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Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum
Durchführen von Assays, besonders von sogenannten
dynamischen Assays oder "Durchfluß"-Assays. Sie bezieht sich
ganz besonders auf die Durchführung von Assays, worin ein
Bindemittel und Analyt auf einem Absorptionsmaterial in
Kontakt gebracht werden.
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Diedurchführung immunologischer Assays unter Verwendung
einer Vorrichtung, die ein Absorptionsmaterial oder eine
Absorptionszone enthält, das/die einen Fluß von
Flüssigkeit, die einen Analyt enthält, durch eine Membran
induziert, die ein Antigen, einen Antikörper oder einen
anderen Bindemitteltyp für den Analyt festhält, ist im Fach
bekannt.
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US-A 4 366 241 beschreibt eine Durchfluß-Assay-Vorrichtung
und Assays, die eine derartige Vorrichtung einsetzen. Die
Assay-Vorrichtung weist eine immunadsorbierende Zone auf,
die an ein Element eines immunologischen Paares fixiert
ist In unmittelbarer Nachbarschaft zu der
immunadsorbierenden Zone befindet sich eine
flüssigkeitsabsorbierende Zone, die eine Flüssigkeitsprobe
durch die immunadsorbierende Zone zieht. Die
Absorptionszone kann die Rate kontrollieren, bei der die
Flüssigkeitsprobe durch die immunadsorbierende Zone gezogen
wird.
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US-A 4 632 901 beschreibt eine Vorrichtung und ein
Verfahren zum Durchführen von Immunoassays, worin ein
Antikörper, wie zum Beispiel ein monoklonaler Antikörper an
eine Membran oder ein Filter gebunden wird. Ein
Absorptionsmaterial befindet sich unter der Membran oder
dem Filter, das den Fluß einer Flüssigkeitsprobe durch die
Membran oder das Filter induziert. Der Analyt in der
Flüssigkeitsprobe bindet sich mit dem Antikörper an die
Membran oder das Filter. Dann kann markierter Antikörper
gegen den Analyt zugesetzt werden. Ein Waschschritt
entfernt dann ungebundenen markierten Antikörper. Das
Vorliegen von markiertem Antikörper auf der Membran oder
dem Filter nach dem Waschschritt läßt auf das Vorliegen
eines Analyts in der zu bestimmenden Probe schließen.
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EP 217403 beschreibt ein Material und eine Vorrichtung zur
Verwendung in Festphasenbindungsassays zur Bestimmung des
Vorliegens oder der Menge eines Analyts in einer Testprobe.
Das Material umfaßt eine poröse Fasermatrix und eine
Vielzahl von im wesentlichen kugeliger Feststoffpartikeln
mit einem durchschnittlichen Durchmesser von circa 0,1 bis
circa 5 um. Die Partikel werden zurückgehalten und auf den
Fasern der Matrix immobilisiert. Die Partikel weisen auf
ihren Oberflächen vorzugsweise eine Substanz auf, die zur
Reaktion mit dem Analyt in der Probe fähig ist, und der
durchschnittliche Durchmesser der Partikel ist kleiner als
die durchschnittliche Porengröße der Matrix. Die
Vorrichtung umfaßt in einer bevorzugten Ausführungsform
eine im wesentlichen ebene Schicht des beschriebenen
Materials.
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EP 299 299 beschreibt ein diagnostisches
Vorrichtungssystem. In einem Behälter ist ein poröses
Substrat aus einem Stück vorgesehen. Das Substrat dient dem
Extrahieren eines Antigens in oder auf einer oberen Schicht
davon, wobei der Rest des Substrates als ein Reservoir
5 dient. Die Poren in der oberen Oberfläche des Substrates
sind zum Einfangen von Antikörpern tragenden Mikrokügelchen
mikroskopisch klein. Ein Zielantigen in einer Testprobe
lagert sich an die Antikörper an, wenn die Testprobe durch
die obere Schicht gegossen wird. Die Poren in allen
Schichtenaußer der oberen Schicht des Substrates weisen
eine viel größere Porengröße auf, um den Reservoiranteil
des Substrates zu umfassen.
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Erfindungsgemäß ist ein Assay zur Bestimmung eines Analyts
vorgesehen, der das Applizieren einer den Analyt
enthaltenden Probe auf eine Oberfläche eines mikroporösen
keramischen Absorptionsmaterials umfaßt, das ganz von
gleichförmiger Mikroporosität ist, um genanntem Material zu
ermöglichen, nicht geladene Partikel, die eine Größe von
mindestens 0,1 um und nicht größer als 10 um aufweisen,
zurückzuhalten und das mindestens ein Bindemittel für den
Analyt festhält; und Bestimmung des darauf zurückgehaltenen
Analyts.
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Erfindungsgemäß ist auch eine Vorrichtung vorgesehen, die
ein mikroporöses keramisches Absorptionsmaterial umfaßt,
das ganz von gleichförmiger Porosität ist, um genanntem
Material zu ermöglichen, nicht geladene Partikel, die eine
Größe von mindestens 0,1 ijm und nicht größer als 10 um
aufweisen und welches mindestens ein Bindemittel trägt,
zurückzuhalten.
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In einer Ausführungsform ist ein Assay für einen Analyt
vorgesehen, worin eine einen Analyt enthaltende Probe
direkt auf ein Absorptionsmaterial appliziert wird, auf dem
mindestens ein Bindemittel für den Analyt festgehlten wird.
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Folglich wird in dem Assay eine Probe, die einen Analyt
enthält, auf eine Oberfläche eines Absorptionsmaterials
appliziert, das mindestens ein Bindemittel für den Analyt
aufweist, der auf mindestens einem Anteil der Oberfläche
des Absorptionsmaterials gehalten wird. Bei dem in dem
Assay eingesetzten Absorptionsmaterial handelt es sich um
eines, das dazu in der Lage ist, Kapillarfluß zu
induzieren, wobei auf eine Oberfläche davon applizierte
Flüssigkeit in das Absorptionsmaterial gezogen wird.
Außerdem ist das Absorptionsmaterial gekennzeichnet durch
eine Porosität oder Dichte, wobei das Absorptionsmaterial
dazu in der Lage ist, nicht geladene Partikel mit einer
Größe von mindestens 0,1 um und nicht größer als 10 um auf
der Oberfläche davon zurückzuhalten. Die Probe fließt an
dem festgehaltenen Bindemittel vorbei in das
Absorptionsmaterial, und der Analyt wird durch das
Bindemittel gebunden. Der durch das festgehaltene
Bindemittel gebundene Analyt wird dann bestimmt. Die Probe
fließt an dem Bindemittel vorbei und durch das
Absorptionsmaterial aufgrund einer Kapillarbewegung durch
das Absorptionsmaterial. Das Absorptionsmaterial kann in
einem Gehäuse enthalten sein, das aus Kunststoff gefertigt
sein kann. Der Assay-Typ, der in den Rahmen der Erfindung
fallen soll, ist denjenigen mit üblichen Fähigkeiten im
Fach bekannt. Zu diesen Assays zählen kompetitive Assays,
Sandwich-Assays, Enzyme-linked-immunosorbent-Assays
(ELISA), Agglutinationsassays, indirekte Assays und andere
im Fach bekannte Assays.
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Die folgenden Aspekte besitzen nur einen Vergleichswert, um
die vorliegende Erfindung wie zuvor definiert zu
veranschaulichen.
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In einem anderen Aspekt ist eine Vorrichtung vorgesehen,
die ein Absorptionsmaterial umfaßt, das in eine Vielzahl
von Testzonen aufgeteilt ist. Jede unter einer Vielzahl von
Testzonen weist eine Oberfläche auf, die zum Zurückhalten
nicht geladener Partikel fähig ist, die eine Größe von
mindestens 0,1 um und nicht größer als 10 um aufweisen.
Eine derartige Vorrichtung kann beim Durchführen einer
Vielzahl von Assays der hierin vorstehend beschriebenen
Arten eingesetzt werden. Das Absorptionsmaterial der
Vorrichtung ermöglicht, eine Probe auf jede der Testzonen
zu appuzieren, indem das Absorptionsmittel den
Probenkreuzstrom zwischen den Testzonen minimiert.
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Das Absorptionsmaterial kann aus Polyolefinen (bevorzugt
Polyethylen), Polyestern und Celluloseacetat ausgewählt
werden. Das Absorptionsmaterial kann mit einem Cellulose
enthaltenden Material behandelt werden. Das
Absorptionsmaterial kann ein gepreßtes keramisches Material
oder ein poröses keramisches Material sein.
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In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die
den Analyt enthaltende Probe auf eine Oberfläche eines
anfeuchtbaren porösen Kunststoffes appliziert, der dazu in
der Lage ist, nicht geladene Partikel mit einer Größe von
mindestens 0,1 um und nicht größer als 10 um
zurückzuhalten; und Bestimmung des auf genannter Oberfläche
zurückgehaltenen Analyts.
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In einem anderen Aspekt weist die Vorrichtung eine
Abdeckung auf, die eine Vielzahl von Öffnungen besitzt, von
denen sich jede über einer Oberfläche einer entsprechenden
Testzone befindet. Eine bevorzugte Ausführungsform der
Abdeckung wird aus einem druckempfindlichen Material, wie
zum Beispiel Vinyl hergestellt und weist ausgestanzte
Öffnungen auf.
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In einem anderen Aspekt ist auch ein Gehäuse vorgesehen,
das einen oberen Deckelanteil und einen unteren Anteil
umfaßt, wobei der obere Deckelanteil eine Öffnung aufweist,
wobei das Absorptionsmaterial, das in dem Gehäuse enthalten
ist und die Oberfläche von der Öffnung in dem oberen
Deckelanteil umgeben ist.
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In einem anderen Aspekt ist eine Vorrichtung vorgesehen,
die aus einem Absorptionsmaterial wie hierin vorstehend
beschrieben besteht. Die Oberfläche des
Absorptionsmaterials enthält mindestens einen
Vertiefungsanteil, von denen jeweils mindestens ein
Vertiefungsanteil bzw. Vertiefungsanteile eine Testzone
definieren. Die mindestens eine Vertiefungszone ist dazu in
der Lage, eine Probe aufzunehmen. Die Oberfläche des
Absorptionsmaterials enthält bevorzugt eine Vielzahl von
Vertiefungsabschnitten. Die Oberfläche des
Absorptionsmaterials schließt überdies bevorzugt mindestens
einen Kanal ein, wobei jeweils mindestens der eine
Kanal/die Kanäle zwischen zwei der Vielzahl von
Vertiefungen angeordnet sind. Der mindestens eine Kanal/die
Kanäle ist/sind angepaßt, um einen Probenüberlauf
aufzunehmen, der an eine Vertiefung appliziert wird. Eine
derartige Ausführungsform kann in der Form einer
Mikrotiterplatte vorliegen.
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Die Erfindung wird nun ferner unter Bezugnahme auf die
beiliegenden Zeichnungen beschrieben, ist aber in keiner
Weise darauf begrenzt, worin:
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Figur 1 eine Draufsicht von einer Ausführungsform der
Oberfläche eines Absorptionsmaterials einer
erfindungsgemäßen Ausführungsform ist;
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Figur 2 eine auseinandergezogene Ansicht von einer ersten
Ausführungsform eines in einem Gehäuse enthaltenen
Absorptionsmaterials ist;
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Figur 3 eine isometrische Ansicht von einem alternativen
Aspekt ist, die eine Vielzahl von Testzonen darstellt;
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Figur 4 eine Draufsicht von einer anderen Ausführungsform
der Oberfläche eines Absorptionsmaterial einer
erfindungsgemäßen Ausführungsform ist;
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Figur 5 eine isometrische Ansicht von noch einem anderen
Aspekt ist, die eine Absorptionstestplatte darstellt, die
eine Vielzahl von Testzonen aufweist;
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Figur 6 eine Querschnittsansicht von dem in Figur 5
gezeigten Aspekt ist; und
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Figur- 7
eine Draufsicht von einer Vielzahl von in einer
Schale enthaltenen Absorptionstestplatten ist.
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-Unter nunmehriger Bezugnahme auf die Zeichnungen kann ein
fester Träger gemäß der vorliegenden Erfindung in der Form
eines Zylinders 10 mit einer oberen Oberfläche 12
aufweisen. Der zylindrische Träger 10 kann in einem Gehäuse
enthalten sein, das einen unteren Anteil 18 und einen
oberen Deckelanteil 20 umfaßt. Der Deckel 20 des Gehäuses
besitzt eine Öffnung 22, welche die Oberfläche 12 von
Zylinder 10 umgibt.
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Die in Figur 1 gezeigte Ausführungsform veranschaulicht
eine erfindungsgemäße Ausführungsform, die als ein Plus-"+
"oder Minus-"-"-Trap-Assay bekannt ist. Auf Oberfläche 12 von
Zylinder 10 befindet sich in einer Ausführungsform
Analytzone 14 und Bindemittelzone 16. Der Analyt und das
Bindemittel können durch passive oder kovalente Anhaf tung
direkt an die Oberfläche 12 angelagert werden, oder sie
können an Latex-Partikel angelagert werden, die sich auf
Oberfläche 12 befinden. Es kann gesehen werden, daß sich in
dieser Ausführungsform Analytzone 14 und Bindemittelzone 16
miteinander schneiden oder überlappen, wobei sie folglich
die Form eines Pluszeichens "+" bilden. Wenn die
Durchführung eines Assays gemäß dieser Ausführungsform
erwünscht ist, bringt man den Analyt in Zone 14 oder auf
Oberfläche 12 und gibt ein Bindemittel für den Analyt in
Zone 16. Wenn man Oberfläche 12 mit einer Probe
kontaktiert, von der vermutet wird, daß sie einen Analyt
enthält, wird sich der Analyt, sofern er vorliegt, an das
Bindemittel in Zone 16 binden. Nachdem die Probe zugegeben
wurde, wird die Oberfläche 12 miteinem-Tracer mit einer
nachweisbaren Markierung kontaktiert, der durch den Analyt
gebunden wird. Wenn ein Analyt in der Probe vorliegt,
bindet sich der Tracer mit der nachweisbaren Markierung
sowohl an Zonen 14 als auch 16. Nachdem die Oberfläche 12
anschließend gewaschen wurde, erscheint ein Pluszeichen "+"
auf der Oberfläche 12 von Träger 10, wobei folglich das
Vorliegen eines Analyts angezeigt wird. Wenn kein Analyt in
der Testprobe vorliegt, bindet sich der Tracer mit der
nachweisbaren Markierung nur an den Analyt in Zone 14. Das
Testergebnis wird folglich als ein Minuszeichen "-"
abgelesen, was folglich die Abwesenheit von Antikörper an
dem Trap-Antigen in der Probe anzeigt.
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Als Alternative, wie in Figur 4 gezeigt, kann sich auf
Oberfläche 12 ein Bindemittelfleck 42 befinden, der ein
Bindemittel für den Analyt enthält und einen Kontrollfleck
44, der ein nicht reaktives Antigen oder einen nicht
reaktiven Antikörper (wie zum Beispiel ein y-Globulin)
enthält. Das durch Kontrollfleck 44 enthaltene nicht
reaktive Antigen oder der nicht reaktive Antikörper dient
dem Nachweis von Kontaminanten durch Einfangen nicht
spezifischer Materialien. Wenn nicht spezifische
Bindungskontaminanten vorliegen, werden sich diese
Kontaminanten an den durch Kontrollfleck 44 enthaltenen
nicht reaktiven oder nicht spezifischen Antikörper binden
und entwickeln Kontrollfleck 44. Wenn Probe auf die
Oberfläche 12 appliziert wird, bindet sich der Analyt,
falls er vorliegt, an das Bindemittel in Bindemittelfleck
42 und entwickelt Bindemittelfleck 42. Wenn kein Analyt
vorliegt, wird der Bindemittelfleck 42 nicht entwickelt.
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Das Bindemittel kann direkt an Oberfläche 12
angelagertwerden oder kann an Latex-Partikel angelagert werden, die
sich auf Oberfläche 12 befinden. Wenn Latex-Partikel
eingesetzt werden, schließt Bindemittelfleck 42
Latex-Partikel ein, an die Bindemittel angelagert sind, und
Kontrollfleck 44 schließt Latex-Partikel ein, an die
nichtreaktives (das heißt nicht spezifisches) Antigen oder
nichtreaktiver (das heißt nicht spezifischer) Antikörper
angelagert ist. Wenn eine den Analyt enthaltende Probe an
Oberfläche 12 appliziert wird, bindet sich der Analyt an
die in Bindemittelfleck 42 enthaltenen Latex-Partikel, und
es sollte keine Bindung an die in Kontrollfleck 44
enthaltenen Partikel auftreten. Wenn in einer Probe kein
Analyt vorliegt, sollte weder Bindemittelfleck 42 noch
Kontrollfleck 44 entwickelt werden. Wenn Kontrollfleck 44
entwickelt wird, ungeachtet, ob Bindemittelfleck 42
entwickelt wird, läßt die Entwicklung von Kontrollfleck 44
auf das Vorliegen von Kontaminanten in der Probe und/oder
in den Testmaterialien schließen. Wenn Kontrollfleck 44
nach Applikation einer Testprobe entwickelt wird, sollten
die Testergebnisse in diesem Fall nicht berücksichtigt
werden, und das Vorliegen von Analyt sollte erneut mit
einem anderen Träger bestimmt werden.
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In einem alternativen, in Figur 3 gezeigten Aspekt wird ein
aus einem Absorptionsmaterial, wie hierin vorstehend
beschrieben, hergestellter Träger 30 in eine Vielzahl von
Testzonen 32 aufgeteilt. Jede der Testzonen 32 weist eine
Oberfläche 34 auf, auf die Bindemittel für den Analyt und
falls erwünscht, wie hierin vorstehend beschrieben, auch
Analyt dergestalt gegeben werden kann, um einen
Bindemittelfleck oder eine "Trap"-Zone (das heißt Haftzone)
zu bilden. Bindemittel- und Kontrollflecke, wie hierin
vorstehend beschrieben, können auch auf Oberfläche 34
gegeben werden. Das Bindemittel und falls erwünscht Analyt
können durch passive oder kovalente Anhaf tung direkt an die
Oberfläche 34 angelagert oder können an Latex-Partikel, die
sich auf der Oberfläche 34 befinden, angelagert werden. Die
Porosität des Absorptionsmittels, aus der die Testzonen 32
bestehen, reicht aus, um einen Proben-Kreuzstrom von einer
Testzonein eine andere zu minimieren. Als ein weiteres
Abschreckmittel für einen Kreuzstrom zwischen Testzonen 32,
werden die Testzonen 32 durch eine Vielzahl von in das
Absorptionsmaterial geschnittenen Kanälen 40 voneinander
getrennt. Folglich ermöglicht diese Ausführungsform die
Durchführung einer Vielzahl von Assays unter Verwendung
einer Vorrichtung, die eine Vielzahl von Testzonen enthält,
worin eine Probe an eine Vielzahl von Testzonen appliziert
werden kann, wobei auf eine Testzone applizierte Probe in
keine sich in unmittelbarer Nachbarschaft befindende
Testzone kreuzströmen oder sie kontaminieren wird.
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Oben auf Träger 30 kann sich eine Abdeckung 36 befinden,
die eine Vielzahl von Öffnungen 38 aufweist. Jede der
genannten Öffnungen 38 befindet sich über einer Oberfläche
34 einer entsprechenden Testzone 32. In einer bevorzugten
Ausführungsform wird Abdeckung 36 aus einem
druckempfindlichen Vinyl mit ausgestanzten öffnungen
gefertigt.
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In einem noch anderen in Figuren 5 und 6 gezeigten Aspekt
wird ein Träger 50 in der Form einer Mikrotiterplatte
gezeigt, die ein absorbierendes Substrat 52, wie hierin
vorstehend beschrieben, in die Oberfläche 53 einschließt,
aus der eine Vielzahl von Vertiefungen 54 geschnitten sind,
wobei jede der genannten Vertiefungen 54 eine Testzone
definiert. Jede der Vertiefungen 54 ist durch eine
kreisförmige Wand 55 begrenzt. Es muß jedoch zur Kenntnis
genommen werden, daß die Form von Vertiefungen 54 nicht auf
eine Kreisform beschränkt werden darf. Eine Vielzahl der
Träger 50 kann in einer Schale 60 enthalten sein.
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Jede der Vertiefungen 54 schließt eine Oberfläche 56 ein,
an die eine Probe appliziert werden kann. Auf Oberfläche 56
bef indet sich ein Bindemittel für den Analyt und falls
erwünscht auch ein Analyt. Das Bindemittel und der Analyt
können in der Form einer Analytzone 14' und Bindemittelzone
16' vorliegen. Oberfläche 56 kann als eine Alternative
einen Bindemittelfleck und einen Kontrollfleck wie hierin
vorstehend beschrieben aufweisen. Das Bindemittel und falls
erwünscht Analyt, können durch passive oder kovalente
Anhaftung an die Oberfläche 56 angelagert werden oder
können an Latex-Partikel die sich auf Oberfläche 56
befinden, angelagert werden. Zwischen Vertiefungen 54
befinden sich Kanäle 58, wobei jeder der genannten Kanäle
58 durch Wände 57, 59, 61 und 63 begrenzt ist. Jeder der
genannten Kanäle 58 ist angepaßt, um Überlauf von einer an
eine benachbarte Vertiefung 54 applizierten Probe
aufzunehmen. Folglich dienen Kanäle 58 der Bereitstellung
eines Raumes sowohl zwischen benachbarten Vertiefungen 54
als auch der Verhinderung von Proben-Kreuzstrom von Proben
zwischen benachbarten Vertiefungen 54.
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In einem kompetitiven Assay konkurrieren ein Analyt und ein
Tracer mit einem für den Analyt und Tracer spezifischen
Bindemittel. Der Tracer ist der Analyt oder ein
angemessenes Analogon davon, der an eine nachweisbare
Markierung oder einen Marker gekoppelt wird. Der Tracer und
Analyt konkurrieren um eine begrenzte Anzahl von
Bindungsorten auf dem Bindemittel, und die Tracer-Menge,
die an das Bindemittel gebunden wird, ist umgekehrt
proportional zu der Analyt-Menge in der Probe. Sowohl die
Tracer-Mengeals auch die Analyt-Menge können durch Messen
der vorliegenden Markierungsmenge bestimmt werden. Die
Markierung oder der Marker, bei denen es sich um einen Teil
des Tracers handelt, kann ein nachweisbarer Marker sein,
wie zum Beispiel ein radioaktives Isotop von zum Beispiel
Jod, Cobalt oder Tritium, ein Enzym, ein
Fluoreszenzfarbstoff, ein absorbierender Farbstoff, eine
Chemilumineszenzsubstanz, ein Spinlabel, Biotin, ein
gefärbter Partikel oder jede andere Markierungssubstanz,
die denjenigen mit üblichen Fähigkeiten im Fach bekannt
sind. Eine bevorzugte Markierung umfaßt gefärbte Partikel,
wie zum Beispiel kolbides Gold.
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Wenn ein Sandwich-Assay eingesetzt wird, wird das
Bindemittel, das für einen Analyt spezifisch ist, mit einer
Probe, die einen Analyt enthält oder von der vermutet wird,
daß sie einen Analyt enthält, in Kontakt gebracht. Der in
der Probe vorliegende Analyt verbindet sich mit dem
Bindemittel. Nachdem die Probe an dem Bindemittel vorbei in
das Absorptionsmaterial geflossen ist, wird der
Analyt-Bindemittel-Komplex anschließend mit einem Tracer in
Kontakt gebracht. Der Tracer ist ein Ligand, der für den zu
bestimmenden Analyt spezifisch ist. So kann es sich bei dem
Tracer zum Beispiel um einen Antikörper handeln, der als
Antwort auf den zu bestimmenden Analyt hervorgerufen wird.
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Der Ligand ist bevorzugt mit einem nachweisbaren Marker wie
hierin vorstehend beschrieben markiert, und die in der
Probe vorliegende Analytmenge wird durch die auf der
Oberfläche des Absorptionsmittels vorliegende
Markierungsmenge bestimmt.
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In einem indirekten Sandwich-Assay wird an das
festgehaltene Bindemittel gebundener Analyt mit einem
Bindemittel für den Analyt in Kontakt gebracht, der an den
Analyt gebunden wird, der an das festgehaltene Bindemittel
gebunden wird. Der in dem Assay verwendete Tracer ist ein
markierter Ligand, der durch das Bindemittel gebunden ist,
das an den Analyt gebunden ist, der an das festgehaltene
Bindemittel gebunden ist.
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Im ELISA-Assay wird der Tracer oder Ligand mit einem Enzym
markiert, und die in der zu bestimmenden Probe vorliegende
Analytmenge wird anhand der Menge an vorliegender
gebundener Enzymmarkierung bestimmt. Ein ELISA-Assay kann
als ein Sandwich-Assay oder als ein kompetitiver Assay
durchgeführt werden.
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In einem Agglutinations-Assay wird ein Bindemittel, das
Partikel umfaßt, die mit einem für einen
Analytspezifischen Antigen oder Antikörper sensibilisiert wurden,
mit einer Probe in Kontakt gebracht, von der vermutet wird,
daß sie den Analyt enthält. Die Anwesenheit des Analyts
wird durch Agglutination der Feststoffpartikel
nachgewiesen.
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Das Bindemittel, das in dem erfindungsgemäßen Assay
verwendet wird, ist von dem zu bestimmenden Analyt
abhängig. Wenn der Analyt zum Beispiel ein Antigen oder
Hapten ist, kann das Bindemittel ein Antikörper oder eine
natürlich vorkommende Substanz sein, die für den Analyt
spezifisch ist. Wenn der Analyt ein Antikörper ist, kann
das Bindemittel ein Antikörper, ein Antigen oder eine
natürlich vorkommende Substanz sein, die für den Analyt
spezifisch ist.
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Der Assay kann für die Bestimmung einer breiten Vielfalt
von Analyten eingesetzt werden. Beispiele von Analyten, die
erfindungsgemäß bestimmt werden können, schließen
Arzneimittel, Hormone, Makromoleküle, Antikörper,
Mikroorganismen, Toxine, Polypeptide, Proteine,
Polysaccharide und Nukleinsäuren ein. Es wird erachtet, daß
sich die Auswahl von einem geeignetem Analyt im Rahmen der
im Fach arbeitenden Fachleute befindet.
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Bei dem für den Assay verwendeten erfindungsgemäßen
Absorptionsmaterial kann es sich um jedes
Absorptionsmaterial mit einer Porosität dergestalt handeln,
daß es dazu in der Lage ist, nicht geladene Partikel von
mindestens 0,1 um und nicht größer als 10 um
zurückzuhalten. Das Absorptionsmaterial ist anfeuchtbar
(hydrophil) und sieht Kapillarbewegung von Flüssigkeiten
durch das Absorptionsmittel vor. Obwohl das
Absorptionsmaterial dazu in der Lage ist, nicht geladene
Partikel von mindestens 0,1 um und nicht größer als 10
um
zurückzuhalten, können Assays unter Verwendung des
Absorptionsmaterials der vorliegenden Erfindung ohne die
Verwendung nicht geladener Partikel durchgeführt werden.
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Das verwendete Absorptionsmaterial muß eine ordnungsgemäße
Regulierung des Flusses der Probe durch das
Absorptionsmittel vorsehen. Die Regulierung des Flusses ist
wichtig, um die Interaktion der Probe mit dem Bindemittel
auf der Oberfläche des Absorptionsmittels zu regeln. Ein
schneller Fluß bewirkt einen Verlust der Empfindlichkeit,
weil der Analyt und das Bindemittel nicht genügend Zeit zum
Reagieren haben. Wenn der Fluß an der Oberfläche und dem
Bindemittel vorbei zu langsam ist, können verstärkte, nicht
spezifische Reaktionen auftreten, weil nicht spezifische
Komponenten in der Probe nicht angemessen von dem
Bindemittel separiert werden können. Folglich führt ein
ordnungsgemäß regulierter Fluß zu einer erhöhten Assay-
Empfindlichkeit. Das Absorptionsmittel verhindert bevorzugt
auch einen "Rückfluß" der Probe zur Oberfläche des
Absorptionsmittels. Wenn das Absorptionsmittel außerdem in
eine Vielzahl von Testzonen zum Durchführen einer
Multiplizität von Assays unterteilt wird, sollte das
Absorptionsmittel einen Kreuzstrom der Proben zwischen
Testzonen verhindern oder minimieren, wodurch Kontamination
der Probe in einer Testzone mit einer Probe/mit Proben aus
einer anderen Testzone/aus anderen Testzonen verhindert
wird. Wenn ein Absorptionsmittel in eine Vielzahl von
Testzonen unterteilt wird, kann ein Fluß von Materialien,
der zu langsam ist, außer verstärkte nicht spezifische
Reaktionen zu verursachen, auch einen Kreuzstrom von Proben
zwischen Testzonen bewirken. Ein erfindungsgemäßes
Absorptionsmittel und am bevorzugtesten ein
Absorptionsmittel mit einer Porosität innerhalb der oberen
Grenzen des hierin vorstehend beschriebenen Bereichs,
ermöglicht der Probe, nach unten und schnell durch das
Absorptionsmittel dergestalt zu fließen, um Kreuzstrom zu
verhindern, während die Geschwindigkeit eines derartigen
Flusses nicht zu übermäßig ist, damit die Assays die
geforderte Empfindlichkeit aufweisen werden. Das
Absorptionsmittel kann in einem Gehäuse oder einer
Ummantelung aus Kunststoff oder aus einer Faserplatte
untergebracht sein.
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In einem Aspekt ist das Absorptionsmittel ein nicht
faseriges Material und besonders ein
Absorptionsmittelporöser Kunststoff, der "anfeuchtbar" und dazu in der Lage
ist, selbst Kapillarfluß in den Kunststoff vorzusehen. Zu
Beispielen von nicht faserigen Absorptionsmaterialien aus
Kunststoff, die verwendet werden können, zählen folgende:
Polyolefin, Polyester, poröses Polyvinylchlorid und
Polystyrol. Das poröse Absorptionsmittel aus Kunststoff
weist eine Porosität oder Dichte wie hierin vorstehend
beschrieben auf. Der poröse Kunststoff ist in einer
bevorzugten Ausführungsform mit einem geeigneten Material
imprägniert, wie zum Beispiel einem Cellulosematerial, das
die geforderte Porosität durch Füllen des Kunststoffs in
die Poren dergestalt vorsieht, um ein poröses Material mit
den geforderten Porengrößen wie vorstehend beschrieben
vorzusehen. Das Cellulosematerial wirkt sich nicht
nachteilig auf die Absorptionsfähigkeit und Anfeuchtbarkeit
des Kunststoffes aus. Ein bevorzugtes Cellulosematerial ist
Celluloseacetat. Ein bevorzugtes Absorptionsmaterial ist
ein poröses Polyethylen-Absorptionsmittel, das eine
Oberfläche aufweist, die Poren enthält, die durch
Verwendung eines Cellulosematerials verengt waren. Ein
derartiger Träger wird von der Porex Technologies Corp. in
Georgia als das MEMPOR Porous Plastics Matrix Support
System (MEMPOR Poröse Kunststoffmatrix- Trägersystem)
verkauft. ("MEMPOR" ist ein Warenzeichen).
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Der poröse Kunststoff kann ein hydrophober poröser
Kunststoff sein, der durch die Zugabe eines Netzmittels,
wie zum Beispiel eines grenzflächenaktiven Mittels
hydrophil oder anf euchtbar gemacht wird.
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Das grenzflächenaktive Mittel kann auf das gesamte oder
einen Anteil des porösen Kunststoffmaterials (wie zum
Beispiel nachdem der poröse Kunststoffträger mit einem
Cellulosematerial imprägniert wurde) appliziert werden. Der
Kunststoff, der hydrophob ist, wird mit einem
grenzflächenaktiven Material dergestalt in Kontakt
gebracht, um einen Anteil der Oberfläche des porösen
Kunststoffs hydrophil oder anf euchtbar zu machen. Das in
dem Assay verwendete Bindemittel wird auf den
"anfeuchtbaren" Anteil des porösen Materials appliziert.
Wenn eine ungenügende Menge an grenzflächenaktivem Material
appliziert wird, werden die Flußraten der Proben und
markierter Antikörper in das Absorptionsmittel verlangsamt,
um sich folglich auf die Empfindlichkeit des Assays
aus zuwirken.
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Das grenzflächenaktive Mittel kann auf die gesamte
Oberfläche des Trägers oder auf einen Anteil der Oberfläche
appliziert werden, wobei es folglich entweder die gesamte
Oberfläche oder einen Anteil der Oberfläche hydrophil
macht.
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Wenn man das grenzflächenaktive Mittel sorgfältig über die
Zone appliziert, wo sich das Bindemittel befinden soll,
werden Probe und Tracer dazu gezwungen, in die Zonen
höchster Hydrophilität oder Anfeuchtbarkeit zu fließen, wo
sich das Bindemittel befindet. Der
Immunkonzentrationsmechanismuswird dadurch verbessert, und
der Fluß der Probe über die gesamte Absorptionsoberfläche
hinweg wird minimiert.
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In einem alternativen Aspekt kann das Absorptionsmittel in
der Form einer gepreßten Faserscheibe vorliegen. Die
gepreßte Faser ist auch hydrophil oder anf euchtbar und dazu
in der Lage, Kapillarfluß in die Faserscheibe vorzusehen.
Die Faserscheibe weist auch eine Porosität oder Dichte auf,
die der Scheibe ermöglicht, nicht geladene Partikel mit
einer Größe von mindestens 0,1 um und nicht größer als
10 um zurückzuhalten. Die Fasern werden dergestalt gepreßt,
daß sie die geforderte Porosität oder Dichte wie vorstehend
beschrieben vorsieht. Die Oberfläche des
Absorptionsmaterials, welches das Bindemittel festhält, ist
bevorzugt eine glatte Oberfläche, indem es die Fähigkeit
verbessert, den Tracer auf einer derartigen Oberfläche
abzulesen.
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Die Oberfläche des Absorptionsmaterials kann beschichtet
sein oder mit einem Material behandelt werden, um eine
nicht spezifische Adsorption, wie zum Beispiel BSA (bovines
Serumalbumin) oder jede beliebige andere im Fach bekannte
Blockierungssubstanz vorzusehen.
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Eine gepreßte Faserscheibe kann durch das Aufschlämmen von
Fasern und Mischen der Fasern mit einem angemessenen
Blockierungsprotein oder -proteinen, Puffern und
grenzflächenaktiven Mitteln hergestellt werden. Eine
bevorzugte Aufschlämmung besteht aus Polyester und
Celluloseacetat. Die Aufschlämmung wird in eine
Papierpresse gegossen. Überschüssiges wäßriges Material
wird während des Preßschrittes entfernt. Die Presse wird
betrieben, um die Scheibe zu pressen, um eine Dichte oder
Porosität der Scheibe vorzusehen, die ausreicht, nicht
geladene Partikel von mindestens 0,1 um und nicht größer
als 10 um zu halten. Die Presse enthält ein feines
Maschensieb, welches die Oberfläche der Scheibe glatt
macht. Die Glätte der Scheibe stellt die Ablesbarkeit des
Assays bereit. In einer bevorzugten Ausführungsform weist
die Scheibe Fasern auf, die Latex-Partikel, Mikrokügelchen
oder andere nicht geladene Partikel auf der Oberfläche der
Scheibe einfängt. Die Fasern sollten auch den Fluß der
Probe, des Tracers und/oder der Reagentien hinunter durch
die Trap- oder die Bindemittelzone richten, anstelle ihn
radial aus der Trap-Zone (das heißt Haftzone) zu richten.
Dies ermöglicht dem Assay, maximale Empfindlichkeit zu
erreichen.
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Erfindungsgemäß ist das Absorptionsmittel aus einem porösen
keramischen Material hergestellt. Das keramische
Absorptionsmittel kann als eine nichtfaserige,
anorganische, poröse Matrix definiert werden. Das
keramische Absorptionsmittel weist eine gleichmäßige oder
identische Porosität oder Dichte durch die gesamte Matrix
hindurch auf, die dem keramischen Absorptionsmittel
ermöglichen wird, die nicht geladenen Partikel mit einer
Größe von mindestens 0,1 um und nicht größer als 10 um
zurückzuhalten. Das keramische Absorptionsmittel kann eine
Porengröße aufweisen, die sich bevorzugt in dem Bereich von
circa 0,5 um bis circa 10 um bewegt. Das keramische
Absorptionsmittel weist bevorzugt eine gleichmäßige
Porositätauf, die sich in dem Bereich von circa 10% bis
circa 80%, am bevorzugtesten circa 40% bewegt.
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Das poröse keramische Absorptionsmittel ist vollkommen
mikroporös, und es liegen keine Makroporen vor. Das poröse
keramische Absorptionsmittel ist in einer bevorzugten
Ausführungsform eine einheitliche Struktur, die als ein
unitäres Stück formgepreßt ist. Das Absorptionsmittel kann
aus einem aluminiumoxidhaltigen Material, wie zum Beispiel
Aluminiumoxid hergestellt werden.
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Das poröse keramische Absorptionsmittel kann aus einem
Rohmaterial enthaltenden Aluminiumoxid mit einem
Reinheitsbereich von circa 50% bis circa 99,9% hergestellt
werden. Das Aluminiumoxid wird in eine gleichförmige
Partikelgröße zermahlen und wird dann sprühgetrocknet Im
Anschluß an das Sprühtrocknen wird das gleichförmige
Aluminiumoxid mit Bindemitteln, Freisetzungsmitteln
und/oder Mikropartikeln vermischt, um ein gleichförmiges
Pulver herzustellen. Zu geeigneten Mikropartikeln zählen
die, die beim Brennen des Keramikmaterials platzen, wodurch
sie Poren in dem Keramikrnaterial zurücklassen. Zu
Beispielen dieser Mikropartikel zählen Latex-Mikropartikel.
Das Pulver kann dann auf eine Anzahl verschiedener Weisen
zur Herstellung von Rohware verarbeitet werden. Zu
Beispielen dieser Verarbeitung zählen Extrusion in Stäbe,
Walzenpressen in dünne Folien oder Pillenpressen zum Formen
einer beliebigen Ausführung oder Spritzgießen zum Bilden
einer beliebigen Ausführung. Das Pulver wird bevorzugt in
Pillen gepreßt.
Dieform des Absorptionsmittels kann abhängig von der
Auslegung der zum Pillenpreßvorgang verwendeten Formpresse
variieren. Die Zusammensetzung des Aluminiumoxids, des
Bindemittels, der verwendeten Materialmenge und dem
Preßdruck wirken sich auf die Porosität des Endproduktes
aus. Je höher der Preßdruck und/oder die Brenntemperatur
desto weniger porös wird das Absorptionsmittel sein. Die
Rohware wird bei einer Temperatur gebrannt, die zum Härten
der Rohware wirksam ist. Bevorzugte Brenntemperaturen
liegen in einem Bereich von circa 1.000ºC bis circa 1.500ºC.
Während des Brennverfahrens verdampfen die Bindemittel, die
Freisetzungsmittel und die Mikropartikel aus der
Aluminiumoxidmatrix, wobei Poren in dem gehärteten
Keramikmaterial bewirkt werden. Die Brenntemperatur wirkt
sich auf die Schrumpfung des Absorptionsmittels und die
Porosität des endgültigen keramischen Absorptionsproduktes
aus. Das keramische Absorptionsmittel kann nach dem Brennen
unter Verwendung der Flußratenanalyse,
Wassersättigungstests und Quecksilbereindringungs-
Porositätstests auf Porosität bewertet werden. Es muß zur
Kenntnis genommen werden, daß die Kontaktzeit einer Probe
mit der Oberfläche des keramischen Absorptionsmittels von
der Probengröße des Absorptionsmittels abhängig ist. Eine
größere Porengröße des Absorptionsmittels sieht einen
schnelleren Fluß der Probe durch das Absorptionsmittel und
weniger Kontaktzeit der Probe mit der Oberfläche des
Absorptionsmittels vor, wohingegen eine kleinere Porengröße
einen langsameren Fluß der Probe durch das
Absorptionsmittel und eine längere Kontaktzeit der Probe
mit der Oberfläche des Absortpionsmittels vorsieht. Um eine
optimale Kontaktzeit der Probe mit der Oberfläche des
Absorptionsmittelsvorzusehen, weist das keramische
Absorptionsmittel, wie hierin vorstehend angegeben,
bevorzugt eine Porengröße von circa 0,5 um bis circa 10 um
auf. Die Flußrate kann auch durch Variieren des Preßdruckes
und/oder der Brenntemperatur angepaßt werden, um vielen
verschiedenen Assay-Bedingungen und Kontaktzeiten Rechnung
zu tragen.
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Gemäß einem noch anderen Aspekt kann das
Absorptionsmaterial ferner eine Vielzahl von Fasern
einschließen, die durch das gesamte Absorptionsmaterial
hindurch ausgebreitet sind. Die Fasern verlaufen parallel
zueinander und in der Flußrichtung einer Probe, wenn eine
Probe auf die Oberfläche des Absorptionsmittels appliziert
wird. Die Fasern befinden sich bevorzugt in unmittelbarer
Nachbarschaft der Poren des Absorptionsmittels. Die Fasern
helfen folglich dabei, den Probenfluß durch die Trap- oder
Bindemittelzone zu richten, anstelle den Fluß radial aus
der Trap-Zone zu richten. Eine derartige Ausführungsform
ist besonders nützlich, wenn das Absorptionsmittel in eine
Vielzahl von Testzonen aufgeteilt wird, weil die Fasern
dabei helfen, den Kreuzstrorn der Proben zu verhindern.
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Wenn ein poröses Kunststoffabsorptionsmittel oder
keramisches Absorptionsmittel eingesetzt wird, handelt es
sich bei den Fasern bevorzugt um Silicafasern, die mit
einem Keramikmaterial beschichtet sind. Wenn eine gepreßte
Faserscheibe, wie hierin vorstehend beschrieben, eingesetzt
wird, kann die Scheibe Cellulosefasern enthalten, die
parallel zueinander und in der Flußrichtung der Probe
verlaufen.
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Erfindungsgemäßkann ein Assay durch Aufgeben eines
Bindemittels für einen Analyt (Antigen, Hapten oder
Antikörper) auf mindestens einen Anteil der Oberfläche des
Absorptionsmittels durchgeführt werden. Das Bindemittel
kann auf die Oberfläche des Absorptionsmittels in der Form
eines Fleckes aufgegeben oder dispensiert, gesprüht oder
auf die Membranoberf läche aufgedruckt werden, um
symbolische Formen zu bewirken. Das Bindemittel kann direkt
auf die Oberfläche des Trägers (entweder durch passive oder
kovalente Verfahren der Anhaftung) aufgegeben werden oder
kann auf Feststoffpartikeln, wie zum Beispiel Latex-
Partikeln festgehalten werden, die auf die Oberfläche des
Absorptionsmittels gebracht werden. Die Oberfläche des
Absorptionsmittels wird dann mit einer Probe in Kontakt
gebracht, von der vermutet wird, daß sie einen Analyt
enthält. Das Bindemittel, welches auf der Oberfläche des
Absorptionsmaterials festgehalten wird, ist für den Analyt
spezifisch. Jeder vorliegende Analyt wird sich mit dem
Bindemittel auf der Oberfläche des Absorptionsmaterials
binden und einen Analyt-Bindemittel-Komplex bilden. Die
Oberfläche des Absorptionsmittels wird auch gleichzeitig
oder im Anschluß an den Kontakt mit der Probe mit einem
Tracer kontaktiert. Der Tracer ist eine markierte Form
eines Liganden, und der eingesetzte Ligand ist von dem
Assay-Format abhängig. In einem kompetitiven Assay handelt
es sich bei dem Ligand des Tracers um einen, der durch das
Bindemittel für den Analyt gebunden wird. In einem
sandwich-Assay wird der Ligand des Tracers durch den Analyt
gebunden (direkter Assay) oder durch ein Bindemittel für
den Analyt gebunden (indirekter Assay). Wenn ein Sandwich-
Assay eingesetzt wird, ist der Tracer bevorzugt eine
markierteform eines Liganden, der für den Analyt
spezifisch ist. In dem Assay werden der Analyt und Tracer
an das festgehaltene Bindemittel gebunden (der Tracer wird
in einem kompetitiven Assay direkt an festgehaltenes
Bindemittel gebunden und durch den Analyt in einem
Sandwich-Assay an das festgehaltene Bindemittel gebunden)
und bleiben folglich auf der Oberfläche des Trägers. Die
Bindung tritt während des Fließens der Probe und des
Tracers an dem festgehaltenen Bindemittel vorbei ein, und
alle ungebundenen Anteile fließen mittels Kapillarbewegung
durch das Absorptionsmittel in das Absorptionsmittel. Die
typischen Flußraten können sich zum Beispiel im Bereich von
circa 12 sec/ml bis circa 40 sec/ml bewegen, obwohl die
vorliegende Erfindung dadurch nicht eingeschränkt werden
darf.
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Nach einem Schritt oder mehreren der Schritte kann vor
einem nachfolgenden Schritt das Waschen der Oberfläche,
welche das Bindemittel festhält, erwünscht sein. So kann
zum Beispiel im Fall eines Sandwich-Assays die Oberfläche
nach der Probenzugabe und vor der Tracer-Zugabe und/oder im
Anschluß an die Tracer-Zugabe und vor der Entwicklung davon
gewaschen werden. Das Waschmittel kann wäßrige
Standardpuffer, wie zum Beispiel Phosphat- und Tris-Puffer
enthalten. Das Waschmittel kann auch Detergentien und
chaotrope Mittel zum Minimieren einer nicht spezifischen
Bindung enthalten.
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Das Bestimmungsverfahren für den Analyt in der bestimmten
Probe hängt von dem in Verbindung mit dem Ligand oder
Tracer verwendeten Markertyp ab. Wenn ein Farbstoff als
einemarkierung oder ein Marker verwendet wird, erscheint
sie auf der Oberfläche des Absorptionsmittels und bleibt
nach allen Waschschritten auf der Oberfläche des
Absorptionsmittels zurück. Bei einer Enzymmarkierung wird
ein geeignetes Substrat verwendet, um einen Farbstoff
vorzusehen. Das Vorliegen eines Radio-, Fluoreszenz-,
Chemilumineszenz-, Enzym- und Chromogenmarkers, Spinlabel
sowie Biotin-, Goldpartikel- oder anderer Markertypen, die
auf der Oberfläche des Absorptionsmaterials zurückbleiben,
können durch jedes im Fach bekannte Mittel bestimmt werden.
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Der Assay kann ein qualitativer oder ein quantitativer
Assay sein, und die Bezeichnung "Bestimmung" wie hierin
verwendet, bedeutet qualitative und/oder quantitative
Bestimmung des Analyts.
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Repräsentative Beispiele von Assays auf spezifische Analyte
schließen Assays auf heterophile Mononukleose-Antikörper
und auf Streptococcus Gruppe A ein. In einem Beispiel eines
Assays auf heterophile Mononukleose-Antikörper enthält eine
Probe, von der vermutet wird, das sie den heterophilen
Mononukleose-Antikörper enthält, der auf die Oberfläche des
Absorptionsmaterials dispensiert wird, die das Bindemittel
oder Antigen enthält, fließt an dem Bindemittel vorbei,
bevor sie in den Träger absorbiert wird. Das Bindemittel
kann an einen Partikel (das heißt Latex), der auf die
Absorptionsoberfläche geschichtet ist, gebunden sein
(entweder durch passive oder kovalente Verfahren), oder
direkt an die Absorptionsoberfläche gebunden sein, oder
durch ein passives oder kovalentes Verfahren direkt an das
Absorptionsmaterial gebunden sein. Die heterophilen
Mononukleose-Antikörper,wenn sie vorliegen, werden an dem
Bindemittel eingefangen (gereinigtes Mononukleose-Antigen).
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Der Tracer, bei dem es sich um ein Anti-Human-IgM oder
Anti-Human-IgG handeln kann, wird dann auf die Oberfläche
dispensiert und bindet sich an die humanen heterophilen
IgM- oder IgG-Antikörper, die an das Bindemittel gebunden
sind. Der Tracer kann mit vielen verschiedenen
nachweisbaren Markern markiert werden, wie zum Beispiel
einem radioaktiven Isotop von zum Beispiel Jod, Cobalt oder
Tritium, Enzymen, Fluoreszenzfarbstoffen, absorbierenden
Farbstoffen, Metallen, Chernilumineszenz-Substanzen,
Spinlabels, Biotin, Goldpartikeln oder allen anderen
Markierungssubstanzen, die denen mit üblichen Fähigkeiten
im Fach bekannt sind. Wenn in der Probe keine heterophilen
Antikörper vorliegen, werden sich keine nachweisbaren
Tracer-Mengen an die Absorptionsoberfläche binden.
Ungebundener Tracer kann unter Einschalten eines
Waschschrittes entfernt werden. Der Waschschritt kann die
Verwendung einer Kombination aus Detergentien und
chaotropen Mitteln zum Minimieren einer nicht spezifischen
Bindung an die Oberfläche der Absorptionsteile erforderlich
machen. Ein Waschschritt kann, abhängig von dem Verhältnis
von Signal zu Geräusch, auch aus dem Assay ausgelassen
werden. Auf Farbstoff basierende Systeme können zum
Beispiel Konjugate in einer verdünnten Form in einem
ausreichenden Volumen verwenden, um dieses Verhältnis zu
erhöhen. In auf Enzym basierenden Systemen können das
Konjugat und/oder Substrat gleichzeitig auch als ein
Waschmechanismus dienen. Mit aus Farbstoff-Konjugaten
hergestellten Tracers können die Reaktionen sofort nachdem
der Waschpuffer in die Vorrichtung absorbiert wurde,
sichtbar gemacht werden. Wenn ein Enzym als der Tracer
verwendet wird, ruft das Zusetzen eines Enzymsubstrates ein
Farbprodukt hervor, das auf der Oberfläche der
Absorptionsvorrichtung sichtbar gemacht wird. In der
Abwesenheit von Mononukleose-Antikörpern bindet sich der
markierte Antikörper nicht an das Bindemittel. In diesem
Fall wird das Enzym nicht an die Oberfläche gebunden und
erzeugt kein Farbprodukt.
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In einem Beispiel eines Assays auf Streptococcus Gruppe A,
wird ein Probenabstrich, bei dem Verdacht besteht, daß er
Streptococcus Gruppe A enthält, in einem Extraktionspuffer
(das heißt chemisch oder enzymatisch) suspendiert, wie
denen mit üblichen Fähigkeiten im Fach bekannt sein wird.
Nach einer kurzen Inkubationsperiode werden für die Gruppe
A spezifische Kohlenhydrat-Antigene exponiert, der Extrakt
kann zur Verbesserung der Bindung von Antigen an Antikörper
neutralisiert werden. Ein Anteil des Extraktes wird auf die
Oberfläche des Absorptionsmaterials appliziert, die ein
Bindemittel enthält. Das Bindemittel kann an einen Partikel
gebunden werden (das heißt Latex oder andere angemessene
Mikrokügelchen), die auf die Absorptionsoberfläche
geschichtet sind oder durch ein passives oder kovalentes
Verfahren direkt an das Absorptionsmaterial gebunden sind.
Das Bindemittel kann ein gereinigter polykolonaler
Antikörper sein, der gegen das Gruppe-A-spezifische
Kohlenhydrat-Antigen hergestellt wurde. Wenn der Extrakt
das Bindemittel passiert, wird das Gruppe-A-Antigen, wenn
es vorliegt, von dem Bindemittel, das den Antikörper
enthält, eingefangen. Der Tracer, bei dem es sich um einen
polyklonalen oder monoklonalen Antikörper handelt, der für
dasgruppe-A-Kohlenhydrat spezifisch ist, wird dann auf das
Absorptionsmaterial dispensiert und in die Vorrichtung
absorbieren lassen. Der Tracer kann in diesem Fall mit
vielen verschiedenen nachweisbaren Markern, wie zum
Beispiel vorstehend beschrieben, oder mit jeder anderen
Markierungssubstanz markiert werden, wie denen mit üblichen
Fähigkeiten im Fach bekannt ist. Wenn keine Antigene der
Gruppe A in dem Extrakt vorliegen, werden sich keine
nachweisbaren Mengen des Tracers an die
Absorptionsoberfläche binden. Ungebundener Tracer kann
unter Einschalten eines Waschschrittes wie vorstehend
beschrieben entfernt werden. Der Waschschritt kann die
Verwendung einer Kombination aus Detergentien und
chaotropen Mitteln zum Minimieren nicht spezifischer
Bindung an die Oberfläche der Absorptionsteile erforderlich
machen. Mit aus Farbstoffkonjugaten hergestellten Tracers
können die Reaktionen sofort, nachdem der Waschpuffer in
die Vorrichtung absorbiert ist, sichtbar gemacht werden.
Wenn ein Enzym als der Tracer verwendet wird, erzeugt die
Zugabe eines Enzymsubstrates ein gefärbtes Produkt, das
sich an die Oberfläche der Absorptionsvorrichtung binden
wird. In der Abwesenheit des Antigens von Streptococcus
Gruppe A bindet sich der markierte Antikörper nicht an das
Bindemittel. In diesem Fall wird das Enzym nicht an die
Oberfläche gebunden und erzeugt kein Farbprodukt.
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Das folgende Beispiel veranschaulicht die Bildung eines
porösen Kunststoffträgers und eines Assays, wobei dieser
Träger eingesetzt wird.
BEISPIEL
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Auseinem Gemisch aus verflüssigtem Polyethylen und einem
grenzflächenaktiven Mittel wird ein poröser
Kunststoffträger hergestellt. Das verflüssigte Polyethylen
und das grenzflächenaktive Gemisch werden in einen
zylindrischen Kunststoffträger mit einer Porengröße von
circa 5 um bis circa 30 um geformt. Eine Aufschlämmung aus
Celluloseacetat wird dann der Oberfläche des
Kunststoffträgers zugefügt. Das Celluloseacetat wird in den
Kunststoffträger absorbiert und wird trocknen lassen. Das
Celluloseacetat wird in einer Menge zugefügt, um
Porengrößen auf dem Träger von circa 0,1 bis circa 10 um
vorzusehen.
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Der Kunststoffträger, der hydrophob ist, wird dann mit
grenzflächenaktivem Verion-Mittel in Kontakt gebracht. Das
grenzflächenaktive Mittel wird dann auf die Oberfläche des
Trägers gegeben, wobei der Träger mit dem
grenzflächenaktiven Mittel imprägniert wird, um eine
hydrophile Oberfläche zu erzeugen.
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Der feste Träger wird zur Verwendung im Zusammenhang mit
einem Mononukleose-Assay wie folgt hergestellt:
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Polystyrol -Latex-Partikel werden kovalent mit Mononukleose-
Antigen beschichtet, das aus bovinen Zellen hergestellt
wurde. Das in diesem Beispiel eingesetzte Mononukleose-
Antigen wurde von Meridian Diagnostics bezogen. Die Latex-
Partikel werden dann auf einen Anteil der Oberfläche des
festen Trägers gebracht. Polystyrol-Latex-Partikel, die mit
humanem IgM passiv beschichtet oder beladen sind, werden
dann auf einen anderen Anteil des festen Trägers gebracht.
Dieser Anteil schneidet den Anteil des Trägers, wo die mit
Mononukleose-Antigen beschichteten Polystyrol-Latex-
Partikel aufgebracht wurden. Die Aufbringungszonen der mit
Mononukleose-Antigen beschichteten Latex-Partikel und der
mit humanem IgM beschichteten Polystyrol-Latex-Partikel
liegen in der Form eines Pluszeichens "+" vor.
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Die Oberfläche des porösen Kunststoffträgers wird dann mit
0,5%igem Ziegenserurn in Kontakt gebracht, um eine nicht
spezifische Adsorption zu verhindern.
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Der Assay wird dann wie folgt durchgeführt:
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150 ul Humanserurn wird auf die Oberfläche des porösen
Kunststoffträgers gebracht und in den Träger adsorbiert.
Dann werden 100 ul kolbides Gold konjugiert an Antihuman-
IgM von der Ziege auf den porösen Kunststoffträger
gebracht. Daran anschließend werden 250 bis 500 ul 1 M
Guanidin und 5% Triton-X-Waschpuffer zugesetzt. Die
Oberfläche des porösen Kunststoffträgers wird dann
abgelesen, um das Vorliegen des Mononukleose-Antikörpers zu
bestimmen. Wenn Mononukleose-Antikörper in der Probe
vorliegt, bindet sich das Konjugat aus kolbidem Gold und
Antihuman-IgM von der Ziege an den Mononukleose-Antikörper,
der sowohl an das Mononukleose-Antigen als auch an das
humane IgM gebunden ist. Auf der Oberfläche des Trägers
erscheint ein Pluszeichen "+". Wenn in der Probe kein
Mononukleose-Antikörper vorliegt, bindet ich das Konjugat
nur an das humane IgM, und auf der Oberfläche des Trägers
erscheint ein Minuszeichen "-".