DE69032014T2

DE69032014T2 - Impfstoff gegen schweinedysenterie mit vermindertem gehalt an proteinuntereinheit

Info

Publication number: DE69032014T2
Application number: DE69032014T
Authority: DE
Inventors: Anthony Ostle; Michael Wannemuehler
Original assignee: University of Iowa Research Foundation UIRF; Ambico Inc; Iowa State University Research Foundation Inc ISURF
Current assignee: University of Iowa Research Foundation UIRF; Ambico Inc; Iowa State University Research Foundation Inc ISURF
Priority date: 1989-11-03
Filing date: 1990-11-02
Publication date: 1998-09-03
Anticipated expiration: 2010-11-03
Also published as: CA2071955A1; EP0502100A1; GR3026715T3; ATE162724T1; CA2071955C; US5236708A; DE69032014D1; JP2965046B2; WO1991006316A1; JPH06505226A; EP0502100B1; DK0502100T3; ES2117005T3; EP0502100A4

Description

Die Erfindung betrifft die Herstellung eines Impfstoffs gegen Schweinedysentene, einer durch die anaeroben Spirochäten Treponema hyodysenteriae verursachte Erkrankung bei Schweinen.
T. hyodysenteriae wurde als primärer ätiologischer Verursacher von Schweinedysentene erkannt (1). Mit T. hyodysenteriae infizierte Schweine können sich zwar von der Krankheit erholen und sind danach gegen eine weitere Infektion mit T. hyodysenteriae resistent, trotzdem waren Bemühungen, durch parenterale Verabreichung toter T. hyodysenteriae-Zellen eine Immunität zu erreichen, nur beschränkt erfolgreich und bei der praktischen Verwendung in der Regel unwirksam (2). Tote ganzzellige T. hyodysenteriae-Bakterien wurden entwickelt, doch verwenden diese oft Adjuvantien auf Mineralölbasis (3) oder die T. hyodysenteriae-Zellen wurden nicht vorbehandelt, um ihre Wirkung als Bakterien zu erhöhen.
Die Verwendung von lebenden nichtvirulenten T. hyodysenteriae- Stämmen als Impfstoff war beim Schutz betroffener Schweine ebenfalls nicht erfolgreich (4, 5). Es wurden auch Kombinationen toter T. hyodysenteriae-Bakterien und nachfolgender lebender nichtvirulenter T. hyodysenteriae-Impfstoffe getestet (6).
Tote ganzzellige auf T. hyodysenteriae basierende Bakterien, die mittels konventioneller Verfahren hergestellt werden wurden hergestellt und in der Praxis verwendet. Die Effizienz dieser Präparate ist jedoch im Vergleich mit ungeimpften Kontrollen niedrig, mit Impfstoffen, bei denen in 50% der Fälle Schweinedysentene auftrat (7). Andere Präparate toter T. hyodysenteriae-Zellen, die als Bakterien verabreicht werden, waren mit Verlusten durch tote Tiere und Symptomen von Schweinedysentene bei geimpften wie auch bei ungeimpften Tieren ebenfalls nur beschränkt erfolgreich (8).
Ein Hauptgrund für die bis heute anhaltende niedrige Effizienz der untersuchten Impfstoffe kann bei der Interferenz anderer T. hyodysenteriae-Antigene mit funktionelleren immunogenen Antigenen liegen. Ein strikt immunogenes nicht-protektives Antigen kann in einem solchen Ausmass immunogener sein als ein protektives Antigen, dass der grösste Teil der Immunantwort des Wirtstiers zum Schaden der Wirtsantwort auf das protektive Antigen gegen das nichtprotektive Antigen gerichtet wird. Anders gesagt können nichtfunktionelle Antigene (jene, die keine Krankheitsresistenz vermitteln können) mit funktionellen Antigenen konkurrieren. Andere Gründe können darin gefunden werden, dass das funktionelle Antigen durch das nichtfunktionelle Antigen verdeckt ist (sterisch) oder dass gegen das nichtprotektive Antigen produzierte Antikörper das protektive Antigen blockieren, welches deshalb durch das Immunsystem des Wirts nicht verarbeitet wird.
Treponema hyodysenteriae ist eine helixförmige anaerobe Spirochäte. Erst 1988 erklärten Forscher, dass erst wenig über die Physiologie, die Biochemie der Zellen und die Ernährung dieses Organismus bekannt sei (13).
Joens, WO90/02565 (Publ. 22. März 1990) betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Untereinheits-Impfstoffes gegen Schweinedysentene. Diese Untereinheit ist ein mit Protein angereichertes Kohlenhydrat-Gemisch aus Proteinen der äusseren Membran und Lipopolysacchariden von Treponema hyodysenteriae, die als Salzextrakt der äusseren Hülle der Zellen hergestellt wird. Die Behandlung eines Salzextraktes mit Proteinase K oder Natrium-M-Periodat soll einen Verlust der Immunogenizität in einem CFI-Mausmodell ergeben. Die mittels SDS-PAGE getrennten und silbergefärbten Extrakte enthielten Banden bei 47-43, 35-33, 14-12 und 10-8 kDa.
Lipooligosaccharide (LOS) wurden mit heissem Phenolwasser der äusseren Membranen von T. hyodysenteriae-Serotypen 1 bis 7 extrahiert (14). Diese LOS wurden als Antigenreagenz in einem enzymgebundenen Assay für den Nachweis von Antikörpern auf T. hyodysenteriae- Antigene verwendet (16). Damit war jedoch die Frage nicht beantwortet, ob die LOS protektive Antigene sind, die sich als Impfstoff eignen. Zudem wurde in einigen Berichten vermutet, dass treponemales Lipopolysaccharid giftig ist.
Diese Erfindung basiert auf einem Verfahren zur Erhöhung der Wirksamkeit toter T. hyodysenteriae-Präparate. Das Verfahren erfolgt durch die parenterale Verabreichung eines Impfstoffes oder Bakteriums, das als aktives Agens T. hyodysenteriae-Zellen und subzelluläre Komponenten enthält, die vorbehandelt wurden, um den Proteingehalt der T. hyodysenteriae-Komponenten zu verringern. Ganze Zellen, die in einem beliebigen bekannten Medium unter konventionellen Bedingungen gezüchtet werden können, werden lysiert und die pelletierten Lysate behandelt, um das Protein physikalisch oder chemisch abzubauen und dadurch die Menge des anwesenden Proteins zu reduzieren. Dieses reduzierte proteinpräparat wird dem Schwein mittels parenteraler Injektion verabreicht, vorzugsweise vor einer Infektion mit T. hyodysenteriae. Der Impfstoff umfasst ein oder mehrere flagellare Proteine, die gegen den chemischen oder physikalischen Abbau im wesentlichen resistent sind.
Eine Menge von 5 x 10&sup9; toten T. hyodysenteriae-Zellen, die behandelt wurden, um den proteingehalt des Bakteriums oder des Impfstoffs zu reduzieren, reicht aus, um Sterblichkeit und Erkrankung infolge von durch eine T. hyodysenteriae-Infektion verursachte Schweinedysentene wesentlich zu verringern. Der Schutz gegen Sterblichkeit und Erkrankung an durch eine T. hyodysenteriae- Infektion verursachte Schweinedysentene, der durch den Impfstoff mit reduziertem Protein oder Bakterium erreicht wird, ist höher als derjenige bei ähnlichen Präparaten toter T. hyodysenteriae- Zellen oder subzellulärer Komponenten, die nicht vorbehandelt wurden, um den Proteingehalt zur verringern.
Die genaue Art der Antigen-Immunantwort ist nicht bekannt, obwohl eine ziemlich sicher ist, dass systemische Antwort auf das LOS- oder Lpsähnliche Komponente der T. hyodysenteriae-Zellen durch das zelluläre und das humorale Immunsystem des Schweins involviert ist. Diese Immunantwort auf die LPS-ähnliche Komponente von T. hyodysenteriae-Zellen wird wahrscheinlich durch die Reduktion in Fremdproteinen von T. hyodysenteriae-Zellen und anderen Quellen gesteigert, die mit der dem Hervorrufen einer spezifischen Immunantwort auf die LPS-ähnliche Komponente von T. hyodysenteriae (9) interferieren kann. Die Immunantwort, die mit dem proteinasebehandelten pelletierten Lysat erhalten wird, ist höher als jene, die mit gereinigtem LPS erhalten wird.
Die Figur 1 vergleicht die Immunantwort auf ein PK-Digest (Bahnen A, D unde) mit jener auf gereinigtes LPS (Bahnen B und C) in einem Westernblot-Assay.
Bei einer Ausfiihrungsform wird die vorliegende Erfindung gegen ein aus T. hyodysenteriae abgeleitetes Impfstoffpräparat gemäss Anspruch 1 gerichtet, so dass nach der Impfung eine statistisch wesentliche Verringerung der Erkrankungen (blutige Diarrhoe) bei Schweinen beobachtet werden kann. Vorzugsweise enthält das Produkt weniger als 1 ug/ml intaktes Protein mit 10'000 Dalton oder mehr. Vorzugsweise werden über 90% der Proteine aus ganzzelligem Lysat, die grösser als 10'000Daltons sind, in Fragmente, die kleiner sind als 10'000 Daltons, reduziert.
Treponema hyodysenteriae-Stämme (virulente und nichtvirulente) sind bei US-amerikanischen und ausländischen Kulturdepots sowie bei privaten Kultur-Sammlungen erhältlich. Es sind mehrere unterschiedliche T. hyodysenteriae-Serotypen (zur Zeit sieben) bekannt, die Schweinedysentene bei anfälligen Tieren verursachen. Verfahren zur Isolierung von T. hyodysenteriae sind in der Literatur beschrieben (10). Zu geeigneten Isolaten gehört der Stamm Nr. 31212 (oder B204) des Serotyps 2 der American Type Culture Collection (a, 11). Eigentlich eignet sich aber jedes T. hyodysenteriae- Isolat, das eine Krankheit bei Schweinen verursachen kann, für die Anwendung dieser Erfindung.
Treponema hyodysenteriae-Zellen können in einem festen oder flüssigen Wachstumsmedium gezüchtet werden. Tryptikase Sojanährlösung (TSN) mit 7,5% pferdeserum (PS), 0,5% Hefeextrakt, VPI anaeroben Salzen (12) und 0,05% L-cystein eignen sich zur Herstellung T. hyodysenteriae-Zellen, die für die Erfindung nötig sind, obwohl in der Literatur (13) auch andere geeignete Medien bekannt sind. T. hyodysenteriae-Zellen werden anaerob oder mikroanaerob in reduzierten Sauerstoffatmosphären bei Temperaturen von 35 bis 40ºC gezüchtet (13). Nach der Züchtung können die T. hyodysenteriae- Zellen mittels Standardverfahren wie Formalin-, Merthiolat- oder Hitzbehandlung (wobei Merthiolat bevorzugt wird) getötet und mittels Zentrifugation oder Ultrafiltration gesammelt werden. Die T. hyodysenteriae-Zellen können auch durch Lysieren getötet werden, was durch physikalische Mittel wie Druckbehandlung oder Beschallung oder durch Verändern des pH-Werts oder der Spannung des umliegenden Mediums erreicht werden kann.
Nach der Herstellung und Lysierung der geeigneten T. hyodysenteriae-Zellen werden die unlöslichen Komponenten des Lysats (z.B. die Membran) behandelt, um den Proteingehalt des Präparats zu reduzieren. Eine solche Reduzierung des Proteingehalts kann durch Behandlung mit proteinabbauenden Enzymen wie Proteinase-K erreicht werden. Dabei muss berücksichtigt werden, dass in der Literatur viele proteinabbauende Enzyme bekannt sind und dass ein beliebiges Enzym oder eine beliebige physikalische oder chemische Behandlung, die eine wesentliche Reduzierung des Proteingehalts des Präparats zur Folge hat (ohne die Immungenizität des Produkts nachteilig zu beeinflussen), für dieses Verfahren verwendet werden kann. Zur Behandlung kann die sequentielle oder simultane Verwendung von Enzymkombinationen anstelle von einem einzigen Enzym gehören. Die spezifischen Temperaturumstände, pH-Wert und andere physikalische Werte, unter denen die Proteinreduktion erfolgt, hängen vom verwendeten Enzym oder dem proteinreduzierenden System ab und können variieren, so lange die gewünschte Schutzwirkung gewährleistet ist. Wenn beispielsweise Proteinase K verwendet wird, wird ein handelsübliches Proteinase K-Präparat in eine Suspension des pelletierten Lysats gegeben, welches danach bei 56ºC zwei Stunden lang und 37ºC weitere zwölf Stunden lang inkubiert wurde.
Die Analyse des von der Proteinase K digerierten ganzzelligen Lysats durch SDS-PAGE ergab nach der Coomassie-blau-Färbung drei bis vier intakte Proteinbanden. Die offensichtliche molekulare Masse dieser Proteinbanden beträgt 30 und 40 kDa (Bem.: diese Banden würden mit den mit spirochetaler Flagella assoziierten Proteinen übereinstimmen). Ausser einem (höchste molekulare Masse) können alle Proteine aus dem Präparat entfernt werden, indem sie mit einer zehnfachen Proteinase K-Konzentration digeriert werden. Zusätzlich zu den oben erwähnten intakten Proteinen gibt es zahlreiche Peptide mit geringer molekularer Masse (< 10 kDa), die als Fleck invder Gelregion oberhalb der Farbfront erkennbar sind. Das Proteinprofil des nicht verdauten ganzzelligen Lysats besteht aus mehreren Proteinbanden (> 50) mit offensichtlichen molekularen Massen zwischen 20 und 150 kDa und keinen nachweisbaren Peptidflecken bei der Farbfront. Das PK-Digest und das ganzzellige Lysat können ebenfalls LPS-ähnliches Material enthalten, das drei Hauptbanden zwischen 16 und 24 kDa aufweist. Die LPS-Banden verfärben sich nicht mit Coomassie-blau, sind jedoch mit Silber nachweisbar. Das 18-20 kDa-Band ist zwar das vorherrschende Band, das von Antiserum nach der Westernblot-Analyse erkannt wird, doch sind die beiden anderen Bande ebenfalls klar erkennbar.
Das PK-Digest wurde mittels Elektronenmikroskopie untersucht. Der Elektronenmikrograph zeigte intakte Strukturen, die mit der treponemalen Flagella übereinstimmen. Zur Zusammensetzung des PK- Digests würden ebenfalls die bakterielle Zellwand (Peptidoglykan), Ribosomen, Nukleinsäuren und Phosphormembranmaterial gehören. Es wird angenommen, dass Peptidoglykan und andere Materialien dem Impfpräparat adjuvans-ähnliche Eigenschaften verleihen.
Vorzugsweise enthält die proteinreduzierte Suspension aus T. hyodysenteriae-Zellen und subzellulären Komponenten das Äquivalent von wenigstens ungefähr 5 x 10&sup9; T. hyodysenteriae-Zellen pro Dosis, obwohl Antigenmengen von mindestens 1 x 10¹&sup0; T. hyodysenteriae-Zellen pro Dosis bevorzugter sind. Dieses Präparat kann mit verschiedenen in der Literatur bekannten Adjuvans-Präparaten gemischt werden, wie Mineralölen, abbaubaren organischen Oelen, Emulgatoren oder Metallsalzen, um die Wirksamkeit des Impfstoffes zu erhöhen. Zu den bevorzugten Adjuvantien gehört das unvollständige Freundsche Adjuvans und Squalen (Haifischoel). Obwohl Mineralöle nicht bevorzugt sind, da sie potentielle Karzinogene sind und auch negative Reaktionen verursachen können, können sie gegebenenfalls trotzdem verwendet werden. Es wird darauf hingewiesen, dass die Verwendung von verschiedenen Adjuvanspräparaten, obwohl sie die Wirksamkeit von diesem oder beliebigen anderen Impfstoffen erhöhen, zur Durchführung dieses Verfahrens nicht unbedingt notwendig ist. Die Verwendung von Adjuvantien, die die Induktion einer IGM-Antwort mehr begünstigen als eine IgG-Antwort, sind bevorzugt.
Der nach dem vorliegenden Verfahren hergestellte Impfstoff wird Schweinen parenteral verabreicht, im allgemeinen durch intramuskuläre oder subkutane Injektion. Der Impfstoff ist am wirksamsten, wenn er Schweinen verabreicht wird, die ansonsten gesund sind und noch keine Symptome einer Schweinedysentene aufweisen. Der Impfstoff wird vorzugsweise in Serien von mindesten zwei Dosen in zweiwöchigen Abständen verabreicht, jedoch können auch andere Immunisierungspläne wirksam sein und mittels konventioneller Mittel bestimmt werden.
Das Verfahren dieser Erfindung wird durch die folgenden experimentellen Beispiele weiter illustriert.

Beispiel 1

Ein Treponema hyodysenteriae-Stamm des Serotyps 2, der aus Schweinen isoliert und als B-204 bezeichnet wurde, wurde in einer reinen Kultur in einem Flüssigmedium gezüchtet, das Tryptikase- Sojanährlösung enthielt, welches mit 5,0% Pferdeserum (PS), 0,5 % Hefeextrakt, VPI anaerobe Salze (12) und 0,05% L-Cystein angereichert worden war. Diese Kultur wurde bei 39ºC in einer Atmosphäre von 10% CO&sub2;, 10% H&sub2; und 80% N&sub2; 12 Stunden gezüchtet, in welcher Zeit des Wachstum des grössten Teils der T. hyodysenteriae stoppte. Die T. hyodysenteriae-Zellen wurden dann durch Zugabe von 1:10'000 Merthiolat getötet. Diese getöteten Zellen wurden anschliessend mittels 45-minötiger Zentrifugation bei 20'000 X g gesammelt und in einer sterilen 0,85% Salzlösung resuspendiert, wonach sie durch Druckerhöhung in einer French Pressure-Zelle (?) (5'000 psi = 3,52 x 10&sup5; g/cm²) lysiert und die Zellmembranen der lysierten T. hyodysenteriae-Zellen mittels zweistündiger Zentrifugation des Lysats bei 100'000 x g gesammelt wurden. Dieses Membranmaterial wurde in einer sterilen phosphatgepufferten 0,85% Salzlösung (pH 7,2) resuspendiert und zwei Stunden mit Protease des Typs XI-S (Proteinase-K) bei 56ºC behandelt und danach noch bei 37ºC 12 Stunden inkubiert. Nach der Proteasebehandlung wurden die subzellulären Komponenten der T. hyodysenteriae bei 4ºC gelagert und umfassten den konzentrierten Impfstoff. Der konzentrierte Wirkstoff wurde mit 25% unvollständigem Freundschen Adjuvans (UFA) gemischt und bildete so eine Wasser-in-Oel-in-Wasser-Emulsion zur Injektion in Versuchstiere. Ähnliche Präparate wurden mit ganzzelligen unbehandelten T. hyodysenteriae-Zellen in UFA und unbehandelten T. hyodysenteriae-Zellmembranen in UFA hergestellt, um die Wirksamkeit des Proteinreduzierungsverfahrens zu testen.
Die proteinreduzierten Präparate wurden mittels Natrium-Dodecyl- Sulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Assay (SDS-PAGE) auf den Proteingehalt der äusseren Membran untersucht, wobei unbehandelte T. hyodysenteriae-Membrane als Kontrolle verwendet wurden. Für ein geeignetes Protokoll siehe Merrill, et al.; Science, 211:1437 (1981). Die unbehandelten T. hyodysenteriae-Membrane wiesen nach der Silberfärbung im Gel viele offensichtliche Proteinbanden auf, während in den proteinreduzierten T. hyodysenteriae-Membranen lediglich drei Proteinbanden gefunden wurden. Dies zeigte, dass die Mehrheit der nativen oder natürlichen T. hyodysenteriae- Membranproteine durch die Proteinase K-Behandlung auf eine Menge reduziert worden war, dass mittels SDS-PAGE/Silberfärbung-Assay keine spezifischen Proteine mehr nachgewiesen werden konnten.
16 SPF (spezifische pathogenfreie) Schweine aus einer Herde ohne Schweinedysentene wurden gewogen und verwendet, um diese Präparate zu testen. Die Schweine wurden zufällig in Gruppen aufgeteilt. Vier Schweinen wurde ein Äquivalent von 4 X 10¹&sup0; T. hyodvsenteriae- Zellen pro Dosis proteinreduzierter Impfstoff in UFA/n zwei Dosen in einem Abstand von zwei Wochen verabreicht. Vier Schweinen wurde ganzzelliges nicht mit Proteinase K behandeltes T. hyodysenteriae in Dosen von von 2 x 10¹&sup0; T. hyodysenteriae-Zellen pro Dosis in UFA in zwei Dosen in einem Abstand von zwei Wochen verabreicht. Vier Schweinen wurden Membrane, die nicht Proteinase K behandelt waren, in einem Äquivalent von 4 X 10¹&sup0; T. hyodysenteriae-Zellen pro Dosis an T. hyodysenteriae-Impfstoff UFA in zwei Dosen, in einem Abstand von zwei Wochen verabreicht. Diese experimentellen Gruppen sind in der Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1 Experimentelle Behandlungsgruppen
Zehn Tage nach der zweiten Impfung erhielten alle experimentellen Schweine während 24 Stunden keine Nahrung, wurden gewogen und mittels oraler Inokulation mit 1,69 x 10¹¹ aktiv wachsenden beweglichen Treponema hyodysenteriae-Zellen geimpft. Die nicht geimpften Kontrollschweine waren vor und nach der Impfung in kontinuierlichem Kontakt mit den geimpften Schweinen. Alle Schweine wurden während 21 Tagen täglich beobachtet und alle Symptome für Schweinedysentene (z.B. blutige Diarrhoe) wurden festgehalten. Am Ende der 21-tägigen Beobachtungszeit wurden alle überlebenden Schweine gewogen, getötet und seziert (?). Zur Re-Isolierung von Treponema hyodysenteriae wurden Proben aus dem Inhalt von DickDarm und Blinddarm entnommen. Die für Schweinedysentene typischen Läsionen wurden bei der Sezierung festgehalten.
Die Ergebnisse der Beobachtungen nach der Impfung aller Gruppen sind in der Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2
* Aus kot reisolierte Treponema hyodrsenteriae. Anzahl Schweine mit Treponema hyodrsenteriae/Anzahl Schweine pro Gruppe.
@ Mordidität gesamt, alle beobachteten Symptome. Gleich (Total Anzahl Tage mit Symptomen/total Anzahl Schweinetage) x 100.
@@ Morbiditüat nur mit Diarrhoe. Der Unterschied zur gesamten Morbidtät liegt vor allem in der Schwachheit und der Ausgezehrtheit der Spalte MID Total.
1 (0,44 kg/Tag)
2 (0,21 kg/Tag)
3 (0,39 kg/Tag)
4 (0,43 kg/Tag) Ergebnisse
Bei Schweinedysentene typische blutige Diarrhoe (MID Diarrhoe) wurde bei den nicht geimpften Kontrolltieren bei den täglichen Beobachtungen bei 21,7% der Tiere festgestellt. Blutige Diarrhoe wurde bei der täglichen Beobachtung ebenfalls bei 16,1% der mit Treponema hyodysenteriae-Membranen, die nicht mit dem Proteinreduktionsverfahren behandelt worden waren, geimpften Tieren festgestellt. Schweine, die ganze Zellen unbehandelter T. hyodysenteriae erhalten hatten, litten nicht an blutiger Diarrhoe. Keines der vier Schweine, die proteinreduzierten T. hyodysenteriae-Impfstoff verabreicht bekommen hatten, litten für Schweinedysentene typischer blutiger Diarrhoe. Diese Daten zeigen klar, dass sich der proteinreduzierte T. hyodysenteriae-Impfstoff verglichen mit nicht geimpften Kontrollschweinen am besten für die Reduzierung der für Schweinedysentene typischen blutigen Diarrhoe eignet. Zudem war der Schutz vor blutiger Diarrhoe wesentlich grösser als jener bei nicht behandelten ganzzelligen Treponema hyodysenteriae- Impfstoffen, die gemäss beschriebenen Verfahren hergestellt wurden (7).
Dieser Schutz erstreckte sich auch auf die erhöhte durchschnittliche Gewichtszunahme bei Schweinen, die proteinreduzierten T. hyodysenteriae-Impfstoff (0,44 kg/Tag) erhielten, verglichen mit Schweinen, die klassischen T. hyodysenteriae-Impfstoff mit toten nicht behandelten ganzen Zellen erhielten (0,21 kg/Tag), wenn auch die Kontrollen in diesem Test nicht so stark betroffen waren.
Treponema hyodysenteriae wurde nach Impfung aus zwei von vier nicht geimpften Kontrolltieren (50%) und einem von vier Schweinen, die T. hyodysenteriae-Impfstoff aus klassischen toten nicht behandelten ganzen Zellen erhielten (25%), reisoliert. T. hyodysenteriae wurde jedoch aus keinem der vier Schweine reisoliert, die proteinreduzierten T. hyodysenteriae-Impfstoff erhielten. Diese Daten zeigen klar, das ein proteinreduzierter Impfstoff, der gemäss dem Verfahren in diesem Anspruch hergestellt wurde, Schweine schützt, die mit einem solchen Präparat gegen die Symptome der Schweinedysentene (blutige Diarrhoe), Gewichtsverlust durch T. hyodysenteriae-Infektion und Reisolierung von T. hyodysenteriae geimpft wurden. Zudem ist dieser Schutz nicht nur im Vergleich zu nicht geimpften Kontrolltieren höher, sondern auch im Gegensatz zu T. hyodysenteriae-Impfstoffen aus toten ganzen Zellen oder aus Membranen, die gemäss dem Stand der Technik hergestellt wurden. Das Verfahren zur Reduzierung des Proteingehalts von T. hyodysenteriae-Impfstoffen vor der Verabreichung an Schweine ergibt klar einen verbesserten Schutz von Schweinen gegen durch Treponema hyodysenteriae-Infektion verursachte Schweinedysentene, was bisher nicht möglich war.

Beispiel 2

In einer Erweiterung der obigen Studie wurden 30 SPF (spezifische pathogenfreie) Schweine aus einer Herde ohne Schweinedysenterje gewogen und verwendet, um verschiedene Dosierungen der Präparate zu testen, die von proteinreduzierten Membranen, unbehandelten Membranen und ganzen unbehandelten Zellen abgeleitet wurden. die Schweine wurde zufällig in Gruppen aufgeteilt. Sechs Schweinen wurde ein Äquivalent von 2 x 10¹&sup0; T. hyodysenteriae-Zellen pro Dosis des proteinreduzierten Impfstoffs in UFA in zwei Dosen in einem Abstand von zwei Wochen verabreicht. Sechs Schweinen wurden nicht mit Proteinase K behandelte, ganzzellige T. hyodysenteriae in Dosen von 2 x 10¹&sup0; T. hyodysenteriae-Zellen pro Dosis in UFA in zwei Dosen in einem Abstand von zwei Wochen verabreicht. Sechs Schweinen wurden nicht mit Proteinase K behandelte Membrane in einem Äquivalent von 2 x 10¹&sup0; T. hyodysenteriae-Zellen pro Dosis T. hyodysenteriae-Impfstoff in UFA in zwei Dosen im Abstand von drei Wochen verabreicht. Um die Dosis/Antwort des proteinreduzierten Impfstoffs zu testen, wurden aus Gruppen, die aus zwei Schweinen bestehen, 4 X, ½ X oder ¼ X die Dosis des proteinreduzierten Impfstoffs in UFA in zwei Dosen in einem Abstand von drei Wochen verabreicht. Alle Versuchstiere wurden in einem grossen Raum untergebracht und auf die gleiche Weise gefüttert und behandelt. Diese Versuchsgruppen sind in der Tabelle 3 dargestellt. Tabelle 3 Versuchsgruppen und Behandlungen
Bei allen Gruppen 1 bis 6 wurden zwei Dosen des Impfstoffes in einem Abstand von drei Wochen verabreicht.
Acht Tage nach der zweiten Impfung wurden die Versuchstiere während 24 Stunden nicht gefüttert, danach gewogen und oral mit 5 x 10¹&sup0; aktiv wachsenden, mobilen T. hyodysenteriae-Zellen geimpft. Diese Impfung wurde am nächsten Tag wiederholt (Tag neun nach der zweiten Impfung). Alle Schweine wurden miteinander untergebracht, die nicht geimpften Kontrollschweine waren somit vor und nach der Impfung in stetigem Kontakt mit den geimpften Schweinen. Alle Schweine wurden nach der zweiten Impfung über eine Zeitspanne von 25 Tagen täglich beobachtet und allfällige Symptome von Schweinedysentene (z.B. blutige Diarrhoe) wurden festgehalten. Am Ende der 25-tägigen Beobachtungszeit wurden alle überlebenden Schweine gewogen, getötet und untersucht. Für die Re-Isolierung von T. hyodysenteriae wurden Proben dem Inhalt von DickDarm, ileozökaler Öffnung und Blinddarm entnommen. Für Schweinedysentene typische Läsionen wurden bei der Sezierung festgehalten.
Die Ergebnisse der Beobachtungen aller Gruppen nach der Impfung sind in Tabelle 4 festgehalten.
* Morbidtätsauftritt- und dauer. Gleich (Anzahl Tage mit blutiger Diarrhoe/Anzahl Tage total seit Impfung bis Tötung oder Tod) x 100.
@ Morbidtätsauftritt- und Dauer. Gleich (Anzahl Tage anderer Diarrhoe als blutiger Diarrhoe/Anzahl Tage total seit Impfung bis Tötung oder Tod) x 100.
** Durchschnittliche täliche Gewichtszunahme. Gleich (Gewicht bei Tötung oder Tod minus Gewicht zur Zeit der Impfung)/Anzahl Tage von Inpfung bis Tötung oder Tod. Zunahme in Kilogramm pro Tag.
Ergebnisse
Für Schweinedysentene typische Diarrhoe wurde bei 5/6 (83%) der nicht geimpften Kontrolltiere beobachtet. Blutige Diarrhoe wurde ebenfalls bei 5/6 (83%) der Schweine beobachtet, die einen Impfstoff erhalten hatten, der aus Treponema hyodysenteriae-Membranen bestand, die nicht mit dem Proteinreduzierungsverfahren behandelt worden waren. Zwei von sechs Schweinen (33%), die Treponema hyodysenteriae aus unbehandelten ganzen Zellen erhalten hatten, litten an blutiger Diarrhoe. Keines der zehn Schweine, die proteinreduzierten T. hyodysenteriae-Impfstoff in der 4-, 1- oder ½-fachen Dosis erhalten hatten, litten an für Schweinedysentene typischer blutiger Diarrhoe. Bei Reduzierung des proteinreduzierten T. hyodysenteriae-Impfstoffs auf ¼ der Dosis wies eines der zwei Schweine, die diesen Impfstoff erhalten hatten, blutige Diarrhoe auf, was eine Dosisantwort auf den proteinreduzierten T. hyodysenteriae-Impfstoff anzeigte. Diese Informationen zeigen klar, dass der proteinreduzierte T. hyodysenteriae-Impfstoff beim Vergleich mit nicht geimpften Kontrolltieren bei der Reduzierung der für Schweinedysentene typischen blutigen Diarrhoe besser abschnitt. Ausserdem war der Schutz gegen blutige Diarrhoe wesentlich höher als derjenige mit gemäss dem Stand der Technik hergestellten Treponema hyodysenteriae-Impfstoffen aus nicht behandelten ganzen Zellen (7).
Dieser Schutz führte bei Schweinen, die proteinreduzierten T. hyodysenteriae-Impfstoff (0,41 kg/Tag)ebenfalls zu einer erhöhten durchschnittlichen täglichen Gewichtszunahme, verglichen mit unbehandelten Kontrolltieren (0,17 kg/Tag) oder Schweinen, die T. hyodysenteriae-Impfstoff aus klassischen, toten unbehandelten ganzen Zellen erhielten (0,29 kg/Tag). Die Verluste durch Tod konnten bei Schweinen, die proteinreduzierten T. hyodysenteriae-Impfstoff erhielten, im Vergleich mit Todesfällen bei Schweinen, die Impfstoff aus unbehandelten ganzen Zellen oder gar keinen Impfstoff erhielten (Kontrollen) um 100% reduzierten werden.
Schweine, die 1 x proteinreduzierten Impfstoff (Gruppe 3) erhielten waren geschützt, wie mittels der durchschnittlichen täglichen Gewichtszunahme (p=0,065) und reduzierter Morbidität (blutige Diarrhoe) (p=0,007) gemessen wurde. Schweine, denen ½ x proteinreduzierter Impfstoff (Gruppe 4) verabreicht worden war, waren geschützt, wie mittels reduzierter Morbidität (blutige Scours) (p=0,088) jedoch nicht mit durchschnittlicher täglicher Gewichtszunahme (p=0,317) gemessen wurde. Schweine, denen ¼ proteinreduzierter Impfstoff (Gruppe 5) verabreicht worden war, waren nicht wesentlich geschützt, was mittels reduzierter Morbidität (blutige Diarrhoe) (p=0,241) oder durchschnittlicher täglicher Gewichtszunahme (p=0,739) gemessen wurde. In allen Fällen wurde die Kruskal- Wallis Einweg-Varianzanalyse angewendet. Der proteinreduzierte Impfstoff bietet in einer Konzentration von mindestens ½ x somit statistisch einen guten Schutz. Das Produkt enthielt bei der Verwendung weniger als 1 ug/ml intakte Proteine von 5-8'000 Da oder mehr.
Treponema hyodysenteriae wurde nach der Impfung aus drei von sechs nicht geimpften Kontrolltieren (50%) und drei von sechs Schweinen (50%), die T. hyodysenteriae-Impfstoff aus klassischen toten, unbehandelten ganzen Zellen erhielten, reisoliert. T. hyodysenteriae wurde jedoch nur aus einem von zehn Schweinen reisoliert, die 4 x, 1x der ½ x proteinreduzierten T. hyodysenteriae-Impfstoff erhielten.
Diese Daten zeigen klar, dass ein proteinreduzierter T. hyodysenteriae-Impfstoff, der gemäss dem Verfahren der Erfindung hergestellt wird, mit eine solchen Präparat geimpfte Schweine gegen die Symptome der Schweinedysentene (Tod, blutige Diarrhoe), durch eine Treponema hyodysenteriae-Infektion verursachten Gewichtsverlust und die Reisolierung von Treponema hyodysenteriae schützt. Zudem ist der Schutz nicht nur im Vergleich mit ungeimpften Kontrolltieren grösser, sondern auch mit T. hyodysenteriae-Impfstoffen aus toten ganzen Zellen oder Membranen, die nach dem Stand der Technik hergestellt wurden. Das Verfahren zur Reduktion des Proteingehalts bei T. hyodysenteriae-Impfstoffen vor der Verabreichung an Schweine hat klar einen verbesserten Schutz von Schweinen gegen durch eine Treponema hyodysenteriae-Infektion verursachte Schweinedysentene zur Folge, was mit den bisherigen Mitteln nicht möglich war.
Die Tabellen 5, 6 und 7 zeigen die Vorteile des Proteinase K- Digests gegenüber ganzzelligem Lysat und Endotoxinpräparaten. In Tabelle 5 zeigt sich ein höhres Blinddarmgewicht und weniger grosse Läsionen. Die Tabelle 6 zeigt, dass sich die Anzahl T. hyodysenteriae, die sich in geimpften Mäusen nach der Impfung erholte durch das PK-Digest am meisten reduzierte. Schliesslich zeigt die Tabelle 7 eine Tendenz zu einer niedrigeren Anzahl kolonienbildender Einheiten. Tabelle 5 Schutz von Mäusen vor einer Infektion mit Treponema hyobysenteriae nach Immunisierung Forsetzung Tabelle 5
a Die klinischen Zeichen der Erkrankung wurden definiert als Überschuss an intraminalem Mucus (XM), Blinddarmatrophie (At) oder keine grossen Läsionen (NGL). Zwei Wochen nach der letzten Immunisierung wurden die Mäuse an zwei aufeinanderfolgenden Tagen 5 x 10&sup6; T. hydrosenteriae B204 geimpft und 10 Tage später getötet.
b Gewicht des Blinddarms in Gramm
c Die Blinddarminhalte wurden mittels Dunkelfeld-Mikroskopie auf die Anwesenheit von Spirochüaten untersucht und reative Resultate von +1 bis +3 aufgestellt, wenn Spirochäten gefunden wurden oder "N.F." angegeben, wenn keine vorhanden waren.
d Die mäuse wurden dreimal inteaperitoneal mit 50 umg (proteingehalt) eines ganzzelligen Lysats immunisiert (in einem Abstand von zwei Wochen), das aus T. hyodysenteriae B204 hergestellt worden war.
c Die Mäuse wurden dreimal mit 50 ug Endotoxin (Butanol/Wasser-Extrakt) aus T. hyodysenteriae B204 immunisiert.
f Die Mäuse (ip) wurden dreimal mit 50 Mmg einem mit Proteinase K-digerierten ganzzelligen Lysat (entspricht 50 ug des ganzzelligen Lysats) immunisiert. Tabelle 6 Anzahl erholter trepoema hyorysenteriae aus geimpften Mäusen nach Imfung
a An zwei aufeinanderfolgenden Tagen mit 5 x 10&sup6; T. hyodysentteriae geimpfte Mäse, 10 Tage später getötet.
b Die mäuse wurden wie in Tabelle 1 beschrieben immunisiert.
c Anzahl Mäuse pro Gruppe
d Kolonienbildende Einheiten (CFU) aus T. hyodysenteriae pro Gramm Blinddarmgewebe. Tabelle 7 Kolonienbildende Einheiten von T. hyodysenteriae aus von infizierten Mäusen
a Die Mäuse wurden wie in Tabelle 1 beschrieben geimpft.
b Anwesenheit (+) oder Abwesenheit (-) von Spirochäten im Blinddarminhalt wie durch Dunkelfeld-Microskopie (DF) bestimmt.
c Blinddarminhalt wurde zum zum Nachweis von B-hämolytischen Spirochäten direkt auf Blut-Agar-Medium gezuuchtet.
d Die Blinddärme wurden den Mäusen entnommen, gewogen und homogenisiert. Das Homogentat wurde seriell aufgelöst und die Anzahl kolonienbildender Einheiten (CFU) T. hyodysenteriae pro Gramm Blinddarm wurde bestimmt.

Beispiel 3

Es wurde nachgewiesen, dass Schweine, die mit unserem Proteinase K-reduzierten ganzzelligen Lysat geimpft wurden, eine bessere Immunreaktivität mit dem in Wannemuehler, et al., Infektion und Immunität, 56:3032-39 (Dec. 1988) beschriebenen 16-20 kDa LPS- Antigen aufweisen. Das Serum aus Schweinen, die mit aus Phenol/Wasser extrahiertem LPS geimpft wurden, reagierte jedoch nicht mit ganzzelligem Lysat, was darauf hinweist, dass gereinigtes LPS keine Imniunantwort auslöst.

Herstellung des Lipopolylsaccharids (LPS) aus T. hyodysenteriae

T. hyodysenteriae wurde über Nacht in mit 5% Pferdeserum und 1% Hefeextrakt angereicherter Tryptikase-Sojanährlösung (TSN) gezüchtet. Die Zellen wurden mittels Zentrifugation geerntet, in phosphatgepfferter Salzlösung resuspendiert und noch einmal zentrifugiert. Das Zellpellet wurde danach in zwei Volumen (Vol/Gew) pyrogenfreiem Wasser und einem Volumen (Vol/Gew) 88% Phenol resuspendiert. Die Zellsuspension wurde zwei Stunden bei Raumtemperatur und danach 48 Stunden bei 4ºC gerührt. Die Phenol- und Wasserphase wurden liess man sieben Tage bei 4ºC trennen. Die Wasserphase (oben) wurde gesammelt und gegen 0,5% NaCl dialysiert. Die Lösung wurde danach zwei Stunden mit RNAse (10 ug/ml) und danach zwei Stunden mit Proteinase K (10 ug/ml) digeriert. Die Lösung wurde dann auf 68ºC gewärmt und ein gleiches Volumen 88% Phenol wurde zugegeben. Das Material wurde bei 68ºC 15 Minuten gerührt. Die Lösung wurde danach abgekühlt und die Phasen mittels Zentrifugation (500 x g) getrennt. Das Wasser wurde gesammelt und gegen 0,5% NaCl dialysiert. Der Niederschlag wurde mittels Zentrifugation (7,500 x g) gesammelt und einmal mit kaltem Ethanol gewaschen. Der Niederschlag wurde in einer minimalen Menge pyrogenfreiem Wasser, schnellgefroren (Trockeneis und Alkoholbad), lyophilisiert und bei -20ºC gelagert

Impfung von Schweinen mit dem Proteinase K-digerierten Material und LPS

Sechs Wochen alte, gekreuzte Schweine (spezifisch pathogenfrei) wurden mit 100 ug treponemalem LPS oder dem Proteinase K- digestierten ganzzelligen Lysat (PK-Digest) intramuskulär in einer äquivalenten Dosis von 1 x 10¹&sup0; Zellen geimpft. Zwölf Tage später wurden die Schweine noch einmal mit den gleichen Präparaten geimpft. Jede Antigendosis wurde in 0,5 ml steriler Salzslösung inkorporiert und danach mit 0,5 ml unvollständigem Freundschem Adjuvans (UFA) gemischt, was ein gesamtes Inokulat von 1,0 ml pro Schwein ergab. Das Serum wurde 10 Tage nach der zweiten Immunisierung zur Verwendung in der Westernblot-Analyse gesammelt.

Beschreibung Western Blot

Treponema hyodysenteriae-Zellen wurden mittels Beschallung lysiert, schnellgefroren und lyophilisiert. Das ganzzellige Lysat (GZL) wurde in steriler Salzlösung in 1 bis 2 mg/ml (Gew/Vol) resuspendiert. Das GZL wurde mit Laemmli Behandlungspufferlösung gemischt, fünf Minuten gekocht und das Material elektrophoretisch getrennt. GZL mit 250 ug Protein wurde jedem Polyacrylamidgel- Präparat (12%) zugegeben. Nach der Trennung wurden die Antigene elektrophoretisch auf Nylonmembrane übertragen. Die Membrane wurden danach mit 5% Magermilch blockiert, mit gepufferter Tris- Salzlösung gewaschen und danach mit den spezifischen Antikörperproben reagieren gelassen. Nach der Inkubation mit Schweine- Antiserum wurden die Nylonmembranen gewaschen und mit alkalinphosphatase-konjugiertem Antischwein-Ziegenimmunoglobulin (u- spezifisch oder c-spezifisch) reagieren gelassen. Die Substratlösung bestand aus Echtrot- und Naphthol AS-MX-Phosphat in Tris- Pufferlösung (pH 8,0).
Die Ergebnisse der Westernblot-Analyse zeigten, dass die Schweine, die mit dem PK-Digest (Bahnen A, D und E der Figur 1) geimpft worden waren, gegen die LPS-Bestandteile des GZL IGM-Antikörper bildeten. Die mit GZL geimpften Schweine (Bahnen B und C) jedoch konnten keine GZL-spezifischen Antikörper bilden. Bei der Untersuchung der IgG-Immunantwort wurden Antikörper gegen die GZL- Bestandteile sowie gegen die im PK-Digest entdeckten intakten Proteine nachgewiesen. Auch hier bildeten die mit GZL geimpften Schweine keine treponemalen spezifischen Antikörper.

REFERENZEN

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Claims

1. Impfstoff umfaßend eine immunogene Präparation abgeleitet von den unlöslichen Bestandteilen des Lysats von Treponema hyodysenteriae-Zellen und mit einem Proteininhalt, der im Verhältnis zum Proteininhalt der unlöslichen Bestandteile des Lysats erheblich reduziert ist, dadurch, daß die unlöslichen Bestandteile des Lysats einem chemischen oder physischen Proteinabbau unterworfen werden, welche Präparation außerdem ein oder mehrere treponemale flagellare Proteine, die gegen den chemischen oder physischen Abbau im wesentlichen resistent sind, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfaßt.

2. Impfstoff nach Anspruch 1, worin die Präparation eine Mehrheit von Peptidfragmenten aus einem oder mehreren treponemalen Oberflächenproteinen infolge des chemischen oder physischen Abbaus umfaßt.

3. Impfstoff nach Anspruch 1 oder 2, worin die Präparation außerdem die Lipopolysaccharide und Lipooligosaccharide, die mit der Außenmembran von T. hyodysenteriae assoziiert sind, im wesentlichen erhält.

4. Impfstoff nach einem der Ansprüche 1-3, worin die Präparation außerdem treponemale Peptidoglykane, Ribosome, Nukleinsäuren und Phosphomembranmaterial umfaßt.

5. Impfstoff nach einem der Ansprüche 1-4, worin die Präparation außerdem dadurch gekennzeichnet ist, daß Proteine mit einem scheinbaren Molekulargewicht von mehr als 10.000 Daltons, mit Ausnahme der Proteine mit einem scheinbaren Molekulargewicht von zwischen 30.000 und 40.000 Daltons, in einer solchen Präparation durch Silberfärbung unter Normalbelastung nicht sichtbar sind.

6. Impfstoff nach einem der Ansprüche 1-5, worin der chemische oder physische Abbau ein enzymatischer Abbau ist.

7. Impfstoff nach Anspruch 6, worin der Abbau mit einem Enzym, das die charakteristische Substratspezifität der Proteinase K hat, stattfindet.

8. Impfstoff nach einem der Ansprüche 1-7, worin die Präparation von einem Außenmembranextrakt solcher Zellen abgeleitet ist.

9. Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes nach einem der Ansprüche 1-8, welches Verfahren die enzymatische Reduktion des Proteininhalts von Treponema hyodvsenteriae-Zellen oder einem subzellularen Membranbestandteil umfaßt.

10. Verwendung einer antigenen Präparation nach einem der Ansprüche 1-8 zur Herstellung eines Präparats zur Vergrößerung der Resistenz von Schweinen gegen Treponema hyodysenteriae.