DE69232006T2 - Pharmazeutische zusammensetzungen - Google Patents

Description

• Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines Polysaccharids oder Polysaccharidderivats in Assoziation mit einer pharmazeutisch aktiven Verbindung, um die Verweilzeit der aktiven Verbindung im Kreislauf eines Patienten zu verlängern oder um die Verbindung an ein spezielles Ziel innerhalb des Körpers eines Patienten zu bringen.
• Es gibt eine große Vielfalt pharmakologisch aktiver Agentien, für die ein Bedarf besteht, entweder eine erhöhte Konzentration in dem zirkulierenden Blut aufrechtzuerhalten oder sie direkt an der Wirkungsstelle abzugeben. Solche Agentien umfassen herkömmliche Arzneimittel, Peptide und Proteine und Oligonukleotide, die in der Krebstherapie und antimikrobiellen Therapie und in der Enzym- oder Hormonersatztherapie und in der Immunologie eingesetzt werden. In vielen Fällen weisen Agentien eine kurze Halbwertszeit im Kreislauf auf und werden schnell durch die Nieren ausgeschieden oder von dem retikuloendothelialen System (RES) und anderen Geweben aufgenommen. Zur Kompensation einen solchen vorzeitigen Arzneimittelverlusts sind größere Dosen erforderlich, so daß sich ausreichende Mengen des Arzneimittels in Regionen, die einer Behandlung bedürfen, konzentrieren können. Dies ist jedoch nicht nur kostenaufwendig, es kann auch zu Toxizität und einer Immunreaktion gegen das "fremde Protein" führen. Beispielsweise wären Cytokine wie Interferon (IFN-γ) und Interleukin-2 (IL-2) wirksamer, weniger toxisch und würden auch in kleineren Mengen eingesetzt, wenn deren Anwesenheit im Kreislauf verlängert werden könnte.
• Kürzliche Fortschritte in der rekombinanten DNA-Technologie haben ein breites Spektrum von biologisch aktiven Proteinen verfügbar gemacht. Obwohl in manchen Fällen eine molekulare Umgestaltung durch beispielsweise ligierte Genfusion oder durch stellengerichtete Mutagenese solche Proteine mit Eigenschaften versehen hat, die mit optimaler Aktivität vereinbar sind, ist es im allgemeinen so, daß der effektive Einsatz dieser Produkte nur durch Abgabesysteme erzielt werden kann. Es wäre wünschenswert, einen vorzeitigen Arzneimittelverlust ohne zielgerichtete Abgabesysteme oder in Verbindung damit zu verhindern.
• Ein Arzneimittelabgabesystem (AAS) ist jedes molekulare oder teilchenförmige Gebilde, welches das Schicksal und die Wirkung von Arzneimitteln, die mit dem Gebilde assoziiert sind, vorteilhaft steuern kann. AAS können in zwei allgemeine Typen unterteilt werden. Der erste Typ umfaßt Makromoleküle (MAAS), beispielsweise Antikörper, Neoglycoproteine sowie synthetische Polymere, wie z. B. Poly(hydroxypropylmethacrylamid), Polylysin und polymerisierte Alkylcyanoacrylate. Die Assoziation von Arzneimitteln mit verschiedenen Typen makromolekularer ,Träger, einschließlich monoklonaler Antikörper, um das Arzneimittel zielgerichtet an die gewünschten Stellen abzugeben, wird beispielsweise von Gregoriadis in Nature 265, 407-411 (1977), beschrieben.
• Der zweite Typ ist ein teilchenförmiges AAS (TAAS), welches beispielsweise Nanosphären oder Mikrosphären, die biologisch abbaubare Materialien wie Albumin oder semibiologisch abbaubare Materialien wie Dextran und Alkylcyanoacrylat- Polymere umfassen, oder aus nicht-ionischen Tensiden oder Liposomen gebildete Vesikel umfaßt.
• Arzneimittel können entweder kovalent mit dem AAS verknüpft oder passiv darin eingeschlossen sein, Beispielsweise können TAAS, umfassend Tensid-Vesikel oder Liposomen, hydrophile oder hydrophobe pharmazeutisch aktive Verbindungen einschließen, indem sie aus einer geeigneten Kombination von Schichten von Tensid oder Lipidmolekülen gebildet werden. Pharmazeutisch aktive Verbindungen sind mit MAAS gewöhnlich kovalent über eine Bindung verknüpft, die im Körper lysiert werden kann oder nicht, beispielsweise vor oder nachdem die aktive Verbindung ihre Funktion erfüllt. Liposomen werden von Gregoriadis in NIPS, 4, 146-151 (1989), und in "Liposomes as Drug Carriers: Recent Trends and Progress", Hrsg. Gregoriadis (1988), Wiley, erörtert.
• Viele MAAS haben eine inhärente (z. B. Antikörper) oder erworbene (z. B. Neoglycoproteine) Fähigkeit, von Zielzellen oder -geweben durch Rezeptoren auf der Oberfläche der letzteren erkannt zu werden. Typischerweise werden solche AAS nach einer Injektion spezifisch von dem Ziel aufgenommen. Die spezifische Aufnahme ist jedoch beschränkt, die Hauptmenge des AAS wird von anderen (für die Therapie) irrelevanten Geweben aufgenommen. Der Grund dafür liegt darin, daß Antikörper und andere AAS-Proteine (unabhängig von ihrer Spezifität für das Ziel) wie andere Proteine am Ende ihres biologischen Lebens katabolisiert werden müssen.
• Proteinmoleküle haben keine feste Lebensspanne und sie "sterben" statistisch. So beginnen die Proteinmoleküle (zusammen mit ihrer Arzneimittellast) vom Moment der Injektion an mit linearer Geschwindigkeit katabolisiert zu werden, wobei nur einige der Moleküle in der Lage sind, mit dem Ziel in Kontakt zu kommen und davon aufgenommen zu werden.
• AAS wie Maus-Antikörper sind bei Injektion in eine andere Spezies fremd. Die Wirtsspezies entwickelt Antikörper, um mit dem fremden Protein bei einer nachfolgenden Injektion fertigzuwerden. Solche Proteine werden nach der ersten Injektion durch schlecht verstandene Mechanismen aus dem Kreislauf entfernt. AAS wie künstlich hergestellte Polymere werden von Opsoninen erkannt und durch das retikuloendotheliale System (RES), hauptsächlich Leber- und Milzmakrophagen, entfernt. In jedem Fall schließt die Sequenz der Ereignisse die Erkennung der AAS- Komponente und die Bindung daran durch Proteine des Wirtsorganismus ein und wird gewöhnlich dadurch initiiert. Eine Unterbrechung der Erkennung und/oder der Bindungsschritte stört den Katabolismus der Komponentenmoleküle.
• Synthetische Polymere, die bei dem MAAS vom makromolekularen Typ verwendet werden, sind beispielsweise Poly(hydroxypropylmethacrylamid), Polylysin und polymerisierte Alkylcyanoacrylate. Diese können im RES-System oder anderen Geweben durch geeignete lysosomale Enzyme katabolisiert werden. Es wäre wünschenswert, die Geschwindigkeit des Katabolismus solcher biologisch abbaubarer AAS vom makromolekularen Typ auf irgendeine Weise zu reduzieren, beispielsweise durch Verringerung der Aufnahme der AAS durch das RES oder andere Gewebe oder durch Verringerung des Abbaus durch lysosomale Enzyme nach der Aufnahme durch das RES.
• Teilchenförmige AAS (TAAS) werden in der Regel durch das RES aus dem Kreislauf entfernt. Aufgrund ihrer Neigung für das RES werden TAAS oft zur Abgabe von Arzneimitteln an diese Gewebe verwendet. Es ist jedoch oft wünschenswert, daß TAAS direkt zu anderen Geweben als denjenigen des RES gelenkt werden. Zur Erreichung dieses Ziels muß die RES-Aufnahme von TAAS blockiert oder verzögert werden.
• Dies wurde bis zu einem gewissen Grad erreicht durch Bschichten von TAAS mit hydrophilen Makromolekülen, wie z. B. Polyethylenglycol (PEG) oder von Ethylenoxid und Propylenoxid; einschließlich solcher Blöcke, die aus Ethylendiamin gebildet sind, erhältlich unter den Handelsbezeichnungen Pluronic, Tetronic, Poloxamer und Poloxamin. Diese Polymere sind künstlich hergestellt. Deren Einsatz wird von um in GB-A-2185397, von Illum und Davis in FEBS Letts. (1984) 167, 79-82, von Illum et al. in Life Sciences (1987) 40, 367-374, von Hunter et al., Scand. J. Immunol. 23, 287 (1986), von Senior et al. in Biochem. Biophys. Acta (1991) 1062, 77-82, und in WO-A-9004384 beschrieben. PEG und Block-Copolymere von Ethylenoxid sind stark hydrophil, eine Eigenschaft, welche für deren Fähigkeit zur Verhinderung oder Verzögerung von (a) der Erkennung von TAAS (mit denen solche Polymere verknüpft sind) durch Gewebe, welche diese vorzeitig aufnehmen, (b) des Verlusts von Arzneimittel, Peptiden und Proteinen (mit denen solche Polymere verknüpft sind) durch vorzeitige Ausscheidung oder Aufnahme durch irrelevante Gewebe verantwortlich sind.
• Abuchowski et al. offenbaren in J. Biol. Chem. (1977) 252, 3282-86, die kovalente Verknüpfung von PEG zweier Molekulargewichte (1900 und 5000) mit Katalase, welche die Immunogenizität des Proteins verringerte und dessen Halbwertszeit im Kreislauf von Mäusen erhöhte. Abuchowski postuliert, daß das Verfahren den Einsatz von Einzymtherapie beispielsweise zur Änderung von Blutmetaboliten oder zur Behandlung von Speicherkrankheiten erlauben würde. Es wäre jedoch wünschenswert, die Halbwertszeit von Proteinen (und Peptiden etc.) sogar noch weiter zu erhöhen, als PEG dazu in der Lage zu sein scheint.
• Abuchowski et al. offenbaren auch, daß sie die Idee des Einsatzes von Dextran (ein Polysaccharid) anstelle von PEG verwarfen, da Dextran bekanntermaßen bei Menschen immunogen ist. In GB-A-2185397 wird vorgeschlagen, daß Polysaccharide, Xanthan und Hyaluronsäure anstelle von Ethylenoxid-Propylenoxid- Blockcopolymeren eingesetzt werden könnten, um die Aufnahme von kolloidalen Teilchen durch die Leber zu verhindern. Es wird angegeben, daß die Anwesenheit von Carboxylgruppen in Xanthangummi für die erwünschte Wirkung vorteilhaft sei. Es werden keine Polysaccharide tatsächlich getestet, noch werden irgendwelche Informationen dahingehend vermittelt, wie Polysaccharide mit der Oberfläche des kolloidalen Teilchens verknüpft werden könnten.
• Senior et al. (oben zitiert) und WO-A-9004384 beschreiben die Beschichtung von Liposomen mit Polyethylenglycol (PEG) durch kovalente Kopplung von Monomethoxy-PEG an Phospholipid. Die Beschichtung führte dazu, daß die Clearance-Zeit von Liposomen aus dem Blut um bis zu 30% erhöht wurde und daß die Liposomen Plasmakomponenten langsamer adsorbierten. Beide Faktoren wurden als das Ergebnis davon angesehen, daß die Oberfläche der Vesikel durch das PEG hydrophiler gemacht wurde.
• (n FEBS Letts. (1987) 283, 42-46, beschreiben Allen & Chonn die Inkorporation von Gangliosiden und deren Asialylderivaten in Liposomen. Ganglioside sind Glycosphingolipide, die zwei Fettsäureketten (hauptsächlich Stearinsäure), Sphingosin und eine Oligosaccharidkomponente, umfassend 5 Einheiten, einschließlich Galactose und eine Sialsäureeinheit, umfassen. Die Inkorporation von Gangliosid erhöhte die Zirkulationszeit von Liposomen und verursachte eine Erhöhung des Anteils von Liposomen, die im Blut gefunden wurden, im Vergleich zur Leber, was anzeigt, daß die RES Aufnahme der Liposomen vermindert ist. Die Wirkung ist für Asialylganglioside weniger ausgeprägt, was von den Autoren als Anzeichen dafür interpretiert wird, daß die Sialsäure und insbesondere deren negative Ladung auf der Liposomenoberfläche für die zu verleihende Wirkung von Bedeutung ist.
• In "Medical Application of Liposomes", (Hrsg. K. Yogi) 1986, beschreibt Sunamoto in dem Kapitel mit der Bezeichnung "Liposomes in Chemotherapy and Immunotherapy", S. 121-129; die Beschichtung; von Liposomen mit verschiedenen Polysacchariden, einschließlich Dextran, Pullulan, Amylopectin, Amylose und Mannan, um die Liposomen gezielt zu speziellen Geweben und Zellen, insbesondere der Lunge, zu lenken. Die Daten zeigen, daß die Verkapselung des Arzneimittels in den Polysaccharid-beschichteten Liposomen die Zirkulationszeit des Arzneimittels (Inulin) im Blutstrom und im Gewebe im Vergleich mit freiem Inulin erhöht. Es gibt keine Daten zum Vergleich der Stabilität und Clearance des Arzneimittels in beschichteten und unbeschichteten Liposomen im Blutstrom; dies gilt auch für den Austritt des Arzneimittels aus Liposomen, und diese Fakten werfen hinsichtlich der Zuverlässigkeit der Schlüsse bezüglich der Wirkung der Polysaccharidbeschichtung Zweifel auf; nach diesem Dokument könnte jedoch erwartet werden, daß die zielgerichtete Lenkung der Liposomen durch die Polysaccharidbeschichtung zur Lunge oder anderen Geweben die Zirkulationszeit der Liposomen verringern würde. Andere Forscher haben den Einsatz von Glycoproteinen und Glycolipiden zur zielgerichteten Lenkung von Liposomen beschrieben, siehe beispielsweise Gregoriadis 1989, 1988 und 1987, oben zitiert.
• In US-A-4501728 wird vorgeschlagen, eine biochemische Membran mit Sialsäureresten zu bedecken, um das Liposom vor einer Erkennung durch das Retikuloendothel zu maskieren. Die Liposomen können ein eingeschlossenes pharmazeutisches Agens enthalten. Die Sialsäurebeschichtung wird bereitgestellt, indem die Membran aus amphiphilen Molekülen hergestellt wird, welche am terminalen Ende des hydrophilen Abschnitts eine einzige Sialsäuregruppierung aufweisen, die mit einer Galactosegruppierung verbunden ist, dann eine Glucosegruppierung, eine Fettsäure und Sphingosin.
• Jennings und Lugowski beschreiben in J. Immunology (1981) 127, 1011-1018, die Konjugation von Meningokokken-Polysacchariden der Gruppen A, B und C an Tetanus-Toxoid, um in einem Versuch zur Herstellung eines Vakzins für Neisse da meningitidis die Immunogenizität des Polysaccharids zu erhöhen. Die Immunogenizität des Gruppe B-Polysaccharids wurde nicht signifikant erhöht, das Konjugat löste jedoch immer noch Antikörper gegen das Tetanus-Toxoid aus.
• Gemäß der vorliegenden Erfindung wird bereitgestellt die neue Verwendung einer Polysaccharidverbindung, deren Polysaccharidkomponente mehr als 5 Sialsäureeinheiten pro Molekül enthält, wobei die mehr als 5 Sialsäureeinheiten in der Kette des Polysaccharidpolymers vorliegen, in einem Verfahren zur Herstellung eines pharmazeutischen Zusammensetzung, die einen aktiven Bestandteil zur Verwendung in einem Behandlungsverfahren umfaßt, in welchem Verfahren die Verfügbarkeit des aktiven Bestandteils im Kreislauf eines Patienten verlängert wird, die Immunogenizität des aktiven Bestandteils verringert wird und/oder die Stabilität des aktiven Bestandteils in vivo erhöht wird.
• Bei der Erfindung kann die Verlängerung der Verfügbarkeit des aktiven Bestandteils im Kreislauf eines Patienten durch entweder Verhinderung oder Verzögerung der Erkennung des pharmazeutisch aktiven Bestandteils oder Komplexes, der diesen enthält, durch Gewebe, welche ansonsten das Arzneimittel oder den Arzneimittelkomplex aufnehmen würden, oder durch Verhinderung oder Verzögerung des Verlusts des pharmazeutischen Bestandteils durch vorzeitige Ausscheidung oder Aufnahme durch therapeutisch irrelevante Gewebe auf andere Weise als spezifische Erkennung erzielt werden. Diese Effekte erhöhen auch die Stabilität des aktiven Bestandteils. Die Polysaccharidverbindung unterdrückt zusätzlich oder alternativ die Immunreaktion, welche ansonsten durch den pharmazeutisch aktiven Bestandteil oder den diesen enthaltenden Komplex ausgelöst würde, indem sie die ersten Erkennungsschritte bei der Immunreaktion stört. Die Erfindung ist von hauptsächlicher Bedeutung für pharmazeutische Zusammensetzungen für die parenterale Verabreichung.
• Bei der Erfindung kann die Polysaccharidverbindung ein natürlich vorkommendes Polysaccharid sein, ein Derivat eines natürlich vorkommenden Polysaccharids, beispielsweise ein Polysaccharid, welches durch Umsetzung einer oder mehrerer aktiven(r) Gruppe(n) auf den Saccharidresten derivatisiert wurde oder welches an irgendeinem Ende der Polysaccharidkette oder über eine aktive Gruppe mitten in der Kette kovalent mit einer derivatisierenden Gruppe verknüpft wurde, oder sie kann ein natürlich vorkommendes Polysaccharidderivat sein, das beispielsweise verknüpfte Phospholipide oder Proteine umfaßt, oder Derivate von natürlich vorkommenden Polysaccharidderivaten, beispielsweise chemisch derivatisierte Verbindungen, wie z. B. hydrolysierte oder anderweitig chemisch umgesetzte Derivate. Der Polysaccharidanteil der Verbindung weist mehr als 5, vorzugsweise mindestens 10 und noch bevorzugter mindestens 20 oder 50, Sialsäurereste in der Polymerkette auf. Leicht verfügbare Polysaccharidverbindungen können bis zu insgesamt 500 Saccharidreste aufweisen, weisen jedoch gewöhnlich weniger als 300 Reste in der Polymerkette auf. Vorzugsweise sind die meisten oder alle Saccharidreste in der Verbindung Sialsäurereste.
• Der Polysialsäureanteil mindestens der Polysaccharidverbindung und vorzugsweise der gesamten Verbindung ist stark hydrophil. Es wird angenommen, daß eine hohe Hydrophilizität die Wahrscheinlichkeit verringert, daß die Polysaccharidverbindung von Geweben erkannt oder aufgenommen und katabolisiert wird. Die Hydrophilizität des Polysaccharids wird primär durch die seitenständigen Carboxylgruppen der Sialsäureeinheiten sowie die Hydroxygruppen verliehen. Andere Gruppen, einschließlich Gruppen auf anderen Saccharideinheiten, wie z. B. Amin-, Hydroxyl- oder Sulfatgruppen oder Kombinationen dieser Gruppen, können auf der Saccharideinheit vorliegen. Diese Gruppen können in der nativen Polysaccharidverbindung vorliegen oder (weniger bevorzugt) können durch chemische Reaktion von vorhandenen nativen Gruppen eingeführt werden. Vorzugsweise ist das Polysaccharid unter den im Kreislauf vorgefundenen Bedingungen, d. h., injiziert, negativ geladen. Das Polysaccharid kann Einheiten mehrerer verschiedener Saccharide umfassen.
• Polysaccharidverbindungen, welche in der Erfindung von besonderem Nutzen sind, sind Polysaccharidverbindungen, die von Bakterien produziert werden. Die natürlichen Verbindungen sind oft Glycolipide, d. h., eine Verbindung, die eine Polysaccharidkomponente über Phosphatesterverknüpfungen mit Phospholipiden verknüpft umfaßt. Solche Glycolipide können in der Erfindung in ihrer nativen Form eingesetzt werden oder in einigen Fällen können Derivate, in denen die Fettsäureketten von dem Polysaccharid abhydrolysiert wurden, vorzuziehen sein.
• Nachdem Sialsäure-Polysaccharide T-Zell-unabhängige Antigene sein können, aktivieren sie (nach einer Injektion) B-Zellen direkt, um hauptsächlich IgM- Antikörper zu bilden. Diese Antikörper überdauern nur einige wenige Tage und somit sind Polysaccharide schlechte Immunogene. Dies ist hinsichtlich ihrer Verwendung in der vorliegenden Erfindung von Vorteil.
• Es ist bevorzugt, daß die Polysaccharidverbindung im wesentlichen frei von endständigen Galactoseeinheiten ist, da diese von Galactose-Rezeptoren auf Hepatozyten und Kuppfer-Zellen erkannt und daher noch schneller aus dem Kreislauf entfernt werden könnten.
• Sialsäuren (auch als Nonulosonsäuren bekannt) sind Mitglieder einer Familie von Amino-haltigen Zuckern, die 9 oder mehr Kohlenstoffatome enthalten. Die bedeutendste der Sialsäuren ist N-Acetylneuraminsäure (auch bekannt als 5-(Acetylamino)-3,5-didesoxy-D-glycero-D-galactononulosonlactaminsäure und O-Sialsäure), welche die Formel:
• aufweist.
• Polysialsäuren können 2→8- und/oder 2→9-verknüpft sein, gewöhnlich in der α-Konfiguration.
• Polysialsäuren werden im allgemeinen als nicht toxisch und im wesentlichen nicht immunogen befunden. Ferner ist die Einheit des biologischen Abbaus, Sialsäure, nicht als toxisch bekannt und in der Tat werden Sialsäuren weitverbreitet in Tierzellen, einschließlich Blutzellen, gefunden.
• Polysaccharidverbindungen, die viele Sialsäureeinheiten enthalten, sind Polysaccharide, welche von E. coll, Moraxella nonliquifaciens, Pasteurella aeroginosis und Neisseria meningitidis oder Derivaten davon gebildet werden. Beispielsweise weist die aus E. coll K1 (durch-Hydrolyse zur Verkürzung der Kettenlängen) erhaltene Colominsäure 2→8-α-verknüpfte Sialsäureeinheiten auf und besitzt eine mittlere Kettenlänge von etwa 16 Einheiten. Polysaccharid aus dem E. coll K92-Stamm umfaßt alternierend 2→8- und 2-49-verknüpfte Sialsäureeinheiten und besitzt eine mittlere Kettenlänge von etwa 78 Einheiten. Polysaccharid C der N. meningitidis Gruppe C besitzt 2→9-verknüpfte Sialsäureeinheiten und weist eine mittlere Kettenlänge von etwa 316 Einheiten auf. Die deacetylierte Version der zuletztgenannten Verbindung besitzt eine mittlere Kettenlänge von etwa 172 Einheiten.
• Eine Gruppe von Polysaccharidverbindungen, welche als von besonderem Nutzen in der Erfindung befunden wurde, sind die Gruppe B-Polysaccharide. Diese Verbindungen werden von Neisseria meningitidis, Moraxella nonliquifaciens, Pasteurella aeroginosis A2 und E. coli K1 produziert. Diese Verbindungen umfassen eine Polysaccharidkomponente, die Sialsäurereste und eine Phospholipidkomponente umfaßt. Die Sialsäurereste sind (2-> 8)-α-verknüpft, das natürlich vorkommende Polymer besteht aus etwa 200 Resten. Das Glycolipid scheint ein kovalent verknüpftes Phospholipid am reduzierenden Ende der Polysaccharidkomponente zu besitzen.
• Es ist vorzuziehen, daß die Bakterien, von denen die Polysaccharidverbindung stammt, aus Gründen der Bequemlichkeit während der Produktion nicht pathogen sind. Es ist deshalb besonders günstig, wenn das Polysaccharid von einem nicht-pathogenen Stamm von E. coli wie E. coli K92 stammt. E. coli K92- Isolate sind wohlbekannt und ein beliebiger Typ eines beliebigen solchen Stammes kann als Quelle eines geeigneten Polysaccharids verwendet werden.
• Eine Polysaccharidverbindung, Welche ein Glycolipid ist, kann entweder in Form des natürlich vorkommenden Glycolipids eingesetzt werden oder es kann ein Derivat eingesetzt werden. Ein besonders geeignetes Derivat ist eines, in dem die Fettsäureketten von der Glycerophosphatgruppe abhydrolysiert wurden, um den Polysialsäureglycerophosphatester zurückzulassen. Die Hydrolyse erfolgt gewöhnlich durch Behandlung mit mildem Alkali. Diese Behandlung verhindert eine Aggregation der Glycolipidmoleküle, welche ansonsten in einem wäßrigen Medium durch die hydrophoben Wechselwirkungens zwischen den Fettsäureketten der Moleküle stattfindet. Die Deaggregation von N. meningitidis-Polysaccharid B wird von Lifely et al. in "Gonococci and Meningococci" (1988) von Poolman et al. (Hrsg.), S. 147-152, beschrieben.
• Die nativen Polysaccharide können hydrolysiert werden, um kürzere Kettenlängen zu bilden, beispielsweise wie von Lifely et al. in Carbohydrate Res. (1986) 156, S. 123, beschrieben. Die Bedingungen bei der Hydrolysereaktion (beispielsweise von Zeit und Temperatur) können so gewählt werden, daß ein ausgewähltes mittleres Molekulargewicht des Produkts erzielt wird.
• Die oben genannten Polysaccharide können ferner durch N-Deacetylierung einiger oder aller der 5-N-Acetylgruppen der Sialsäureeinheiten derivatisiert werden. Die resultierenden 5-Amingruppen können weiter derivatisiert werden, beispielsweise durch partielle N-Reacetylierung, N-Acylierung durch andere Säuren als Essigsäure, einschließlich Aminosäuren oder Peptide oder Fettsäuren.
• Eine weitere Art der Derivatisierung der Polysaccharide ist durch Oxidation mit Natriumperiodat, welche eine Aldehydgruppe am nichtreduzierenden Ende der Polysialsäurekette bildet. Eine Schiffsche-Base-Reaktion kann dann mit einer Aminogruppe eines Arzneimittels (z. B. einer Proteinseitenkette oder -endgruppe) stattfinden.
• Es wurde festgestellt, daß bei Einführung dieser Sialsäure-enthaltenden Polysaccharidverbindungen in den Blutstrom von Patienten ein Anteil schnell vom Blutstrom aufgenommen und der Rest eliminiert wird, gewöhnlich mit einer gleichmäßigen Geschwindigkeit. Die Halbwertszeit der Verbindung nach dem anfänglichen schnellen Aufnahmeschritt ist ein guter Indikator der Eignung der Polysaccharidverbindung in der Erfindung zur Verlängerung der Zirkulationszeiten und/oder Stabilität eines aktiven Bestandteils und/oder Verringerung seiner Immunogenizität, wobei Verbindungen mit langen Halbwertszeiten besonders geeignet sind. Der Anteil der Verbindungen, welcher im ersten schnellen Schritt eliminiert wird, ist ebenfalls ein Indikator der potentiellen Eignung, bei brauchbaren Verbindungen wird kein oder nur ein kleiner Anteil der Verbindung im ersten Schritt aus dem Kreislauf entfernt.
• Es ist bevorzugt, daß die im der Erfindung verwendete Polysaccharidverbindung eine Verbindung ist, bei der weniger als etwa 50%, vorzugsweise weniger als etwa 25%, noch bevorzugter weniger als etwa 20%, nach intravenöser Verabreichung aus dem Kreislauf entfernt wird, beispielsweise innerhalb eines Zeitraums von etwa 5 Minuten nach der Injektion. Eine geeignete Polysaccharidverbindung hat nach dem Stadium der schnellen Entfernung vorzugsweise eine Halbwertszeit (in dem Lebewesen, welches mit der Zusammensetzung behandelt wird) von mindestens 10 h, vorzugsweise mindestens 20 h, beispielsweise 30 h oder mehr, für eine optimale Wirkung. Es wird festgestellt, daß eine Korrelation zwischen der Anzahl von Sialsäureeinheiten in dem Polysaccharid und der unmittelbaren Entfernung und der Halbwertszeit der Verbindung besteht, so daß Verbindungen, die mehr als etwa 20, bevorzugter mehr als 50 und noch bevorzugter mehr als 100 Einheiten, im Mittel besitzen, besonders gute Eigenschaften aufweisen. Vorzugsweise werden deshalb Polysialsäureverbindungen mit maximaler Kettenlänge eingesetzt, obwohl es für einige Zwecke vorteilhaft sein kann, daß die natürliche Polysaccharidverbindung zu kürzeren Kettenlängen hydrolysiert ist, beispielsweise zur Beschichtung von Liposomen oder zur Konjugation mit Proteinen.
• In der Erfindung kann die pharmazeutisch aktive Verbindung direkt kovalent mit der Polysaccharidverbindung verknüpft sein. Die aktive Verbindung kann mit der Polysaccharidverbindung in stöchiometrischen Mengen verknüpft sein, d. h., ein Molekül des aktiven Bestandteils kann mit einem Molekül der Polysaccharidverbindung verknüpft sein. Alternativ kann es günstig sein, daß zwei oder mehr Moleküle des aktiven Bestandteils kovalent mit einem Molekül der Polysaccharidverbindung verknüpft oder daß zwei oder mehr Moleküle der Polysaccharidverbindung mit einem Molekül des aktiven Bestandteils verknüpft sind.
• Die kovalente Verknüpfung kann beispielsweise über eine Peptidbindung zwischen einer Carboxylgruppe auf einem der Moleküle und einer Amingruppe auf dem anderen erfolgen oder über eine Esterverknüpfung zwischen einer Carboxylgruppe auf einer Verbindung und einer Hydroxylgruppe auf der anderen Verbindung. Manchmal kann die Verknüpfung eine sein, welche im Körper lysiert werden kann, beispielsweise innerhalb des Gewebes, in dem dir aktive Bestandteil seine Wirkung ausübt. Eine solche Lysis ist jedoch oft unnötig, da das Polysaccharid keine erhebliche Wirkung auf die Aktivität des aktiven Bestandteils haben mag. Eine weitere Verknüpfung, über die der aktive Bestandteil kovalent an die Polysaccharidverbindung gebunden sein könnte, ist die über eine Schiffsche Base zwischen einer Aminogruppe auf einer der Verbindungen und einer Aldehydgruppe auf der anderen Verbindung.
• Eine pharmazeutisch aktive Verbindung kann kovalent mit einem Sialsäureenthaltenden Polysaccharid oder einem Derivat davon verknüpft werden, beispiels-Weise durch Bildung einer Schiffschen Base zwischen einer freien Aminogruppe auf dem aktiven Bestandteil, die mit einer Aldehydgruppe, welche am nichtreduzierenden Ende des Polymers durch Periodat-Oxidation gebildet wurde, umgesetzt wird. Alternativ kann eine freie Amingruppe auf einer pharmazeutisch aktiven Verbindung mit der 1-Carboxylgruppe des Sialsäurerests umgesetzt werden, um eine Peptidylbindung zu bilden. Alternativ kann eine Esterverknüpfung zwischen der 1-Carbonsäuregruppe und einer Hydroxylgruppe oder anderen geeigneten aktiven Gruppe auf dem aktiven Bestandteil ausgebildet werden. Alternativ kann eine Carboxylgruppe auf einer pharmazeutisch aktiven Verbindung eine Peptidverknüpfung mit einer deacetylierten 5-Aminogruppe bilden. Alternativ kann eine Aldehydgruppe eines Moleküls einer pharmazeutisch aktiven Verbindung eine Schiffsche Base mit der N-deacetyüerten 5-Aminogruppe eines Sialsäurerests bilden. Difunktionelle Verknüpfungsverbindungen können eingesetzt werden, beispielsweise zur Verknüpfung von Amin- und Thiolgruppen oder zur Verknüpfung von zwei Hydroxylgruppen.
• Alternativ kann die Polysaccharidverbindung in nicht-kovalenter Weise mit der pharmazeutisch aktiven Verbindung assoziiert sein. Beispielsweise können die Polysaccharidverbindung und die pharmazeutisch aktive Verbindung über hydrophobe Wechselwirkungen verknüpft sein, beispielsweise über Lipidkomponenten der Polysaccharidverbindung mit einer hydrophoben pharmazeutisch aktiven Verbindung. Andere nicht-kovalente Assoziationen können über elektrostatische Wechselwirkungen stattfinden, wobei entgegengesetzte Ionen einander anziehen. Beispielsweise kann ein positiv geladener aktiver Bestandteil, der beispielsweise quaternäre Ammoniumionen umfaßt, an Carboxylatgruppen auf dem Polysaccharid ionisch gebunden sein. Ein Beispiel wäre das Antibiotikum Doxorubicin in ionischer Bindung an Carboxylatgruppen von Polysaccharid B.
• In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann die Polysaccharidverbindung über ein Arzneimittelabgabesystem mit der pharmazeutisch aktiven Verbindung wechselwirken. Beispielsweise kann die Polysaccharidverbindung eingesetzt werden, um die Verfügbarkeit des aktiven Bestandteils im Kreislauf zu beeinflussen, indem die Erkennung und Aufnahme der herkömmlichen molekularen oder teilchenförmigen Komponenten von AAS des oben beschriebenen Typs beeinflußt wird. In dieser Ausführungsform kann die Polysaccharidverbindung mit dem teilchenförmigen oder molekularen Gebilde des Arzneimittelabgabesystems kovalent verknüpft oder nicht kovalent assoziiert sein. Beispielsweise kann die Polysaccharidverbindung in einer zur Wirkung von Polyethylenglycol und/oder der oben erörterten Materialien vom Pluronic-Copolymer- Typ analogen Weise wirken.
• Beispiele kovalenter Wechselwirkungen zwischen der Polysaccharidverbindung und einem Liposom könnten Phosphatesterverknüpfungen zwischen den Glycerophosphat-Kopfgruppen der Phospholipide sein. Die kovalenten Bindungen können entweder vor oder nach Formierung der Phospholipide zu Vesikeln gebildet werden. Alternativ kann das Polysaccharid mit Lipidkomponenten über Wechselwirkungen zwischen der 1-Carbonsäuregruppe von Sialsäure, Hydroxylgruppen auf dem Polysaccharid oder Amingruppen, die durch Deacetylierung gebildet wurden, und reaktiven Gruppen auf Molekülen, einschließlich hydrophober Ketten, verknüpft sein. Beispielsweise können die hydrophoben Moleküle Lipide sein, insbesondere Phosphatidylethanolamin-Derivate, mit deren Amingruppe kovalente Verknüpfungen gebildet werden können. Gleichermaßen können kovalente Wechselwirkungen zwischen nicht-ionischen synthetischen Tensid- Vesikeln und Polysaccharidverbindungen über Ester, Amid- oder Etherverknüpfungen auf den hydrophilen Anteilen der Moleküle, entweder vor oder nach Formierung der Vesikel ausgebildet, stattfinden.
• Alternativ kann die Polysaccharidverbindung nicht kovalent mit einer TAAS- Komponente verknüpft sein. Nicht-kovalente Verknüpfungen können beispielsweise Wasserstoffbrücken-Wechselwirkungen zwischen hydrophoben Anteilen der TAAS- Komponente und einer Polysaccharidverbindung, welche eine hydrophobe Gruppe umfaßt (welche z. B. ein Glycolipid ist) oder welche kovalent mit einer hydrophoben Gruppe verknüpft wurde, darstellen. Solche hydrophoben Derivate der Polysaccharidverbindung können gebildet werden durch Umsetzung der 1-Carbonsäuregruppe eines Sialsäurerests in der Polysaccharidverbindung oder einer Hydroxylgruppe der Polysaccharidverbindung oder eines Aldehyd-Derivats eines Polysaccharidmoleküls mit beispielsweise einer Hydroxylgruppe, einer Carbonsäuregruppe, einem Halogenatom oder einer Amingruppe. Beispielsweise kann eine Glycolipidverbindung in die Hülle eines Liposoms oder Tensid-Vesikels inkorporiert werden, wobei deren hydrophoben Fettsäurekettenanteile mit den hydrophoben Anteilen der Lipide oder Tenside wechselwirken. Die Polysaccharide B, K92 würden beispielsweise zur Verwendung in dieser Anmeldung geeignet sein. Das Glycolipid würde günstigerweise mit den Tensiden oder Phospholipiden inkorporiert während die Vesikel gebildet werden oder nach Bildung der Vesikel durch Äquilibrierung des Glycolipids mit vorgebildeten Liposomen.
• Wenn das AAS eine makromolekulare Komponente umfaßt, wie z. B. einen Antikörper, ein Neoglycoprotein oder synthetisches Polymer, kann die Polysaccharid-komponente kovalent oder nicht kovalent mit der makromolekularen Komponente assoziiert sein. Kovalente Verknüpfungen könnten über Ester-, Peptidverknüpfungen oder andere Verknüpfungen des Typs, der oben für Verknüpfungen zwischen pharmazeutisch aktiven Verbindungen und der Polysaccharidverbindung beschrieben wurde, erfolgen und finden am günstigsten über Peptidverknüpfungen mit Carboxyl- oder Amingruppen auf dem Peptidanteil des Makromoleküls statt.
• Viele Beispiele von Verfahren zur Bildung kovalenter Verknüpfungen zwischen Polysacchariden und anderen Verbindungen, wie z. B. Proteinen, Peptiden oder Lipiden, sind bekannt und können eingesetzt werden, um die oben vorgeschlagenen kovalenten Bindungen zu erzielen. Beispielsweise können reduzierende Zucker mit Amingruppen, beispielsweise des N-Terminus eines Peptids, von Seitenketten Lysin-haltiger Peptide oder Ethanolamingruppen von Lipiden, verknüpft werden durch eine reaktive Aminierungsprozedur wie von Gray, G., Arch. Biochem. Biophys. 163, 426 (1974), beschrieben, gefolgt von einer selektiven Reduktion des Enamin-Zwischenprodukts durch ein Cyanohydridoboratanion wie von Borch, R. F. et al. in J. Am. Chem. Soc. 93, 2897 (1971), beschrieben, um ein sekundäres Amin zu bilden. Nicht-reduzierende Zucker, einschließlich Sialsäurereste, können zuerst durch selektive Oxidation unter Verwendung von Periodat wie von Jennings, H. J. et al., J. Immunol. 127, 1011 (1981), beschrieben derivatisiert werden, um eine Aldehydgruppe zu bilden, bevor sie in der Aminierungsreaktionsprozedur gekoppelt werden.
• Eine alternative Reaktion, basierend auf dem von Weissig, V. et al., FEBS Leta 202, 86 (1986), beschriebenen Verfahren, koppelt die Carbonsäuregruppe einer Saccharideinheit, z. B. von Sialsäure, in Gegenwart eines Carbodiimids an eine Aminogruppe, z. B. des N-Terminus eines Peptids oder der Seitenkette eines Lysinrests. Natürlich könnte dieses Verfahren auch eingesetzt werden, um eine 5-deacetylierte Amingruppe einer Sialsäureeinheit an eine Carbonsäuregruppe in beispielsweise einer Proteinseitenkette oder einem C-Terminus zu koppeln.
• Eine alternative Reaktion beinhaltet die Diazotierung einer aromatischen Amingruppe, die in das Polysaccharid eingeführt wurde, beispielsweise unter Verwendung von para-Phenylendiamin, das mit einer Carbonsäuregruppe umgesetzt wurde, gefolgt von der Reaktion mit der Seitenkette eines Phenylalanin- oder Tyrosinrests des Proteins, ähnlich der von Snyder, S. L, et al., Biochim. Biophys. Acta, 772, 288 (1984), entwickelten und von Senior et al., BBA 1003, 58, (1989), modifizierten Technik.
• Freie Hydroxylgruppen auf einer Polysaccharidverbindung können mit freien Hydroxylgruppen oder Thiolgruppen auf einem Protein oder Lipid beispielsweise mittels Veresterung unter Verwendung einer(s) zweiwertigen Säure oder Säurederivats verknüpft werden.
• Wenn die an die Kohlenhydratgruppierung zu koppelnde Verbindung eine Isothiocyanatgruppe enthält (oder beispielsweise über eine Arylgruppe derivatisiert werden kann, um eine solche zu enthalten), kann diese beispielsweise durch Umsetzung in Methylsulfoxid, katalysiert durch Dibutylzinndilaurat, nach dem von de Beider et al. in Carbohydrate Res. (1973), 30, 375-378, beschriebenen Verfahren an eine freie Hydroxylgruppe des Polysaccharids gekoppelt werden. Das Produkt ist ein Thiocarbamoyl-Derivat. Beispielsweise kann Fluoresceinisothiocyanat umgesetzt werden, um ein O-(Fluoresceinylthiocarbamoyl)sialsäure-Derivat zu bilden.
• Alternative Reaktionen eines Sialsäure-enthaltenden Polysaccharids beinhalten partielle Deacetylierung, d. h., Entfernung einiger der N-Acetylgruppen, um freie Amingruppen zu erzeugen, gefolgt von der Umsetzung dieser Amingruppen durch kovalente Kopplungsreaktionen wie oben beschrieben. Eine weitere Reaktion, welche durch diese einleitende Deacetylierung ermöglicht wird, ist die Umsetzung mit einem hetero-bifunktionellen Reaktanten wie dem N-Hydroxysuccinimidester von Iodessigsäure, N-Succinimidyl-4-(2-bromacetylamino)benzoat oder N-Succinimidyl-3- (2-pyridyldithio)propionat, gefolgt von der Kopplung an die Thiolgruppe eines Peptids oder Proteins, wie von Wolffund Gregoriadis in Biochim. Biophys. Acta (1984) 802, 259-273, und Barbet et al. in J. Supramol. Struct. Gell. Biochem. (1981) 16, 243-258, beschrieben.
• Wenn die Polysaccharidverbindung zur Beschichtung eines Liposoms eingesetzt wird, kann sie bei der Bildung des Liposoms inkorporiert werden, beispielsweise durch Mischen einer verankerten Polysaccharidverbindung, d. h., die mit einer hydrophoben Ankergruppierung versehen ist, mit dem Liposomen-bildenden Lipid. Alternativ kann die Polysaccharidverbindung nachträglich mit der Oberfläche eines vorgebildeten Liposoms durch Reaktion mit aktiven Gruppen auf der Liposomenoberfläche, wie z. B. Amingruppen, aromatischen Amingruppen, Carbonsäuregruppen oder Derivaten, wie z. B. Säurechloridgruppen, umgesetzt werden. Beispielsweise beschreiben Weissig, V. et al. (oben zitiert) einen Anker, welcher das N-Glutaryl-Derivat von Phosphatidylethanolamin ist. Die Carbonsäuregruppe kann mit Amingruppen auf einer Polysaccharidverbindung, beispielsweise einer deacetylierten oder partiell deacetylierten Polysialsäureverbindung, in Gegenwart eines Carbodiimids umgesetzt werden. Alternativ kann Palmitoyl- oder ein anderes Fettsäurechlorid eingesetzt werden, um mit Amingruppen auf einer Polysaccharidverbindung zu reagieren. Die 1-Carbonsäuregruppe eines Sialsäurerests kann eingesetzt werden zur Bildung einer Esterverknüpfung mit einer Verbindung, die eine hydrophobe Gruppe enthält und ein Hydrocarbyl-Halogenatom aufweist, durch Bildung des Kronenethers des Natriumsalzes der Carbonsäure, gefolgt von Umsetzung mit dem Halogenkohlenwasserstoff. Viele andere Verfahren zur Bindung von Proteinen an Liposomen und Lipiden, welche unschwer an die Bindung von Polysacchariden adaptiert werden können, wurden beschrieben und werden im Überblick von Gregoriadis, G., Hrsg., "Liposomes as drug carriers", John Wiley & Sons (1988), Heath, T. et al., Chem. Phys. Lipids 40, 347 (1986) und Machy, P. et al., "Liposomes in Cell Biology and Pharmacology", Les Editions Inserms, Paris (1987), dargestellt.
• Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung werden bereitgestellt eine neue Verwendung von Liposomen, welche an ihre äußere Oberfläche gebunden eine Polysaccharidgrupppierung aufweisen, die mindestens 5 Sialsäureeinheiten pro Molekül umfaßt, wobei die mehr als 5 Sialsäureeinheiten in der Kette des Polysaccharidpolymers vorliegen, die Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in einem Behandlungsverfahren, worin das Medikament einen pharmazeutisch aktiven Bestandteil umfaßt. Die Liposomen können in einem Verfahren der Behandlung durch Therapie oder Diagnose eingesetzt werden.
• In diesen weiteren Aspekten der Erfindung kann das Polysaccharid nach irgendeinem der oben beschriebenen Verfahren in die Liposomen inkorporiert werden. Wenn die zur Herstellung der Liposomen verwendete Polysaccharidverbindung ein anderes als ein natürlich vorkommendes Glycolipid ist, hat dessen Verbindung den hydrophoben Anteil vorzugsweise kovalent an eine Sialsäureeinheit der Polysaccharidkomponente gebunden, beispielsweise über die 1-Position oder das Stickstoffatom. Eine Verknüpfung über die 1-Position kann beispielsweise eine Esterverknüpfung umfassen. Diese Polysaccharidverbindungen werden für neu gehalten.
• Eine Esterverknüpfung an der 1-Position kann durch ein neues Verfahren gebildet werden, welches einen ersten Schritt umfaßt, in dem ein Kronenether mit einer Verbindung, die eine Polysaccharidgruppierung, umfassend mindestens 5 Sialsäurereste pro Molekül in Form eines Alkalimetall- oder Ammoniumsalzes, umfaßt, umgesetzt wird, und einen zweiten Schritt, in dem das Produkt des ersten Schritts mit einer Verbindung der Formel X-R¹ umgesetzt wird, worin R' eine gegebenenfalls substituierte C&sub8;&submin;&sub3;&sub0;-Alkyl- oder -Alkenylgruppe ist und X ein Halogenatom ist. X ist vorzugsweise Brom. Der erste Schritt der Reaktion kann beispielsweise in wäßriger Lösung, z. B. des Natriumsalzes des Polysaccharids (d. h. der Carbonsäuregruppen der Sialsäuren), in Gegenwart eines Kronenethers wie 18- Krone-6 durchgeführt werden. Im Anschluß an die Reaktion, z. B. bei Umgebungstemperatur bis die Reaktion abgeschlossen ist (z. B. für einige wenige Minuten bis zu einigen Stunden, z. B. 5 Minuten - 5 Stunden), wird Wasser beispielsweise durch Verdampfen oder vorzugsweise durch Gefriertrocknen entfernt. Der Kronenether wird dann beispielsweise in einem organischen Lösungsmittel, günstigerweise Dimethylformamid, erneut gelöst, gefolgt von der Zugabe eines Halogenkohlenwasserstoffes oder einer substituierten Verbindung und Rühren bei erhöhter oder vorzugsweise Umgebungstemperatur für beispielsweise einige Stunden oder Tage, beispielsweise 5 Stunden - 5 Tage, bis die Reaktion stattgefunden hat. Die Alkyl- oder Alkenylgruppe der Verbindung X-R¹ ist gewöhnlich ein C&sub1;&sub2;&submin;&sub2;&sub4;-, vorzugsweise C,&sub1;&sub4;&submin;&sub2;&sub2; Alkyl oder -Alkenyl, welches gegebenenfalls Substituenten wie Alkyl- oder Alkenylgruppen, Alkanoyloxy oder Alkylcarboxamido einschließen kann, wobei in jedem davon die Alkyl- oder Alkenylgruppen 6 bis 30 Kohlenstoffatome aufweisen.
• In dem breiten Aspekt der vorliegenden Erfindung, worin das Polysaccharid direkt mit einem Molekül eines aktiven Bestandteils über eine kovalente Bindung verknüpft ist, kann ein einziges Molekül mit jedem Molekül des aktiven Bestandteils verknüpft sein, beispielsweise wenn die aktive Verbindung ein kleines Molekül oder ein relativ kurzes Polypeptid ist. Wenn ein einziges Polysaccharidmolekül verknüpft ist, ist es von besonderer Bedeutung, daß das Molekül aus mindestens 50 Sialsäureeinheiten und vorzugsweise etwa 100 Sialsäureeinheiten oder mehr gebildet ist. Wenn das Polysaccharid mit dem aktiven Bestandteil über ein AAS oder direkt über eine kovalente Verknüpfung mit einen aktiven Bestandteil verknüpft ist, welcher ein relativ großes Molekül ist, beispielsweise ein Protein oder ein Polypeptid, dann kann mehr als ein Polysaccharidmolekül vorteilhafterweise mit der AAS-Einheit oder, gegebenenfalls, jedem Molekül des aktiven Bestandteils assoziiert sein. Wenn das Polysaccharid eine relativ geringe Anzahl von Sialsäureeinheiten umfaßt, beispielsweise weniger als 50 oder 20 Einheiten, ist es bevorzugt, daß mehrere Moleküle mit jeder AAS-Einheit oder jedem Molekül des aktiven Bestandteils assoziiert sind. Oft ist es vorteilhaft, daß mehrere Moleküle eine relativ hohe Anzahl an Sialsäureeinheiten, beispielsweise mehr als 50 oder etwa 100 oder mehr, zur Assoziation mit jeder AAS-Einheit oder jedem Molekül des aktiven Bestandteils aufweisen. Die Gesamtzahl von Sialsäureeinheiten, die mit jeder AAS-Einheit oder jedem Molekül des aktiven Bestandteils assoziiert ist, beeinflußt die Gesamthydrophilizität, die dem aktiven Bestandteil verliehen wird. Durch Verwendung von Polysaccharidmolekülen mit einem relativ hohen Molekulargewicht gibt es eine sterische Wirkung bei erhöhten Entfernungen vom aktiven Bestandteil oder AAS, von der angenommen wird, daß sie die Halbwertszeit im Kreislauf und die Stabilität erhöht und die Immunogenizität des aktiven Bestandteils verringert. Wenn eine Polysaccharidverbindung mit hohem Molekulargewicht eingesetzt wird, kann mehr als ein Molekül des aktiven Bestandteils mit jedem Molekül der Polysaccharidverbindung assoziiert sein, insbesondere wenn der aktive Bestandteil ein relativ niedriges Molekulargewicht aufweist, beispielsweise wenn er ein Peptid ist.
• Die vorliegende Erfindung ist von besonderem Wert, wenn die pharmazeutisch aktive Verbindung eine ist, welche im Kreislauf eines Patienten für einen längeren Zeitraum zur Verfügung stehen muß. Sie ist von besonderem Nutzen für pharmazeutisch aktive Bestandteile, welche durch rekombinante DNA- Technologie gebildete Proteine umfassen, die dazu neigen, schnell von Geweben aufgenommen zu werden, wo sich ihre pharmazeutische Aktivität nicht zeigt. Pharmazeutisch aktive Verbindungen, deren Verfügbarkeit im Kreislauf durch die Erfindung vorteilhafterweise verlängert werden würde, sind Interleukine, beispielsweise IL-2, IL-6 oder IL-1, Interferone, Tumornekrose-Faktor (TNF) sowie Enzyme, beispielsweise zur Verwendung in der Enzymtherapie wie von Abuchowski (oben zitiert) etc. beschrieben. Eine weitere Klasse von Verbindungen, welche vorteilhafterweise in der Erfindung eingesetzt werden kann, sind Verbindungen, die mit Viren, beispielsweise HIV, um die Wechselwirkung mit bestimmten Rezeptoren konkurrieren, die auf Zellen im Blutstrom vorhanden sind. Ein Typ einer aktiven Verbindung, welcher in der Erfindung eingesetzt werden könnte, sind fluoreszierende Agentien, die bei chemischen Untersuchungen eingesetzt werden können.
• Beispielsweise können Fluorescein-Derivate direkt an eine Polysaccharidverbindung gekoppelt werden oder können in Liposomen inkorporiert werden, welche mit der Polysaccharidverbindung beschichtet sind. Aktive Bestandteile, welche vorteilhafterweise in Liposomen oder andere AAS inkorporiert werden würden, schließen Cytostatika, Cytokine, Antibiotika, Hämoglobin, Enzyme, Hormone, Steroide etc. ein.
• Die folgenden Beispiele illustrieren die erhöhte Zirkulationszeit eines Moleküls, das als Modell für einen aktiven Bestandteil in einer Maus, als Modell für alle Säuger eingesetzt, verwendet wurde. Es steht zu erwarten, daß dieselben Wirkungen beobachtet werden, wenn aktive Bestandteile mit der Polysaccharidverbindung kombiniert und Menschen verabreicht werden.
BEISPIELE Polysaccharidverbindungen Gruppe B-Polyaccharid
• Gruppe B-Polysaccharid von N. meningitidis ist ein Polymer, das aus (2→8)- α-verknüpften Sialsäureresten mit einer Kettenlänge von etwa 200 Resten (Sialsäureeinheiten) und einer terminalen Phospholipideinheit am reduzierenden Ende des Polymers aufgebaut ist. Das Polysaccharid wird aus der Zellwand des Bakteriums Neisseria meningitidis extrahiert. In wäßriger Lösung bildet das Polymer Aggregate (aggregierte oder intakte Form). Die Behandlung der Lösung mit 0,1 M NaOH bei 37ºC für 4 h entfernt die Acylketten des Phospholipids und die Polymerketten deaggregieren (deaggregierte Form).
• Das Polysaccharid B aus E. coli K1 ist ein Homopolymer von 2→8-verknüpfter Sialsäure und weist etwa 190 Sialsäureeinheiten auf. E. coli K1 ist leicht pathogen. Es wird in den folgenden Beispielen als "K1" bezeichnet.
• Polysaccharid B kann durch Behandlung bei 100ºC, pH 7,0, für 1-9 h autohydrolysiert werden, um ein Polymer niedrigeren Molekulargewichts mit einer Kettenlänge, welche wahrscheinlich weniger als 80 Einheiten beträgt, zu bilden. Das Polysaccharid wird in den folgenden Beispielen als "Polysaccharid niedrigeren Molekulargewichts (MG)" bezeichnet.
• Polysaccharid B aus E. coli K1 kann zu noch kürzeren Kettenlängen hydrolysiert werden, um ein als Colominsäure bekanntes Produkt zu bilden, das eine mittlere Kettenlänge von etwa 15 bis 30 Einheiten aufweist. Dieses ist kommerziell erhältlich. Die in diesen Experimenten eingesetzte Colominsäure wurde von Sigma Chemical Co. erhalten.
• Polysaccharid K92 aus E. coli K92 ist ein Glycolipid, dessen Polysaccharidgruppierung ein Homopolymer von Sialsäure, worin 2→8- mit 2→9 Verknüpfungen alternieren, mit einer Kettenlänge von etwa 80 bis 100 Einheiten ist. Es wird in den folgenden Beispielen als "K92" bezeichnet. E. coli K92 ist im wesentlichen nicht pathogen. Die Phospholipidgruppierung kann wie für N. meningitidis-Polysaccharid B durch Hydrolyse entfernt werden.
• Polysaccharid C aus Neisseria meningitidis-Gruppe C ist ein Homopolymer von 2→9-verknüpften Sialsäureeinheiten, dessen Kettenlänge etwa 120 Einheiten beträgt. Es ist ein Glycolipid und die Phospholipidgruppierung kann wie für N. meningitidis-Polysaccharid B entfernt werden.
Fluorescein-Konjugation
• Fluorescein wird als Agens in klinischen Tests eingesetzt und ist als solches eine pharmazeutische Verbindung, beispielsweise zur Untersuchung der Permeabilität und Mikrozirkulation in vivo. Fluoresceinisothiocyanat (FITC) wird in einigen dieser Versuche eingesetzt, um die Wirkung der Konjugation von Polysaccharid auf die Clearance-Rate von Fluorescein aus dem Kreislauf (von Mäusen) zu untersuchen. Fluorescein kann unter Verwendung von ¹²&sup5;I nach wohlbekannten Techniken radioaktiv markiert werden. Das "heiße" Fluorescein-¹²&sup5;I kann anschließend durch Nachweis der Anwesenheit der radioaktiven ¹²&sup5;1-Markierung nachgewiesen werden. FITC wird mit der Polysialsäure-Polysaccharidverbindung verknüpft, indem das Tetrabutylaminosalz des Polysaccharids gebildet wird. Dieses Salz wird dann mit FITC in Lösung in DMSO/Pyridin unter Rühren für 24 h bei Raumtemperatur unter Anwendung eines Verfahrens umgesetzt, das ursprünglich von A. N. de Beider et al., Carbohydrate Res. 30 375 (1973), beschrieben wurde. Die Grundreaktion ist wie folgt:
• Das Konjugat, welches 0,93 nMol FITC pro 50.000 Dalton von B-Polysaccharid enthält, wird durch Extraktion von ungebundenem FITC mittels Dialyse, gefolgt von Ethanolfällung des Konjugats und Gelitration und schließlich erneuter Fällung des Produkts in Ethanol gewonnen. Die ¹²&sup5;I-Markierung wird nach der Konjugation vorgenommen.
• Im Stand der Technik ist bekannt, daß nicht-konjugiertes Fluorescein innerhalb von etwa 5 Minuten im wesentlichen aus dem Kreislauf entfernt wird.
Assay für Polysialsäure
• Zum Nachweis von Polysialsäuren, einschließlich Gruppe B-Polysaccharid (PSB), in einer Blutprobe wird eine Plasmaprobe zuerst mit Trichloressigsäure (10% Endkonzentration) behandelt, um Serumproteine auszufällen, von denen viele ebenfalls Sialsäure als Endgruppen der Proteine enthalten. Das behandelte Serum wird dann mit einer leichten Modifizierung des Verfahrens von Svennerholm in Biochim. Biophys. Acta, Bd. 24, S. 604-611, (1957), einem Assay unterworfen. Dieser bestimmt polymere Sialsäure oder eine andere Sialsäure wie folgt: die Probe (0,5 ml), die Polysaccharid enthält, wird mit Resorcin-Reagenz (0,5 ml) gemischt und in heftig siedendem Wasser 30 Min. lang erhitzt. Die Probe wird abgekühlt und entweder direkt bei 570 nm abgelesen oder die Farbe mit Amylalkohol (1 ml) extrahiert und bei 590 nm abgelesen. Standardkurven wurden erstellt, indem bekannte Mengen des entsprechenden Polysaccharids zu Serum, welches ansonsten auf die gleiche Weise behandelt worden war, um Serumproteine wie oben beschrieben auszufällen, zugegeben wurden und diese mit dem oben beschriebenen kolorimetrischen Verfahren analysiert wurden.
BEISPIEL 1 Halbwertszeit von Polysaccharid B nach intravenöser Injektion
• T.O.-Auszuchtmäusen mit einem Gewicht von 25-30 g wurde intravenös (Schwanzvene) 0,2 ml phosphatgepufferte Salzlösung, pH 7,4, enthaltend 1,4 bis 2,8 mg N. meningitidis-Gruppe B-Polysaccharid in aggregierter oder deaggregierter Form, injiziert. Den Tieren wurde aus der Schwanzvene unmittelbar vor und in Zeitintervallen nach der Injektion Blut entnommen und die Blutserumproben wurden auf Gruppe B-Polysaccharid untersucht. Der Assay beinhaltet die Bestimmung von Sialsäure mit einem kolorimetrischen Verfahren nach Ausfällung der Serumproteine, von denen viele ebenfalls Sialsäure enthalten und ansonsten das Verfahren stören würden. Die Gruppe B-Polysaccharidwerte in den Seren wurden in logarithmischer Darstellung aufgetragen und Halbwertszeiten des aggregiert oder deaggregiert injizierten Polymers wurden abgeleitet. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 1 angegeben und graphisch in Fig. 1 dargestellt. TABELLE 1
• * Paaren von T.O.-Mäusen in fünf individuellen Experimenten wurde intravenös 0,2 ml 1%iger NaCl in PBS, enthaltend 1,4-2,8 mg intaktes bzw. deacyliertes PSB, injiziert. Den Mäusen wurde in Zeitintervallen aus der Schwanzvene Blut entnommen und das Blutplasma auf - Polysaccharid B untersucht. Die Ergebnisse sind als Prozentsatz der injizierten Dosis für das gesamte Blut der Maus ausgedrückt. Die Zahlenwerte in Tabelle 1 zeigen, daß 40,0 bis 57,8% des injizierten Polysaccharids innerhalb von 2-4 Min. nach der Injektion im Kreislauf verbleibt, d. h., 42,2 bis 60% der injizierten Dosis des aggregierten Polysaccharids wird innerhalb von 2-4 Min. nach der Injektion aus dem Kreislauf entfernt. Danach ist die Eliminierungsrate langsam und zeigt eine Halbwertszeit von etwa 20 h. Die anfängliche schnelle Entfernung des Polysaccharids ist wahrscheinlich darauf zurückzuführen, daß es in der aggregierten Form vorliegt, wobei die gebildeten Partikel von den Lungen oder dem RES bei der ersten Passage eingefangen werden. Im Gegensatz dazu wurden nur 10-19% des deaggregierten Polysaccharids während der ersten 2-4 Min. nach der Injektion durch Gewebe entfernt. Der Rest der Dosis wurde langsam mit einer Halbwertszeit von etwa 30 h eliminiert.
• Die lange Halbwertszeit (30 h) und die lineare (auf einer logarithmischen Skala) Geschwindigkeit der Clearance aus dem Blutkreislauf fast der gesamten injizierten Menge des deaggregierten Gruppe B-Polysaccharids legt nahe, daß das Polymer (in der deaggregierten Form) ein exzellenter Kandidat ist, um als Mittel zur Verlängerung der Zirkulation von damit kovalent verknüpften Arzneimitteln, Peptiden und Proteinen zu dienen. Das Polymer könnte auch als Beschichtungsmaterial für Arzneimittel-enthaltende oder Arzneimittel-gekoppelte AAS oder TAAS dienen, um deren Halbwertszeit im Kreislauf zu verlängern. Die aggregierte (Glycolipid)-Form könnte ebenfalls für die Erhöhung der Halbwertszeit von Phospholipid Vesikel-TAAS von Nutzen sein.
BEISPIEL 2 Clearance von intaktem PSB niedrigen Molekulargewichts, konjugiert an Fluorescein, aus dem Blutkreislauf. Wirkung der Dosis
• T.O.-Mäusen wurde intravenös 0,2 - 0,25 ml phosphatgepufferte Salzlösung (PBS), enthaltend intaktes Polysaccharid B "niedrigen" Molekulargewichts in Konjugation mit Fluorescein, welches anschließend mit ¹²&sup5;I radioaktiv markiert wurde, injiziert. Den Tieren wurde in Zeitintervallen Blut entnommen und die ¹²&sup5;I-Radioaktivität im Plasma gemessen. Die Werte stammen von individuellen Tieren und repräsentieren % der injizierten Radioaktivität im Gesamtblut (auf 7,5% des Körpergewichts geschätzt). Die Dosisspalte zeigt die Gesamtmenge an kaltem (nicht-radioiodiertem) und heißem (radioiodiertem) FITC-Polysaccharid B-Konjugat, vor der Injektion gemischt. Die Zahlen in Klammern bezeichnen die Menge (ug) an radioiodiertem Konjugat in der Mischung.
• Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 2 dargestellt und graphisch in Fig. 2 illustriert. TABELLE 2
• Die Ergebnisse zeigen, daß konjugiertes Fluorescein im Vergleich zur bekannten Clearance-Rate von nicht-konjugiertem Fluorescein relativ langsam aus dem Kreislauf entfernt wird. Die Konjugation mit Polysaccharid niedrigen Molekulargewichts führt dazu, daß etwa 70% des FITC-Konjugats innerhalb von 30 Min. nach der Injektion aus dem Kreislauf entfernt werden. Anschließend beträgt die Halbwertszeit etwa 6 h und ist von der Dosis unabhängig. Diese letztere Tatsache zeigt an, daß es keine "Sättigungskonzentration" gibt, welche verhindern könnte, daß das Polysaccharid zur Verlängerung der Zirkulationszeit für einige aktive Bestandteile, welche in relativ hohen Dosen verabreicht werden müssen, d. h., wenn eine hohe Dosis an Polysacharid vorliegen wird effektiv sein könnte. Ein weiterer Vorteil besteht darin, daß sehr wenig Polysaccharid eingesetzt werden kann, um die Zirkulation eines aktiven Bestandteils zu verlängern. Nachdem die Geschwindigkeit nicht durch das Verhältnis von heißem FITC zu Gesamt-FITC beeinflußt wird, messen wir darüber hinaus nicht nur einfach die Geschwindigkeit der Clearance von heißem FITC, welches sich von der von kaltem FITC unterscheiden würde.
BEISPIEL 3 Clearance von deacyliertem Polysaccharid 8 niedrigen Molekulargewichts (N. meningitidis) in Konjugation mit Fluorescein aus dem Blut: Wirkung der Dosis
• T.O.-Mäusen wurde intravenös 0,2-0,25 ml PBS, enthaltend hydrolysiertes (deacyliertes) Polysaccharid B "niedrigen" Molekulargewichts in Konjugation mit FITC, welches anschließend mit 1251 radioaktiv markiert wurde, injiziert. Eine Hydrolyse (4 h bei 37º und pH 8,0) zur Entfernung der Acylgruppen des Phospholipids wurde unter Verwendung des FITC-Polysaccharid B-Konjugats in Mischung mit dem radioiodierten Konjugat durchgeführt.
• Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 3 und in Fig. 3 dargestellt. TABELLE 3
• Die Ergebnisse zeigen an, daß, ähnlich den Ergebnissen für Beispiel 2, die Konjugation mit dieser Polysaccharidverbindung, welche der in Beispiel 2 eingesetzten ähnlich ist, bei der jedoch die Phospholipidgruppierungen durch Hydrolyse deacyliert wurden, dazu führt, daß nur 29,3-70,2% des FITC-Konjugats innerhalb der etwa ersten 30 Min. nach der Injektion aus dem Kreislauf entfernt werden und die anschließende Halbwertszeit etwa 5% h beträgt. Die Deacylierung des Phospholipidanteils scheint soweit die Erhöhung der Zirkulationszeit betroffen ist wenig Auswirkung auf die Eigenschaften der Polysaccharidverbindung zu haben, mit Ausnahme der ersten wenigen Minuten, wenn die Konzentration für die entsprechende Zeit für das deacylierte Polysaccharid höher ist (Tabelle 3) und dies ist möglich, da nach der Hydrolyse des nativen Polysaccharids, um kürzere Kettenlängen zu bilden, nur eine Minderheit der Polysaccharidmoleküle eine damit verknüpfte Phospholipidkette aufweisen. Deacylierung des Phospholipids beeinflußt somit eine Minderheit von Molekülen.
BEISPIEL 4 Clearance von Polysaccharid C (PSC) (N. meningitidis) nach intravenöser Injektion aus dem Kreislauf
• Es wurde dem Verfahren von Beispiel 1 gefolgt, jedoch unter Verwendung von N. meningitidis-Polysaccharid C. Es wurden das intakte Polysaccharid und die hydrolysierte Form, in der die Phospholipidgruppen deacyliert waren, verglichen.
• T.O.-Mäusen wurde intravenös 1.250 ug Polysaccharid C (PSC), entweder intakt oder hydrolysiert, um das Phospholipid zu deacylieren, injiziert. Den Tieren wurde in Zeitintervallen Blut entnommen und Plasmaproben auf N-Acetylneuraminsäure (NaNa) (Sialsäure) untersucht. Die Ergebnisse von individuellen Tieren sind % des injizierten Materials für das Gesamtblut.
• Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 4 und graphisch in Fig. 4 dargestellt. TABELLE 4
• Die Ergebnisse zeigen an, daß, wie bei den Ergebnissen von Beispiel 1, sowohl für das intakte als auch für das hydrolysierte (deacylierte) PSC ein Anteil der Polysaccharidverbindung relativ schnell nach der Injektion aus dem Kreislauf entfernt wird, jedoch die Entfernungsgeschwindigkeit danach langsam ist. Die Entfernungsgeschwindigkeit von intaktem Polysaccharid ist höher (d. h., die Halbwertszeit ist niedriger) (8 h) als für die hydrolysierte Form (20 h) und die letztere wäre ein guter Kandidat für die Verwendung zur Verlängerung der Zirkulationszeit und zur Stabilisierung von aktiven Bestandteilen.
BEISPIEL 5 Clearance von Polysaccharid K92 nach intravenöser Injektion aus dem Kreislauf
• Die Prozedur der Beispiele 1 und 4 wurde wiederholt, jedoch unter Verwendung von Polysaccharid K92 in seinen intakten und hydrolysierten (zur Deacylierung der Phospholipidgruppen) Formen.
• T.O.-Mäusen wurde intravenös 1.230 ug intaktes oder hydrolysiertes (deacyliertes) Polysaccharid K92 (PS K92) injiziert. Den Tieren wurde in Zeitintervallen Blut entnommen und Plasmaproben auf N-Acetylneuraminsäure (NaNa) analysiert. Die Ergebnisse von individuellen Tieren sind % des injizierten Materials für das Gesamtblut.
• Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 5 dargestellt und graphisch in Fig. 5 illustriert. TABELLE 5
• Die Ergebnisse zeigen an, daß der Anfangsverlust in den ersten wenigen Minuten nach der Injektion für diese beiden Polysaccharidverbindungen relativ niedrig ist (im Vergleich zu den anderen getesteten Polysaccharidverbindungen). Darüber hinaus ist die anschließende Geschwindigkeit der Entfernung aus dem Kreislauf relativ niedrig, die Halbwertszeit in jedem Fall liegt bei etwa 40 Stunden.
• Somit ist selbst nach 5 Tagen immer noch ein signifikanter Anteil des Polysaccharids im Kreislauf verblieben.
• Die Entfernung der Acylgruppen aus der Phospholipidgruppierung von dieser Verbindung scheint keinen signifikanten Unterschied hinsichtlich der Halbwertszeit zu machen und es ist nicht ganz verstanden, warum dies der Fall ist. Es könnte sein, daß die teilchenförmige Anordnung der Verbindung deren Eigenschaften so deutlich beeinflußt, daß die Anwesenheit des Phospholipids wenig Einfluß hat. Es steht zu erwarten, daß diese Verbindungen von sehr großem Nutzen zur Erhöhung der Zirkulationszeit und Stabilität von Arzneimitteln sein werden und würden sie mit guten verlängerten Freisetzungscharakteristiken ausstatten, was die Optimierung einer zielgerichteter Lenkung zu Organen oder Zellen durch zielsuchende Gruppen erlaubt.
BEISPIEL 6 Clearance von Colominsäure und Colominsäure-FITC-Konjugaten nach intravenöser Injektion aus dem Kreislauf
• Das Verfahren von Beispiel 1 wurde für intakte Colominsäure wiederholt. FITC-Colominsäure-Konjugat, mit ¹²&sup5;I markiert, wurde ebenfalls in einer separaten Gruppe von Experimenten verabreicht und die Ergebnisse wie in Beispiel 2 bewertet.
• T.O.-Mäusen wurde intravenös 1.600 ug FITC-Colominsäure oder 1.920 ug intakte Colominsäure injiziert. Den Tieren wurde in Zeitintervallen Blut entnommen und Plasmaproben hinsichtlich NaNa analysiert. Die Ergebnisse von individuellen Tiere sind % des injizierten Materials für das Gesamtblut.
• Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 6 dargestellt und graphisch in Fig. 6 illustriert. TABELLE 6
• Die Ergebnisse zeigen an, daß die Geschwindigkeit der Entfernung des FITC- Colominsäure-Konjugats aus dem Kreislauf im wesentlichen dieselbe ist wie die Entfernungsgeschwindigkeit von Colominsäure alleine. Obwohl das Polysaccharid eine gewisse Wirkung bei der Erhöhung der Zirkulationszeit von FITC besitzt, ist die Verbesserung nicht so gut wie für die Polysaccharide mit höherem Molekulargewicht, welche längere Halbwertszeiten aufweisen.
BEISPIEL 7 Herstellung von Colominsäure-Lipid-Derivaten Material und Methoden
• Ei-Lecithin wurde von Lipid Products, Nuthill, Surrey, bezogen. Cholesterin, Dichlormethan (DCM), Dimethylformamid (DMF), Chloroform und Methanol stammten von E. Merck (Deutschland) und wurden ohne weitere Reinigung eingesetzt. Colominsäure-Natriumsalz (Poly-2,8-N-acetylneuraminsäure) von E. coli und Sephadex G-200 (grob) wurden von Sigma Chemicals, London, erhalten. 18-Krone-6, 2-Bromhexadecansäure, 1-Tetradecylamin, 1-Bromoctadecan und 2,4,6-Trichlorphenol wurden von Aldrich Chemical Company bezogen und ohne weitere Reinigung eingesetzt.
BEISPIEL 7.1 Synthese des Colominsäure-Koniugats mit Octadecan (Schema 9) (a) Herstellung von Colominsäure-Kronenether:
• Colominsäure (Natriumsalz) (50 mg) wurde in 20 ml destilliertem Wasser gelöst und 18-Krone-6 (30 mg) durch 30-minütiges Rühren bei 20ºC hinzufügt. Das Wasser wurde durch Gefriertrocknen verdampft.
(b) Kopplung von Colominsäure-Kronenether mit 1-Bromoctadecan (Produkt D6):
• Colominsäure-Kronenether (35 mg) wurde in 1,5 ml DMF gelöst und 1-Bromoctadecan (6 mg) wurde durch Rühren bei 20ºC für 24 h hinzugefügt. Das Lösungsmittel wurde verdampft und das Produkt erneut in 1 ml destilliertem Wasser gelöst. Die Entfernung von Wasser wurde mittels Gefriertrocknen erreicht.
BEISPIEL 7.2 Synthese des Colominsäure-Koniugats mit N-Tetradecylhexadecylcarboxamid (Schema 2) Synthese von N-Tetradecyl-(2-bromhexadecylcarboxamid) (a) Herstellung von 2-Bromhexadecansäurephenylester
• 2-Bromhexadecansäure (1 g) wurde in trockenem Chloroform (20 ml) gelöst. Nach Zugabe von 2,4,6-Trichlorphenol (0,558 g) wurde die Reaktionsmischung in ein Eisbad gestellt. Dicyclohexylcarbodiimid (0,736 g), gelöst in trockenem Chloroform (2 ml), wurde der Lösung zugegeben. Nach 15-minütigem Rühren der Lösung in einem Eisbad wurde die Temperatur auf 20ºC eingestellt. Die Bildung des Produkts wurde durch Dünnschichtchromatographie auf Kieselsäureplatten mit einer Dichlormethan/Methanol-Mischung (10 : 0,1 Vol./Vol.) als Lösungsmittel bestätigt. Die Lösung wurde 24 h lang bei 20ºC gerührt und der ausgefallene Harnstoff durch Filtration entfernt. Das Filtrat wurde zweimal mit Natriumbicarbonatlösung (0,05 M) und Wasser gewaschen. Das rohe Reaktionsprodukt wurde mittels Flüssigkeitschromatographie auf Silicagel unter Verwendung desselben Lösungsmittelsystems als Elutionsmittel gereinigt.
(b) Herstellung von N-Tetradecyl-(2-bromhexadecylcarboxamid):
• 1-Tetradecylamin (0,591 g) wurde zu einer Lösung von 2-Bromhexadecansäurephenylester (1,425 g) in trockenem Chloroform durch Rühren bei 20ºC für 24 h zugegeben. Die Bildung der Peptidbindung wurde durch Dünnschichtchromatographie auf Kieselsäureplatten mit einer Dichlormethan/Methanol-Mischung (10 : 0,1 Vol./Vol.) als Lösungsmittel bestätigt. Die Reaktionsmischung wurde mit Citronensäurelösung (10%, Gew/Vol.), Natriumbicarbonatlösung (0,05 M) und Wasser (x 3) gewaschen.
(c)Kopplung von N-Tetradecyl-(2-bromhexadecylcarboxamid) mit Colominsäure- Kronenether (Produkt D11)
• Colominsäure-Kronenether (80 mg) wurde in trockenem Dimethylformamid (DMF) (4 ml) gelöst. Nach Zugabe von N-Tetradecyl-(2-bromhexadecylcarboxamid) (60 mg) wurde die Lösung 24 h lang bei 20ºC gerührt. Dann wurde das Lösungsmittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde in Wasser (2 ml) gelöst, welches dann durch Gefriertrocknen entfernt wurde.
BEISPIEL 7.3 Inkorporation der Colominsäure-Lipid-Derivate auf Liposomen
• Zur Herstellung kleiner unilamellarer Liposomen (KUL), welche die Derivate inkorporiert hatten, wurden Ei-Phosphatidylcholin (PC) (32 uMol) und Cholesterin (32 uMol) in Chloroform in einem Molverhältnis von 1 : 1 gemischt. Colominsäure-Lipid- Derivate, synthetisiert wie oben (10% Gew./Gew. der gesamten liposomalen Lipide), wurden in Chloroform/Methanol (1 : 1, Vol./Vol.) gelöst und der Lipidmischung zugegeben. Die Lösungsmittel wurden mittels Rotationsverdampfung im Vakuum ausgetrieben und die getrockneten Lipide in 2 ml Kaliumphosphatpuffer (pH 7,4, 0,1 M) durch sanftes Schütteln suspendiert. Die milchige Suspension wurde in einem Eisbad für 10 1-minütige Perioden, die sich mit 30-sekündigen Intervallen abwechselten, beschallt. Nach der Beschallung wurden die Proben 2 h lang bei 20ºC stehengelassen. Nicht-inkorporierte Materialien wurden von den Liposomen mittels Säulenchromatographie auf Sephadex G-200, mit Kaliumphosphatpuffer (pH 7,4, 0,1 M) voräquilibriert, abgetrennt.
Bestimmung von Colominsäure
• Colominsäure wurde spektralphotometrisch in 0,1 ml der Fraktionen, die nach Chromatographie unter Anwendung des oben beschriebenen allgemeinen Verfahrens erhalten worden waren, spektralphotometrisch bestimmt. Das Ausmaß der Inkorporation von Colominsäure (% der insgesamt eingesetzten) in Liposomen wurde auf Basis der insgesamt in den zum Liposomenpeak gehörigen Fraktionen gewonnenen und der anschließend gewonnenen (zweiter Peak von nichtinkorporiertem Material) bestimmt.
Resultate Charakterisierung von N-Tetradecyl-(2-bromhexadecylcarboxamid):
• Die Konjugation (Schema 2b) von 2-Bromhexadecansäure mit 1-Tetradecylamin wurde mittels massenspektroskopischer Analyse bestätigt. Vor der Kopplung wurde ein aktiver Ester der 2-Bromhexadecansäure synthetisiert (Schema 2a). In dem Massenspektrum des Produkts zeigt die Anwesenheit des Peaks bei 514 m/z die Ausbildung der Bindung zwischen 2-Bromhexadecansäure und 2,4,6-Trichlorphenol an. Das Produkt wurde dann mit 1-Tetradecylamin konjugiert, wobei das Massenspektrum des resultierenden Materials einen Peak bei 530 m/z zeigt, welcher impliziert, daß die Konjugation dieser beiden Verbindungen abgeschlossen war.
Liposomencharakterisierung:
• Während der Experimente wurden kleine unilamellare Vesikel (KUV) mit PG und Cholesterin in einem Molverhältnis von 1 : 1 hergestellt, Colominsäure-Lipid- Derivate wurden zu Lipidmischungen (10% des Gesamtlipidgewichts) zugegeben, wenn dies erforderlich war. KUV wurden von den nicht-inkorporierten Materialien durch Molekularsiebohromatographie unter Verwendung von Sephadex G-200 abgetrennt.
• Fig. 7 zeigt die Elutionsprofile von Colominsäure und KUV (vor dem Auftragen gemischt). Zwei getrennte Peaks, die Liposomen (Fraktionen 14-22) und Colominsäure (Fraktionen 22-44) repräsentieren, sind zu sehen. Nahezu 95% der aufgetragenen Colominsäure wurden in diesen Fraktionen nachgewiesen. KUV, die D&sub1;&sub6; oder D&sub1;&sub1; inkorporierten, (siehe Schemata 1 und 2) wurden auf Sephadex G-200- Säulen aufgetragen. Fig. 8 zeigt das Elutionsprofil von liposomalem D&sub1;&sub6;. Etwa 51% des Colominsäure-Derivats D&sub1;&sub6; wurde mit Liposomen gewonnen (d. h., in die Doppelschichten inkorporiert). Ein ähnlicher Anteil (52,14%) des Golominsäure-Derivats D&sub1;&sub1; (Fig. 9) wurde in KUV inkorporiert.
BEISPIEL 8 Inkorporation von Polysaccharid 8 in Liposomen
• Es wurden Versuche durchgeführt, um festzustellen, ob Polysaccharid B (PSB) seine Phospholipidgruppierung in die Doppelschicht kleiner unilamellarer Liposomen (KUV) einführen könnte, die liposomale Oberfläche hydrophil machen und somit die Halbwertszeit der Vesikel im Blutkreislauf verlängern könnte.
Methodik
• Ei-Phosphatidylcholin (PC) oder Distearoylphosphatidylcholin (DSPC) und äquimolare Mengen an Cholesterin (25 mg Phospholipid und 12,5 mg Cholesterin) wurden in Chloroform gelöst. Nachdem das Lösungsmittel durch Rotationsverdampfung entfernt war, wurden 2 ml 0,06 M Carboxyfluorescein (CF), auch 1,2 mg Polysaccharid B enthaltend, zugegeben. Der Behälter wurde heftig geschüttelt, um den Lipidfilm zu zerstören, und die Suspension wurde in einem Bad 3 Min. lang bei 4ºC (PC) und 60ºC (DSPC-KUV) beschallt. Die Suspension wurde dann bei denselben Temperaturen 6 Min. lang mit 30 Sekunden Pause nach jeder Minute mit einer Sonde beschallt. Die klare Suspension, enthaltend die KUV, wurde dann über eine Sepharose CL-4B-Säule geleitet, um Liposomen-inkorporiertes CF und PSB von freien Materialien abzutrennen. Das Muster der Trennung aus einem typischen Experiment zeigt, daß 19,2% des PSB mit der KUV-Fraktion gewonnen wurden. Die Ergebnisse der PSB-Inkorporation in PC oder DSPC-KUV aus acht Experimenten sind in Tabelle 7 dargestellt. TABELLE 7: Inkorporation von PSB in KUV
BEISPIEL 10 Wirkung von PSB in KUV auf die Vesikel-Clearance aus dem Kreislauf von Mäusen nach intravenöser Injektion
• T. O.-Mäuse wurden in zwei Gruppen von zwei aufgeteilt und es wurde ihnen in die Schwanzvene KUV, aus PC und Cholesterin (Molverhältnis 1 : 1) aufgebaut und CF mit oder ohne inkorporiertem(s) PSB enthaltend, injiziert. Ihnen wurde intravenös CF-enthaltende KUV oder CF-enthaltende KUV, beschichtet mit 118 ug PSB, injiziert. Den Tieren wurde in Zeitintervallen nach der Injektion Blut entnommen und Blutplasmaproben für das Gesamt-CF nach dem Verfahren von Kirby, Clarke und Gregoriadis (Biochem. Journal 186, 591 (1980)) entnommen. Die Werte stammen von individuellen Tieren und geben % des injizierten liposomalen CF für das Gesamtblut an.
• Die Ergebnisse in Tabelle 8 und Fig. 10 zeigen die Konzentration von liposomalem CF in deren Blut in Zeitintervallen nach der Infektion. Ein Vergleich der Werte von den beiden Gruppen zeigt, daß die Anwesenheit von PSB auf der liposomalen Oberfläche zu einer langsameren Clearance-Rate führt. Ähnliche Ergebnisse wurden in einem anderen Experiment mit PSB-beschichteten KUV, hergestellt aus DSPC und Cholesterin wie oben, und in einem Experiment mit PSB-beschichteten KUV, hergestellt aus DSPC und Cholesterin, erhalten. TABELLE 8 Clearance von in Liposomen eingefangenem CF nach intravenöser Injektion

Claims (24)

1. Verwendung einer Polysaccharidverbindung für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die einen aktiven Bestandteil umfaßt, worin die Polysaccharidverbindung mehr als 5 Sialsäureeinheiten pro Polysaccharidmolekül enthält, wobei die mehr als 5 Sialsäureeinheiten in der Kette des Polysaccharidpolymers vorliegen, zur Verlängerung der Verfügbarkeit des aktiven Bestandteils im Kreislauf.

2. Verwendung einer Polysaccharidverbindung für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die einen aktiven Bestandteil umfaßt, worin die Polysaccharidverbindung mehr als 5 Sialsäureeinheiten pro Polysaccharidmolekül enthält, wobei die mehr als 5 Sialsäureeinheiten in der Kette des Polysaccharidpolymers vorliegen, zur Verringerung der Immunogenizität des aktiven Bestandteils.

3. Verwendung einer Polysaccharidverbindung für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die einen aktiven Bestandteil umfaßt, worin die Polysaccharidverbindung mehr als 5 Sialsäureeinheiten pro Polysaccharidmolekül enthält, wobei die mehr als 5 Sialsäureeinheiten in der Kette des Polysaccharidpolymers vorliegen, zur Erhöhung der Stabilität des aktiven Bestandteils in vivo.

4. Verwendung nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, worin der aktive Bestandteil und das Polysaccharid durch kovalente Bindungen oder durch hydrophobe Assoziation direkt miteinander assoziiert sind.

5. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, worin der aktive Bestandteil und das Polysaccharid durch das Medium eines Arzneimittelabgabesystems miteinander assoziiert sind.

6. Verwendung nach Anspruch 5, worin das Arzneimittelabgabesystem ein makromolekulares Arzneimittelabgabesystem ist.

7. Verwendung nach Anspruch 5, worin das Arzneimittelabgabesystem ein teilchenförmiges Arzneimittelabgabesystem ist.

8. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 5 bis 7, worin die Polysaccharidverbindung durch eine kovalente Bindung mit dem Arzneimittelabgabesystem assoziiert ist.

9. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 5 bis 7, worin die Polysaccharidverbindung durch eine nicht-kovalente Bindung, welche eine hydrophobe Bindung oder eine Ionenbindung ist, mit dem Arzneimittelabgabesystem assoziiert ist.

10. Verwendung nach Anspruch 7, worin das Arzneimittelabgabesystem Liposomen umfaßt, welche auf ihrer Oberfläche eine Polysaccharidkomponente der Polysaccharidverbindung einschließen.

11. Verwendung nach Anspruch 6, worin das Arzneimittelabgabesystem eine Peptid- oder Proteinkomponente umfaßt, welche kovalent an die Polysacchardverbindung gebunden ist.

12. Verwendung nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Polysaccharidverbindung ein bakterielles Polysaccharid oder Derivat davon oder ein synthetisches Analogon eines solchen Polysaccharids oder Derivats ist.

13. Verwendung nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Polysaccharid mindestens 20, vorzugsweise mindestens 50, noch bevorzugter mindestens 100, Sialsäurereste pro Molekül in der Polysaccharidkomponente aufweist, wobei die Sialsäurereste in der Polymerkette des Polysaccharids vorliegen.

14. Verwendung nach Anspruch 13, worin im wesentlichen alle Saccharidreste des Polysaccharids Sialsäurereste sind.

15. Verwendung nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Polysaccharid im wesentlichen frei von endständigen Galactose-, Fucose- und Mannoseeinheiten ist.

16. Verwendung nach Anspruch 14 oder 15, worin die Polysaccharidverbindung aus Gruppe B-Polysacchariden von N. meningitidis, E. coli K1, Moraxella nonliquifaciens und Pasteurella aeroginosis, Gruppe C von N. meningitidis, E. coli K92-Polysaccharid und von E. coli K1 erhaltener Colominsäure ausgewählt ist.

17. Verwendung nach Anspruch 16, worin die Polysaccharidverbindung das Derivat eines Glycolipids ist, welches einer alkalischen Hydrolyse unterworfen wurde, um die Fettsäureketten zu entfernen.

18. Verwendung nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, worin der aktive Bestandteil ein Peptid oder ein Protein umfaßt, welches vorzugsweise kovalent an die Polysaccharidverbindung gebunden ist.

19. Verwendung von Liposomen, welche an ihre äußere Oberfläche eine Polysaccharidgruppierung gebunden haben, die mindestens 5 Sialsäureeinheiten pro Molekül umfaßt, wobei die mehr als 5 Sialsäureeinheiten in der Kette des Polysaccharidpolymers vorliegen, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers.

20. Verwendung von Liposomen nach Anspruch 19, worin die Polysaccharidgruppierung Teil einer Polysaccharidverbindung bildet, welche auch einen hydrophoben Anteil umfaßt, der in die Lipidschicht des Liposoms inkorporiert ist.

21. Verwendung von Liposomen nach Anspruch 20, worin die Polysaccharidverbindung ein natürlich vorkommendes Glycolipid ist oder ein Derivat davon, welches die natürlich vorkommende Lipidgruppe einschließt.

22. Verwendung von Liposomen nach Anspruch 20, worin die Polysaccharidverbindung ein Derivat eines natürlich vorkommenden Polysaccharids umfaßt, an das kovalent ein hydrophober Anteil gebunden wurde, wobei der hydrophobe Anteil vorzugsweise kovalent an eine Sialsäureeinheit der Polysaccharidgruppierung gebunden ist, noch bevorzugter über die 1-Position oder das Stickstoffatom.

23. Liposomen, die einen pharmazeutisch aktiven Bestandteil enthalten oder damit assoziiert sind, welche an ihre äußere Oberfläche eine Polysaccharid- Gruppierung gebunden haben, die mindestens 5 Sialsäureeinheiten pro Molekül umfaßt, wobei die mehr als 5 Sialsäureeinheiten in der Kette des Polysaccharidpolymers vorliegen:

24. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend Liposomen nach Anspruch 23.