DE69131069T2

DE69131069T2 - Plasmid das für die aminosäuresequenz von tcf-ii kodierende dns enthalt, transformierte zelle und produktion einer physiologisch aktiven substanz mit ihrer verwendung

Info

Publication number: DE69131069T2
Application number: DE69131069T
Authority: DE
Inventors: Kanji Kawagoe-Shi Saitama 350 Higashio; Masaya Sakyo-Ku Kyoto-Shi Kyoto 606 Nagao; Fumiko Utsunomiya-Shi Tochigi 321-01 Oogaki; Nobuyuki Oyama-Shi Tochigi 323 Shima; Hiroaki Shimotsuga-Gun Tochigi 329-05 Takaoka; Eisuke Maronie Haitsu 201 Shimotsuga-Gun Tochigi 329-05 Tsuda
Original assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Current assignee: Atlas Pharmaceuticals Inc Sunnyvale Calif Us
Priority date: 1990-07-13
Filing date: 1991-07-15
Publication date: 1999-07-15
Anticipated expiration: 2011-07-16
Also published as: EP0539590A4; KR920702417A; WO1992001053A1; ATE178354T1; DE69131069D1; EP0539590B1; US5328836A; CA2066618C; ES2132087T3; EP0539590A1; DK0539590T3; KR0153009B1; CA2066618A1; JP2634323B2

Description

Plasmide, die DNA enthalten, die die Aminosäuresequenz von TCF-II codieren, mit den Plasmiden transformierte Zellen und Produktionsverfahren der biologisch aktiven Substanz unter Verwendung der transformierten Zellen.

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft Expressionsvektoren, die DNA enthalten, die die Aminosäuresequenz eines von menschlichen Fibroblasten abgeleiteten Glykoproteins codiert (es wird nachstehend als TCF-II bezeichnet), mit den Plasmiden transformierte Zellen und ein Produktionsverfahren der biologisch aktiven Substanz unter Verwendung der transformierten Zellen.
TCF-II ist erfindungsgemäß für pharmazeutische Produkte als Hepatozyten-Wachstumsfaktor, als für einen Tumor cytotoxische Faktor etc. oder als ein biochemisches oder pharmakologisches Reagens nützlich.

Stand der Technik

Interferon β ist ein repräsentativer Faktor als biologisch aktiver Faktor, beispielsweise der cytotoxische Tumorfaktor, der durch von Menschen abgeleitete Fibroblasten produziert wird. Dies ist ein Glykoprotein, das von den Fibroblasten sezerniert wird, wenn die Zellen nach der Züch tung durch polyI-polyC- oder das Sendai-Virus geerntet und stimuliert werden. Es wurde geklärt, daß das Protein verschiedene physiologische Aktivitäten neben seiner Antivirus- oder Antitumoraktivität besitzt. Ein von Fibroblasten abgeleitetes für einen Tumor cytotoxisches Glykoprotein mit der Bezeichnung CBF ist in dem offengelegten japanischen Patent Nr. 58-146293 offenbart. Ein das Tumorwachstum hemmender Faktor (INF) mit einem Molekulargewicht von 35.000 bis etwa 45.000, der aus der Kulturbrühe von von menschlichem Gewebe abgeleiteten Fibroblasten gereinigt wird, ist in dem offengelegten japanischen Patent Nr. 61- 33120 offenbart. Ferner sind eine Tumornekrosefaktorartige Substanz, die aus der Kulturbrühe von Fibroblasten gereinigt wurde, ein von Fibroblasten abgeleiteter Nekrosefaktor, FNF, und eine biologisch aktive Substanz mit cytotoxischer Aktivität, die von von Tieren abgeleiteten Fibroblasten produziert wird und ein Molekulargewicht von 40.000 bis 60.000 und einen isoelektrischen Punkt mit einem Wert von 5,0 ± 0,5 besitzt, in dem offengelegten japanischen Patent Nr. 61-56131, dem offengelegten japanischen Patent Nr. 61-1872 bzw. dem offengelegten japanischen Patent Nr. 62-103021 beschrieben. Zusätzlich sind die gesamte primäre Aminosäuresequenz und eine cDNA, die die Aminosäuresequenz eines für einen Tumor cytotoxischen Faktors codiert, der aus der Kulturbrühe von menschlichen Fibroblasten abgeleitet ist, ein Molekulargewicht von 36.000 ± 1000 und einen Wert für den isoelektrischen Punkt von mehr als 10,5 besitzt, in dem offengelegten japanischen Patent Nr. 64-10998 beschrieben.

Offenbarung der Erfindung

Die genannten Erfinder hatten biologisch aktive Substanzen, die in der Kulturbrühe von menschlichen Fibroblasten enthalten sind, untersucht und ein Glykoprotein mit verschiedenen biologischen Aktivitäten gefunden, das sich bezüglich des Molekulargewichts, des Werts der isoelektri schen Punkts etc. von den vorstehend beschriebenen Substanzen unterscheidet. Sie hatten auch eine Patentanmeldung über dieses Glykoprotein (PCT/JP 90/00314; international veröffentlichtes Patent, WO 90/10651, Datum der Veröffentlichung: 20. September 1990) vorgenommen.
Dieses Glykoprotein (TCF-II), das von menschlichen Fibroblasten abgeleitet ist, ist ein Glykoprotein, das durch die folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften gekennzeichnet ist.
a. Molekulargewicht (MG): In der SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese zeigt es Banden mit MG 74.000 ± 2000 und 78.000 ± 2000 unter nichtreduzierenden Bedingungen, und es zeigt auch eine gemeinsame Bande A mit MG 52.000 ± 2000 und eine Bande B mit MG 30.000 ± 2000 und eine Bande C mit MG 26.000 ± 2000 unter reduzierenden Bedingungen.
b. Wert des isoelektrischen Punkts: 7,4 bis 8,6.
c. Wärmestabilität: stabil beim Erhitzen bei 60ºC für 10 Minuten.
d. pH-Stabilität: stabil im Bereich von pH 6 bis 9.
e. Glykoprotein: es wird an eine Concanavalin A (Con A)- Sepharosesäule adsorbiert.
f. Biologische Aktivität: es hemmt das Wachstum von KB- Zellen, HeLa-Zellen und L929-C18-Zellen, aber nicht von IMR-90-Zellen.
g. Reaktivität gegen Antikörper: dessen cytotoxische Aktivität wird durch Anti-TNF-, Anti-Lymphotoxin- und Anti- Interferon-β-Antikörper nicht neutralisiert.
Ferner besitzt der erfindungsgemäße TCF-II bevorzugt die folgende N-terminale Aminosäuresequenz und Aminosäurezusammensetzung.
h. N-terminale Aminosäuresequenz: die vorstehend genannten Banden B und C sind jeweils Unterketten der Bande A. Der N-Terminus der Bande A ist blockiert. Die Bande B und die Bande C besitzen die gleiche N-terminale Aminosäuresequenz wie folgt:
Val-Val-Asn-Gly-Ile-Pro-Thr- (SEQ ID No.: 1) oder Val-Val-Asn-Gly-Ile-Pro-Thr-X-Thr-Asn-Ile-Gly-X-Met-Val- Ser-Leu- (SEQ ID No.: 2)
X bedeutet eine nichtidentifizierte Aminosäure.
i. Aminosäurezusammensetzung: bei der Hydrolyse mit HCl zeigt es die folgende Aminosäurezusammensetzung:
Ferner bestimmten die genannten Erfinder die Nukleotidsequenz einer cDNA, die die Aminosäuresequenz von TCF-II codiert, und beschrieben die Nukleotidsequenz in der vorstehend genannten Patentanmeldung. Die genannten Erfinder reinigten mRNA, die von menschlichen embryonalen Fibroblasten IMR-90-Zellen abgeleiteten TCF-II codiert, clonierten das Gen und leiteten die Aminosäuresequenz von TCF-II durch Bestimmen der Nukleotidsequenz des Gens nach den folgenden Verfahren ab:

(1) Extraktion von poly(A)&spplus;-RNA aus IMR-90-Zellen

Gesamt-RNA wurde nach dem Guanidinthiocyanat-Caesiumchlorid-Verfahren (Biochemistry 18, 5294 bis 5299 (1979)) aus 2 · 10&sup8; IMR-90-Zellen hergestellt, die in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), das 5% Serum eines neugeborenen Kalbs (NBCS) enthielt, gezüchtet wurden. Die IMR-90- Zellen wurden in 28 ml 6 M Guanidinthiocyanatlösung, die 5 mM Natriumcitrat, 0,5% Sarkosyl, 0,1 M β-Mercaptoethanol enthielt, suspendiert und homogenisiert. 4 ml 5,7 M Caesiumchloridlösung, die 0,1 M EDTA enthielt, wurde in jedes Polyallomer-Zentrifugenröhrchen eingebracht. 7 ml der homogenisierten Lösung wurden auf die Caesiumchloridlösung überschichtet und dann bei 35.000 UpM 16 Stunden bei 20ºC unter Verwendung eines 40-Ti-Rotors einer Beckman- Zentrifuge zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurden die Pellets zweimal mit 95% Ethanol gewaschen und in 200 ul 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5), der 1 mM EDTA enthielt, aufgelöst, wobei 5 min auf 65ºC erhitzt wurde. Die so erhaltene Lösung wurde als Gesamt-RNA-Lösung bezeichnet. Die poly(A)&spplus;-RNA wurde aus der Gesamt-RNA durch oligo(dT)- Cellulose-Säulenchromatographie gereinigt. Die Gesamt-RNA- Lösung wurde auf die oligo(dT)-Cellulosesäule geladen, die mit 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,4), der 1 mM EDTA, 0,5 M NaCl und 0,05% SDS enthielt, equilibriert worden war. Die an die Säule adsorbierte Fraktion wurde mit 10 mM Tris- HCl-Puffer, pH 7,4, der 1 mM EDTA und 0,05% SDS enthielt, eluiert. Das Eluat wurde als poly(A)&spplus;-RNA-Lösung bezeichnet.

(2) Synthese der cDNA

Doppelsträngige cDNA wurde unter Verwendung von poly(A)&spplus;- RNA von (1) als Matrize und unter Verwendung eines cDNA- Synthesekits (Pharmacia) synthetisiert, und ein EcoRI- Adaptor wurde an die cDNA gebunden. Das Syntheseverfahren wurde nach dem Protokoll von Pharmacia durchgeführt, ausgenommen, daß reverse Transkriptase (AMV-RTase, 40 Einheiten/Reaktionsgemisch, Life Science), abgeleitet von einem nichtsphärischen Krankheitsvirus des Vogelknochenmarks der Synthese des ersten Strangs zugesetzt wurde.

(3) Konstruktion einer cDNA-Bank

Die cDNA mit dem EcoRI-Adaptor, die aus (2) erhalten worden war, wurde in einen EcoRI-Arm (Promega) des Phagenvektors λ gt 10 insertiert. Die aus 3, 3 ug poly (A)&spplus;-RNA synthetisierte cDNA wurde in 150 ul 66 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,6), der 1 mM Spermidin, 10 mM Magnesiumchlorid, 15 mM Dithiothreit und 0,2 mg/ml Rinderserumalbumin enthielt (Säulenpuffer), aufgelöst. 5,2 ul der vorstehenden Lösung wurden mit 1 ug λgt 10 EcoRI-Arm vermischt und dann mit Ethanol gefällt. Rekombinante Phagen-DNA einschließlich sowohl λgt 10 als auch cDNA wurde wie folgt konstruiert. Das vorstehende Präzipitat wurde in 9 ul des Säulenpuffers rekonstituiert und wurde bei 16ºC über Nacht durch Zugabe von 1 ul 10 mM Adenosintriphosphat und 1 ul T&sub4;-DNA-Ligase (350 Einheiten/ul) inkubiert.

(4) Absuchen der cDNA-Bank

(i) Herstellung einer Oligonukleotidsonde

Für die Herstellung einer Sonde wurde ein Gemisch der 17meren Komplementärstrang-Oligonukleotide (Gemisch aus 384 Spezies) entsprechend der Aminosäuresequenz von Val¹ bis Pro&sup6; in der N-terminalen Aminosäuresequenz der TCF-IIβ-Kette synthetisiert und am 5'-Terminus mit T4-Polynukle otidkinase (TAKARA SHUZO Co., Ltd.) und [γ-³²P]ATP (Amersham) markiert. Diese Sonde ist im folgenden gezeigt:
Komplementärstrang, der als Sonde verwendet wird:
(Gemisch aus 384 Spezies)
3'-CACCACTTACCGTAGGG-5' (SEQ I No.: 3)
G G G C A
A A A T
T T T

(ii) Screening des rekombinanten Phagen

Etwa 500 Tausend Plaques des Phagen wurden durch Verpacken der rekombinanten Phagen-DNA in vitro, die von (3) erhalten wurde, unter Verwendung von Gigapack Gold (Stratagene) und anschließend durch Infektion von E. coli C600hfl damit erhalten. Nach der Adsorption der Plaques an Hybond-N- Filter (Amersham) wurden sie mit Alkali denaturiert, neutralisiert und 2 Stunden bei 80ºC gebacken. Die Hybridisierung wurde nach dem Verfahren von Bell et al. (Nature 310, 775 bis 777 (1984)) durchgeführt. Das erste Screening wurde unter Verwendung der gemischten Sonde, die von (i) erhalten wurde, durchgeführt. Ein Clon, der das TCF-IIcDNA-Fragment enthielt, wurde in den positiven Plaques, die durch das erste Screening detektiert wurden, gefunden.

(5) Clonierung der vollen codierenden Region der TCF-IIcDNA, die in Aminosäuren translatiert werden kann.

Die N-terminale Aminosäuresequenz der TCF-II-β-Kette und ein paar interne Aminosäuresequenzen (Einbuchstaben-Code), (α) NYMGNLSQTRSGL (SEQ ID No.: 4) und (β) TSXSVYGWGYT- GLINYDGLL (X: nicht identifiziert) (SEQ ID No.: 5), die jeweils von den α- und β-Ketten von TCF-II durch deren Spaltung mit Lysylendopeptidase erhalten wurden, fielen mit den entsprechenden Aminosäuresequenzen eines der menschlichen Hepatozyten-Wachstumsfaktoren (hHGFs) zusam men. Daher wurde angenommen, daß TCF-II von einer der Familien der hHGF-Gene exprimiert wird. Bezüglich hHGF beschrieben MIYAZAWA et al. (Biochemical and Biophysical Research Communication 163, 967 bis 973 (1989) und NAKAMURA et al. (Nature 342, 440 bis 443 (1989)) die vollständigen Nukleotidsequenzen der jeweiligen hHGF-cDNAs. Der Vergleich der Aminosäuresequenzen, die von beiden hHGF-cDNAs abgeleitet sind, zeigte Unterschiede in den Aminosäuren an 14 Stellen in ihren Sequenzen. Aus diesen Ergebnissen wurde die Anwesenheit der Familie von hHGF-Genen vermutet. Daher wurden auf den Grundlagen identischer Oligonukleotidsequenzen beider hHGFs an den 5'- und 3'- nichtcodierenden Regionen Oligonukleotide, die als Primer verwendet wurden, chemisch synthetisiert, und ein Absuchen der TCF-II-cDNA wurde nach dem Verfahren der Polymerase- Kettenreaktion (PCR) durchgeführt. Ein Sal-77-Primer, der eine Spaltstelle für das Restriktionsenzym Sal I hatte und ein SpH2203-Primer, der eine Spaltstelle des Restriktionsenzyms Sph I hatte, wurde mit dem DNA-Synthesegerät (Applied Systems) synthetisiert. Diese Primer sind wie folgt gezeigt:
Sal-77 Primer: 5'-GGTCGACTAGGCACTGACTCCGAACAGGATTC-3' (SEQ ID No.: 6) Sal I
Sph2203-Primer: 5'-GGCATGCACAGTTGTATTGGTGGGTGCTTCAG-3' (SEQ ID No.: 7) Sph I
Die Clonierung nach dem PCR-Verfahren wurde nach dem folgenden Verfahren durchgeführt:

(i) PCR

cDNA, synthetisiert wie in (2) beschrieben 1,0 ul
(aufgelöst in 150 ul Säulenpuffer)
20 uM Sal-77-Primer 2,5 ul
20 uM SpH2203-Primer 2,5 ul
10 · PCR-Reaktionslösung 10,0 ul
(100 mM Tris-HCl, pH 8,3, enthaltend 500 mM KCl, 15 mM MgCl&sub2; und 0,1% (Gew./Vol.) Gelatine) Ein Gemisch aus jeweils 1,25 mM dGTP, dATP, dTTP und dCTP 16,0 ul
Ampli Taq (5 Einheiten/ul, TAKARA SHUZO) 0,5 ul
Destilliertes Wasser 67,5 ul
Nachdem die vorstehenden Lösungen gut in einem Mikrozentrifugenröhrchen mit einer Volumengröße von 0,5 ml gemischt worden waren, und die flüssige Oberfläche mit etwa 100 u1 Mineralöl (Sigma) bedeckt wurde, wurde die PCR mit dem Quick Thermo System (Nippon Genetics Co., Ltd.) durchgeführt.
Die Reaktionsbedingungen waren wie im folgenden gezeigt; nach der Vorbehandlung bei 94ºC für 7 min wurde eine dreistufige Reaktion, die aus Assoziierungsreaktion bei 55ºC für 3 min. der Polymerasereaktion bei 72ºC für 2 min und der Denaturierungsreaktion bei 94ºC für 2 min bestand, 35mal wiederholt. Dann wurde das Reaktionsgemisch 3 min bei 55ºC und anschließend 11 min bei 72ºC behandelt und dann auf Raumtemperatur zurückgebracht. (Jedes Mal umfaßt die Veränderung der Zeit für die Temperatur). Als ein Teil des Reaktionsgemisches mittels Elektrophorese unter Verwendung von Agarosegel analysiert wurde, wurde ein DNA- Fragment mit etwa 2, 3 Kilobasen (Kb), das als die gewünschte TCF-II-cDNA galt, erhalten. Dann wurde die DNA, die aus vier Röhrchen, die das vorstehend genannte Reaktionsgemisch enthielten, erhalten worden war, mit Ethanol gefällt und mit den Restriktionsenzymen Sal I und Sph I gespalten. Nach einer Agaroseelektrophorese der gespaltenen DNA wurde das DNA-Fragment mit etwa 2,3 kb unter Verwendung von DE-81-Papier (Whatman) bedeckt.

(ii) Subclonierung

Das cDNA-Fragment mit etwa 2,3 Kb, das von (i) erhalten und mit den Restriktionsenzymen Sal I und Sph I gespalten worden war, wurde unter Verwendung des Ligierungskits (TAKARA SHUZO) in ein Vektorfragment insertiert, das durch Spalten des Plasmidvektors pUC1B (Nippon Gene Co., Ltd.) mit den Restriktionsenzymen Sal I und Sph I erhalten worden war und in Escherichia Coli DH 5 α gemäß dem Protokoll von BRL transfiziert. Mehr als 20 Subclone konnten erhalten werden.

(iii) Bestimmung der Nukleotidsequenz

Die Nukleotidsequenzen der so erhaltenen Subclone wurden nach dem Didesoxyverfahren (Sequenase Ver. 2.0 TOYOBA) bestimmt. Einbaufehler der Nukleotide, verursacht durch Ampli Taq (TAKARA SHUZO), wurden durch Analyse der Nukleotidsequenzen mehrerer Subclone korrigiert. Die Nukleotidsequenz der nach dem vorstehend genannten Verfahren erhaltenen TCF-II-cDNA und die von der Nukleotidsequenz abgeleitete Aminosäuresequenz sind in Fig. 1 gezeigt. Sie besteht aus 2172 Basenpaaren (bp) von ATG des Initiationscodons der Translation bis TAG des Terminationscodons. Wenn die DNA in das Protein translatiert wird, besteht TCF-II aus 723 Aminosäuren. Die Aminosäuresequenz von dem ersten Methioninrest (Met¹) bis zu dem 29. Rest Alanin (Ala²&sup9;) wird als Signalsequenz angenommen. TCF-II, in dem zwei Polypeptide, bestehend aus einer α-Kette und einer β- Kette, über Disulfidbrücken verbunden sind, wurde, wie gefunden wurde, zuerst als Einzelkette, wie in Fig. 1 gezeigt, synthetisiert. Die N-terminale Aminosäuresequenz der α-Kette in TCF-II wurde nicht nachgewiesen, weil dessen N-Terminus blockiert war.
Die N-terminale Aminosäuresequenz der β-Kette und ein paar interne Aminosäuresequenzen der α- und β-Ketten, die wie vorstehend genannt, bestimmt wurden, sind in Fig. 1 gezeigt. Die erhaltene TCF-II-cDNA besitzt eine Ähnlichkeit bezüglich der Nukleotidsequenz mit hHGF, wie von MIYAZAWA et al. (Biochemical and Biophysical Research Communication 163, 967 bis 973 (1989)) aufgefunden wurde. Jedoch deletiert die von TCF-II-cDNA abgeleitete Aminosäuresequenz fünf Aminosäurereste (F-L-P-S-S) entsprechend Phe¹&sup6;² bis Ser¹&sup5;&sup6; in der von der hHGF-cDNA abgeleiteten Aminosäuresequenz. TCF-II unterscheidet sich auch bezüglich der Deletion von fünf Aminosäureresten der codierenden Region von dem hHGF. Daher zeigten die Fakten, daß die TCF-II-cDNA eine neue in der Familie der hHGF-Gene war.
Basierend auf den Kenntnissen über die erhaltene TCF-IIcDNA betrifft die vorliegende Erfindung die Insertion von TCF-II-cDNA in einen Expressionsvektor und die Produktion von TCF-II durch rekombinante Technologie. (Nachstehend wird durch rekombinante Technologie produzierter TCF-II als rTCF-II bezeichnet). Daher liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, die Konstruktion von Expressionsvektoren, die eine DNA enthalten, die die Aminosäuresequenz von TCF-II codiert, mit den TCF-II- Expressionsplasmiden transformierte Zellen und ein Produktionsverfahren für rTCF-II oder einen rekombinanten Hepatozyten-Wachstumsfaktor unter Verwendung der transformierten Zellen bereitzustellen.
Die vorliegende Erfindung wurde durch Erledigen der vorstehenden Aufgaben durchgeführt. Zuerst betrifft die vorliegende Erfindung einen Expressionsvektor, wie in Anspruch 1 definiert. Der Vektor enthält eine DNA, die die Aminosäuresequenz von TCF-II codiert. Expressionsvektoren sind beispielsweise pcDNA I (Invitrogen), pMNSM (Tsuchiya et al., Biochemical and Biophysical Research Communication 158, 576 bis 583 (1989)) etc. Der erfindungsgemäße Expressionsvektor wird im allgemeinen gemäß den folgenden Methoden konstruiert. Die TCF-II-cDNA, die in das pUC18-Plasmid (Nippon Gene) wie vorstehend genannt subcloniert wurde, wird aus dem Plasmid unter Verwendung von Restriktionsen zymen herausgeschnitten. Andererseits wird beispielsweise ein Plasmidfragment aus dem Expressionsvektor pcDNA I (Invitrogen) unter Verwendung von Restriktionsenzymen ausgeschnitten. Dann wird das TCF-II-Expressionsplasmid durch Ligierung beider Fragmente unter Verwendung einer Ligase und durch Insertieren des TCF-II-cDNA-Fragments in das pcDNA-I-Fragment codiert. Um TCF-II-cDNA, Plasmidfragmente etc. herauszuschneiden, werden verschiedene Arten von Restriktionsenzymen, deren Verwendung gut bekannt ist, insbesondere Bam HI, Sph I etc., bevorzugt als Restriktionsenzyme verwendet. T&sub4;-DNA-Ligase ist als Ligase ebenfalls bevorzugt. Das Ausschneiden der Plasmidfragmente und ihre Ligierungen können gemäß Verfahren durchgeführt werden, die gut bekannt und etabliert sind. Erfindungsgemäß kann das Plasmid pcDTCFdh für die TCF-II-Expression in großer Menge, die rTCF-II-Expression in großer Menge erzielen kann, gemäß dem in Fig. 4 gezeigten Verfahren konstruiert werden.
Das Maus-DHFR-Expressionplasmid pAdD26SVpA(3) (Proc. Natl. Acad. Sci USA 82, 689 bis 693 (1985)) wurde getrennt davon mit den Restriktionsenzymen EcoR I und BamH I und mit den Restriktionsenzymen BamH I und Pst I gespalten. Nach Elektrophorese der separat gespaltenen Plasmide unter Verwendung von ME-Agarosegel (1%, TAKARA SHUZO) wurden 1,8 kb und 0,5 kb DNA-Fragmente von jedem Plasmid unter Verwendung von jeweils DE-81-Papier (Whatman) isoliert. Das Maus-DHFR-Expressionsplasmid, pBAdDSV, wurde durch Vermischen der beiden DNA-Fragmente (1,8 kb und 0,5 kb DNAs) mit Bluescript SK &spplus; (Stratagene), die mit EcoR I und Pst I gespalten worden waren, und durch deren Ligierung unter Verwendung von T4-DNA-Ligase konstruiert. Das Plasmid für die TCF-II-Expression in einer großen Menge, pcDTCFdh, das eine TCF-II-Expression in einer großen Menge erzielen kann, wurde durch Insertieren des 2,4 kb DNA-Fragments, das von dem Plasmid pBAdDSV erhalten worden war, das mit Nae I gespalten worden war und mit dem Klenow-Fragment glattendig gemacht wurde, in das TCF-II-Expressionsplasmid (Fig. 2, 6,3 kb) unter Verwendung von T&sub4;-DNA-Ligase, erhalten.
Das so erhaltene Plasmid, pcDTCFdh, enthält die TCF-II- Expressionseinheit, die aus dem Cytomegalievirus-Promotor und der TCF-II-cDNA besteht, die zwischen dem Promotor und den Spleiß- und den Polyadenylierungsstellen lokalisiert ist, die aus dem frühen SV40-Gen stammen, und der Maus- DHFR-Expressionseinheit, die aus dem späten Adenovirus- Promotor und dem Maus-DHFR-Gen besteht, das zwischen dem Promotor und der Polyadenylierungsstelle aus dem frühen SV40-Gen lokalisiert ist.
Das so erhaltene TCF-II-Expressionsplasmid wird unter Verwendung von Escherichia coli (E. coli) amplifiziert und aus aus E. coli gereinigt. Verschiedenen Arten von E. coli, wie MC1061/P3 etc., die im Handel erhältlich sind, können verwendet werden. Das Plasmid wird selektiert und durch Züchten von E. coli mit dem Plasmid in dem Medium, das Ampicillin etc. enthält, amplifiziert und dann aus dem E. coli gereinigt. Eine Transformante, die durch Transfektion von E. coli, MC1061/P3 mit dem Expressionsplasmid (Fig. 2) gemäß der Erfindung erhalten worden war, wurde bei dem Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-3479 hinterlegt.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch transformierte Säugerzellen, die durch Transfektion von Zellen mit dem erhaltenen TCF-II-Expressionsplasmid erhalten wurden. Säugerzellen, wie Cos-1-, CHO-, Namalwa-, Φ 2-, NIH 3T3-, BHK-Zellen etc., werden bevorzugt verwendet. Die Transfektion kann nach den üblicherweise verwendeten Verfahren, wie Calciumphosphat, DEAE-Dextran, Lipofectin, Elektroporationsmethoden etc., durchgeführt werden.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung die Produktion des Glykoproteins mit der Bezeichnung TCF-II und mit den Eigenschaften a. bis i. wie vorstehend und in Anspruch 6 dargelegt, durch Züchten der so erhaltenen transformierten Zellen und Reinigung des Glykoproteins aus der Kulturbrühe. Die Züchtung kann nach dem in der WO90/10651 beschriebenen Verfahren durchgeführt werden. D. h., die transformierten Säugerzellen werden im Medium mit Serum oder ohne Serum gezüchtet. Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM), das 5% Serum neugeborener Kälber enthält, wird als das repräsentative Medium angegeben. Aminosäuren, Transferin, Fettsäuren und Hormone, wie Insulin etc., können dem Medium gegebenenfalls zugesetzt werden.
Die Zellen werden in dem Medium gezüchtet, und eine Standkultur unter Verwendung von T-Kolben etc., eine schwimmende Kultur unter Verwendung von Mikroträgern und eine kontinuierliche Kultur unter Verwendung einer Hohlfaser oder eines keramischen Trägers können als Kultursysteme angepaßt werden. Es ist bevorzugt, daß die Züchtung in einer Atmosphäre mit 5% CO&sub2; bei 20 bis 37ºC als Kulturbedingungen durchgeführt wird, und daß das Medium alle 2 bis 3 Tage ausgetauscht wird. Nachdem die Zelldichte das Optimum erreicht, wird das Medium alle 7 bis 10 Tage ausgetauscht, und die Kulturbrühe wird gewonnen. Das erwünschte Glykoprotein wird aus der gewonnen Kulturbrühe gereinigt. Die Kulturbrühe wird etwa 10fach durch Ultrafiltration (UF) unter Verwendung einer Membrane mit einer Porengröße mit einem MG von 6000 konzentriert. Das gewünschte Glykoprotein in dem UF-Konzentrat wird an Kationenaustauscherharze adsorbiert und dann aus den Harzen mit Puffern, die 0,3 bis 0,6 M NaCl enthalten, eluiert. CM-Sephadex-C-50 (Pharmacia) etc. kann als Ionenaustauscherharz angegeben werden. Die eluierten Fraktionen, die eine potente Hepatozyten-wachstumsstimulierende Aktivität oder cytotoxische Aktivität gegen Maus-L929-C18-Zellen besitzen, werden gewonnen und anschließend auf eine Affinitätschromatogra phiesäule für Glykoprotein aufgebracht. Con-A-Sepharose (Pharmacia) ist besonders geeignet für die Affinitätschromatographie für das erwünschte Glykoprotein. Die Affinitätssäule wird mit 0,05 M Tris-HCl-Puffer, pH 7,0, der 0,5 M NaCl enthält, equilibriert und dann wird die vorstehend genannte gewonnene aktive Fraktion auf die Säule aufgebracht. Nach Waschen der Säule mit Equilibrierungspuffer wird das aktive Material von der Säule mit einem Elutionspuffer, der Kohlenhydrat entsprechend der an die Säule adsorbierten Kohlenhydratkette des Glykoproteins enthält, eluiert. Wenn die vorstehend genannte Con-A-Sepharose verwendet wird, wird das aktive Material mit dem Puffer, der α-Methyl-D-mannopyranosid enthält, eluiert. Die eluierte aktive Fraktion wird gegen Wasser dialysiert und dann lyophilisiert. Das lyophilisierte aktive Material wird mit 0,05 M Tris-HCl, pH 6,0 bis 7,0, der 0,2 M NaCl enthält, rekonstituiert und weiter über HPLC unter Verwendung einer Säule, die mit starken Kationenaustauscherharzen gepackt ist, gereinigt. Die Mono-S-Säule (Pharmacia) eignet sich besonders als Säule mit starken Kationenaustauscherharzen für die HPLC. Die Elution des aktiven Materials von der Mono-S-Säule wird unter Verwendung eines linearen Gradienten von 0 bis 1,0 M NaCl durchgeführt, und die aktiven Fraktionen werden gewonnen. rTCF-II wird bei einer NaCl- Konzentration von 0,6 bis 0,9 M eluiert. Die so erhaltene aktive Fraktion wird weiter mittels Affinitätschromatographie unter Verwendung von Heparin-Sepharose (Pharmacia) gereinigt. Die Elution des aktiven Materials von der Heparin-Sepharose-Säule wird durch einen linearen Gradienten von 0,3 bis 2,0 M NaCl durchgeführt, und das erwünschte Material wird bei einer NaCl-Konzentration von 1,0 bis 1,5 M eluiert. Anschließend wird der Test auf die Hepatozytenwachstumsstimulierende Aktivität von rTCF-II wie nachstehend erwähnt durchgeführt.
Die Hepatozyten wurden von männlichen Wistar-Ratten nach dem Verfahren von Segren (Method in Cell Biology, Bd. 13, S. 29, Academic Press, New York, 1976) entnommen. Die so erhaltenen Hepatozyten wurden in jede Vertiefung von Plastikplatten mit 24 Vertiefungen (Falcon) mit einer Zelldichte von 8,8 · 10&sup4; Zellen/0,5 ml/Vertiefung ausgebracht und unter der Anwesenheit von 5% CO&sub2; bei 37ºC gezüchtet. William-E-Kulturmedium (Flow Laboratory), das mit 10% Serum neugeborener Kälber (Hyclone), 10 uM Dexamethason, 100 E/ml Penicillin und 100 ug/ml Streptomycin supplementiert war, wurde als Kulturmedium (nachstehend als basales Kulturmedium abgekürzt) verwendet. Nach 24stündiger Inkubation bei 37ºC wurde das Kulturmedium gegen das basale Kulturmedium, das die Testproben enthielt, ausgetauscht. Nach weiterer Züchtung der Hepatozyten für 24 Stunden wurde die Kulturbrühe gegen das basale Kulturmedium, das 4 uCi/ml (86 Ci/mmol) ³H-Thymidin (Amersham) enthielt, ausgetauscht. Nach 2stündiger Züchtung wurde die DNA-Synthese der Zellen bestimmt. Bei der Markierung der Zellen mit ³H- Thymidin wurden die eingebauten Radioaktivitäten (dpm) als Unterschied der Radioaktivitäten (dpm), die zwischen der Anwesenheit und der Abwesenheit von 10 mM Hydroxylharnstoff in jeder Testprobe gemessen wurden, definiert. Nach zweimaligem Waschen der Zellen mit kalter PBS, 10%iger Perchlorsäure bzw. 95% Ethanol und Lufttrocknen wurden die Zellen in 0, 8 ml 10% SDS, das 10 mM MgCl&sub2; enthielt, solubilisiert, und anschließend wurden die Radioaktivitäten unter Verwendung eines Flüssigszintillationszählers bestimmt.
Die repräsentativen Hepatozyten-wachstumsstimulierende Aktivität von rTCF ist in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1
hEGF (WAKUNAGA Pharmaceutical Co.) wurde als positive Kontrolle für die Hepatozyten-wachstumsstimulierende Aktivität verwendet. Die Ergebnisse in Tabelle 1 zeigen an, daß rTCF-II bezüglich der Hepatozyten-wachstumsstimulierenden Aktivität stärker als hEGF ist.
rTCF-II bei der vorliegenden Erfindung ist als Hepatozyten-Wachstumsfaktor, Antitumorfaktor, Leukämie-Differenzierungsinduzierender Faktor und endothelialer Zellfaktor nützlich.

Kurze Beschreibung der Figuren

Die Fig. 1a und 1b zeigen die gesamte primäre Aminosäuresequenz von TCF-II und die Nukleotidsequenz der DNA, die die Aminosäuresequenz codiert.
Die Fig. 2 zeigt eine schematische Darstellung des Verfahrens zur Konstruktion des TCF-II-Expressionsplasmids gemäß der Erfindung.
Die Fig. 3 zeigt die Expression der TCF-II-cDNA. In der Figur zeigen - O - und - - die HGF-Aktivitäten in der Kulturbrühe von Cos-1-Zellen ohne TCF-II-cDNA bzw. mit TCF-II-cDNA an.
Die Fig. 4 zeigt eine schematische Darstellung des Verfahrens zur Konstruktion des Plasmids für die TCF-II- Expression in großer Menge.
Die Fig. 5 zeigt die CM-Sephadex-C-50-Säulenchromatographie der Kulturbrühe (die 5% CS enthielt) von transformierten Namalwa-Zellen mit dem TCF-II-Expressionsplasmid. In der Figur zeigen (1) und (2) die Fraktionen, die mit 0,05 M Tris-HCl-Puffer (pH 6,8 bis 7,0), der 0,3 M NaCl und 0,01% Tween 20 enthält, bzw. mit 0,05 M Tris-HCl- Puffer (pH 7,0), der 0,6 M NaCl und 0,01% Tween 20 enthält, eluiert wurden. - O - und - - zeigen die optische Dichte bei 280 nm (OD 280 nm) bzw. die cytotoxische Aktivität gegen L929-C18-Zellen.
Die Fig. 6 zeigt die Con-A-Sepharose-CL-6B-Affinitätschromatographie der eluierten rTCF-II-Fraktion (Fraktion eluierte bei 0,6 M NaCl) aus einer cm-Sephadex-C-50- Chromatographie. In der Figur zeigen (1) und (2) die Fraktionen, die mit 0,05 Tris-HCl-Puffer (pH 7,0), der 0,5 M NaCl enthält, bzw. mit 0,05 M Tris-HCl-Puffer (pH 7,0), der 0,5 M NaCl, 0,01% Tween 20 und 0,2 M α-Methyl-Dmannopyranosid enthält, eluiert wurden. - O - und - - bezeichnen die optische Dichte (OD 280 nm) bzw. die cytotoxische Aktivität gegen L929-C18-Zellen.
Die Fig. 7 zeigt die Mono-S-HPLC der eluierten rTCF-II- Fraktion von Con-A-Sepharose CL-6B-Affinitätschromatographie. In der Figur bezeichnen, , - - und ---- die optische Dichte (OD 280 nm), die cytotoxische Aktivität gegen L929-C18-Zellen bzw. einen linearen Gradienten der NaCl-Konzentration.
Die Fig. 8 zeigt die Heparin-HPLC der eluierten rTCF-II- Fraktion von Mono-S-HPLC. In der Figur bezeichnet , - und ---- die optische Dichte (OD 280 nm), die cytotoxische Aktivität bzw. den linearen Gradienten der NaCl- Konzentration.
Die Fig. 9 zeigt die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese von gereinigtem rTCF-II (unter nichtreduzierenden und reduzierenden Bedingungen).
Die Fig. 10 zeigt die cytotoxischen Aktivitäten von rTCF- 11 gegen verschiedene Tumorzellinien. In der Figur bezeichnen - -, - -, - Δ - und - O - die cytotoxischen Aktivitäten von rTCF-II gegen Sarkom 180-, Meth- A-Sarkom-, KB- bzw. IMR-90-Zellen.
Die Fig. 11 zeigt die Hepatozyten-wachstumsfaktorstimulierende Aktivität von rTCF-II.

Die beste Form, die Erfindung auszuführen

Anschließend wird die vorliegende Erfindung konkret näher beschrieben, wie in den folgenden Beispielen gezeigt ist.

BEISPIEL 1

(1) Konstruktion des TCF-II-Expressionsplasmids

TCF-II-cDNA (Fig. 1), die in das pUC-18-Plasmid (Nippon Gene) wie in Fig. 2 gezeigt, subcloniert wurde, und das DNA-Fragment des pcDNA-I-Expressionsvektors (Invitrogen) wurden durch die folgenden Restriktionsenzymbehandlungen ausgeschnitten, und ihre DNA-Fragmente wurden erhalten.
1 ug pUC18-Plasmid, das eine Insertion der TCF-II-cDNA hatte, und 1 ug pcDNA-I-Plasmid wurden getrennt in 10 ul 20 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,5, der 10 mM MgCl&sub2;, 1 mM Di thiothreit und 100 mM KCl enthielt, aufgelöst. Die so erhaltenen Lösungen wurden mit jeweils einer Einheit der Restriktionsenzyme BamH I und Sph I bei 37ºC für eine Stunde gespalten. Nach den Spaltungen wurde das TCF-II-cDNA- Fragment mit etwa 2,3 kb und das pcDNA-I-Fragment mit etwa 4,0 kb durch ME-Agarosegelelektrophorese (1%, TAKARA SHUZO) getrennt bzw. unter Verwendung von DE81-Papier (Whatman) gewonnen.
Anschließend wurde das TCF-II-cDNA-Fragment in das pcDNA- I-Fragment durch die folgenden Reaktionen insertiert.
100 ng TCF-II-cDNA-Fragment und 50 ng pcDNA-I-Fragment wurden in 10 ul 60 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,6, der 1 mM ATP, 1 mM Spermidin, 10 mM MgCl&sub2; und 15 mM DTT enthielt, aufgelöst und anschließend durch Inkubieren des Gemisches mit 300 Einheiten der T&sub4;-DNA-Ligase bei 15ºC über Nacht ligiert.
Anschließend wurde eine Transformante mit dem TCF-II-cDNA- Expressionsplasmid durch Transfektion von E. coli, MC1061/P3 mit der vorstehend genannten Reaktionslösung gemäß dem üblicherweise verwendeten Verfahren erhalten.
Diese Transformante wurde bei dem Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-3479 hinterlegt. Das konstruierte TCF-II-Expressionsplasmid ist in Fig. 2 gezeigt.

(2) Herstellung und Reinigung des TCF-II-Expressionsplasmids

Der vorstehend genannte transformierte E. coli wurde in einem Liter L-Medium, das 25 ug/ml Ampicillin enthielt, gezüchtet und weiter über Nacht durch Zugabe von Chloramphenicol zu der Kultur in einer Endkonzentration von 170 ug/ml gezüchtet, bis der OD660nm-Wert der Kulturbrühe 0,8 erreichte. Das TCF-II-Expressionsplasmid wurde mittels CsCl-Dichtegradienten-Ultrazentrifugation nach Behandlungen des Plasmids mit Alkali und Polyethylenglykol gemäß dem Verfahren von Maniatis et al. (Molecular cloning, 2. Auflage) gereinigt.

(3) Transformation der Säuqerzellen mit dem TCF-II- Expressionsplasmid

Gemäß dem Verfahren von Parker et al. (J. Virology 31, 360 bis 369 (1979)) wurde das TCF-II-Expressionsplasmid in Cos-I-Zellen nach dem Calciumphosphat-Verfahren transfiziert. Als negative Kontrolle wurde pcDNA I allein in Cos- I-Zellen auf gleiche Weise transfiziert.

(4) Bestätigung der rTCF-II-Expression

Um die Expression von biologisch aktivem rTCF-II zu bestätigten, wurde die Ratten-Hepatozyten-wachstumsstimulierende Aktivität, die als Indikator für die Expression von rTCF-II verwendet wurde, im Kulturüberstand von Cos- I-Zellen bei 72stündiger Inkubation nach Transformation der Zellen mit dem TCF-II-Expressionsplasmid untersucht. Die DNA-Synthese der Ratten-Hepatozyten wurden durch Einbau von ³H-Thymidin in DNA gemäß dem Verfahren von Gohda et al. (J. Clin. Invest. 81, 414 bis 419 (1988)) gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 gezeigt. Wie in Fig. 3 gezeigt, wurde die Ratten-Hepatozyten-wachstumsstimulierende Aktivität in dem Kulturüberstand von Cos-I-Zellen bei 72stündiger Inkubation nach Transformation der Zellen mit dem TCF-II-Expressionsplasmid nachgewiesen, und dadurch wurde die Expression von rTCF-II bestätigt. Die Ratten- Hepatozyten-wachstumsstimulierende Aktivität wurde in dem Kulturüberstand von Cos-I-Zellen, die nur mit dem pcDNAI-Vektor transfiziert wurden, nachgewiesen.

BEISPIEL 2

(1) Konstruktion des Plasmids für die TCF-II-Expression in großer Menge

Das Maus-DHFR-Expressionsplasmid, pAD26SVpA(3) (Proc. Natl. Acad. Sci USA 82, 689 bis 693 (1985)) wurde separat mit den Restriktionsenzymen EcoR I und BamH I und mit den Restriktionsenzymen BamH I und Pst I gespalten. Nach der separaten Elektrophorese der gespaltenen Plasmide unter Verwendung von ME-Agarosegel (1%, TAKARA SHUZO) wurden 1,8 kb DNA und 0,5 kb DNA-Fragmente von jedem Plasmid unter Verwendung von DE-81-Papier (Whatman) jeweils isoliert. Das Maus-DHFR-Expressionsplasmid, pBAdSV, wurde durch Mischen der beiden DNA-Fragmente (1,8 kb und 0,5 kb DNAs) mit Bluescript SK &spplus; (Stratagene), der mit den Restriktionsenzymen EcoR I und Pst I gespalten worden war, und durch deren Ligierung unter Verwendung von T&sub4;-DNA-Ligase gemäß dem in BEISPIEL 1 gezeigten Verfahren konstruiert.
Das pBAdDSV-Plasmid wurde mit den Restriktionsenzymen EcoR I und Spe I gespalten. Nach Trennung durch Elektrophorese wurde das gespaltene Fragment (EcoR I - Spe I, 2,4 kb) unter Verwendung von DE-81-Papier (Whatman) gewonnen und mit dem Klenow-Fragment glattendig gemacht. Das Plasmid pcDTCFdh für die TCF-II-Expression in großer Menge wurde durch Insertieren des 2,4 kb-Fragments von dem Plasmid pBAdDSV in das TCF-II-Expressionsplasmid (Fig. 2, 6,3 kb), das mit Nae I gespalten worden war, unter Verwendung von T&sub4;-DNA-Ligase erhalten. Das so erhaltene Plasmid pcDTCFdh enthält die TCF-II-Expressionseinheit, die aus dem Cytomegarovirus-Promotor und der TCF-II-cDNA, die zwischen dem Promotor und den Spleiß- und Polyadenylierungsstellen aus dem frühen SV40-Gen liegt, und aus der Maus- DHFR-Expressionseinheit, die aus dem späten Adenovirus- Promotor und dem Maus-DHFR-Gen, das zwischen dem Promotor und der Polyadenylierungsstelle aus dem frühen SV40-Gen lokalisiert ist, besteht.

(2) Transformation von Namalwa-Zellen mit dem TCF-II- Expressionsplasmid und Expression des TCF-II-Gens

Namalwa-Zellen, ATCC CRL 1432, wurden mit dem Plasmid pcDTCFdh zur TCF-II-Expression in großer Menge nach dem Lipofectin-Verfahren (Focus 11 (2), 37 (1989)), wie nachstehend beschrieben, transformiert.
Die Plasmid-DNA-Lösung wurde durch Auflösen von 10 ug des Plasmids pcDTCFdh und 1 ug des Plasmids pMCIneo in 10 ul TE-Puffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,5) und Zugabe von 1,5 ml OPTI-MEM (GIBCO) zu dieser DNA-Lösung hergestellt. Die Lipofectin-Lösung wurde durch Zugabe von 0,1 ml Lipofectin (1 ug/ml, BRL) zu 1,4 ml OPTI-MEM gemäß dem Protokoll von BRL hergestellt. Namalwa-Zellen, 1 · 10&sup7;-Zellen wurden in 0,3 ml OPTI-MEM suspendiert. 1,5 ml Lipofectin- Lösung und 0,3 ml Namalwa-Zellsuspension wurden zu 1,5 ml der vorstehend, genannten Plasmid-DNA-Lösung gegeben. Nach deren sanften Vermischen durch Pipettieren wurde ein Gemisch in einem T-Kolben (25 cm², SUMITOMO BAKELITE Co.) überführt und in einem CO&sub2;-Inkubator 4 Stunden inkubiert und anschließend mit 7 ml Kulturmedium (RPMI 1640, enthaltend 10% FCS) versetzt und über Nacht inkubiert. Die Zellen wurden 3 Tage durch Austauschen der Kulturbrühe gegen Kulturmedium inkubiert und weitere 2 Wochen durch Austauschen der Kulturbrühe gegen das Kulturmedium, das 500 ug/ml G418 (SIGMA) enthielt, inkubiert. G418-resistente Zellen, die von der vorstehenden Kultur erhalten worden waren, wurden in α-MEM (GIBCO), das 50 nM Methotrexat (MTX) und 10% dialysiertes FCS enthielt, suspendiert, in jede Vertiefung einer Mikroplatte mit 96 Vertiefungen mit einer Zelldichte von 5000 Zellen/Vertiefung inokuliert und 2 Wochen inkubiert. Große Mengen TCF-II-produzierende Stämme unter den erhaltenen MTX-resistenten Stämmen wurden durch einen ELISA abgesucht. Ein große Menge TCF-II produzierender Clon, G&sub2;H&sub3;C&sub2;, wurde durch Clonieren der erhaltenen, den TCF-II in großen Mengen produzierenden Zellen unter Verwendung von RPMI-1640-Medium, das 10% FCS und 10% Hybridoma-Clonierungsfaktor (Origen) enthielt, nach dem Grenzverdünnungsverfahren und durch Absuchen der den TCF- II in großen Mengen produzierenden Clone mittels ELISA erhalten. Die Produktivität von TCF-II in dem Kulturüberstand dieses Clons betrug etwa 1,0 mg/l. Dieser Clon G&sub2;H&sub3;C&sub2; wurde bei Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-3480 hinterlegt.

(3) Reinigung von rTCF-II

1) Züchtung transformierter Namalwa-Zellen (G&sub2;H&sub3;C&sub2;)

Die transformierten Namalwa-Zellen wurden mit einer Zelldichte von 4 · 10&sup5; Zellen/ml in 2,5 l RPMI-1640-Medium, das 5% Kälberserum (CS) enthielt, inokuliert und bei 37ºC inkubiert. 20l Kulturbrühe wurden nach dem Feed-batch- Kulturverfahren erhalten, bei dem 2,5 l des gleichen Mediums alle zwei Tage der Inkubation bei 37ºC zugegeben wurden.

2) Assay auf die rTCF-II-Aktivität

Maus-L929-Zellen (ATCC CCL1) wurden subcloniert, und ein Subclon, L929-C18, mit der größten Empfindlichkeit gegenüber TCF-II wurde ausgewählt. L929-C18-Zellen wurden bis zur Konfluenz in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), das 10% FCS enthielt, gezüchtet, und dann wurden die Zellen durch Trypsinbehandlung geerntet. Die Zellen wurden mit einer Zelldichte von 6 · 10&sup5; Zellen/ml in DMEM, das 10% FCS und. 1 ug/ml Actinomycin D enthielt, suspendiert. 50 ul DMEM, das auf gleiche Weise wie die Zellsuspension hergestellt worden war, wurden jeder Vertiefung einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen (Falcon, 3072) zugesetzt, und 50 ul der Probenlöslung, die durch Auflösen oder Verdünnen der Probe, die rTCF-II gemäß der Erfindung in oder mit dem gleichen DMEM enthielt, wurden der Vertiefung mit der ersten Verdünnung zugesetzt. Beide wurden gemischt, und 50 ul des Gemisches wurden anschließend der Vertiefung mit der zweiten Verdünnung zugesetzt und gut gemischt. Eine stufenweise verdünnte Probe wurde durch Wiederholen der vorstehenden Verfahren hergestellt. 50 ul der Zellsuspension wurden in jede Vertiefung, die eine stufenweise verdünnte Probe enthielt, inokuliert, und die Zellzüchtung wurde bei 37ºC 2 Tage in einem CO&sub2;-Inkubator durchgeführt. Nach Inkubation wurde das Medium sanft entfernt, und die Zellen wurden zweimal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Die lebensfähigen Zellen, die an jeder Vertiefung hafteten, wurden fixiert und durch Zugabe von 50 ul 0,5% Kristallviolett in einem Gemisch aus Methanol und Wasser (1:4) zu jeder Vertiefung angefärbt. Jede Vertiefung wurde mit destilliertem Wasser gewaschen und luftgetrocknet. Das Kristallviolett in jeder Vertiefung wurde mit Sorensons-Puffer (ein Gemisch aus 6,1 ml 0,1 M Dinatriumcitrat, 3,9 ml 0,1 N HCl und 10 ml Ethanol) extrahiert. Die Absorption der Extrakte bei 570 nm wurde durch ein Mikrotiter-Spektrophotometer gemessen.
Die Einheiten von TCF-II (E/ml) wurden als Verdünnungsverhältnis bei 50% Zelltod definiert.

3) Reinigung von rTCF-II

20 l der in 1) beschriebenen Kulturbrühe wurden auf pH 6,2 bis 7,0 eingestellt, 1,5 kg Nettogewicht cm Sephadex C-50, das mit 0,05 Tris-HCl-Puffer, pH 7,0, equilibriert worden war, wurden zu der vorstehend genannten Kulturbrühe gegeben, und das gewünschte Material wurde an das Harz durch sanftes Rühren bei 4ºC für 24 Stunden in einem pH-Bereich von 6,5 bis 7,0 adsorbiert. Nach der Adsorption wurden die Harze durch Filtration über ein Whatman Nr. 2-Filterpapier auf einem Buchner-Trichter gewonnen. Die gewonnenen Harze wurden mit 0,05 M Tris-HCl-Puffer, pH 7,0, gewaschen. Etwa 1500 g der gewaschenen Harze wurden in eine Säule ( 7 · 40 cm) gepackt, und die Säule wurde mit 0,05 M Tris-HCl- Puffer, pH 7,0, der 0,01% Tween 20 und 0,3 M NaCl enthielt, eluiert. Die Elution des Proteins wurde durch Absorption bei 280 nm überwacht. Als das Protein fast vollständig eluiert war, wurde die Säule weiter mit einer Salzkonzentration von 0,6 M NaCl in dem gleichen Puffer eluiert. Die cytotoxische Aktivität gegen die L929-C18- Zellen in jeder Fraktion wurde bestimmt. Das so erhaltene Elutionsprofil ist in Fig. 5 gezeigt. Die Fraktion, die bei einer Salzkonzentration von 0,6 M NaCl eluierte, zeigte eine potente cytotoxische Aktivität. Diese Fraktion wurde als rTCF-II-Fraktion bezeichnet. Dann wurde Con-A- Sepharose CL-6B (Pharmacia) mit 0,05 M Tris-HCl-Puffer, pH 7,0, der 0,5 M NaCl, 1 mM CaCl&sub2; und 1 mM MgCl&sub2; enthielt, equilibriert, und das Gel wurde in die Säule gepackt ( 2,5 · 8 cm):
Die Säule wurde gut mit dem gleichen Puffer gewaschen. Die rTCF-II-Fraktion (pH 7,0), die aus der cm-Sephadex-C-50- Chromatographie erhalten worden war, wurde auf die Säule geladen. Nach erneutem Waschen der Säule mit 0,05 M Tris- HCl-Puffer, pH 7,0, der 0,5 M NaCl enthielt, mit 10fachem Säulenbettvolumen wurde das gewünschte Material mit 0,05 M Tris-HCl-Puffer, pH 7,0, der 0,5 M NaCl und 0,3 M α- Methyl-D-mannopyranosid enthielt, mit einer Fließgeschwindigkeit von 70 ml/h eluiert.
Die Elution des Proteins wurde durch die optische Absorption bei 280 nm überwacht, und die cytotoxische Aktivität in jeder Fraktion wurde bestimmt. Das so erhaltene Elutionsprofil ist in Fig. 6 gezeigt. Die Fraktionen, die zuerst eluierten, wurden gewonnen. Die gewonnene Fraktion wurde mit 0,01 M Phosphatpuffer, pH 7,0, verdünnt, um eine Endkonzentration an NaCl von weniger als 0,3 M zu ergeben. Die verdünnte Fraktion, die auf pH 6,5 bis 7,0 eingestellt wurde, wurde auf eine Mono-S-Säule (Pharmacia) für die HPLC geladen, die mit 0,01 M Phosphatpuffer, pH 7,0, der 0,01% Tween enthielt, equilibriert worden war. Nach dem Beladen wurde die Säule mit 0,01 M Phosphatpuffer, pH 7,0, der 0,01% Tween 20 enthielt, 20 min bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml/min gewaschen und dann mit einem linearen Gradienten von 0 bis 1,0 M NaCl 60 min mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml/min eluiert. Das so erhaltene Elutionsprofil ist in Fig. 7 gezeigt. Die aktive Fraktion wurde bei 0,76 M NaCl eluiert. Um die Reinheit zu erhöhen, wurde die gewonnene aktive Fraktion wie vorstehend genannt verdünnt und erneut auf eine Mono-S-Säule geladen. Die Elution wurde erneut mit den Gradienten von 0 bis 1,0 M NaCl durchgeführt. Die aktiven Fraktionen wurden gewonnen. Die so erhaltene aktive Fraktion, die mit 10 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5, der 0,01% Tween 20 enthielt, bis zu einer Endkonzentration an NaCl von 0,3 M verdünnt worden war, wurde auf einer Heparinsäule für HPLC (TOSO) geladen, die mit 10 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5, der 0,3 M NaCl und 0,01% Tween 20 enthielt, equilibriert worden war. Nach dem Beladen wurde die Säule mit 10 mM Tris-HCl- Puffer, pH 7,5, der 0,3 M NaCl und 0,01% Tween 20 enthielt, für 20 min mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml/min gewaschen. Das aktive Material wurde von der Säule mit einem linearen Gradienten von 0,3 bis 2,0 M NaCl in dem gleichen Puffer für 60 min bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml/min eluiert. Das so erhaltene Elutionsprofil ist in Fig. 8 gezeigt.
So wurde der gereinigte rTCF-II erhalten. 11,6 mg des aktiven Proteins wurden aus 20 l Kulturbrühe erhalten. Eine spezifische Aktivität des gereinigten Proteins bezüglich der cytotoxischen Aktivität betrug etwa 5,3 · 10&sup6; Einheiten/mg Protein.

(4) Physikalisch-chemische Eigenschaften von rTCF-II

Die physikalisch-chemischen Eigenschaften von rTCF-II, der gemäß den vorstehend genannten Verfahren erhalten wurde, sind wie folgt:

1 Bestimmung des Molekulargewichts in der SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Das Molekulargewicht von rTCF-II wurde durch Elektrophorese unter Verwendung von Polyacrylamidgel, das 0,1% SDS enthielt, bestimmt. Das SDS-Elektrophoresemuster von rTCF- 11 ist in Fig. 9 gezeigt. rTCF-II zeigte zwei benachbarte Banden mit 78.000 ± 2000 und 74.000 ± 2000 unter nichtreduzierenden Bedingungen. Unter reduzierenden Bedingungen trennte sich die rTCF-II in drei Polypeptidbanden aus einer gemeinsamen Bande A mit einem MG von 52.000 ± 2000, Bande B mit einem MG von 30.000 ± 2000 und Bande C mit einem MG von 26.000 ± 2000.

2 Wert des isoelektrischen Punkts

Die Werte des isoelektrischen Punkts von rTCF-II wurden als 7,4 bis 8,6 mittels isoelektrischer Fokussierung unter Verwendung der LKB-Elektrophoreseausrüstung von Phast Gel IEF3-9 bestimmt.

3 Wärmestabilität

rTCF-II wurde in 0,1 M Tris-HCl-Puffer, pH 7,5, der 0,01% Tween 20 enthält, in einer Konzentration von 600 E/ml aufgelöst. Die rTCF-II-Lösung wurde 10 min bei 25, 35, 50, 60, 70, 80, 90 und 95ºC stehengelassen. Der Rest Aktivität nach der Wärmebehandlung bei jeder Temperatur wurde als relative Aktivität (%) gegen die Aktivität (100%) der Kontrolle geschätzt, die bei 25ºC stehengelassen wurde. rTCF- II war bis 60ºC stabil.

4 pH-Stabilität

Jeder in Tabelle 2 gezeigte Puffer, der 0,01% Tween 20 enthält, wurde hergestellt. rTCF wurde in jedem Puffer (Tabelle 2) in einer Endkonzentration von 600 E/ml aufgelöst und bei 37ºC 1 Stunde stehengelassen. Die verbleibende cytotoxische Aktivität wurde als relative Aktivität (%) gegen die Aktivität (100%) der Kontrolle gemessen, die bei pH 8,0 bei Raumtemperatur 1 Stunde stehengelassen wurde. rTCF-II war im Bereich von pH 6,0 bis 9,0 stabil.

Tabelle 2 Puffer

pH 1 ~ 3 1/10 M Glycin - HCl
pH 4 ~ 6 1/10 M Acetatpuffer
pH 7 ~ 8 1/10 M Tris - HCl
pH 9 ~ 12 1/10 M Glycin - NaOH

5 N-terminale Aminosäuresequenz

100 ug rTCF-II wurden reduziert, und drei Polypeptide, A mit einem MG von 52.000, B mit einem MG von 32.000 und C mit einem MG von 28.000, wurden nach dem Elektroblot- Verfahren getrennt. Die N-terminale Aminosäuresequenz jedes Polypeptids wurde unter Verwendung eines Applied Biosystems 477 A Protein Sequenators analysiert. Die Nterminale Aminosäuresequenz des Polypeptids A konnte nicht bestimmt werden, weil dessen N-Terminus blockiert war. Die Polypeptide B und C hatten die gleiche N-terminale Aminosäuresequenz wie folgt:
Asn (SEQ ID No.: 8)
Da Polypeptid B und C die gleiche N-terminale Aminosäuresequenz zeigen, scheint rTCF-II eine heterodimere Struktur zu besitzen, in der das Polypeptid A mit einem MG von 52.000 an das Polypeptid B mit einem MG von 32.000 oder an das Polypeptid C mit einem MG von 28.000 über eine Disulfidbrücke gebunden ist.

(5) Biologische Aktivität von rTCF-II

1) Cytotoxische Aktivität gegen einen Tumor

Eine menschliche Tumorzellinie, KB, und Maustumorzellinien, Sarkom 180 und Meth-A-Sarkom, wurden als Zielzellen verwendet. Menschliche embryonale Lungenfibroblasten, IMR- 90-Zellen, wurden ebenfalls als normale Zellen verwendet. KB- und Sarkom-180-Zellen wurden mit einer Zellinie von 1 · 10&sup4; Zellen/ml in DMEM, das 10% FCS enthielt, suspendiert. Meth-A-Sarkom wurde mit einer Zelldichte von 1 · 10&sup4; /ml in RPMI 1640, das 10% FCS enthielt, suspendiert. Normale Zellen, IMR-90, wurden bei einer Zelldichte von 1 · 10&sup5; Zellen/ml in DMEM, das 10% FCS enthielt, suspendiert. 50 ul jeder Zellsuspension wurde jeder Vertiefung in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen mit flachem Boden (Falcon, 3072) zugesetzt.
rTCF-II wurde in DMEM, das 10% FCS enthielt, für KB, Sarkom 180- und IMR-90-Zellen und in RPMI 1640, das 10% FCS enthielt, für Meth-A-Sarkomzellen aufgelöst. Eine reihenverdünnte rTCF-II-Lösung wurde durch Verdünnen der vorstehenden rTCF-II-Lösung mit DMEM oder RPMI 1640 mit 10% FCS hergestellt. 50 ul einer reihenverdünnten rTCF-II-Lösung wurden jeder Vertiefung, die 50 ul jeder Zellsuspension enthielt, zugesetzt, wodurch Endkonzentrationen an rTCF-II von 0, 2, 4, 8, 16, 31, 62, 125, 250, 500 und 1000 ng/ml erhalten wurden. Nach gutem Vermischen wurden die Platten in einem CO&sub2;-Inkubator bei 37ºC 4 Tage inkubiert.
Bezüglich jeder Zellinie wurden die Anzahlen lebensfähiger Zellen in jeder Vertiefung unter Verwendung eines Hämacytometers gezählt. Die Zahlen lebensfähiger Zellen wurden als Mittelwert von doppelten Experimenten ausgedrückt.
Die cytotoxische Aktivität (%) wurde gemäß der folgenden Gleichung berechnet:
Die cytotoxische Aktivität von rTCF-II gegen die getesteten Zellinien ist in Fig. 10 gezeigt. rTCF-II hat eine potente cytotoxische Aktivität gegen Sarkom 180 und Meth- A-Sarkom und ebenfalls eine cytotoxische Aktivität gegen KB. rTCF-II hatte jedoch keine cytotoxische Aktivität gegen normale Zellen, IMR-90.

2) Hepatozyten-wachstumsstimulierende Aktivität

Hepatozyten wurden männlichen Wistar-Ratten mit einem Gewicht von 200 g nach dem Verfahren von Segren (Method lin Cell Biology, Bd. 13, S. 29, Academic Press, New York, 1976) entnommen. Die so erhaltenen Hepatozyten wurden in jede Vertiefung von Platten mit 24 Vertiefungen (Falcon) bei einer Zelldichte von 8,8 · 10&sup4; Zellen/Vertiefung geimpft und bei 37ºC gezüchtet. Ein William-E-Kulturmedium (Flow Laboratory), das mit 10% fötalem Kälberserum (FCS) und 10 uM Dexamethason supplementiert war, wurde als Kul turmedium verwendete (nachstehend als basales Kulturmedium abgekürzt). Nach 24stündiger Inkubation bei 37ºC wurde die Kulturbrühe gegen das basale Kulturmedium, das rTCF-II enthielt, ausgetauscht. Die Hepatozyten wurden weiter 24 Stunden gezüchtet und dann in dem basalen Kulturmedium, das 4 u Ci/ml 3H-Thymidin (Amersham) enthielt, 2 Stunden gezüchtet. Nach Züchten wurden die Zellen zweimal mit kalter PBS, 5% Perchlorsäure bzw. 95% Ethanol gewaschen und an der Luft getrocknet. Die Zellen wurden in 10% SDS- Lösung, die 10 mM MgCl&sub2; enthielt, solubilisiert, und die DNA-Synthese der Zellen wurde durch Messen der Radioaktivitäten unter Verwendung eines Flüssigszintillationszählers bestimmt.
Die das Hepatozyten-wachstumsstimulierende Aktivität von rTCF-II ist in Fig. 11 gezeigt.

Industrielle Anwendbarkeit

Die vorliegende Erfindung betrifft ein ökonomisches Produktionsverfahren in großem Umfang für TCF-II, das durch Konstruktion des TCF-II-Expressionsvektors, der DNA enthält, die die Aminosäuresequenz von TCF-II codiert, und durch Produktion von rTCF-II unter Verwendung der rekombinanten Technik unter Verwendung des Expressionsvektors durchgeführt. Der erfindungsgemäße erhaltene rTCF-II kann auf dem Gebiet der pharmazeutischen Produkte als Hepatozyten-Wachstumsfaktor, als cytotoxischer Tumorfaktor etc. verwendet werden. Ferner kann der erfindungsgemäße rTCF-II als biochemisches oder pharmakologisches Reagens verwendet werden.

Bemerkungen zu den Transformanten

1. pcTCF(s)/MC1061/P3

Hinterlegungsstelle
Name: Fermentation Research Institute; Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry
Adresse: 1-3 Higashi-1 choume, Tsukuba-shi, Ibaragi-ken,
Japan
Hinterlegungsdatum: 13. Juli 1990
Hinterlegungsnummer: FERM BP-3479
[Die Hinterlegung entspricht dem Budapester Vertrag: Überführt von einer Hinterlegung in Japan (Hin- terlegungsnummer, FERM P-11605)]

2. TCdG&sub2;H&sub3;C&sub2;

Hinterlegungsstelle
Name: Fermentation Research Institute; Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry
Adresse: 1-3 Higashi-1 choume, Tsukuba-shi, Ibaragi-ken,
Japan
Hinterlegungsdatum: 10. Juli 1991
Hinterlegungsnummer: FERM BP-3480

SEQUENZPROTOKOLL

SEQ ID NO: 1
ART DER SEQUENZ: Peptid
LÄNGE DER SEQUENZ: 7 Aminosäuren
STRANGFORM: einzeln
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: Oligopeptid
URSPRÜNGLICHER HERKUNFTSORGANISMUS: Mensch
EIGENSCHAFTEN: N-terminaler TCF-II
SEQ ID NO: 2
ART DER SEQUENZ: Peptid
LÄNGE DER SEQUENZ: 17 Aminosäuren
STRANGFORM: einzeln
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: Oligopeptid
URSPRÜNGLICHER HERKUNFTSORGANISMUS: Mensch
EIGENSCHAFTEN: N-terminaler TCF-II
SEQ ID NO: 3
ART DER SEQUENZ: Nukleotid
LÄNGE DER SEQUENZ: 17 bp
STRANGFORM: einzeln
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: Oligopeptid
URSPRÜNGLICHER HERKUNFTSORGANISMUS: synthetisch
EIGENSCHAFTEN: 5'-Terminus des TCF-II-gens
CANCANTTRC CNTADGG
SEQ ID NO: 4
ART DER SEQUENZ: Peptid
LÄNGE DER SEQUENZ: 13 Aminosäuren
STRANGFORM: einzeln
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: Oligopeptid
URSPRÜNGLICHER HERKUNFTSORGANISMUS: Mensch
EIGENSCHAFTEN: interner TCF-II-α
SEQ ID NO: 5
ART DER SEQUENZ: Peptid
LÄNGE DER SEQUENZ: 20 Aminosäuren
STRANGFORM: einzeln
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: Oligopeptid
URSPRÜNGLICHER HERKUNFTSORGANISMUS: Mensch
EIGENSCHAFTEN: interner TCF-II-β
SEQ ID NO: 6
ART DER SEQUENZ: Nukleotid
LÄNGE DER SEQUENZ: 32 bp
STRANGFORM: einzeln
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: Oligonukleotid
URSPRÜNGLICHER HERKUNFTSORGANISMUS: synthetisch
EIGENSCHAFTEN: Primer
GGTCGACTAG GCACTGACTC CGAACAGGAT TC
SEQ ID NO: 7
ART DER SEQUENZ: Nukleotid
LÄNGE DER SEQUENZ: 32 bp
STRANGFORM: einzeln
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: Oligonukleotid
URSPRÜNGLICHER HERKUNFTSORGANISMUS: synthetisch
EIGENSCHAFTEN: Primer
GGCATGCACA GTTGTATTGG TGGGTGCTTC AG
SEQ ID NO: 8
ART DER SEQUENZ: Peptid
LÄNGE DER SEQUENZ: 21 Aminosäuren
STRANGFORM: einzeln
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: Oligopeptid
URSPRÜNGLICHER HERKUNFTSORGANISMUS: Mensch
EIGENSCHAFTEN: N-terminaler TCF-II
SEQ ID NO: 9
ART DER SEQUENZ: Nukleotid mit dem entsprechendem Protein
LÄNGE DER SEQUENZ: 2289 bp
STRANGFORM: einzeln
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: cDNA
URSPRÜNGLICHER HERKUNFTSORGANISMUS: Mensch
EIGENSCHAFTEN: TCF-II-codierende Sequenz

Claims

1. Expressionsvektor mit der Fähigkeit, eine DNA- Sequenz, die die Aminosäuresequenz von TCF-II wie in Fig. 1a und 1b dargestellt, codiert, zu translatieren.

2. Expressionsvektor nach Anspruch 1, wobei die DNA, die die Aminosäuresequenz von TCF-II codiert, die DNA- Sequenz von Fig. 1a und 1b besitzt.

3. Transformierte Säugerzelle, die einen Expressionsvektor nach Anspruch 1 oder 2 enthält.

4. Transformierte Säugerzelle nach Anspruch 3, die pcTCF(s)/MC1061/P3 mit der Hinterlegungsnummer FERM-PB- 3479 ist.

5. Transformierte Säugerzelle nach Anspruch 3, die TCdG&sub2;H&sub3;C&sub2; mit der Hinterlegungsnummer FERM-BP-3480 ist.

6. Verfahren zur Produktion eines Glykoproteins mit der Bezeichnung ICF-II und den folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften:

(a) Molekulargewicht:

in der SDS-PAGE unter nichtreduzierenden Bedingungen Auftreten von zwei Banden von 74.000 ± 2000 bzw. 78.000 ± 2000;

in der SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen Auftreten von drei Banden von 52.000 ± 2000, 30. 000 ± 2000 bzw. 26.000 ± 2000 (Banden A, B und C) ;

(b) isoelektrischer Punkt: 7,4 - 8,6;

(c) stabil bei 10minütigem Erhitzen auf 60ºC;

(d) stabil bei einem pH-Wert von 6 bis 9;

(e) Adsorption an eine Concanavalin-A-Sepharosesäule;

(f) Wachstumsinhibitor für KB-, HeLa- und L929-C18- Zellen, aber nicht für IMR-90-Zellen;

(g) Cytotoxizität wird durch Anti-TNF-, Anti-LT- oder Anti-Interferon-β-Antikörper nicht neutralisiert;

(h) die Polypeptide der Banden B und C sind Unterketten der Bande A, und beide besitzen die gleiche Nterminale Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 1 dargestellt ist, und

(i) die Aminosäurezusammensetzung ist wie folgt:

wobei das Verfahren die folgen Stufen umfaßt:

(a) Züchten einer transformierten Säugerzelle, die den Vektor nach Anspruch 1 oder 2 enthält, in einem Kulturmedium zur Expression und Produktion der Glykoproteine in das Kulturmedium; und

(b) Isolieren der Glykoproteine aus dem Kulturmedium.