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Die Erfindung bezieht sich allgemein auf Zusammensetzungen zum
Behandeln von Neoplasmen oder Krebs beim Menschen und genauer
auf die Verwendung von Interleukin-10 (IL-10) zur Herstellung
von Zusammensetzungen zum Behandeln von Krebs.
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Immunologische Wege der Krebstherapie beruhen auf der Idee, daß
Krebszellen die Verteidigung des Körpers gegen abweichende oder
fremde Zellen und Moleküle auf irgendeine Weise umgangen haben
und daß diese Verteidigung therapeutisch stimuliert werden
könnte, um verlorenen Boden zurückzugewinnen; z.B. S. 623-648 in
Klein, Immunology (Wiley-Interscience, New York, 1982). Die
kürzlichen Beobachtungen, daß verschiedene Immuneffektoren das
Tumorwachstum direkt oder indirekt hemmen können, hat zu einem
neuerlichen Interesse an diesem Weg einer Krebstherapie geführt:
z.B. Herberman, Concepts Immunopathol., Bd. 1, S. 96-132 (1985)
(natürliche Killerzellen setzen einem Tumorzellenwachstum
Widerstand entgegen); Rosenberg et al., Ann. Rev. Immunol., Bd. 4,
S. 681-709 (1988) (klinische Verwendung von IL-2-aktivierten
Killerzellen zum Behandeln von Krebs); Ralph et al., J. Exp.
Med., Bd. 167, S. 712-717 (1988)(tumorizide Aktivität durch
Makrophagen, die durch Lymphokine stimuliert wurden), Tepper et
al., Cell, Bd. 57, S. 503-512 (1989) (IL-4 besitzt
Antitumoraktivität), M. Cohen, "Lymphokines and Tumor Immunity", S. 237-
253 in S. Cohen, Hrsg., "Lymphokines and the Immune Response"
(CRC Press, Boca Raton, 1990) und dergleichen.
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Die Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von Interleukin-10
(IL-10) zum Verringern und/oder Verhindern des Wachstums von
Tumoren. Die Erfindung schließt auch pharmazeutische
Zusammensetzungen, die Interleukin-10 umfassen, ein. Vorzugsweise wird
das Interleukin-10 der Erfindung aus der Gruppe ausgewählt, die
aus den reifen Polypeptiden mit den offenen Leserahmen besteht,
welche durch die hierin in SEQ. ID. Nr. 1 und 2 angegebenen
Aminosäuresequenzen definiert werden (alle SEQ. IDs werden
unmittelbar vor den Ansprüchen angegeben), wobei die
Standardabkürzung mit drei Buchstaben zum Anzeigen von L-Aminosäuren
verwendet wird und vom N-Terminus ausgegangen wird. Diese beiden
Formen von IL-10 werden manchmal als Human-IL-10 (hIL-10 oder
Human-Cytokinsynthese-Hemmfaktor) beziehungsweise Virus-IL-l0
(vIL-10 oder BCRF1) bezeichnet: z.B. Moore et al., Science, Bd.
248, S. 1230-1234 (1990); Vieira et al., Science, Bd. 88, S.
1172-1176 (1991); Fiorentino et al., J. Exp. Med., Bd. 170, S.
2081-2095 (1989); Hsu et al., Science, Bd. 250, S. 830-832
(1990). Bevorzugter wird das bei dem Verfahren der Erfindung
verwendete reife IL-10 aus der Gruppe ausgewählt, die aus den
reifen Polypeptiden mit den offenen Leserahmen besteht, welche
durch die hierin in SEQ. ID Nr. 3 und 4 angegebenen
Aminosäuresequenzen definiert werden.
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Figur 1 ist eine diagrammartige Darstellung des
Säuger-Expressionsvektors pcD(SRα).
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Figur 2 ist eine diagrammartige Darstellung des
Bakterien-Expressionsvektors TRP-C11.
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Figur 3 zeigt das Plasmid pGSRG, das den offenen Leserahmen
(ORF) von Maus-IL-10, Virus-IL-10 oder Human-IL-10 trägt, welche
in seine XhoI-Restriktionsstelle inseriert sind; sie zeigt auch
die Sequenz der RBS-ATG-Polylinker-Regionen des endgültigen
Aufbaus (TAC-RBS genannt).
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die Erfindung ist auf die Verwendung von IL-10 bei der
Herstellung eines Arzneimittels zum Verhindern und/oder Verringern des
Krebswachstums gerichtet. IL-10 zur Verwendung bei der Erfindung
wird aus der Gruppe reifer Polypeptide ausgewählt, welche durch
die offenen Leserahmen kodiert werden, die durch die
cDNA-Inserts von pH5C, pH15C und pBCRF1(SRα) definiert werden, die bei
der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville,
Maryland, unter den Zugangsnummern 68191, 68192 beziehungsweise
68193 hinterlegt sind.
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Ein breiter Bereich einzelliger und mehrzelliger
Expressionssysteme (d.h. Wirt-Expressionsvektor-Kombinationen) kann zum
Herstellen der Polypeptide der Erfindung verwendet werden.
Mögliche Typen von Wirtszellen schließen Bakterien, Hefe,
Insekten, Säuger und dergleichen ein, sind aber nicht darauf
beschränkt. Viele Übersichten stehen zur Verfügung, welche eine
Anleitung zum Durchführen einer Wahl und/oder Modifikationen
spezieller Expresßionssysteme liefern; um z.B. einige zu nennen
geben de Boer und Shepard, "Strategies for Optimizing Foreign
Gene Expression in Escherichia coli", S. 205-247, in Kroon,
Hrsg., Genes: Structure and Expression (John Wiley & Sons, New
York, 1983), einen Überblick über mehrere E. coli-Expressions-
systeme; Kucherlapati et al., Critical Reviews in Biochemistry,
Bd. 16, Ausgabe 4, S. 349-379 (1984), und Banerji et al.,
Genetic Engineering, Bd. 5, S. 19-31 (1983) geben einen Überblick
über Verfahren zum Transfizieren und Transformieren von
Säugerzellen; Reznikoff und Gold, Hrsg., Maximizing Gene Expression
(Butterworths, Boston, 1986) geben einen Überblick über
ausgewählte Themen der Genexpression in E. coli, Hefe und
Säugerzellen, und Thilly, Mammalian Cell Technology (Butterworths,
Boston, 1986) gibt einen Überblick über Säugerexpressionssysteme.
Gleichfalls stehen viele Übersichten zur Verfügung, die
Techniken und Bedingungen zum Linken und/oder Manipulieren spezieller
cDNA und Expressionskontrollsequenzen zum Herstellen und/oder
Modifizieren von Expressionsvektoren beschreiben, die zur
Verwendung bei der vorliegenden Erfindung geeignet sind, z.B.
Sambrook et al. (vorstehend zitiert).
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Ein E. coli-Expressionssystem wird durch Riggs im US-Patent 4
431 739 offenbart, welches durch Verweis inbegriffen ist. Ein
besonders nützlicher prokaryontischer Promotor zur hohen
Expression in E. coli ist der durch de Boer im US-Patent 4 551 433
offenbarte tac-Promotor. Sekretionsexpressionsvektoren stehen
ferner für E. coli-Wirte zur Verfügung. Besonders nützlich sind
die durch Ghrayeb et al., EMBO J., Bd. 3, S. 2437-2442 (1984)
offenbarten pIN-III-ompA-Vektoren, in denen die zu
transkribierende cDNA mit dem Teil des E. coli-OmpA-Gens fusioniert ist,
der das Signalpeptid des ompA-Proteins kodiert, welches wiederum
bewirkt, daß das reife Protein in den periplasmatischen Raum des
Bakteriums ausgeschieden wird. Die US-Patente 4 336 336 und 4
338 397 offenbaren ebenfalls Sekretionsvektoren für
Prokaryonten.
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Zahlreiche Bakterienstämme sind geeignete Wirte für
prokaryontische Expressionsvektoren, welche E. coli-Stämme wie etwa W3110
(ATCC Nr. 27325), JA221, C600, ED767, DH1, LE392, HB1O1, X1776
(ATCC Nr. 31244), X2282, RR1 (ATCC Nr. 31343) MRCI; Bacillus
subtilis-Stämme und andere Enterobacteriaceae wie etwa
Salmonella typhimurium oder Serratia marcescens und verschiedene
Pseudomonas-Spezies einschließen. Allgemeine Verfahren zum Ableiten
von Bakterienstämmen wie etwa E. coli K12X1776, die bei der
Expression eukaryontischer Proteine nützlich sind, werden von
Curtis III im US-Patent 4 190 495 offenbart.
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Außer prokaryontischen und eukaryontischen Mikroorganismen
können Expressionssysteme, die aus mehrzelligen Organismen
stammende Zellen umfassen, ebenfalls zum Herstellen von
Proteinen der Erfindung verwendet werden. Von besonderem Interesse
sind Säugerexpressionssysteme, weil der
Weiterverarbeitungsmechanismus nach der Translation wahrscheinlicher biologisch
aktive Säugerproteine erzeugt. Mehrere DNA-Tumorviren sind als
Vektoren für Säugerwirte verwendet worden. Besonders wichtig
sind die zahlreichen Vektoren, die SV40-Replikations-,
Transkriptions- und/oder Translationskontrollsequenzen umfassen,
welche an Kontrollsequenzen der Bakterienvermehrung gekoppelt
sind; z.B. die durch Okayama und Berg entwickelten, in Mol.
Cell. Biol., Bd. 2, S. 161-170 (1982) und Mol. Cell. Biol., Bd.
3, S. 280-289 (1983) offenbarten und durch Takebe et al., Mol.
Cell. Biol., Bd. 8, S. 466-472 (1988) verbesserten pcD-Vektoren.
Andere Säugerexpressionsvektoren auf SV-40-Grundlage schließen
die durch Kaufman und Sharp in Mol. Cell. Biol., Bd 2, S. 1304-
1319 (1982) und Clark et al. im US-Patent 4 675 285 offenbarten
ein, welche beide durch Verweis hierin inbegriffen sind.
Affenzellen sind üblicherweise die bevorzugten Wirte für die
vorstehenden Vektoren. Derartige, die SV40-ori-Sequenzen und ein
intaktes A-Gen enthaltende Vektoren können sich in Affenzellen
autonom vermehren (unter Ergeben höherer Kopienzahlen und/oder
stabilerer Kopienzahlen als sich nicht-autonom vermehrende
Plasmide). Weiterhin können sich die SV40-ori-Sequenzen
enthaltenden Vektoren ohne ein intaktes A-Gen in COS7-Affenzellen, die
von Gluzman, Cell, Bd. 23, S. 175-182 (1981) beschrieben und von
der ATCC erhältlich sind (Zugangsnummer CRL 1651), autonom (aber
nicht stabil) zu hohen Kopienzahlen vermehren. Die vorstehenden
Vektoren auf SV40-Grundlage sind auch zum Transformieren anderer
Säugerzellen wie etwa Maus-L-Zellen durch Einbau in die
Wirtszellen-DNA befähigt.
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Mehrzellige Organismen können ebenfalls als Wirte für die
Herstellung der Polypeptide der Erfindung dienen, z.B.
Insektenlarven, Maeda et al., Nature, Bd. 315, S. 592-594 (1985), und Ann.
Rev. Entomol., S. 351-372 (1989), und transgene Tiere, Jaenisch,
Science, Bd. 240, S. 1468-1474 (1988).
I. Test auf Interleukin-10
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IL-10 zeigen mehrere biologische Aktivitäten, welche die
Grundlage von Tests und Einheiten bilden. Insbesondere besitzen IL-10
die Eigenschaft des Hemmens der Synthese wenigstens eines
Cytokins in der aus IFN-γ, Lymphotoxin, IL-2, IL-3 und GM-CSF
bestehenden Gruppe in einer γ-Helferzellenpopulation, die zum
Synthetisieren eines oder mehrerer dieser Cytokine durch Aussetzen
gegenüber syngenen, Antigen-aufweisenden Zellen (APCs) und
Antigen veranlaßt wurden. Bei dieser Aktivität werden die APCs so
behandelt, daß sie nicht zur Vermehrung befähigt sind, ihr
Antigen-verarbeitender Mechanismus jedoch funktionsfähig bleibt.
Dies wird bequemerweise durch Bestrahlen der APCs, z.B. mit etwa
1500-3000 R (Gamma- oder Röntgenstrahlung) vor dem Mischen mit
den T-Zellen bewerkstelligt.
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Wahlweise kann die Cytokinhemmung in primären oder vorzugsweise
sekundären Mischlymphozytenreaktionen (MLR) bestimmt werden, in
welchem Fall syngene APCs nicht verwendet zu werden brauchen.
MLR sind in der Technik gut bekannt, z.B. Bradley, S. 162-166,
in Mishell et al., Hrsg., Selected Methods in Cellular
Immunology (Freeman, San Francisco, 1980), und Battisto et al., Meth. in
Enzymol., Bd. 150, S. 83-91 (1987). Kurz gesagt, werden zwei
Populationen allogener Lymphzellen gemischt, wobei eine der
Populationen vor dem Mischen zum Verhindern des Wachstums z.B.
durch Bestrahlung behandelt worden ist. Vorzugsweise werden die
Zellpopulationen in einer Konzentration von etwa 2 x 10&sup6;
Zellen/ml in ergänztem Medium, z.B. RPMI 1640 mit 10% fetalem
Kälberserum, hergestellt. Sowohl für die Kontrollen als auch
Testkulturen werden für die Bestimmung 0,5 ml jeder Population
gemischt. Für eine sekundäre MLR werden die nach 7 Tagen bei der
primären MLR zurückbleibenden Zellen durch frisch hergestellte,
bestrahlte Stimulatorzellen erneut stimuliert. Die Probe, die
verdächtig wird, IL-10 zu enthalten, kann den Testkulturen zum
Zeitpunkt des Mischens zugesetzt werden und sowohl Kontrollen
als auch Testkulturen können 1 bis 3 Tage nach dem Mischen auf
Cytokinerzeugung getestet werden.
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Zum Erhalten von T-Zellpopulationen und/oder APC-Populationen
für IL-10-Bestimmungen werden in der Technik wohlbekannte
Techniken eingesetzt, die bei DiSabato et al., Hrsg., Meth. in
Enzymol., Bd. 108 (1984), vollständig beschrieben werden. APCs
für den bevorzugten IL-10-Test sind periphere Blutmonozyten.
Diese werden mittels Standardtechniken erhalten, wie z.B. von
Boyum, Meth. in Enzymol., Bd. 108, S. 88-102 (1984); Mage, Meth.
in Enzymol., Bd. 108, S. 118-132 (1984); Litvin et al., Meth. in
Enzymol., Bd. 108, S. 298-302 (1984); Stevenson, Meth. in
Enzymol., Bd. 108, S. 242-249 (1989) und Romain et al., Meth. in
Enzymol., Bd. 108, S. 148-153 (1984) beschrieben, wobei die
Zitate durch Verweis inbegriffen sind. Vorzugsweise werden
Helfer-T-Zellen in den IL-10-Tests verwendet, welche durch
zuerst Abtrennen von Lymphozyten aus dem peripheren Blut,
anschließend Selektieren, z.B. durch Panning oder
Durchflußzytometrie,
von Helferzellen mittels eines im Handel erhältlichen
Anti-CD4-Antikörpers, z.B. im US-patent 4 381 295 beschriebener
und von Ortho Pharmaceutical Corp. erhältlicher OKT4, erhalten
wurden. Die erforderlichen Techniken werden von Boyum in Scand.
J. Clin. Lab. Invest., Bd. 21 (Erg. 97), S. 77 (1986), und in
Meth. in Enzymol., Bd. 108 (vorstehend zitiert), und von Bram et
al., Meth. in Enzymol., Bd. 121, S. 737-748 (1986), vollständig
offenbart. Im allgemeinen werden PBL aus frischem Blut durch
Ficoll-Hypaque-Dichtegradienten-Zentrifugation erhalten.
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Eine Vielfalt von Antigenen kann in der Bestimmung eingesetzt
werden, z.B. Hämocyanin der "Schlüsselloch-Napfschnecke",
Geflügel-γ-Globulin oder dergleichen. Vorzugsweise werden anstelle
von Antigen Helfer-T-Zellen mit monoklonalem
Anti-CD3-Antikörper, z.B. im US-Patent 4 361 549 offenbartes OKT3, bei der
Bestimmung stimuliert.
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Cytokinkonzentrationen in Kontroll- und Testproben werden durch
biologische und/oder immunchemische Standardtests gemessen. Der
Aufbau der immunchemischen Tests auf spezifische Cytokine ist,
wenn das gereinigte Cytokin zur Verfügung steht, in der Technik
wohlbekannt, z.B. sind Campbell, Monoclonal Antibody Technology
(Elsevier, Amsterdam, 1984); Tijssen, Practise and Theory of
Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985), und das US-
Patent 4 486 530 für die ausgedehnte Literatur über den
Gegenstand beispielhaft. ELISA-Kits für Human-IL-2, Human-IL-3 und
Human-GM-SCF sind im Handel von Genzyme Corp. (Boston, MA)
erhältlich und ein ELISA-Kit für Human-IFN-γ ist von Endogen,
Inc. (Boston, MA) im Handel erhältlich. Für Human-Lymphatoxin
spezifische polyklonale Antikörper sind von Genzyme Corp.
erhältlich, welche in einem Radioimmuntest auf Human-Lymphotoxin
verwendet werden können, z.B. Chard, An Introduction to
Radioimmunoassay and Related Techniques (Elsevier, Amsterdam, 1982).
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Biologische Bestimmungen der vorstehend angeführten Cytokine
können ebenfalls zum Bestimmen der IL-10-Aktivität verwendet
werden. Ein biologischer Test auf Human-Lymphotoxin wird von
Aggarwal, Meth. in Enzymol., Bd. 116, S. 441-447 (1985) und
Matthews et al., S. 221-225, in Clemens et al., Hrsg.,
Lymphokines and Interferons: A Practical Approach (IRL Press,
Washington, D.C., 1987) offenbart. Human-IL-2 und GM-CSF kann mit den
Faktor-abhängigen, von der ATCC unter den Zugangsnummern TIB 214
beziehungsweise CCL 246 erhältlichen Zellinien bestimmt werden.
Human-IL-3 kann durch seine Fähigkeit, die Bildung eines breiten
Bereichs hämatopoetischer Zellkolonien in Weichagarkulturen wie
z.B. von Metcalf, Th- Hematopoietic Colony Stimulating Factors
(Elsevier, Amsterdam, 1984) beschrieben, zu stimulieren,
bestimmt werden. INF-γ kann mit Anti-Virus-Tests, z.B. Meager, S.
129-147, in Clemens et al., Hrsg. (vorstehend zitiert)
mengenmäßig bestimmt werden.
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Die Cytokin-Produktion kann auch durch mRNA-Analyse bestimmt
werden. Cytokin-mRNA kann, wie von White et al., J. Biol. Chem.,
Bd. 257, S. 8569-8572 (1982), und Gillespie et al., US-Patent 4
483 920, beschrieben, durch zytoplasmatische Punkthybridisierung
gemessen werden. Andere Wege schließen Punktblotting mittels
gereinigter RNA, z.B: Kapitel 6 in Hames et al., Hrsg., Nucleic
Acid Hybridization A Practical Approach (IRL Press, Washington,
D.C., 1985), ein.
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In einigen Fällen müssen auf IL-10-Aktivität zu testende Proben
vorbehandelt werden, um vorbestimmte Cytokine zu entfernen, die
den Test stören könnten. Zum Beispiel erhöht IL-2 die Produktion
von IFN-γ in einigen Zellen. Somit kann IL-2 in Abhängigkeit von
den im Test verwendeten Helfer-T-Zellen von der zu testenden
Probe entfernt werden müssen. Ein derartiges Entfernen wird
bequemerweise durch Führen der Probe durch eine Anti-Cytokin-
Affinitätsstandardsäule bewerkstelligt.
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Zur Erleichterung werden Einheiten der IL-10-Aktivität als die
Fähigkeit von IL-10 definiert, die IL-4-induzierte Vermehrung
von MC/9-Zellen zu erhöhen, die im US-Patent 4 559 310
beschrieben und von der ATCC unter der Zugangsnummer CRL 8306 erhältlich
sind. 1 Einheit/ml ist als die IL-10-Konzentration definiert,
welche 50% der maximalen Stimulation der MC/9-Vermehrung über
dem Wert von IL-4 in dem folgenden Test ergibt. Es werden
zweifache oder dreifache Verdünnungen von IL-4 und IL-10 in 50 ul
Medium je Näpfchen in einer Standard-Mikrotiterplatte
hergestellt; das Medium besteht aus RPMI 1640, 10% fetalem
Kälberserum, 50 uM 2-Mercaptoethanol, 2 mM Glutamin, Penicillin (100
E/L) und Streptomycin (100 ug/ml). Man setzt 25 ul/Näpfchen in
Medium verdünntes IL-4 mit 1600 E/ml (400 E/ml zum Schluß) zu
und inkubiert über Nacht, z.B. 20-24 Stunden. Man setzt
³H-Thymidin (z.B. 50 uCi/ml in Medium) zu 0,5-1,0 uCi/Näpfchen zu und
inkubiert die Zellen erneut über Nacht; danach werden die Zellen
geerntet und die eingebaute Radioaktivität wird gemessen.
II. Reinigung und pharmazeutische Zusammensetzungen
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Wenn Polypeptide der vorliegenden Erfindung in löslicher Form
exprimiert werden, zum Beispiel als sekretiertes Produkt
transformierter Hefe- oder Säugerzellen, können sie gemäß
Standardverfahren der Technik, einschließlich Schritten der
Ammoniumsulfatfällung, Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltration,
Elektrophorese, Affinitätschromatographie und/oder dergleichen; z.B:
liefern "Enzyme Purification and Related Techniques", Methods in
Enzymology, 22:233-577 (1977), und Scopes, R. Protein
Purification: Principles and Practise (Springer-Verlag, New York, 1982)
eine Anleitung bei derartigen Reinigungen. Wenn Polypeptide der
Erfindung in unlöslicher Form, zum Beispiel als Aggregate,
Einschlußkörper oder dergleichen, exprimiert werden, können sie
gleichermaßen durch Standardverfahren in der Technik,
einschließlich des Abtrennens der Einschlußkörper aus
aufgebrochenen Wirtszellen durch Zentrifugieren, Löslichmachen der
Einschlußkörper mit chaotropen Mitteln und Reduktionsmitteln,
Verdünnen des löslich gemachten Gemischs und Erniedrigen der
Konzentration des chaotropen Mittels und Reduktionsmittels
gereinigt werden, so daß das Polypeptid eine biologisch aktive
Konformation einnimmt. Die letzteren Verfahren werden in den
folgenden Zitaten offenbart: Winkler et al., Biochemistry,
25:4041-4045 (1986); Winkler et al., Biotechnology, 3:992-998
(1985); Koths et al., US-Patent 4 569 790 und die europäischen
Patentanmeldungen 86306917.5 und 86306353.3.
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Hierin verwendet bedeutet "wirksame Menge" eine zum Verringern
oder Verhindern des Tumorwachstums ausreichende Menge. Die
wirksame Menge für einen besonderen Patienten kann in
Abhängigkeit von solchen Faktoren wie dem Zustand und Typ der zu
behandelnden neoplastischen Erkrankung, der Gesamtgesundheit des
Patienten, dem Verabreichungsverfahren, der Schwere der
Nebenwirkungen und dergleichen schwanken. Im allgemeinen wird IL-10
als pharmazeutische Zusammensetzung verabreicht, die eine
wirksame Menge IL-10 und einen pharmazeutischen Träger umfaßt. Ein
pharmazeutischer Träger kann jede verträgliche, nicht-toxische
Substanz sein, die zum Zuführen der Zusammensetzungen der
Erfindung an einen Patienten geeignet sind. Im allgemeinen sind zur
parenteralen Verabreichung derartiger Wirkstoffe nützliche
Zusammensetzungen gut bekannt; z.B. Remington's Pharmaceutical
Science, 15. Ausg. (Mack Publishing Company, Easton, PA 1980).
Alternativ können Zusammensetzungen der Erfindung durch ein
implantierbares oder injizierbares Wirkstoff-Zufuhrsystem in den
Körper eines Patienten eingeführt werden: z.B. Urquhart et al.,
Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., Bd. 24, S. 199-236 (1984); Lewis,
Hrsg., Controlled Release of Pesticides and Pharmaceuticals
(Plenum Press, New York, 1981); US-Patent 3 773 919; US-Patent
3 270 960.
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Wenn IL-10 parenteral verabreicht wird, wird es in einer
injizierbaren Einheitsdosisform (Lösung, Suspension, Emulsion) in
Verbindung mit einem pharmazeutischen Träger formuliert.
Beispiele derartiger Träger sind normale Kochsalzlösung, Ringersche
Lösung, Dextroselösung und Hanksche Lösung. Nicht-wäßrige
Träger, wie etwa fette Öle und Ölsäureethylester, können ebenfalls
verwendet werden. Ein bevorzugter Träger ist 5%
Dextrose/Kochsalzlösung. Der Träger kann untergeordnete Menge Additive
enthalten, wie etwa Substanzen, welche die Isotonie und chemische
Stabilität verstärken, z.B. Puffer und Konservierungsmittel. Das
IL-10 wird vorzugsweise in gereinigter Form, im wesentlichen
frei von Aggregaten und anderen Proteinen in einer Konzentration
im Bereich von etwa 5 bis 20 ug/ml formuliert. Vorzugsweise wird
IL-10 durch ununterbrochene Infusion verabreicht, so daß eine
Menge im Bereich von etwa 50-800 ug je Tag (d.h. etwa 1-16
ug/kg/Tag) zugeführt wird. Die tägliche Infusionsrate kann auf
der Grundlage des Überwachens von Nebenwirkungen und
Blutzellenzählungen verändert werden.
BEISPIELE
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Die folgenden Beispiele dienen zum Veranschaulichen der
vorliegenden Erfindung. Die ausgewählten Vektoren und Wirte, die
Konzentration von Reagenzien, die Temperaturen und die Werte
anderer Variablen sind nur zum Veranschaulichen der vorliegenden
Erfindung und sollen nicht als deren Einschränkung angesehen
werden.
Beispiel 1. Expression von Human-CSIF in einem bakteriellen
Wirt
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Ein synthetisches Human-CSIF-Gen wird aus einer Mehrzahl
chemisch synthetisierter, doppelsträngiger DNA-Fragmente unter
Bilden eines als TAC-RBS-hCSIF bezeichneten Expressionsvektors
zusammengesetzt. Das Klonieren und die Expression werden in
einem Standard-Bakteriensystem, zum Beispiel dem von Viera und
Messing in Gene, Bd. 19, S. 259-268 (1982), beschriebenen E.
coli K12-Stamm JM101, JM103 oder dergleichen, durchgeführt.
Verdauungen mit Restriktionsendonukleasen und Reaktionen mit
Ligasen werden unter Anwenden von Standardvorschriften ausgeführt,
z.B. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual
(Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982).
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Das Alkaliverfahren (Maniatis et al., vorstehend zitiert) wird
zu Plasmidherstellungen in kleinem Maßstab verwendet. Für
Herstellungen in großem Maßstab wird eine Abänderung des
Alkaliverfahrens verwendet, bei dem ein gleiches Volumen Isopropanol
zum Fällen von Nukleinsäuren aus dem geklärten Lysat verwendet
wird. Die Fällung mit kaltem 2,5M Ammoniumacetat wird zum
Entfernen von RNA vor der Äquilibriumsdichtezentrifugation mit
Cesiumchlorid und dem Nachweis mit Ethidiumbromid verwendet.
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Für Filterhybridisierungen werden Kreise aus Whatman 540-Filter
zum Abheben von Kolonien verwendet, die anschließend durch
Behandlung (jeweils 2 Minuten lang) mit 0,5M NaOH, 1,5M NaCl und
anschließend mit 1M Tris-HCl pH 8,0, 1,5 M NaCl und anschließend
durch Erhitzen auf 80ºC (30 min) lysiert und fixiert werden.
Hybridisierungen finden 6 h bei 42ºC in 6xSSPE, 20% Formamid,
0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS), 100 mg/ml E. coli tRNA, 100
mg/ml Coomassie Brilliant Blue G-250 (Bio-Rad) mittels
³²P-markierter (kinasierter) synthetischer DNA statt. (20xSSPE wird
durch Lösen von 174 g NaCl, 27,6 g NaH&sub2;PO&sub4; 9H&sub2;O und 7,4 g EDTA in
800 ml H&sub2;O hergestellt. Der pH wird mit NaOH auf 7,4 eingestellt,
das Volumen wird auf 1 Liter eingestellt und die Probe wird
durch Autoklavieren sterilisiert.) Die Filter werden zwei Mal
(15 min, Raumtemperatur) mit 1xSSPE, 0,1% SDS gewaschen. Nach
der Autoradiographie (Fuji RX Film) werden positive Kolonien
durch Abgleichen der erneut gewachsenen Kolonien mit den blau
angefärbten Kolonien auf den Filtern ausfindig gemacht. Die DNA
wird durch das Didesoxyverfahren, Sanger et al., Proc. Natl.
Acad. Sci., Bd. 74, S. 5463 (1977) sequenziert. Matrizen für die
Didesoxyreaktionen sind entweder einzelsträngige DNA relevanter
Regionen, die erneut in M13mp-Vektoren kloniert wurden (z.B.
Messing et al., Nucleic Acids Res., Bd. 9, S. 309 (1981)), oder
doppelsträngige DNA, die durch das Minialkaliverfahren
hergestellt und mit 0,2M NaOH (5 min, Raumtemperatur) denaturiert und
aus 0,2M NaOH, 1,43M Ammoniumacetat durch Zusatz von 2 Volumina
Ethanol gefällt wurde. DNA kann durch Phosphoramiditchemie
mittels Applied Biosystems 380A-Synthetisierern synthetisiert
werden; die Synthese, das Entschützen, die Spaltung und Reinigung
(7M Harnstoff PAGE, Elution, DEAE-Cellulose-Chromatographie)
werden wie im Handbuch des 380A Synthetisierers beschrieben
ausgeführt.
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Komplementäre Stränge zu klonierender synthetischer DNAs
(jeweils
400 ng) werden gemischt und mit Polynucleotid-Kinase in
einem Reaktionsvolumen von 50 ml phosphoryliert. Diese DNA wird
in einem Volumen von 50 ml bei Raumtemperatur 4 bis 12 Stunden
mit 1 mg mit einem geeigneten Restriktionsenzym verdauter
Vektor-DNA ligiert. Bedingungen für die Phosphorylierung, Verdauung
mit Restriktionsenzymen, Polymerase-Reaktionen und die Ligation
sind beschrieben-worden (Maniatis et al., vorstehend zitiert).
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Kolonien werden (gewünschtenfalls) durch Plattieren auf L-Agar,
der mit Ampicillin, Isopropyl-1-thio-beta-D-galactosid (IPTG)
(0,4 mM) und 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-beta-D-galactopyranosid
(x-gal) (40 mg/ml) ergänzt ist, auf lacZ+-Kolonien gezählt.
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Der TAC-RBS-Vektor wird durch Auffüllen der einzigen
BamHIStelle des tacP-tragenden Plasmids pDR540 (Pharmacia) mit
DNAPolymerase aufgebaut. Dieser wird anschließend mit
unphosphorylierten synthetischen Oligonucleotiden (Pharmacia) ligiert, die
ein doppelsträngiges Fragment bilden, das eine hierin in SEQ.
ID. Nr. 5 angegebene und RBS bezeichnete
Konsensusribosom-Bindungsstelle kodiert. Nach der Ligation wird das Gemisch
phosphoryliert und erneut mit dem SstI-Linker ATGAGCTCAT ligiert.
Dieser Komplex wurde anschließend mit SstI und EcoRI gespalten
und das Fragment mit 173 Basenpaaren (bp) wurde durch
Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) isoliert und in
EcoRI-SstI-verkürztes pUC19 (Pharmacia) kloniert (wie nachstehend
beschrieben). Die Sequenz der RBS-ATG-Polylinker-Regionen des
endgültigen Aufbaus (TAC-RBS genannt) wird in Figur 3 gezeigt.
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Das synthetische IL-10-Gen wird in acht Schritten in einem
pUC19-Plasmid zusammengesetzt. Bei jedem Schritt können
deletionsfreie Inserts und/oder Inserts nach dem Klonieren durch
Halten des lacZ(α)-Gens von pUC19 im Rahmen mit dem in Schritt
1 inserierten ATG-Startkodon nachgewiesen werden.
Deletions- und/oder Insertionsänderungen enthaltende Klone können durch
Zählen auf blaue Kolonien auf x-gal und IPTG enthaltenden L-
Ampicillin-Platten herausgefiltert werden. Wahlweise können bei
jedem Schritt Insertsequenzen leicht mittels eines universellen
Sequenzierungsstarters bei z.B. von Boehringer Mannheim
erhältlichen
Plasmid-DNA-Zubereitungen in kleinem Maßstab bestätigt
werden.
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In Schritt 1 wird der TAC-RBS-Vektor mit SstI verdaut mit T4-
DNA-Polymerase (deren 3'-Exonukleaseaktivität die überhängenden
3'-Stränge der Sstl-Schnitte unter Bilden von Fragmenten mit
stumpfem Ende verdaut) behandelt und nach der Deaktivierung von
T4-DNA-Polymerase mit EcoRI unter Bilden eines 173 bp-Fragments
behandelt, das die TAC-RBS-Region enthält und ein stumpfes Ende
am ATG-Startkodon und den EcoRI-Schnitt am entgegengesetzten
Ende besitzt. Schließlich wird das 173 bp-TAC-RBS-Fragment
isoliert.
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In Schritt 2 wird das isolierte TAC-RBS-Fragment von Schritt 1
mit EcoRI/KpnI-verdautem Plasmid puC19 und dem hierin in SEQ.
ID. Nr. 6 dargestellten synthetischen Fragment 1A/B gemischt,
welches, wie nachstehend gezeigt wird, eine stumpfes Ende an
seinem stromaufwärts gelegenen Terminus und ein versetztes,
einem KpnI-Schnitt entsprechendes Ende an seinem stromabwärts
gelegenen Terminus besitzt. Dieses KpnI-Ende befindet sich
stromabwärts neben einer BstEII-Stelle. Die Fragmente werden
unter Bilden des pUC19 von Schritt 2 ligiert.
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In Schritt 3 werden die synthetischen Fragmente 2A/B, das hierin
in SEQ. ID. Nr. 7 dargestellt ist und 3A/B, das hierin in SEQ.
ID. Nr. 8 dargestellte ist, mit BstEII/Smal-verdautem pUC19 aus
Schritt 2 (nach Verstärkung und Reinigung) gemischt und unter
Bilden von puC19 des Schritts 3 ligiert. Es ist anzumerken, daß
der stromabwärts gelegene Terminus des Fragments 3A/B
zusätzliche Basen enthält, welche das stumpfe SmaI-Ende bilden. Diese
zusätzlichen Basen werden in Schritt 4 gespalten. Ferner
besitzen die Fragmente 2A/B und 3A/B komplementäre, einzelsträngige
9-Rest-Enden, die sich beim Mischen rekombinieren, wobei sie den
stromaufwärts gelegenen BstEII-Schnitt von 2A/B und das
stromabwärts gelegene stumpfe Ende von 3A/B zum Ligieren mit dem pUC19
hinterlassen.
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In Schritt 4 wird das pUC19 aus Schritt 3 mit AflII/XbaI
verdaut, verstärkt, gereinigt, erneut gereinigt, mit dem hierin in
SEQ. ID. Nr. 9 dargestellten synthetischen Fragment 4A/B
gemischt und unter Bilden des pUC19 von Schritt 4 ligiert.
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In Schritt 5 wird das pUC19 von Schritt 4 mit Xbal/Sa/I verdaut,
verstärkt und gereinigt und mit dem hierin in SEQ. ID. Nr. 10
dargestellten Fragment 5A/B gemischt und unter Bilden des pUC19
von Schritt 5 ligiert. Es ist anzumerken, daß das versetzte
Sa/I-Ende des Fragments 5A/B durch Verdauung mit HpaI in Schritt
6 entfernt wird.
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In Schritt 6 wird pUC19 von Schritt 5 mit HpaI/PstI verdaut,
verstärkt und gereinigt und mit dem hierin in SEQ. ID. Nr. 11
dargestellten synthetischen Fragment 6A/B gemischt und unter
Bilden des pUC19 von Schritt 6 ligiert.
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In Schritt 7 wird pUC19 von Schritt 6 mit ClaI/SphI verdaut,
verstärkt und gereinigt und mit dem hierin in SEQ. ID. Nr. 12
dargestellten synthetischen Fragment 7A/B gemischt und unter
Bilden des pUC19 von Schritt 7 ligiert.
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In Schritt 8 wird pUC19 von Schritt 7 mit MluI/HindIII verdaut,
verstärkt und gereinigt und mit den synthetischen Fragmenten,
8A/B, das hierin in SEQ. ID. Nr. 13 dargestellt ist, und 9A/B,
das hierin in SEQ. ID. Nr. 14 dargestellt ist, gemischt und
unter Bilden des endgültigen Aufbaus ligiert, welcher
anschließend durch Standardtechniken in den E. coli K-12-Stamm JM101
inseriert wird, der zum Beispiel von der ATCC unter der
Zugangsnummer 33876 erhältlich ist. Nach der Kultivierung wird Protein
aus den JM101-Zellen extrahiert und Verdünnungen dieser Extrakte
werden auf biologische Aktivität getestet.
Beispiel 2. ExDression von vIL-10 in COS7-Affenzellen
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Ein den offenen Leserahmen für vIL-10 kodierendes Gen wurde
durch eine Polymerase-Kettenreaktion unter Verwenden von
Startern
verstärkt, welche die spätere Insertion des verstärkten
Fragments in einen EcoRI-verdauten pcD(SRα)-Vektor (Figur 1)
erlaubten. Der kodierende Strang des inserierten Fragments wird
hierin in SEQ. ID. Nr. 15 dargestellt.
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Klone, die das Insert in der richtigen Orientierung trugen,
wurden durch Expression von vIL-10 und/oder das
elektrophoretische Muster des Restriktionsverdauten nachgewiesen. Ein
derartiger, das vIL-10-Gen tragender Vektor wurde als pBCRF1(SRα)
bezeichnet und wurde bei der ATCC unter der Zugangsnummer 68193
hinterlegt. pBCRF1(SRα) wurde in E. coli MC1061 verstärkt, durch
Standardtechniken isoliert und zum Transfizieren von
COS7-Affenzellen wie folgt verwendet: ein Tag vor der Transfizierung
wurden ungefähr 1,5 x 10&sup6; COS7-Affenzellen auf einzelne 100 mm-
Platten in Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DME)
eingeimpft, das 5% fetales Kälberserum (FCS) und 2 mM Glutamin
enthielt. Zum Ausführen der Transfizierung wurden COS7-Zellen von
den Platten durch Inkubation mit Trypsin entnommen, zwei Mal in
serumfreiem DME gewaschen und zu 10&sup7; zellen/ml in serumfreiem DME
suspendiert. Eine aliquote Menge von 0,75 ml wurde mit 20 ug DNA
gemischt und in eine sterile Elektroporationsküvette mit 0,4 cm
überführt. Nach 10 Minuten wurden die Zellen mit 200 Volt, 960
uF in einer BioRad Gene Pulser-Einheit gepulst. Nach weiteren 10
Minuten wurden die Zellen aus der Küvette entnommen und 20 ml
DME zugesetzt, das 5% FCS, 2 mM Glutamin, Penicillin,
Streptomycin und Gentamycin enthielt. Das Gemisch wurde in aliquoten
Mengen auf vier 100 mm-Gewebekulturschalen verteilt. Nach 12-24
Stunden bei 37ºC, 5% CO&sub2;, wurde das Medium durch ein ähnliches
Medium ersetzt, das nur 1% FCS enthielt, und die Inkubation
wurde weitere 72 Stunden bei 37ºC, 5% CO&sub2;, fortgesetzt, wonach
das Medium gesammelt und auf seine Fähigkeit, die IFN-γ-Synthese
zu hemmenm getestet wurde.
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Aliquote Mengen von 10 ml frisch isolierten PBL (etwa 2x10&sup6;
Zellen/ml) wurden bei 37ºC mit PHA (100 ng/ml) in einem Medium
inkubiert, das aus (i) 90% mit 5% FCS und 2 mM Glutamin
ergänztem DME und (ii) 10% Überstand aus zuvor mit pBCRF1(SRα)
transfizierten COS7-Zellen bestand. Nach 24 Stunden wurden die
Zellen und Überstände zum Testen auf Anwesenheit von IFN-γ-mRNA
beziehungsweise IFN-γ-Protein geerntet. Kontrollen wurden
identisch behandelt, außer daß 10% Überstand von COS7-Kulturen
stammte, die zuvor mit einem Plasmid transfiziert wurden, das
ein nicht-verwandtes cDNA-Insert trug. Die vIL-10-behandelten
Proben zeigten eine 50%ige Hemmmung der IFN-γ-Synthese bezogen
auf die Kontrollen.
Beispiel 3. Expression von vIL-10 in Escherichia coli
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Ein das hierin in SEQ. ID. Nr. 4 dargestellte reife vIL-10
kodierende Gen kann in E. coli exprimiert werden.
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Das cDNA-Insert von pBCRF1(SRα) wird erneut in ein M13-Plasmid
kloniert, wo es zwei Mal durch ortsgerichtete Mutagenese
verändert wird: zuerst unter Bilden einer ClaI-Stelle am 5'-Ende
der Kodierungsregion für das reife vIL-10-Polypeptid und
zweitens unter Bilden einer BamHI-Stelle am 3'-Ende der
Kodierungsregion für das reife vIL-10-Polypeptid. Die mutierte Sequenz
wird anschließend leicht in den nachstehend beschriebenen TRP-
C11-Expressionsvektor inseriert.
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Der TRPC11-Vektor wurde durch Ligieren eines synthetischen
Konsensus-RBS-Fragments an ClaI-Linker (ATGCAT) und durch
Klonieren der sich daraus ergebenden Fragmente in ClaI-verkürztes
pMT11hc (das zuvor zum Enthalten der ClaI-Stelle modifiziert
worden war) aufgebaut. pMT11hc ist ein kleines (2,3 Kilobasen)
AMPR, TETS-Derivat von pBR322 mit hoher Kopienzahl, welches die
πVX-Plasmid-EcoRI-HindIII-Polylinker-Region trägt. (πVX wird von
Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor Laboratory, 1982, beschrieben.) Dieses wurde durch
Verkürzen von pMT11hc mit EcoRI und BamHI, Auffüllen der sich
daraus ergebenden klebrigen Enden und Ligieren mit ClaI-Linker
(CATCGATG), wodurch die EcoRI- und BamHI-Stellen
wiederhergestellt wurden und die SmaI-Stelle durch eine ClaI-Stelle ersetzt
wurde, zum Enthalten der ClaI-Stelle modifiziert. Eine
Transformante
aus dem TRPC11-Aufbau besaß eine von ClaI-Stellen
flankierte Tandem-RBS-Sequenz. Eine der ClaI-Stellen und ein
Teil der zweiten Kopie der RBS-Sequenz wurden durch Verdauen
dieses Plasmids mit PstI, Behandeln mit Bal31-Nuklease,
Verkürzen mit EcoRI und Behandeln mit T4-DNA-Polymerase in
Anwesenheit aller vier Desoxynucleotidtriphosphate entfernt. Die sich
daraus ergebenden 30-40 bp-Fragmente wurden durch PAGE gewonnen
und in SmaI-verkürztes pUC12 kloniert. Ein von pKC101 (von
Nichols et al. in Methods in Enzymology, Bd. 101, S. 155
(Academic Press, N.Y., 1983) beschrieben) abgeleitetes, E. coli-trP-
tragendes EcoRI-Fragment mit 248 bp wurde anschließend in die
EcoRI-Stelle kloniert, um den TRPCII-Aufbau zu vervollständigen,
welcher in Figur 2 veranschaulicht wird. TRPC11 wird als Vektor
für vIL-10 eingesetzt, indem man es zuerst mit ClaI und BamHI
verdaut, reinigt und anschließend in einer
Standardligationslösung mit dem ClaI-BamHI-Fragment des die für den reifen BCRF1
kodierende Nukleotidsequenz enthaltenden M13 mischt. Das
inserthaltige, als TRPC11-BCRF1 bezeichnete TRPC11 wird im z.B. von
der ATCC unter der Zugangsnummer 33876 erhältlichen E. coli K12-
Stamm JM101 vermehrt.
Beispiel 4. Suppression von Tumoren in Mäusen durch IL-10
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Die Wirkung von IL-10 auf das Tumorwachstum wurde in einer zu
der von Tepper et al., Cell, Bd. 57, S. 503-512 (1989)
beschriebenen ähnlichen Bestimmung getestet. Kurz gesagt, umfaßt die
hier angewandte Bestimmung das getrennte Injizieren von Mäusen
mit zwei Gruppen van Zellen aus einer syngenen Tumorzellinie,
wobei eine Gruppe mit einem IL-10-exprimierenden Plasmid stabil
transfiziert ist und die andere eine nicht-transfizierte
Kontrolle ist. Die Häufigkeit der Tumorbildung wurde anschließend
bei Mäusen verglichen, denen Zellen der beiden Gruppen getrennt
injiziert wurden.
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Bei allen Versuchen wurden BALB/c-Mäusen entweder transfizierte
oder nicht-transfizierte, von der ATCC unter der Zugangsnummer
TIB 18 erhältliche NS1-Myelom-Tumorzellen injiziert. Die NS1-
Zellen wurden durch Elektroporation mit Plasmid pGSRG (in Fig.
3 veranschaulicht), das den offenen Leserahmen (ORF) von in die
XhoO-Restriktionsstelle inseriertem Maus-IL-10, Virus-IL-10 oder
Human-IL-10 trug, transfiziert. pGSRG enthält einen Marker zum
Bestimmen stabil transfizierter NS1-Zellen und ist ein
Abkömmling des von Schnee et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Bd. 84, S.
6904-6908 (1987), beschriebenen pSVDtβ. Die IL-10-Inserts für
pGSRG wurden wie folgt erhalten. EcoRI-Linkersequenzen
enthaltende PCR-Starter wurden jeweils für pH5C, pBRCRF1 und pcD(SRα)-
F115 hergestellt, so daß die ORF der entsprechenden cDNA-Inserts
verstärkt werden konnten. Die verstärkten ORF wurden
anschließend erneut in EcoRI-verdaute pcD(SRα)-Vektoren kloniert und zum
Selektieren von Vektoren, welche die ORF in der richtigen
Orientierung enthielten, getrennt exprimiert. Schließlich wurden die
XhoI-Fragmente der pcD(SRα) erneut in entsprechende
XhoI-verdaute pGSRG-Plasmide kloniert.
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Die NS1-Zellen wurden wie folgt mit den pGSRG transfiziert.
Zellen (2-3 x 106) aus einer halbkonfluenten Petrischale mit 100
mm Durchmesser wurden zentrifugiert, ein Mal in 10 ml steriler,
phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen,
zentrifugiert und erneut in 0,5 ml PBS suspendiert. 20-100 ug Plasmid-
DNA wurden in 1 ml PBS suspendiert. Die Zellen und DNA wurden
gemischt, in eine Küvette auf Eis verbracht und in einem Bio-Rad
Gene Pulser, der auf 960 Mikrofarad Kapazität und 200-300 Volt
eingestellt war, mit einem Elektroschock versetzt. Nach 10 min
auf Eis wurden die Zellen anschließend auf eine
Standard-Mikrotiterplatte mit 96 Näpfchen in 100 ul Volumen plattiert. 48-78
Stunden später wurden jedem Näpfchen 100 ul Mycophenolsäure-
Selektionsmedium (0,5 ug/ml Mycophenolsäure, 100 ug/ml Xanthin,
15 ug/ml Hypoxanthin, 12-15% fetales Kälberserum, 600 ug/ml
Glutamin in DME High Glucose) zugesetzt.
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In einem ersten Versuch wurden jeweils 4, 3, 4 beziehungsweise
5 Mäusen 5 x 10&sup6; nicht-transformierte Zellen (Kontrolle), pGSRG-
mIL10-transformierte Zellen, pGSRG-vIL10-transformierte Zellen
und pGSRG-hIL10-transformierte Zellen intraperitoneal injiziert.
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Nach 4 Wochen hatten 3 von 4 Kontrollmäusen sichtbare Tumore
entwickelt; keine der Versuchsmäuse entwickelte nach 4 Wochen
Tumore.
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In einem zweiten Versuch wurden 16 Mäusen 5 x 10&sup6;
nicht-transformierte Zellen intraperitoneal injiziert und 15 Mäusen wurde
5 x 10&sup6; pGSRG-mIL10-transformierte Zellen injiziert. Nach zwei
Wochen wurden 8 der 16 Kontrollmäuse erneut 5 x 10&sup6;
nicht-transformierte Zellen injiziert und 7 der 15 Versuchsmäuse wurden
erneut 5 x 10&sup6; pGSRG-mIL10-transformierte Zellen injiziert. 4
Wochen nach den ersten Injektionen wurden die Mäuse
auf-Anzeichen einer Tumorentwicklung untersucht. 16 von 16 Kontrollmäusen
hatten sichtbare Tumore entwickelt und keine Versuchsmaus hatte
irgendwelche Zeichen von Tumoren entwickelt.
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Die Beschreibungen der vorangehenden Ausführungsformen der
Erfindung sind zum Zweck der Veranschaulichung und Beschreibung
vorgestellt worden. Sie sind nicht dazu bestimmt, erschöpfend zu
sein oder die Erfindung auf die genauen offenbarten Formen
einzuschränken. Die Ausführungsformen wurden ausgewählt und
beschrieben, um die Grundsätze der Erfindung am besten zu
erläutern und dadurch anderen Fachleute zu ermöglichen, die Erfindung
in verschiedenen Ausführungsformen und mit verschiedenen
Abwandlungen, die an die besondere, beabsichtigte Verwendung
angepaßt sind, am besten zu nützen. Es ist beabsichtigt, daß der
Umfang der Erfindung durch die hieran angefügten Ansprüche
definiert werden soll.
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Die Anmelder haben pH5C, pH15C und pBCRF1(SRα) tragende,
getrennte Kulturen von E. coli MC1061 bei der American Type
Culture Collection, Rockville, MD, USA (ATCC), unter den
Zugangsnummern 68191, 68192 beziehungsweise 68193 hinterlegt. Diese
Hinterlegungen wurden unter nach dem Vertrag der ATCC zur
Kulturhinterlegung für Patentzwecke angegebenen Bedingungen
durchgeführt, was sicherstellt, daß die Hinterlegung dem US
Comissioner of Patents and Trademarks gemäß 35 USC 122 und 37 CFR 1.14
zugänglich gemacht wird und der Öffentlichkeit nach Erteilung
eines US-Patents zugänglich gemacht wird, was erfordert, daß die
Hinterlegung aufrechterhalten wird. Die verfügbarkeit des
hinterlegten Stamms darf nicht als Lizenz zum Ausüben der Erfindung
unter Verstoß der unter der Autorität einer Regierung
Einklang mit ihren Patentgesetzen gewährten Rechte aufgefaßt
werden.
SEOUENZLISTEN