einer Eosin-Lösung gefärbt (Schritt 66), die durch Mischen der in Tabelle IV angegebenen Komponenten hergestellt wurde. Die Schritte des Spülens, Belichtens und bildmäßigen Abbildens werden in derselben Weise durchgeführt, wie das in Beispiel 1 beschrieben ist, und sind in Figur 4 als Schritte 68 bis 78 gezeigt. Tabelle IV
Es ist also ersichtlich, daß die oben angegebenen Aufgaben aus der Gruppe der Aufgaben, die sich aus der vorangehenden Beschreibung offensichtlich ergeben, in effizienter Weise erreicht werden. Da bestimmte Änderungen bei der Durchführung des oben beschriebenen Verfahrens gemacht werden können, ohne vom Umfang der Erfindung abzuweichen, ist es beabsichtigt, daß die gesamte Offenbarung, die in der obigen Beschreibung enthalten ist, als beispielhaft angesehen wird, nicht jedoch als die Erfindung beschränkend. Es versteht sich auch, daß es beabsichtigt ist, daß die folgenden Ansprüche alle allgemeinen und speziellen Merkmale der oben beschriebenen Erfindung und alle Angaben zum Umfang der Erfindung abdecken, die aus sprachlichen Gründen unter diesen Umfang fallen könnten.

Claims

1. Verfahren zur Färbung eines Zellen-Materials zur Ausbildung eines Kontrasts zwischen einem Kern-Material und einem Zytoplasma-Material zur Herstellung eines gefärbten, für eine automatisierte Apparate-Analyse geeigneten Zellen-Materials und zum bildmäßigen Abbilden des gefärbten Zellen-Materials, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt, daß man aufeinanderfolgend

- das Zellen-Material mit einem organischen Thionin-Farbstoff färbt, der einen vorbestimmten sauren pH-Wert aufweist, der so ausgewählt ist, daß sich der Thionin-Farbstoff unterscheidbar mehr an das Kern-Material bindet als an das Zytoplasma-Material und eine ausgewählte dekadische Extinktion im Infrarot-Bereich erzielt, wenn er derart an das Kern-Material gebunden ist, wobei der Farbstoff ein Thionin-Salz und eine Lösung zum Puffern des pH-Wertes einschließt;

- das Zellen-Material mit einem zweiten Farbstoff gegenfärbt, der eine dekadische Extinktion im Infrarot-Bereich durch das Zytoplasma-Material aufweist, die von der dekadischen Extinktion im Infrarot-Bereich durch das Kern-Material mit dem Thionin-Farbstoff unterscheidbar ist;

- das gefärbte Zellen-Material mit Energie im Infrarot-Bereich des Spektrums bestrahlt; und

- das gefärbte Zellen-Material unter Ansprechen auf die Abgabe von Infrarot-Energie durch das gefärbte Zellen-Material aufgrund der Bestrahlung mit Infrarot- Energie bildmäßig abbildet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Schritt des bildmäßigen Abbildens den Schritt umfaßt, daß man die abgegebene Energie digital darstellt, wobei der Schritt des bildmäßigen Abbildens weiter den Schritt umfaßt, daß man die digitalisierte Bildinformation pathologisch testet, und worin der Schritt des Testens einen Schritt umfaßt, daß man das Zellenmaterial klassifiziert.

3. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Schritt des bildmäßigen Abbildens das Nachweisen der abgegebenen Energie mit einem optoelektrischen Wandler einschließlich Photovervielfacher, Festkörper-Photodetektoren, Detektor-Anordnungen und Fernsehkameras umfaßt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Schritt des Gegenfärbens das Färben mit einer Gegenfarbstoff-Verbindung unter Herstellung von gefärbtem Zellen-Material einschließt, worin das Zytoplasm-Material für die Infrarot-Strahlung relativ transparent ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Schritt des Färbens das Herstellen eines Thionin-Farbstoffs einschließt, der im wesentlichen aus einem Thionin-Salz, einem organischen Lösungsmittel und einem Puffer für den pH-Wert besteht.

6. Verfahren nach Anspruch 5, worin das organische Lösungsmittel gewählt ist aus der aus Alkoholen mit niedrigem Molekulargewicht bestehenden Gruppe.

7. Verfahren nach Anspruch 6, worin das organische Lösungsmittel gewählt ist aus der aus Methanol, Ethanol und Isopropylalkohol bestehenden Gruppe.

8. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Schritt der Bestrahlung mit Infrarot-Energie den Schritt umfaßt, daß man Energie im nahe-infraroten Strahlungsbereich des Spektrums liefert.

9. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Schritt des Gegenfärbens die Schritte umfaßt, daß man

- einen Gegenfarbstoff des Papanicolaou-Typs herstellt, der im wesentlichen aus einer ersten Färbelösung, einer zweiten Färbelösung und alkoholischen Spül- Lösungen besteht,

- worin die erste Färbelösung im wesentlichen aus einem orange-farbenen Farbstoff, einem alkoholischen Lösungsmittel und einem Puffer für den pH-Wert besteht; und

- worin die zweite Färbelösung im wesentlichen aus einem grünen Farbstoff, einem roten Farbstoff, einem Puffer für den pH-Wert und einem alkoholischen Lösungsmittel besteht; und man

- das Zellen-Material im Anschluß an den Thionin-Färbeschritt mit dem Gegenfarbstoff des Papanicolaou-Typs färbt.

10. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Schritt des Gegenfärbens die Schritte umfaßt, daß man

- einen Gegenfarbstoff des Eosin-Typs herstellt, der im wesentlichen aus einem Eosin Y-Farbstoff, einem organischen Lösungsmittel und einem Puffer für den pH- Wert besteht; und

- das Zellen-Material im Anschluß an den Thionin-Färbeschritt mit einem Gegenfarbstoff des Eosin-Typs färbt.