DE69031876T2

DE69031876T2 - Peptidyl prolyl-cis.trans-isomerase

Info

Publication number: DE69031876T2
Application number: DE69031876T
Authority: DE
Inventors: Toshiya Hayano; Setsuko Katou; Noboru Maki; Masanori Suzuki; Nobuhiro Takahashi
Original assignee: Tonen Corp
Current assignee: Tonen General Sekiyu KK
Priority date: 1989-07-19
Filing date: 1990-07-19
Publication date: 1998-08-13
Anticipated expiration: 2010-07-20
Also published as: EP0647713B1; EP0647713A1; EP0647714A1; EP0647714B1; DE69021462D1; DE69032315D1; DE69021462T2; DE69032315T2; EP0413440A3; US5416015A; EP0413440B1; DE69031876D1; US5284762A; EP0413440A2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Escherichia coli Peptidyl-Prolyl-cis-trans-Isomerase β sowie Gene, welche für dieselbe codieren.
Peptidyl-Prolyl-cis-trans-Isomerase (PPIase) beschleunigt die Proteinfaltungsreaktion, indem sie die Isomerisierung von Prolyl-Peptidbindungen in dem Protein katalysiert. Sie ist als ein Mittel zum Aktivieren eines inaktiven Proteins, welches durch Gentechnologie produziert wurde, und als ein Reagens für eine enzymologische Analyse nützlich. Ihr entsprechendes codierendes Gen ist für die Produktion des Enzyms durch Gentechnologie nützlich und es wird ebenfalls erwartet, daß es als Ausgangsmaterial für das Gen verwendet wird, welches die Produktion durch Gentechnologie der Enzymderivate erlaubt, deren enzymatische Aktivität, intrazelluläre Lokalisierbarkeit, Substratspezifität und Stabilität verändert wurde. Die vorliegende Erfindung beschreibt weiterhin ein Mittel zur effizienten Produktion eines nützlichen Proteins mit einer korrekten Konformation, indem das oben erwähnte Gen in denselben Zellen exprimiert wird wie denen, in welchen das andere Gen, das für das nützliche Protein codiert, exprimiert wird.
PPIase wurde in den Nieren von Schweinen gefunden [Fisher, G., Bang, H. & Mech, C., Biomed. Biochim. Acta, 43 1101 - 1111 (1984)]; von ihr ist bekannt, daß sie die enzymatische Aktivität zur Isomerisierung einer Xaa-Pro-Bindung aufweist (wobei Xaa für eine beliebige Aminosäure steht und Pro für L-Prolin) [Fisher, G., Bang, H. & Mech, C., Biomed. Biochim. Acta, 43, 1101 - 1111 (1984)] und daß sie die Proteinfaltungsreaktion von einigen denaturierten Proteinen, wie z.B. der Immunglobulin L-Kette und Ribonudease T&sub1;, beschleunigt [Lang, K., Schmid, F. & Fischer, G., Nature 329, 268 - 270 (1987)]. Es wurde gezeigt, daß die Aminosäuresequenz des aus Schweinenieren gereinigten Enzyms mit der von Cyclophilin identisch ist, einem Protein, von welchem bekannt ist, daß es an ein immunsuppressives Mittel, Cyclosporin A (CsA) bindet, von welchem gefunden wurde, daß es die PPIase-Aktivität inhibiert. Da die immunsuppressive Aktivität direkt proportional zu der Bindungsfähigkeit von CsA-Derivaten an Cyclophilin ist, welches das meiste der CsA-Bindungsaktivität in lymphoiden Zellen darstellt, wird gefolgert, daß die Wirkung von CsA, z.B. die immunsuppres sive Wirkung in T-Zellen, durch die Inhibition der PPIase- Aktivität vermittelt wird [Takahashi, N., Hayano, E., & Suzuki, M., Nature 337, 473 - 475 (1989)]. Die CsA-Bindung und die PPIase-Aktivitäten wurden in fast allen Organen und in fast allen Spezies gefunden. Es ist jedoch nicht be kannt, wie CsA spezifisch auf das Immunsystem wirkt. Insbesondere wurde nicht erklärt, wie CsA bei einer Organtransplantation auf T-Zellen wirkt.
Rhodopsin, ein Sehpigment, welches in tierischen Retinas vorkommt, besteht aus einem Chromophor, 11-cis-Retinal, welcher in dem Proteinanteil von Rhodopsin an Opsin gebunden ist, und hängt mit der Sehleitung in den Photorezeptorzellen zusammen, in welchen der Chromophor schrittweise umgewandelt wird und die maximale Absorptionswellenlänge folglich unter dem Einfluß von Licht verändert wird. Bei Drosophila ist eine Mutante, bei welcher die Umwandlung des Vorläufers Opsin zu dem Rhodopsin inhibiert ist, bekannt. Das ninaA-Gen, welches für diese Inhibierung verantwortlich ist, ist isoliert worden und dessen Nukleotidsequenz ist bestimmt worden, und als ein Ergebnis wurde gezeigt, daß das ninaA-Gen für ein Protein codiert, welches in der Aminosäuresequenz eine Homologie zu Cyclophilin zeigt. Da demgemäß das ninaA für ein Cyclophilin-ähnliches Protein codiert und das Cyclophilin mit der PPIase identisch ist, codiert das ninaA-Gen möglicherweise ein Protein, welches eine PPIase-Aktivität besitzt, und somit wird vermutet, daß seine Aktivität die Bildung von Rhodopsin aus seinem Vor- läufer Opsin durch ein Steuern seiner Faltungsreaktionen bewirkt. Das ninaA-Gen wird ausschließlich in dem Kopfteil, welcher Photorezeptorzellen enthält, exprimiert und in den anderen Teilen des Körpers werden Genfragmente, welche mit dem ninaA-Gen hybridisieren und eine davon verschiedene Größe besitzen, nachgewiesen. Folglich wird geschlossen, daß das ninaA-Gen spezifisch in den Photorezeptorzellen exprimiert wird und nur der Bildung von Rhodopsin dient [Shieh, B.-H., Stamnes, M.A., Seavello, S., Harris, G.L. & Zuker, C.S., Nature, 338, 67 - 70 (1989); und Schneuwly, S., Shortridge, R.D., Larrivee, D.C., Ono, T., Ozaki, M. & Pak, W.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86 (1989)].
Wenn eine PPIase spezifisch in T-Zellen exprimiert wird, kann die Gegenwart der T-Zell-spezifischen Form in ähnlicher Weise eine Erklärung für die spezifische Wirkung von CsA auf die T-Zellen bieten. Diese Vermutung wird durch die Beobachtung gestützt, daß viele Genkopien, welche in der Lage sind mit dem Cyclophilingen zu hybridisieren, in Säugetierzellen vorhanden sind [Haendler, B., Hofer Warbinek, R. & Hofer, E., EMBO, 947 - 950 (1987)]. Es wurde bisher nur bestätigt, daß in jeder bis jetzt analysierten Zelle eine Art von Cyclophilin exprimiert wird, und in dem so exprimierten Protein wird keine Multiplizität gefunden. Ein Beweis für die Gegenwart von mehreren Cyclophilinen oder PPIasen in einer Spezies kann theoretisch gut als Beweis anerkannt werden, daß jede PPIase ein spezifisches Proteinsubstrat hat.
In dem Fall von Neurospora ist die Gegenwart von zwei Spezies von Cyclophilin-mRNAs bekannt, welche von einem einzigen Gen transkribiert werden. Eine dieser mRNAs codiert für das Cyclophilin-Molekül, welches im Cytoplasma vorhanden ist, und ein anderes mRNA-Molekül codiert für eine mito chondriale Form mit einer zusätzlichen Signalsequenz für ihre Translokation in Mitochondrien. Das letztere Protein wird, nach Translokation in das Mitochondrium, prozessiert und bildet eine molekulare Spezies, welche mit dem Cyclophilin identisch ist, das im Cytoplasma vorhanden ist. In diesem Fall ist daher tatsächlich eine molekulare Spezies an aktivem Protein vorhanden und die Multiplizität ist dem Unterschied bei der Lokalisierung von einem Protein in der Zelle zuzuschreiben [Tropschug, M., Nicholson, D.W., Hartl, F.-U., Köhler, H., Pfanner, N., Wachter, E. & Neupert, W., J. Biol. Chem. 263, 14433 - 14440 (1988)].
Die katalytische Wirkung von PPIase auf die Proteinfaltung wurde an neun Arten von Proteinen untersucht, d.h. Concanavalin A, Prothrombin, Ribonudease A, Ribonudease T&sub1;, Cytochrom C, β-Lactoglobulin, Meiokinase, Chymotrypsinogen und Pepsinogen, von welchen bekannt ist, daß sie derart beschaffen sind, daß während der Rückfaltung des Proteins aus dem denaturierten Zustand zu dem aktiven Zustand die Isomerisierung der Prolyl-haltigen Peptidbindungen den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt bei der Rekonstitution des denaturierten Proteins ausmacht. Jedoch wurde nur bei zwei Arten dieser Proteine, d.h. Ribonudease T und Cytochrom C gefunden, daß die Rückfaltung durch PPIase beschleunigt wird [Lin, L.-N., Hasumi, H. & Brands, J.F., Biochim. Botphys, Acta 956, 256 - 266 (1988)]. Diese Ergebnisse legen nahe, daß eine PPIase-Spezies auf begrenzte Spezies von Proteinsubstraten wirken kann.
Obwohl basierend auf den oben beschriebenen Tatsachen die Gegenwart einer multiplen Form von PPIase, welche auf begrenzte Arten von Proteinen wirkt, vermutet wird, ist ihre Gegenwart nicht tatsächlich bewiesen worden.
Die Theorie, daß multiple Formen von PPIase in einer Spezies eines Organismus vorhanden sind, und daß die Substratspezifität einer gegebenen PPIase, beispielsweise aus einem Säugetier, welches aus einer großen Anzahl an Zellen zusammengesetzt ist, die mit in hohem Maße differenzierten Funktionen ausgestattet sind, beispielsweise von der aus Hefe, welche ein einzelliger Organismus ist, und von Escherichia coli, welches ein Prokaryot ist, abweichen kann, wird als eine logische Folgerung im Hinblick auf die verschiedenen Funktionen verstanden, welche durch die verschiedenen oben erwähnten Zellen erfüllt werden müssen.
Die Hypothese, daß die Wirkung von CsA durch die Inhibition der PPIasen-Aktivität modifiziert wird, wurde auf der Grundlage der inhibitorischen Wirkung von CsA auf die PPIase aus Schweinen vorgeschlagen. Um die Hypothese zu rechtfertigen, ist es wichtig die Frage zu klären, ob oder ob nicht die Aktivitäten von PPIasen aus vielen Organismen mit stark divergierenden phylogenetischen Ursprüngen, z.B. Escherichia coli und Hefe, durch CsA inhibiert werden. Darüber hinaus ist bis jetzt noch keine Beziehung zwischen der Verteilung der CsA-Bindungsaktivität in niederen Organismen und der inhibitorischen Wirkung von CsA auf ihre PPIasen hergestellt worden.
Die Gegenwart von multiplen Formen von PPIasen in verschiedenen Zellen legt nahe, daß jede PPIase in jeder Zelle auf ihre spezifischen Substrate wirkt. Dieser Punkt, verbunden mit dem Befund, daß eine PPIase einer zellspezifischen Form in den Photorezeptorzellen von Drosophila vorhanden sein kann, erlangt offensichtlich bei der Verwendung einer rekombinanten DNA für die Herstellung eines spezifischen Proteins mit einer spezifischen Zelle als einem Wirt eine tiefe Bedeutung. Es ist wünschenswert, daß PPIasen, welche die Faltung des Zielproteins oder den Prozeß von dessen Proteinsynthese beeinflussen, mit dem Zielprotein, welches in der Wirtszelle produziert wird, koexistieren. Im allgemeinen ist man der Meinung, daß die PPIase der Wirtszelle effektiv auf das Protein einwirkt, welches der Wirtszelle eigen ist. Daher können die PPIasen und ihre Gene aus Escherichia coli und Hefe, welche häufig als Wirte für die Produktion von nützlichen Substanzen durch die rekombinante DNA-Technologie verwendet werden, für den oben erwähnten Zweck nützlich sein. Verschiedene Organismen werden auf die Gegenwart von Cyclophilin hin untersucht, wobei die Fähigkeit des Proteins, Cyclosporin A zu binden, als ein Index verwendet wird, und die Cyclosporin A-Bindungsaktivität wurde in Arthropoden (Küchenschaben), Trematoden, Mollusken, Schimmelpilzen, Poriferen, Hefen und Pflanzen (Kürbissen) wie auch in Säugetieren nachgewiesen (Koletsky, A.J., Harding, MW. & Handschumacher, R.E., J. Biol. Chem. 137, 1054 - 1059, 1986]. Nichtsdestotrotz wurde keine Verbindung zwischen diesen Aktivitäten und der PPIase-Aktivität hergestellt.
Obwohl gezeigt wurde, daß die PPIase aus Schweinen die Proteinfaltung beschleunigt, sind die Frage, ob oder ob nicht die PPIase in der Spezies wie z.B. einem Insekt, Hefe und Mikrobakterien usw. tatsächlich vorhanden ist und diese Aktivität zeigt, und die Frage des Ausmaßes, mit dem sie an der Proteinfaltung beteiligt ist, noch nicht definitiv beantwortet worden. Als eines der Mittel, um die zahlreichen oben erwähnten Probleme zu lösen, wird es für wichtig gehalten, PPIase aus Escherichia coli und Hefe zu isolieren, die Natur der PPIase als Protein zu studieren und deren Gene zu erhalten.
Wie oben beschrieben wurden Beispiele gefunden, in welchen PPIasen mit der Faltung von Proteinen in Zusammenhang stehen. In diesen Fällen ist jedoch nur eine Spezies von PPIase für eine Spezies von Organismus identifiziert worden und somit war die Nützlichkeit der PPIase für die Protein faltung beschränkt.
Diese Erfindung ist daher darauf gerichtet, eine Spezies eines Enzyms, das homogen aus Escherichia coli isoliert wurde, zur Verfügung zu stellen und ist weiterhin darauf gerichtet, Gene, die für das Enzym codieren, sowie ein Verfahren zum Reproduzieren des Enzyms in einer hohen Ausbeute, in dem das Gen verwendet wird, zur Verfügung zu stellen.
Die vorliegende Erfindung stellt eine E. coli PPIase-β, welche dadurch gekennzeichnet ist, daß sie die folgenden Eigenschaften besitzt: (1) sie wirkt auf und isomerisiert die Peptidbindung Xaa-Pro (wobei Xaa für irgendeine Aminosäure und Pro für L-Prolin steht), (2) sie zeigt ein einziges Molekulargewicht von ca. 20.000 Dalton bei der Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gradientengelelektrophorese, (3) sie zeigt bei der isoelektrischen Fokussierung einen einzigen isoelektrischen Punkt von ca. 5,0 und (4) sie wird durch CsA nicht inhibiert; ein Verfahren zur Herstellung des Enzyms, welches gekennzeichnet ist durch ein Gewinnen aus E. coli-Zellen; ein Gen, welches für das Enzym codiert; sowie ein Verfahren zur Herstellung des Enzyms durch Verwendung des Gens zur Verfügung.
In den Zeichnungen:
zeigt Fig. 1 ein Elutionsprofil bei der Trennung von E. coli-Extrakt unter Verwendung einer DEAE-Sepharose CL-6B- Säule;
zeigt Fig. 2 ein Elutionsprofil bei der Reinigung der Hauptfraktion (β-Fraktion), welche in Fig. 1 gezeigt ist, durch Gelfiltration mit einer Sephadex-G75-Säule, wobei
die Elution des Proteins anzeigt, das durch Absorption bei 280 nm nachgewiesen wurde, und
die Elution o der PPIase-Aktivität anzeigt.
zeigt Fig. 3 das Ergebnis der Bestimmung der Molekulargewichte von gereinigter PPIase-α und PPIase-β;
zeigt Fig. 4 das Ergebnis der Bestimmung der isoelektrischen Punkte von gereinigter PPIase-α und PPIase-β;
ist Fig. 5 ein Diagramm, welches zeigt, daß die gereinigte PPIase-β bei der Analyse mit der Umkehrphasen-Aquapore-RP- 300-Säule einen einzigen Peak ergibt;
zeigt Fig. 6 das Ergebnis der Trennung von Peptidfragmenten, die aus dem Trypsinverdau von PPIase-β erhalten wurden, wobei eine Umkehrphasen-Spher-56P-18-Säule verwendet wurde;
zeigt Fig. 7 das Ergebnis der Trennung von Peptidfragmenten, die aus der Cyanbromidspaltung von PPIase-β erhalten wurden, wobei eine Umkehrphasen-Aquapore-RP-300-Säule verwendet wurde;
ist Fig. 8 eine graphische Darstellung, welche eine Wirkung von CsA auf die Aktivitäten von Hefe- und E. coli-PPIase der vorliegenden Erfindung, verglichen mit der Aktivität von PPIase aus Schweinen, im Hinblick auf die Beziehung zwischen der CsA-Konzentration und der verbleibenden Aktivität der PPIase zeigt;
zeigen Fig. 9-1 bzw. Fig. 9-2 (SEQ ID NR 19) eine Nukleotidsequenz eines Gens, welches aus E.coli stammt und für die PPIase-β der vorliegenden Erfindung codiert, und eine Aminosäuresequenz, welche von dieser abgeleitet wurde;
zeigt Fig. 10 ein Verfahren zur Konstruktion eines Plasmids pBLΔEPPIb;
zeigt Fig. 11-1 (A) ein Verfahren zur Konstruktion eines Expressionsplasmids pATtrp EPPIb, und zeigt Fig. 11-2 (B) (SEQ ID NR 20) eine Nukleotidsequenz eines Verknüpfungsbereichs zwischen dem trpE-Promotor und dem PPIase-Gen in dem Plasmid pATtrp EPPIb;
zeigt Fig. 12 ein Expressionsprofil der PPIase-β, welche durch transformierte E. coli-Zellen produziert wurde;
zeigt Fig. 13 ein Elutionsprofil bei der Trennung von PPIase-β, welche von den transformierten E. coli-Zellen produziert wurde, wobei eine DEAE-Sepharose-CL-6B-Säule verwendet wurde;
zeigt Fig. 14 ein Elutionsprofil bei der Reinigung einer Fraktion, die in Fig. 13 erhalten wurde, durch Gelfiltration auf einer Sephadex-675-Säule;
zeigt Fig. 15 den Vergleich zwischen einer natürlichen PPIase-β und der rekombinanten PPIase (β) bei der SDS-Elektrophorese;
zeigt Fig. 16 den Vergleich zwischen einer natürlichen PPIase-β und der rekombinanten PPIase-(β) durch die isoelektrische Fokussierung anhand ihrer isoelektrischen Punkte;
zeigt Fig. 17 den Vergleich zwischen einer natürlichen PPIase-β und dem rekombinanten Typ der PPIase-(β) auf einer Umkehrphasen-Aquapore-RP-300-Säule;
zeigt Fig. 18 den Vergleich zwischen der natürlichen PPIase-α, der natürlichen PPIase-(β) und der rekombinanten PPIase-β hinsichtlich ihrer Aktivitäten;
zeigen Fig. 19A und 19B (SEQ ID NR 21-33) den Vergleich von Aminosäuresequenzen von PPIase oder Cyclophilin mit verschiedenen Ursprüngen; und
zeigt Fig. 20 Hydropathiemuster von Aminosäuresequenzen von PPIasen mit verschiedenen Ursprüngen.
Die Gewinnung der PPIase aus E. coli kann durch irgendwelche Verfahren erreicht werden, die herkömmlich verwendet werden, um ein Enzym aus Mikroorganismen zu erhalten.
Zwei PPIase-Komponenten, d.h. PPIase-β als eine Hauptkomponente und PPIase-α als eine Nebenkomponente, werden erhalten.
Diese PPIase werden mit Trypsin und Cyanbromid behandelt, die Aminosäuresequenzen der Fragmente werden bestimmt und die N-terminalen Aminosäuresequenzen werden durch ein herkömmliches Verfahren bestimmt, um die PPIasen hinsichtlich ihrer Aminosäuresequenzen zu charakterisieren. Eine Oligonukleotidsonde wird auf der Basis der Information aus den Aminosäuresequenzen des PPIase-β-Proteins entworfen.
Dann wird ein Gen, welches für die PPIase der vorliegenden Erfindung codiert, durch das Screenen einer DNA-Bibliothek aus E. coli mit der Oligonukleotidsonde erhalten. Die Nukleotidsequenz der klonierten DNA wird bestimmt. Die übereinstimmung zwischen dem korrespondierenden Teil der Aminosäuresequenz, die aus der obigen Nukleotidsequenz ermittelt wurde, und der Aminosäuresequenz des tryptischen Fragments des Proteins (β), welches aus E. coli isoliert wurde, zeigt, daß die DNA, welche aus E. coli stammte, die E. coli PPIase-β codiert.
Weiterhin zeigt der Vergleich der bestimmten Aminosäuresequenz mit den Aminosäuresequenzen der bekannten PPIasen, daß die PPIase-β ein neues Enzym ist, welches von den bekannten PPIasen verschieden ist.
Die PPIase-β der vorliegenden Erfindung besitzt die Aminosäuresequenz, welche in Fig. 9 gezeigt ist (SEQ ID NR 19). Die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht darauf beschränkt sondern schließt Enzyme ein, bei welchen eine oder mehrere Aminosäuren in der in Fig. 9 gezeigten Aminosäuresequenz (SEQ ID NR 19) durch andere Aminosäuren ersetzt wurden, und/oder eine oder mehrere Aminosäuren zu der genannten Aminosäuresequenz hinzugefügt wurden, und/oder eine oder mehrere Aminosäuren aus der genannten Aminosäuresequenz entfernt wurden, und bei welchen immer noch dieselben charakteristischen Eigenschaften wie jene der E. coli PPIase-β beibehalten werden.
Die charakteristischen Eigenschaften des Enzyms der vorliegenden Erfindung werden im Detail in Beispiel 2 beschrieben.
Die PPIase der vorliegenden Erfindung katalysiert die Isomerisierung der Prolyl-Peptid-Bindung in einem Protein und beschleunigt die Faltung des Proteins und kann daher verwendet werden, um ein physiologisch aktives Polypeptid in der inaktiven Form, welches durch Genmanipulation hergestellt wurde, in eine korrekte Konformation der aktiven Form umzuwandeln. Weiterhin kann das interessierende physiologisch aktive Polypeptid direkt in der aktiven Form hergestellt werden, indem ein Gen, welches für die PPIase dieser Erfindung codiert, in einer exprimierbaren Form in einen Wirt eingefügt wird, in welchen ein Gen, das für ein physiologisch aktives Polypeptid codiert, in einer exprimierbaren Form eingefügt wurde, und die zwei Gene in demselben Wirt exprimiert werden. Wo zwei unterschiedliche Arten von Enzym innerhalb einer Spezies zur Verfügung gestellt werden, können die unterschiedlichen Enzyme, die für die Aktivierung durch Beschleunigung der Faltung verschiedener Proteine innerhalb derselben Spezies geeignet sind, unabhängig voneinander verfügbar gemacht werden. Da die PPIase der vorliegenden Erfindung nicht mit CsA wechselwirkt, ist sie als ein Reagens, um den Wirkungsmechanismus von CsA im Vergleich mit PPIase aus Säugetieren oder Hefe auf die Inhibition durch CsA zu untersuchen, und für weitere Forschungsreagenzien nützlich.
Das Gen, welches für die PPIase der vorliegenden Erfindung codiert, ist für die Herstellung der PPIase der vorliegenden Erfindung durch genetische Manipulation wie auch in einer modifizierten Form als ein Genmaterial für die Herstellung von PPIase-Derivaten, bei welchen deren enzymatische Aktivität, Stabilität, intrazelluläre Lokalisierbar keit und Substratspezifität geändert wurde, nützlich. Darüber hinaus ist das Gen der vorliegenden Erfindung als eine Sonde zum Screenen auf ein Gen, welches für ein anderes PPIase-Enzym codiert, nützlich.
Wenn das vorstehend erwähnte Gen verwendet wird, um eine PPIase in einem Mikroorganismenwirt, wie z.B. rekombinanten Escherichia coli herzustellen, wie in den Beispielen 4 bis 6 beschrieben wird, kann die PPIase sehr viel effizienter hergestellt werden, als die, welche aus nicht-rekombinanten E. coli extrahiert wird. Die PPIase, welche so hergestellt wurde, indem die Rekombinante verwendet wurde, besitzt dieselben charakteristischen Eigenschaften wie die PPIase, die aus nicht-rekombinanten E. coli extrahiert wurde, wie in Beispiel 6 beschrieben wird.

Beispiele

Für eine genauere Darstellung der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Beispiele vorgestellt. Diese sollen nur zur Veranschaulichung dienen und beschränken die Erfindung in keiner Weise.

Beispiel 1 Reinigung der E. coli-PPIase

In 500 ml eines 0,1 M Tris-HCl-Puffers (pH 7,8), welcher 5 mM 2-Mercaptoethanol enthielt, wurden 200 g von unter anaeroben Bedingungen kultivierten Escherichia coli (Stamm ST 249) suspendiert, zwei Zyklen einer Einfrier- und Auftau- Behandlung wiederholt und dann mit Polytron gerührt. Die Suspension wurde für 30 Minuten bei Raumtemperatur mit 2 g Lysozym behandelt, mit Polytron gerührt und zentrifugiert. Zu dem Überstand wurde Ammoniumsulfat bis zu einer 80%igen Sättigung zugegeben und dieses wurde über Nacht bei 4ºC stehen gelassen. Der resultierende Niederschlag wurde durch zentrifugale Trennung gesammelt, in 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,8), welcher 0,05% NaN&sub3; enthielt, suspendiert, gegen denselben Puffer dialysiert und dann einer zentrifugalen Trennung unterworfen. Nach der Entfernung des Niederschlags in dem Dialysat wurde der Überstand auf eine Ionenaustausch-DEAE-Sepharose-CL-68-Säule (2,5 cm im Durchmesser x 40 cm) aufgetragen. Die Peptidyl-Prolyl-cis-trans-Isomerase(PPIase)-Aktivität wurde durch das Verfahren gemessen, welches in Takahashi, N. et al., Nature 337, 473 - 475 (1989) beschrieben wird. Die Elution der Probe von der Säule wurde bewirkt, indem die Natriumchloridkonzentration schrittweise auf 0,05 M, 0,1 M, 0,2 M, 0,3 M und 0,5 M erhöht wurde. Die Elution wurde bei einer Flußgeschwindigkeit von 20 milstunde durchgeführt. Das Elutionsprofil, welches von dem DEAE-Säulenchromatographen erhalten wurde, ist in Fig. 1 gezeigt. Die E. coli-PPIase-Aktivität wurde in der Durchflußfraktion (Salzkonzentration 0 M) und in der Fraktion, die bei einer Salzkonzentration von 0,1 M eluierte, nachgewiesen. Von der Gesamtmenge der Aktivität wurden ca. 10% in der Durchflußfraktion und ca. 90% in der Fraktion, die mit einer Salzkonzentration von 0,1 M eluierte, erhalten. Die Komponente in der Durchflußfraktion wird als eine Nebenkomponente (α) und die in der Fraktion, die bei einer Salzkonzentration von 0,1 M eluierte, als eine Hauptkomponente (β) angegeben.
Die zwei Fraktionen wurden entsprechend durch Gelfiltration auf einer Sephadex-G75-Säule (2,5 cm im Durchmesser x 90 cm) gereinigt. Der Reinigungsvorgang der Hauptfraktion ist in Fig. 2 gezeigt.
Ein 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0), welcher 0,15 M NaCl und 0,05% NaN&sub3; enthielt, wurde als Elutionsmittel verwendet, und die Flußgeschwindigkeit betrug 10 ml/Stunde. Die Hauptkomponente der PPIase wurde durch diesen Reinigungsschritt zu einem einzigen Bestandteil gereinigt, wie durch Reinheitstests auf Natriumdodecylsulfat(SDS)-Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigchromatographie bestimmt wurde.
Die Hauptkomponente wird als PPIase-β bezeichnet. Die Nebenkomponente wird als PPIase-α bezeichnet.

Beispiel 2 Charakterisierung der Escherichig coli-PPIase-β

(1) Bestimmung des Molekulargewichtes

Das Molekulargewicht der PPIase-β, welche in Beispiel 1 erhalten wurde, wurde durch die SDS-Polyacrylamid-Konzen trationsgradientengel (12% - 30% Polyacrylamidgel)-Elektrophorese bestimmt. Als Molekulargewichtsstandards wurden Phosphorylase (Molekulargewicht: 94.000), Rinderserumalbumin (67.000), Ovalbumin (43.000), Carboanhydrase (30.000), Sojabohnen-Trypsininhibitor (20.100) und α-Lactalbumin (14.000) verwendet. Es wurde gefunden, daß die PPIase-β ein einziges Molekulargewicht von ca. 20.000 Dalton besitzt, wie in Fig. 3 gezeigt ist.

(2) Bestimmung des isoelektrischen Punktes

Der isoelektrische Punkt der PPIase-β, welche in Beispiel 1 erhalten wurde, wurde durch die isoelektrische Fokussierung gemäß dem Handbuch der isoelektrischen Fokussierung mit Ampholinen (LKB Corp.) bestimmt, indem Cytochrom C (pI 10,6), Wal-Myoglobin (8,30), Pferde-Myoglobin (7,3), Schweine-Myoglobin (6,45), Schweine-Trifluoracetylmyoglobin (5,92), Azurin (5,65), C-Phycocyanin (4,85) und C-Phycocya- nin (4,65) als Standards verwendet wurden. Es wurde gefunden, daß die PPIase-β dieser Erfindung einen einzigen isoelektrischen Punkt von ca. 5,0 aufweist, wie in Fig. 12 gezeigt ist.

(3) Homogenität auf der Umkehrphasensäule

Die PPIase-β der vorliegenden Erfindung wurde auf eine Umkehrphasen-Aquapore-RP-300-Säule (2,1 mm im Durchmesser x 3 cm; hergestellt von der Applied Biosystems Corp.) aufgetragen und mit 0,1% Trifluoressigsäure, welche Acetonitril in Konzentrationen eines linearen Gradienten von 0% bis 100% enthielt, über eine Periode von 45 Minuten bei einer Flußgeschwindigkeit von 200 ul/min eluiert. Wie in Fig. 5 gezeigt, ergab die PPIase einen einzigen Peak.

(4) Bestimmung der partiellen Aminosäuresequenz

Aminosäuresepuenzen von tryptischen Fragmenten

Eine Lösung von 200 ug E. coli-PPIase-β, welche in 50 ul 0,1 M NH&sub4;HCO&sub3; gelöst waren, wurde mit 4 ug TPCK-behandeltem Trypsin für 8 Stunden bei 37ºC verdaut. Der Verdau wurde auf einer Umkehrphasen-Spher-5RP-18-Säule (2,1 mm im Durchmesser x 3 cm) und einer Aquapore-RP-300-Säule (2,1 mm im Durchmesser x 3 cm) (beide von Applied Biosystems) getrennt und gereinigt. In diesem Fall wurde die Elution mit einem linearen Gradienten von 0% bis 100% Acetonitril-Konzentration in 0,1% Trifluoressigsäure oder 0,1% Heptafluorbutylsäure über einer Periode von 45 Minuten bei einer Flußgeschwindigkeit von 200 ul/min durchgeführt, um 18 Peptidpeaks zu erhalten. Das Elutionsprofil ist in Fig. 6 gezeigt.
Sieben der Peptidfragmente wurden mit einem automatischen Sequenziergerät Modell 477A (Applied Biosystems) analysiert, um die Aminosäuresequenz zu bestimmen, und als Ergebnis wurden die folgenden Aminosäuresequenzen erhalten:

Aminosäureseguenzen von Fragmenten, die aus der Cyanbromidspaltung resultierten

In einer 70%igen Ameisensäure wurden 200 ug der PPIase durch Behandlung mit 500 ug Cyanbromid über Nacht hydrolysiert. Die resultierenden Fragmente wurden auf Umkehrphasen-Spheri-5RP-18 (2,1 mm im Durchmesser x 3 cm)- und Aquapore-RP-300 (2,1 mm im Durchmesser x 3 cm)-Säulen (beide von Applied Biosystems) getrennt und gereinigt. In diesem Falle wurde die Elution durch einen linearen Gradienten von 0% bis 100% Acetonitrilkonzentration in 0,1% Trifluoressigsäure oder 0,1% Heptafluorbutylsäure über eine Periode von 45 Minuten bei einer Flußgeschwindigkeit von 200 ul/Minute durchgeführt, um 15 Peptidpeaks zu erhalten. Das Elutionsprofil ist in Fig. 7 gezeigt.
Sechs dieser Peptidfragmente wurden mit einem automatischen Sequenziergerät Modell 477A (Applied Biosystems) auf die Aminosäuresequenz hin analysiert. Als Ergebnis wurden die folgenden Aminosäuresequenzen erhalten:

(5) N-Terminale Aminosäuresequenz

Die PPIase-β wurde auf die aminoterminale Sequenz hin analysiert, indem ein Aminosäuresequenziergerät Modell 477A (von Applied Biosystems) verwendet wurde. Als Ergebnis wurden die folgenden Sequenzen erhalten:

(6) Aminosäurezusammensetzung

Zu 5 ug der gereinigten PPIase-β in einem Teströhrchen wurden 0,5 ml 6 N HCl zugegeben, und die Mischung wurde ent gast, in einem Röhrchen verschlossen und 24 Stunden lang bei 110ºC hydrolysiert. Das resultierende Hydrolysat wurde unter Unterdruck verdampft und auf die Aminosäurezusammensetzung hin analysiert, indem ein Aminosäureanalysator JLC- 300 (Japan Electron Optics Laboratory Co., Ltd.) verwendet wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1
(1) Die Werte in Klammern repräsentieren die Zahlen der Aminosäuren, die aus den bestimmten Aminosäuresequenzen erhalten wurden.
(2) Zwei Val-Val-Bindungen und drei Val-Ile-Bindungen sind in der Aminosäuresequenz vorhanden.

(7) Empfindlichkeit von Escherichia coli-PPIase-β gegenüber Cyclosporin A (CsA)

Die Inhibitionswirkung von CsA auf die Aktivität der gereinigten E. coli-PPIase-β wurde durch das Verfahren bestimmt, welches in N. Takahashi et al., Nature 377, 473 - 475 (1989) beschrieben wird. Die Ergebnisse sind in Fig. 8 gezeigt. Die Figur zeigt den Vergleich des Ausmaßes an Inhibition durch Cyclosporin A auf Escherichia coli-PPIase und die Schweine-PPIase. Cyclosporin A in einer Konzentration, die ausreichend ist, um die Schweine-PPIase und die Hefe-PPIase vollständig zu inhibieren, bringt praktisch keine Inhibition für die Escherichia coli-PPIase-β. Die Bindung von CsA inhibiert Schweine-PPIase- und Hefe-PPIase- Aktivitäten; daher scheint eine positive Beziehung zu bestehen zwischen der Bindungsaktivität von CsA an die PPIase und der Inhibitionswirkung von CsA auf die PPIase- Aktivität. Es wird angenommen, daß sich die Wirkungen von CsA auf verschiedene Organismen, wie z.B. die antifungale Wirkung, die antischistosomale Wirkung, die anti-Malaria- Wirkung und dergleichen, durch die Bindungsaktivität von CsA an die PPIase, nämlich die Inhibitionswirkung von CsA auf die PPIase-Aktivität, manifestieren. Man beachte, daß die Tatsache, daß die Inhibitionswirkung von CsA bei E. coli-PPIase nicht beobachtet wird, mit der Tatsache übereinstimmt, daß die Bindungsaktivität von CsA, welches in allen getesteten Eukaryoten vorhanden ist, in E. coli nicht nachgewiesen wurde.

Beispiel 3 Klonieren des Escherichia coli-PPIase-β-Gens

DNA mit hohem Molekulargewicht wurde gemäß dem Verfahren, welches von Thomas et al. (J. Mol. Biol., 11, 476 (1965)] beschrieben wird, aus dem E. coli-Stamm HB101 präpariert. Ca. 2 ug der hochmolekularen DNA wurden in 20 ul einer Lösung [10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM NaCl, 6 mM MgCl&sub2;, 6 mM Mercaptoethanol, 0,1% Gelatine, 10 Einheiten Bgl II (Nippon Gene K.K.) und 10 Einheiten Hind III (Nippon Gene K.K.)] für 3 Stunden bei 37ºC verdaut, einer Elektrophorese auf 0,8%igem Agarosegel unterworfen und gemäß dem Southern- Verfahren [Southern, E.M, J.Mol. Biol., 98, 503 (1975)] auf einen Membranfilter (Amersham Corp., "Hybond-N") überführt.
Die DNA wurde durch Aussetzen an UV-Licht für 2 Minuten auf dem Filter fixiert und dann wie folgt mit einer Sonde 10 hybridisiert. Als die Sonde diente die DNA-Kette: (SEQ ID NR 15) 5'-ATGAA(AG)CA(AG)AA(AG)GC(TCAG)ACCAAAGAACC-3', die von einem automatischen DNA-Synthesegerät (Applied Bio- Systems Corp., "Modell 380") auf der Basis einer Aminosäuresequenz von Methionin an Position 59 zu Prolin an der Stelle von Position 67 in der E. coli-PPIase-β synthetisiert wurde. Die synthetische DNA (20 pmol) wurde in 50 ul einer Lösung, welche 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM Dithiothreitol, 100 uCi [γ-³²P] ATP (3000 Ci/mmol, von der Amersham Corp.) und 12 Einheiten T4-Polynukleotidkinase (hergestellt von der Takara Shuzo Co., Ltd) enthielt, für 60 Minuten bei 37ºC umgesetzt, um das 5'-Ende mit ³²P zu markieren. Der Filter wurde für 1 Stunde bei 37ºC in eine Vorhybridisierungslösung [5 x Denhardt-Lösung (100 x Denhardt-Lösung = 2% Rinderserumalbumin, 2% Ficoll und 2% Polyvinylpyrrolidon), 1 M NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM EDTA, (pH 8,0), 0,1% Natriumdodecylsarcosinat und 20 ug/ml beschallte Lachssperma-DNA) und dann für 15 Stunden bei 37ºC in eine Hybridisierungslösung (eine Lösung, die durch Einarbeiten von ca. 10&sup6; cpm/ml der oben erwähnten markierten DNA in die Vorhybridisierungslösung erhalten wurde] eingetaucht. Der Filter wurde bei Raumtemperatur mit einer 6 x SSC-Lösung (20 x SSC = 3 M NaCl, 0,3 M Trinatriumcitrat) gewaschen, weiterhin für 30 Minuten bei 37ºC mit einer Lösung von 3 x SSC und 0,1% Natriumdodecylsarcosinat gewaschen und für 4 Tage bei -80ºC an einen Röntgenfilm (Kodak, "XAR-5") ausgesetzt. Der entwickelte Film zeigte, daß ca. 1 kb des Bgl II/Hind III-DNA-Fragmentes mit der Sonde hybridisierten. Somit wurde eine E. coli-Genbibliothek, welche ca. 1 kb-DNA-Fragmente enthielt, wie folgt hergestellt.
Circa 50 ug der oben erwähnten hochmolekularen E. coli-DNA wurden für 3 Stunden bei 37ºC in einer Lösung (10 mM Tris- HCl (pH 7,5), 100 mM NaCl, 6 mM MgCl&sub2;, 6 mM Mercaptoethanol, 0,1% Gelatine, 200 Einheiten Bgl II (Nippon Gene K.K.) und 200 Einheiten Hind III (Nippon Gene K.K.)] verdaut und einer Elektrophorese auf 0,8%igem Agarosegel unterworfen. Ein DNA-Fragment mit ca. 1 kb wurde durch das Glaspulververfahren (Bio-101 Corp., "Gene Clean ) abgetrennt und gereinigt.
Circa 50 ng des gewonnenen Bgl II/Hind III-DNA-Fragments und ca. 100 ng pUC119-Vektor, welcher mit BamHI und Hind III verdaut worden war, wurden für 15 Stunden bei 16ºC in 40 ul einer DNA-Ligationskit-Lösung A und 8 ul einer Lösung B (Takara Shuzo Co., Ltd.) ligiert, um ein rekombinantes Plasmid zu erhalten. 20 ul der resultierenden Reaktionsmischung wurden verwendet, um 400 ul kompetente Zellen des JM 109-Stammes (Epicurian coli , STRATAGENE) gemäß der Beschreibung des Herstellers zu transformieren. Die Transformanten wurden auf zehn X-Gal-Platten mit einem Durchmesser von 90 mm (50 ug/ml 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid, 80 ug/ml Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid, 25 ug/ml Ampicillin, ein LB-Kulturmedium (1% Baktotrypton, 1% NaCl, 0,5% Hefeextrakt) und 1,5% Agar] ausgestrichen. Diese Platten wurden über Nacht bei 37ºC inkubiert, um ca. 1.500 Transformanten als weiße Kolonien zu erhalten. Diese wurden als eine Bibliothek zum Screenen auf E. coli-PPIase- Gene verwendet.
Die rekombinanten Kolonien wurden auf einen Filter (Amersham Corp., "Hybond-N") überführt. Der Filter wurde 5 Minuten lang auf ein 3MM-Filterpapier (Whatman Corp.) gelegt, welches mit 0,5 N NaOH und 1,5 M NaCl getränkt war, wobei die Oberfläche des Filters mit den Kolonien nach oben zeigte, und dann für 5 Minuten auf dasselbe Filterpapier, welches mit 1 M Tris-HCl (pH 7,5) und 1,5 M NaCl getränkt war. Dann wurde der Filter mit einer 2 x SSC-Lösung gewaschen, an der Luft getrocknet und mit Uv-Licht bestrahlt, um die E. coli-DNA auf dem Filter zu fixieren. Der so erhaltene Filter wurde unter denselben Bedingungen wie oben beschrieben einer Hybridisierung unterworfen, indem eine synthetische DNA als Sonde verwendet wurde. Dann wurde der Filter gewaschen und an einen Röntgenf ilm exponiert und entwickelt. Neun erhaltene positive Klone wurden für die nachfolgende Analyse verwendet. Insbesondere wurde jede der interessierenden Kolonien auf den Platten in einem LB-Kulturmedium, welches 25 ug/ml Ampicillin enthielt, angeimpft und unter Schütteln bei 37ºC über Nacht kultiviert. 115 ml der resultierenden Kultur wurden verwendet, um durch das alkalische bakteriolytische Verfahren [Ish-Horowicz, D. & J.F. Burke, Nucleic Acids Res., 9, 2989 (1981)] eine rekombinante DNA zu präparieren. Die so erhaltenen 9 Klon-DNAs wurden einem doppelten Verdau mit EcoRI und Hind III, dann einer Elektrophorese auf 1% Agarose und weiterhin einer Southern-Analyse unterworfen, wie oben beschrieben wurde. Als ein Ergebnis wurde gefunden, daß nur ein Klon, welcher 950 bp eines E. coli-DNA-Fragments enthielt, ein positiver Klon war. Diese Plasmid-DNA wurde als pEPPIb bezeichnet.
Das Insert von pEPPIb wurde in eine DNA vom M13mp-Phagentyp subkloniert und durch das Dideoxy-Verfahren analysiert, um seine Nukleotidsequenz zu bestimmen (Fig. 9 (SEQ ID NR 19)). Die Aminosäuresequenz, welche von der Nukleotidsequenz abgeleitet wurde, war mit der Aminosäuresequenz des Peptids, das aus der E. coli-Hauptkomponente (PPIase-β) erhalten wurde, vollständig identisch; daher wurde das isolierte Gen als ein Gen bestätigt, welches für die E. coli PPIase-β codiert. Dieses Gen codierte für ein Protein, welches aus 164 Aminosäureresten bestand und ein Molekulargewicht von 18.184 Dalton besaß, wie aus der Aminosäuresequenz berechnet wurde. Dieses Molekulargewicht stimmt sehr genau mit dem überein, das aus den Daten der SDS-Elektrophorese geschätzt wurde. Darüber hinaus stimmt die Aminosäurezusammensetzung sehr genau mit den gefundenen Werten (Tabelle 1) überein.
Fig. 19 (SEQ ID NR 21-33) zeigt die gesamte Aminosäuresequenz der E. coli PPIase-β und eine teilweise Aminosäuresequenz der PPIase-α im Vergleich mit den Sequenzen von anderen Cyclophilinen. In der Figur sind die Aminosäuren, die bei allen Spezies, einschließlich E. coli, in homologen Bereichen konserviert sind, innerhalb der Kästen. Die Aminosäuresequenz von E. coli PPIase-β zeigt ca. 25% Homologie mit denen von Cyclophilin/PPIasen aus den anderen Spezies, und insbesondere wurde eine hohe Homologie in den Bereichen von dem 30. bis zu dem 70. Rest und von dem 100. bis 120. Rest, von der aminoterminalen Seite aus gezählt, beobachtet. Auch E. coli PPIase-α zeigt eine teilweise hohe Homologie zu PPIase-β und konservierten Aminosäureresten in stark homologen Bereichen unter den Sequenzen der anderen Spezies. Daher scheinen sowohl PPIase-β als auch -α aus E. coli cyclophilinähnliche PPIasen zu sein. Anders als die Cyclophilin/PPIasen aus den anderen Spezies, insbesondere der Eukaryoten, besitzen die PPIasen aus E. coli keine Empfindlichkeit gegenüber CsA. Es wird angenommen, daß der Vergleich ihrer Strukturen die Grundlage für die Aufklärung des CsA-Bindungsmusters von anderen Spezies und von dem Wirkungsmechanismus der PPIasen als Enzym und dergleichen bietet.
In dem Fall der Schweine-PPIase führt ein SH-Modifizierungsreagens Modifikationen von vier Cysteinresten ein und nimmt dieser ihre enzymatische Aktivität. Jedoch wird die Modifikation von einem der Cysteine inhibiert, wenn CsA an das Enzym bindet. Nach dieser Modifikation wird die enzymatische Aktivität zurückgewonnen, indem CsA durch Verdünnung von dem Enzym freigesetzt wird. Es wurde daher geschlossen, daß CsA den Cysteinrest vor der Modifikation mit dem SH- Reagens schützt, indem es direkt mit dem Cysteinrest als aktiver Gruppe wechselwirkt [Fisher, G., Wittmann-Liebold, B., Lang, K., Kekfhaber, T. Schmid, F.X. Nature 111, 476- 478 (1989)). Andererseits werden die PPIasen, die aus E. coli stammen, in ihrer enzymatischen Aktivität weder durch das CsA noch durch das SH-Modifizierungsreagens beeinträchtigt.
Wenn man unter diesem Gesichtspunkt die Aminosäuresequenz in Fig. 19 (SEQ ID NR 21 - 33) anschaut, findet man keinen Cysteinrest, welcher unter all den PPIasen aus den gegebenen Organismen völlig konserviert ist.
Bei dem Vergleich der Hydropathiemuster [Kyte, J.M. & Doolittle, R.F., J. Mol. Biol. 157, 105 - 132 (1982)) von PPIasen aus Schweinen und Hefe, von welchen gezeigt wurde, daß sie CsA binden und daß die enzymatischen Aktivitäten durch CsA inhibiert werden (siehe unsere frühere Patentan meldung, welche Hefe-PPIase betrifft), mit E. coli-PPIase- β, von welcher gezeigt wurde, daß sie nicht durch CsA inhibiert wird, sind Cys-115 in Schweinen und Cys-117 in Hefe, welche beiden PPIasen aus Schweinen und Hefe, die für CsA empfindlich sind, gemeinsam sind und in E. coli fehlen, an ähnlichen Positionen in den Hydropathiemustern (Fig. 20) lokalisiert.
In E. coli-PPIase-β sind an solchen Positionen keine Cysteinreste vorhanden und daher wird vorhergesagt, daß Cys-115 in Schweinen und Cys-117 in Hefe direkt mit CsA wechselwirken. Im Lichte der Daten für E. coli läßt die Theorie, daß die obigen Cysteinreste aktive Gruppen sind, welche direkt mit der Ausprägung der enzymatischen Aktivität zusammenhängen, Raum für Zweifel. Wenigstens in dem Fall von E. coli wurde kein Beweis geliefert, daß die Cysteinreste aktive Gruppen sind. Eher wird von den zwei Bereichen mit hoher Homologie, welche bei den Aminosäuresequenzen aller Spezies gefunden werden, angenommen, daß sie für die Ausprägung der Aktivitäten wichtig sind.
Man beachte, daß Escherichia coli HB101/pEPPIb, welche das Plasmid pEPPIb enthält, bei dem Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology unter FERM P-11042 hinterlegt wurde.

Beispiel 4 Konstruktion des Plasmids pBLEPPIb (Fig. 10)

In 100 ul einer Lösung [50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 7 mM MgCl&sub2;, 150 mM KCl und 20 Einheiten Pvu 1 (hergestellt von der Nippon Gene K.K.)) wurden 6 ug eines Plasmids (pEPPIb), welches das E. coli-PPIase-β-Gen enthielt, 180 Minuten lang bei 37ac verdaut. Der Verdau wurde zweimal mit 50 ul einer Phenol/Chloroform (1 : 1)-Mischung extrahiert, um Proteine zu entfernen, und mit Ethanol gefällt. Die gewonnene DNA wurde mit einem Zentrifugalevaporationsgerät getrocknet und in 100 ul eines Mungbohnen-Nukleasepuffers (Takara Shuzo Co., Ltd., "DNA-Deletionskit") gelöst. Nach einer Zugabe von 2 ul Mungbohnen-Nuklease (Takara Shuzo Co., Ltd., "DNA- Deletionskit") wurde der Mischung erlaubt, 60 Minuten lang bei 37ºC zu reagieren, sie wurde zweimal mit 50 ul einer Phenol/Chloroform (1 : 1)-Mischung extrahiert, um Proteine zu entfernen, und mit Ethanol gefällt. Die gewonnene DNA wurde mit einem Zentrifugalevaporationsgerät getrocknet, 60 Minuten lang bei 37ºC mit 30 ul einer Lösung [100 mM Tris- HCl (pH 7,6), 7 mM MgCl&sub2;, 50 mM NaCl und 20 Einheiten EcoRI (Nippon Gene K.K.)] umgesetzt und einer Elektrophorese auf einem 1,2%igen Agarosegel unterworfen. Die eingefügte DNA wurde durch das Glaspulververfahren (Bio-101 Corp., "Gene Clean ") gewonnen und mit 10 ul einer TE-Lösung [10 mM Tris-HCl (pH 7,5) und 1 mM EDTA] extrahiert.
4 ul der eingefügten DNA wurden mit ca. 15 ng einer Vektor- DNA (Bluescript II SK+), welche vorher mit den Restriktionsenzymen EcoRI (hergestellt von der Nippon Gene K.K.) und EcoRV (hergestellt von der Nippon Gene K.K.) verdaut worden war, in 30 ul DNA-Ligationskit-Lösung A (Takara Shuzo Co., Ltd.) und 5,5 ul Lösung B 16 Stunden lang bei 16ºC ligiert, um ein rekombinantes Plasmid zu erhalten.
Escherichia coli XL-1 Blue wurde mit 20 ul der Ligationsmischung durch das Calciumchlorid-Verfahren [Mandel, M. & Higa, A. (1970), J. Mol. Biol. 53, 149) transformiert. Die Transformante wurde als weiße Kolonie selektioniert, welche durch Kultivieren der Zellen 16 Stunden lang bei 37ºC auf einer X-Gal-Platte (155 ug/ml 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D- galactopyranosid, 80 ug/ml Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid, 50 ug/ml Ampicillin, 1% NaCl, 0,5% Hefeextrakt, 1% Trypton und 1,5% Agar) erhalten wurden.
Die Transformante wurde in einem LB-Kulturmedium (1% NaCl, 0,5% Hefeextrakt und 1% Trypton), welches 50 ug/ml Ampicillin enthielt, angeimpft und darin 6 Stunden lang bei 37ºC kultiviert. Aus der Kultur wurde durch das alkalische bakteriolytische Verfahren [Birnboim, H.C. & Doly, J. (1979) Nucleic Acids Res. 7, 1513] Plasmid-DNA präpariert und in 30 ul einer TE-Lösung gelöst. Ein Drittel der so erhaltenen DNA wurde 60 Minuten lang bei 37ºC mit einer Lösung [50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 7 mM MgCl&sub2;, 100 mM NaCl, 25 ng/ul Ribonuklease A, 5 Einheiten Xho I (Takara Shuzo Co., Ltd.) und 5 Einheiten BamH I (Nippon Gene K.K.)) behandelt und dann einer Elektrophorese auf 0,8%igem Agarosegel unterworfen, um ein Plasmid zu bestätigen, welches das gewünschte Insert enthielt. Die Transformante wurde in 200 ml eines LB-Mediumsl welches 50 ug/ml Ampicillin enthielt, kultiviert und dem alkalischen bakteriolytischen Verfahren unterworfen, um eine Plasmid-DNA zu präparieren. Die Plasmid-DNA wurde weiter durch die Cäsiumchlorid-Dichtegradientenzentrifugation [Maniatis, T. et al. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Habor Laboratory) gereinigt. Dieses Plasmid wurde als pBLEPPIb bezeichnet.

Beispiel 5 Konstruktion des Plasmids pBLΔEPPIb (Fig. 11)

29 ug pBLEPPIb wurden 12 Stunden lang bei 37ºC in 1 ml einer Lösung [50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 7 mM MgCl2, 150 mM NaCl und 200 Einheiten Sal 1] verdaut und dann 45 Minuten lang bei 5ºC stehen gelassen, um die Restriktionsenzyme zu inaktivieren. Zu 500 ul der resultierenden Lösung wurden 10 ul 1 mM Thio-dNTP (Stratogene Corp.; EXO/MUNG-Deletionskit) und 10 ul Klenow-Fragment (Takara Shuzo Co., Ltd.) zugegeben und der Mischung wurde erlaubt, 45 Minuten lang bei 37ºC zu reagieren, um die Spaltungsstellen mit glatten Enden zu versehen. Die DNA-Lösung wurde mit einer Phe nol/Chloroform (1 : 1)-Mischung extrahiert, um Proteine zu entfernen, und mit Ethanol gefällt, um die DNA zu gewinnen. Als nächstes wurde diese DNA in 25 ul einer Lösung [50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 7 mM MgCl2, 60 mM NaCl und 40 Einheiten Hind III) verdaut, mit Phenol extrahiert, mit Ethanol gefällt und durch ein Zentrifugalevaporationsgerät getrocknet.
Die so erhaltene DNA wurde in 100 ul eines Exo III-Puffers (Takara Shuzo Co., Ltd.; DNA-Deletionskit) gelöst und mit 1 ul Exonuklease III (dasselbe Kit) bei 23ºC umgesetzt. Im Laufe dieser Reaktion wurden in Intervallen von 20 Sekunden Proben von 10 ul genommen, mit 10 ul Mungbohnen-Nukleasepuffer gemischt und auf Eis gestellt, um die Reaktion zu stoppen. Eine Gesamtmenge von zehn so erhaltenen Proben wurde vereinigt, 5 Minuten lang bei 65ac erwärmt, um die Exonuklease III zu inaktivieren, und dann 60 Minuten lang bei 37ºC mit 2 ul Mungbohnen-Nuklease (hergestellt von demselben Hersteller) behandelt, um eine DNA-Deletion zu erzeugen. Die Mischung wurde mit Phenol extrahiert und mit Ethanol gefallt, um die DNA zu gewinnen. Ein Viertel der so gewonnenen DNA wurde 120 Minuten lang bei 16ºC mit 100 ul DNA-Ligationskit-Lösung A und 12 ul der Lösung B (beide von Takara Shuzo Co., Ltd.) behandelt, um die DNA zu cyclisieren.
Die cyclisierte DNA wurde mit Sal I verdaut, um nicht umgesetzte Plasmid-DNA zu entfernen. Die erhaltene Plasmid-DNA wurde verwendet, um den E. coli-Stamm XL-1 Blue durch das CaCl&sub2;-Verfahren zu transformieren. Eine Plasmid-DNA wurde auf dieselbe Weise gereinigt, wie sie oben für die Transformante beschrieben wurde, doppelt mit Xho I (Takara Shuzo Co., Ltd.) und Ecor I (Nippon Gene K.K.) verdaut und dann einer Elektrophorese mit 1,2%igem Agarosegel unterworfen, um eine Transformante mit einem Insert einer gewünschten Länge zu selektionieren. Die 5'-terminale Basensequenz des PPIase-β-Gens in dem Plasmid-DNA-Molekül aus der Transfor mante wurde bestimmt, indem ein M13-Sequenzierungskit (Toyobo K.K.) verwendet wurde. Ein Klon, von welchem angenommen wurde, daß er für die Konstruktion des das PPIase-β- Gen exprimierenden Plasmids am geeignetsten warl wurde selektiert. Dieses Plasmid wurde als pBLΔEPPIb bezeichnet.

Beispiel 6 Konstruktion des Expressionsdlasmids pATrp EPPIb

Zehn ug der pBLΔEPPIb Plasmid-DNA, welche in dem Beispiel 5 erhalten wurde, wurden 120 Minuten lang bei 37ºC mit 50 ul einer Lösung [50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 7 mM MgCl&sub2;, 100 mM NaCl und 20 Einheiten Xho I (Takara Shuzo Co., Ltd.)] behandelt, mit Phenol extrahiert und mit Ethanol gefällt, um die DNA zu gewinnen. Diese DNA wurde 50 Minuten lang bei 37ºC mit 50 ul Klenow-Puffer [7 mM Tris-HCl (pH 7,5), 7 mM MgCl&sub2;, 100 mM NaCl, 0,1 mM EDTA und 5 Einheiten Klenow- Fragment (Takara Shuzo Co., Ltd.)] behandelt, um die Xho 1- Spaltungsstellen mit glatten Enden zu versehen, mit Phenol extrahiert und dann mit Ethanol gefällt, um die DNA zu gewinnen. Die so erhaltene DNA wurde weiter 60 Minuten lang bei 37ºC mit 30 ul einer Lösung [50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 7 mM MgCl&sub2;, 100 mM NaCl und 20 Einheiten BamH I (Nippon Gene K.K.)] behandelt, einer Elektrophorese mit einem 1,2%igen Agarosegel unterworfen, und die eingefügte DNA wurde durch das Glaspulver-Verfahren gewonnen. Die eingefügte DNA wurde aus 10 ul einer TE-Lösung extrahiert.
Andererseits wurde mit Pst I/Cla I doppelt verdauter pPL- TNF (Ikenaka et al., Chem. Pharm. Bulletin, im Druck), welcher eine trp-Promotor-trp-LSD-Sequenz enthielt, mit einem großen Pst I/Cla I-Fragment aus pAT153 ligiert, um einen pATtrp-Vektor zu erhalten (offenbart in der japanischen Patentanmeldung Nr. 68-37,452), und 10 ug der Vektor-DNA wurden mit Cla I (BioRad Co.) verdaut, die Spaltungsstelle wurde durch ein Klenow-Fragment mit glatten Enden versehen, es wurde mit BamH I verdaut, und dann einer Elektrophorese auf einem 1,2%igen Agarosegel unterworfen, um die eingefügte DNA abzutrennen. Die eingefügte DNA wurde durch das Glaspulver-Verfahren gewonnen und aus 10 ul TE-Lösung extrahiert.
Dann wurden 2 ul des erhaltenen DNA-Fragmentes, welches das E. coli-PPIase-β-Gen enthielt, 16 Stunden lang bei 16ºC mit 30 ul eines linearisierten pATtrp in 30 ul einer DNA-Ligationskit-Lösung A und 6 ul der Lösung B (beide Takara Shuzo Co., Ltd.) ligiert, und ein cyclisches rekombinantes Plasmid wurde erhalten. Das Expressionsplasmid wurde als pATtrp EPPIb bezeichnet. Escherichia coli-Stamm HB 101 wurde unter Verwendung des Expressionsplasmids pATrp EPPIb durch das Calciumchlorid-Verfahren transformiert.
Die erhaltene Transformante wurde für eine experimentelle Expression von E. coli-PPIase-β in E. coli-Zellen verwendet. In dem folgenden Experiment wurde die Transformante, welche das pATtrp-Plasmid enthielt, als eine Kontrolle verwendet. 50 ul einer Glycerinstammlösung der Transformante wurden in 5 ml eines LB-Kulturmediums, welches 50 ug/ml Ampicillin enthielt, angeimpft und über Nacht bei 37ºC kultiviert. 50 ul der Vorkultur wurden in 100 ml eines M9CA- amp-Kulturmediums (0,05% NaCl, 0,6% Na&sub2;HPO&sub4;, 0,3% KH&sub2;PO&sub4;, 0,1% NH&sub4;Cl, 0,2% Casaminosäure, 2 mM MgSO&sub4;, 0,2% Glucosel 0,1 mM CaCl&sub2;, 50 ug/ml Ampicillin, pH 7,4) angeimpft und bei 37ºC in Kultur geschüttelt. Wenn die Trübung (Absorption bei 600 nm) der Kultur ca. 0,3 erreichte, wurde 3-β-Indolacrylsure (IAA) bis zu einer Endkonzentration von 50 ug/ml zugegeben, um eine Expression zu induzieren, und die Schüttelkultur wurde weiter für ca. 20 Stunden bei 37ºC fortgesetzt. Es wurde bestätigt, daß die Produktion von PPIase-β durch die Transformante, bei einer quantitativen Bestimmung durch Densitometrie gefolgt von einer Elektrophorese über 50 mal höher war als die der Kontrolle (Fig. 12). Es ist klar, daß die PPIase-β in einer großen Menge in der löslichen Fraktion der Transformante exprimiert wird.

Beispiel 7 Produktion von PPIase-β

In 5 ml eines LB-Am-Kulturmediums (10 g/l Baktotrypton, 5 g/l Hefeextrakt, 5 g/l NaCl und 50 ug/ml Ampicillin) wurden 50 ul der oben erwähnten Glycerinstammlösung der Transformante angeimpft und über Nacht bei 37ºC kultiviert. In 50 ml eines LB-Amp-Kulturmediums wurden 0,5 ml der resultierenden Kultur angeimpft und wieder über Nacht kultiviert. Dann wurden 4 ml der Kultur in 400 ml M9CA-Amp-Kulturmedium angeimpft, für 2 Stunden bei 37ºC kultiviert und nach Zugeben von 0,8 ml 20 mg/ml 3-β-Indolacrylsäure (IAA)-Lösung für weitere 24 Stunden kultiviert.
Die Kultur in 400 ml M9CA-Amp-Medium wurde mit 10 Wiederholungen durchgeführt. Circa 4 Liter der vereinigten Kultur wurden für 5 Minuten bei 4ºC und bei 6.000 UpM zentrifugiert, um 11,8 g nasse Bakterienzellen zu erhalten.
11,8 g der Bakterienzellen wurden in 50 ml 0,1 M Tris-HCl (pH 7,5) Lösung, welche 5 mM 2-Mercaptoethanol enthielt, suspendiert und für 1 Stunde bei 30ºC mit 11,8 mg Lysozym behandelt. Die Mischung wurde für 1 Minute beschallt, um die Zellen zu homogenisieren, und für 30 Minuten bei 18.000 UpM zentrifugiert. Dieser Überstand wurde dreimal gegen 3 Liter 10 mM Tris-HCl-Lösung (pH 8,0), welche 0,05% NaN&sub3; enthielt, dialysiert und dann auf eine DEAE-Sepharose-CL- 6B-Säule (2,5 cm im Durchmesser x 40 cm) aufgetragen, welche vorher mit demselben Puffer äquilibriert worden war. Die enzymatische Aktivität der Peptidy-Prolyl-cis-trans- Isomerase wurde durch das Verfahren gemessen, welches in Takahashi, N. et al., Nature, 337, 473-475 (1989) beschrieben wird. Die Elution des Proteins von der Säule wurde bewirkt durch eine schrittweise Elution mit 0,05 M, 0,1 M, 0,2 M und 0,3 M NaCl. Das gewünschte Enzym wurde in einem Eluat mit einer Salzkonzentration von 0,1 M nachgewiesen (Fig. 21). Die Fraktionen 176-196, die eine enzymatische Aktivität aufwiesen, wurden mit 80% gesättigtem Ammoniumsulfat konzentriert und auf einer Sephadex-G75-Säule (2,5 cm im Durchmesser x 90 cm) mit 10 mM Tris-HCl (pH 8,02), welcher 0,15 M NaCl und 0,05% NaN&sub3; enthielt, getrennt (Fig. 14), um eine gereinigte Probe zu erhalten. Die Fraktionen 64-78, die in der Figur gezeigt werden, wurden als eine gereinigte Fraktion vereinigt und wie unten beschrieben charakterisiert.

Beispiel 8 Charakteristik-Vergleich zwischen rekombinanter Escherichia coli PPIase-β und dem natürlichen Gegenstück

(1) Bestimmung des Molekulargewichtes

Die Molekulargewichte wurden durch Natriumdodecylsulfat- Polyacrylamid-Gradientengel (12% bis 30% Polyacrylamidgel)- Elektrophorese bestimmt. Als Molekulargewichtstandards wurden Phosphorylase b (Molekulargewicht: 94.000), Rinderserumalbumin (67.000), Ovalbumin (43.000), Carboanhydrase (30.000), Sojabohnen-Trypsininhibitor (20.100) und a-Lactalbumin (14.400) verwendet. Es wurde gefunden, daß die rekombinante E. coli-PPIase-β ein einziges Molekulargewicht von 20.000 Dalton besitzt, wie in Fig. 15 gezeigt ist, welches nicht von dem des natürlichen Gegenstücks unterschieden werden konnte.

(2) Bestimmung des isoelektrischen Punktes

Die isoelektrischen Punkte wurden gemäß dem Handbuch der isoelektrischen Fokussierung mit Ampholinen, welches von der LKB Corp. veröffentlicht wird, bestimmt. Als Standards wurden Cytochrom C (pl 10,6), Wal-Myoglobin (8,3), Pferde- Myoglobin (7,4), Schweine-Myoglobin (6,45), Schweine-Trifluoracetylmyoglobin (5,92), Azurin (5,65) und C-Phycocyanin (4,85, 4,65) verwendet. Die Ergebnisse sind in Fig. 16 gezeigt. Es wurde gefunden, daß die rekombinante E. coli PPIase-β einen einzigen isoelektrischen Punkt von ca. 6,2 besitzt, wie in der Figur gezeigt ist, welcher nicht von dem des natürlichen Gegenstücks unterschieden werden konnte.

(3) Vergleich durch Umkehrphasensäulenchromatographie

Die Probe wurde auf eine Umkehrphasen-Aquapore-RP-300-Säule (2,1 mm im Durchmesser x 3 cm; Applied Biosystems Corp.) aufgetragen. Die Elution wurde mit einem linearen Gradienten von 0% bis 100% Acetonitrilkonzentration in 0,1% Trifluoressigsäure über eine Periode von 45 Minuten bei einer Flußgeschwindigkeit von 200 ul/Minute durchgeführt. Das gereinigte Enzym ergab einen einzigen Peak. Die Retentionszeit der rekombinanten Probe auf den Säulen konnte nicht von der des natürlichen Enzyms unterschieden werden. Die rekombinante Probe und die natürliche Probe wurden gemischt und einer Trennung unterworfen. Die Mischung ergab einen einzigen Peak und zeigte keinerlei Unterschied in dem Verhalten auf der Umkehrphasensäule (Fig. 17).

(4) Aminoterminale Seaqenz

Wenn die Standard-PPIase, die in Beispiel 7 erhalten wurdel mit einem automatischen Proteinsequenziergerät, Modell 477A (hergestellt von Applied Biosystems), analysiert wurde, war die folgende Sequenz von dem aminoterminalen Methionin bis zu dem 20. Rest mit der des natürlichen Enzyms völlig identisch:

(5) Aminosäurezusammensetzung

In einem Teströhrchen wurden 20 ug der gereinigten PPIase mit 0,5 ml 6 N HCl gemischt, entgast, verschlossen und 24 Stunden lang bei 110ºC hydrolysiert. Das resultierende Hydrolysat wurde unter Unterdruck getrocknet und dann auf die Aminosäurezusammensetzung hin mit einem Aminosäureanalysator, Modell JLC-300 (NIPPON DENSI Co., Ltd.), analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Diese Tabelle gibt die Zusammensetzungswerte für das rekombinante und das natürliche Enzym an, welche eine enge Übereinstimmung zeigen.

(6) Bestimmung der spezifischen Aktivität des Enzyms

Die spezifischen Aktivitäten des rekombinanten und des natürlichen Enzyms wurden auf der Grundlage der Werte berechnet½die gemäß dem Verfahren, welches in T. Takahashi et al., Nature, 377, 473-475 (1989) beschrieben wird, aus der Aktivitätsmessung erhalten wurden. Als Ergebnis betrug die spezifische Aktivität des natürlichen Enzyms 51.480 willkürliche Einheiten/A&sub2;&sub0;&sub0; 1 Einheit, während die des rekombinanten Enzyms 52.876 willkürliche Einheiten/A&sub2;&sub8;&sub0; 1 Einheit betrug. Somit konnte bei der spezifischen Aktivität kein Unterschied festgestellt werden (Fig. 18).

Hinterlegung von Mikroorganismen

Escherichia coli JM107/pUC-y-PPI, welche das Plasmid PUC-y- PPI enthielt, wurde am 4. Juli 1989 bei dem Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology (FRI), 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki, 305 Japan, als FERM P-10812 hinterlegt und am 11. Juli 1990 als FERM BP-3002 in eine internationale Hinterlegung unter dem Budapester Vertrag überführt.
Escherichia coli HB101/pEPPIb, welche das Plasmid pEPPIb enthielt, wurde am 3. Oktober 1989 bei der FRL als FERM P- 11042 hinterlegt und am 11. Juli 1990 als FERM BP-3003 in eine internationale Hinterlegung unter dem Budapester Vertrag überführt.

Claims

1. Eine Escherichia coli Peptidyl-Prolyl-cis-trans-Isomerase β, welche die folgenden Eigenschaften besitzt:

(1) sie wirkt an und isomerisiert eine Xaa-Pro-Bindung (wobei Xaa für irgendeine Aminosäure und Pro für L-Prolin steht) in einer Peptidkette,

(2) sie weist ein Einzelmolekulargewicht von etwa 20.000 Dalton in einer Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Konzentrationsgradientgelelektrophorese auf,

(3) sie weist einen einzelnen isoelektrischen Punkt von etwa 5,0 in einer isoelektrischen Fokussierung auf, und

(4) sie wird nicht durch CsA gehemmt.

2. Das Enzym β nach Anspruch 1, welches die folgende Aminosäuresequenz aufweist:

3. Ein Verfahren zum Herstellen von Escherichig coli Peptidy-Prolyl-cis-trans-Isomerase β, gekennzeichnet durch das Gewinnen des Enzyms gemäß Anspruch 1 oder 2 aus Zellen von Escherichia coli.

4. Ein Gen, welches für eine Escherichia coli Peptidyl Prolyl-cis-trans-Isomerase β gemäß Anspruch 1 oder 2 codiert.

5. Ein Gen nach Anspruch 4, welches die folgende Basensequenz besitzt:

6. Ein Expressionsplasmid, welches ein Gen gemäß Anspruch 4 oder 5 enthält.

7. Ein Verfahren zum Herstellen einer Escherichia coli Peptidy-Prolyl-cis-trans-Isomerase β gekennzeichnet, gekennzeichnet durch Kultivieren eines Wirtsorganismus, der mit einem Expressionsplasmid gemäß Anspruch 6 transformiert ist,

und Gewinnen einer Escherichia coli Peptidyl-Prolyl- cis-trans-Isomerase β aus der sich ergebenden Kultur.