DE69314087T2

DE69314087T2 - Veränderte Signalsequenzen

Info

Publication number: DE69314087T2
Application number: DE69314087T
Authority: DE
Inventors: Alfonsus Johannes Bonekamp; Tilborg Marcellis Wilhelmu Van
Original assignee: Gist Brocades NV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 1992-05-25
Filing date: 1993-05-25
Publication date: 1998-01-15
Anticipated expiration: 2013-05-26
Also published as: EP0572088B1; EP0572088A3; ATE158616T1; DK0572088T3; DE69314087D1; EP0572088A2; US5705362A

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Gentechnololgie, insbesondere die Sezernierung von rekombinanten Proteinen durch Mikroorganismen.

Hintergrund der Erfindung

Viele sezernierte und membrangebundene Proteine werden in einer Vorstufenform synthetisiert. Dieses Vorstufenmolekül enthält eine NH&sub2;-terminale Erweiterung von 15-30 Aminosäuren, das Signal- oder Leitpeptid. Diese zusätzliche Peptidsequenz unterstützt das Protein beim Durchtritt durch die Zellmembran. Bezüglich der Länge und Sequenz dieser Peptide existiert eine große Variabilität. Diese Variabilität kann beobachtet werden, wenn dasselbe Protein, aus verschiedenen Spezies (Intraspezies) stammend, betrachtet wird, aber auch, wenn verschiedene Proteine derselben Spezies (Interspezies) betrachtet werden.
Trotz der beobachteten Variation gibt es einige allgemeine strukturelle Charakteristika, die erfüllt sein müssen, damit diese Proteine korrekt prozessiert werden und sie ihre Funktion beim Membrantransport korrekt erfüllen. Signalpeptide haben einen basischen N-terminalen Bereich, dem ein zentraler hydrophober Kern folgt, welcher von ausreichender Länge ist, um durch die Membran hindurchzuragen. Am C-Terminus gibt es für gewohnlich eine kleine ungeladene Aminosäure.
Die Signalpeptide werden durch sogenannte Signalpeptidasen gespalten. Es hat sich gezeigt, daß diese Peptidasen vorzugsweise gewisse Aminosäuresequenzen erkennen, und daß diese Erkennung wirtsspezifisch ist. Beispielsweise erkennt die Bacillus-Signalpeptidase I die Sequenz Ala-X-Ala, wobei X eine beliebige Aminosäure sein kann, und spaltet das Protein unterhalb dieser Sequenz. Einige Vorsicht ist jedoch geboten, da die Spaltspezifität auch von den Aminosäuren abhängt, die dem C-Terminus des Signalpeptids folgen. Viele sekretorische Bacillus-Proteine sind bekannt und die Stellen für einen enzymatischen Verdau sind charakterisiert worden (von Heijne und Abrahmsen ((1989) FEBS Lett. 244 439-446).
Die Verwendung von Wildtyp- (oder unmodifizierten) Signalsequenzen zur Sekretion von sowohl heterologen als auch homologen Proteinen aus Bacilli ist beschrieben worden.
Chang (US 4,711,843) beschreibt die Produktion und Sekretion heterologer Proteine in Bacillus subtilis, die mit Vektoren transformiert waren, welche das interessierende Gen in operativer Verbindung mit der Signalsequenz des β- Lactamasegens von Bacillus licheniformes enthielten.
Palva (US 5,010,000) beschreibt ein Verfahren zur Produktion und Sekretion von ausgewählten Proteinen oder Teilen davon in Bacillus-Stämmen durch Verbinden der DNS, die für das ausgewählte Protein kodiert, mit der Signalsequenz von α- Amylase aus Bacillus amyloliquefaciens.
Stephens et al. (US 4,769,327) beschreibt einen Vektor, der eine für das sekretorische Signal kodierende Sequenz des Bacillus licheniformes α-Amylase Gens umfasst, und die Verwendung eines solchen Vektors für die Produktion und Sekretion von heterologen Proteinen aus Bacilli.
Heikinheimo et al. (Appl. Microbiol. Biotechnol. (1991) 35:51-55) haben berichtet, daß die Verwendung der α-Amylase Signalsequenz aus Bacillus amyloliquefaciens für die Produktion von heterologen Proteinen zu einem heterogenen Produkt führen kann.
Yamagushi et al. (Agric. Biol. Chem. (1991) 55: 2875-2876) haben berichtet, daß Zufallspunktmutationen im Bereich der Signalpeptidspaltung der Bacillus stearothermophilus α- Amylase die Effizienz der α-Amylase-Sekretion sowohl positiv als auch negativ beeinflussen können.
Unter den rekombinanten DNS-Produkten nehmen pharmazeutische Proteine eine hervorragende Rolle ein. Wie oben angegeben, können sich in Abhängigkeit von der verwendeten Signalsequenz heterogene Produkte bilden. Solche Produkte zeigen häufig erhöhte Immunogenizität. Um solche unerwünschten Nebenwirkungen zu vermeiden, ist es wichtig, daß die Produkte so homogen wie möglich sind. Diese Homogenität ist auch vom Zulassungsstandpunkt aus wichtig und damit von weiterreichender Bedeutung als nur bei der Herstellung von pharmazeutischen Proteinen. Die unspezifische Spaltung sollte daher minimiert werden.
Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren zur Minimierung der beobachteten Heterogenität. Dieses Verfahren basiert auf der spezifischen Modifikation der Aminosäuren um die Signalpeptidase-Spaltstelle herum.
Modifizierte Signalpeptide sind z.B. aus Chang (US 4,711,844) bekannt, der modifizierte Penicillinase-Signalpeptide beschreibt, sowie aus Chang et al. (EP 196 864), in der modifizierte pho A-Signalpeptide beschrieben werden. Im Allgemeinen werden diese modifizierten Sequenzen gemacht, um die Sekretion gewünschter Proteine zu erreichen oder zu verbessern, und nicht um die Prozessierungsambiguität von ansonsten normal sezernierten Proteinen zu reduzieren.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung offenbart ein Verfahren zum Ändern des C-Terminus einer Signalsequenz in einer Weise, die Spaltungsambiguität vermeidet.
Genauer gesagt, offenbart die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Reduzierung der Signalpeptidasen- Spaltungsambiguität bei Signalpeptiden mit zwei (oder mehr) überlappenden Spaltstellen.
Durch überlappende Spaltstellen verursachte Signalpeptidasen- Spaltungsambiguität wird durch Änderungen der Aminosäuren, die zur Spaltstelle gehören, dadurch verringert, daß die unerwünschten Spaltstellen beseitigt werden. Dies kann durch Ersetzen, Hinzufügen oder Löschen spezifischer Aminosäuren erreicht werden.
Genauer gesagt, wird die Signalpeptidasen-Spaltungsambiguität in solchen Signalpeptiden reduziert, die zumindest vier Alanine an ihrem C-Terminus enthalten. Ein Teil der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß das Alanin an Position -4 durch einen Serinrest, einen Glycinrest, einen Lysinrest oder einen Phenylalaninrest ersetzt wird. Auch ist es möglich, die Ambiguität durch Austausch der Aminosäuren bei Position -1 oder durch Deletion einer Aminosäure zu verringern.
Die vorliegende Erfindung kann auch dazu verwendet werden, eine zusätzliche Aminosäure einem gewünschten N-Terminus hinzuzufügen. Im zuvor beschriebenen Fall der vier Alanine wäre dies durch Ändern der Aminosäuren an den Positionen -3 oder -1 möglich.
Die vorliegende Erfindung offenbart weiterhin modifizierte Signalsequenzen, die bei Spaltung zu einem homogenen Proteinprodukt führen und bei denen das Protein den korrekten N-Terminus enthält.
Die Wildtyp-Signalsequenzen werden aus Genen erhalten, die für Proteine kodieren, welche normal aus Bacilli sezerniert werden. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung aus B. licheniformes erhaltene, modifizierte α-Amylase- Signalsequenzen zur Verfügung.
Die vorliegende Erfindung offenbart weiterhin DNS- Expressionsprodukte, welche einen homogenen N-Terminus haben, sowie ein Verfahren zum Erhalten solcher Produkte.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt ein Massenspektrum, das anhand von aufgefangenem Material aus nEGF aufgezeichnet wurde. MH&spplus;-Ionen werden bei m/z 6109+/-6 gefunden.
Fig. 2 zeigt die Klonierungsstrategie von hIL-3.
Fig. 3 zeigt die synthetischen Sonden, die verwendet wurden, um die gewünschten Aminosäurenaustausche zu erhalten (SEQ ID NOS:7-16).
Fig. 4 zeigt ein HPLC-Chromatogramm von Komplett-hIL-3, das mit Endo-Lys-C verdaut war. Die Signale A und B liegen in einem Verhältnis von etwa 80 zu 20 % vor.
Fig. 5 zeigt ein HPLC-Chromatogramm des kompletten, mit Endo- Lys-C verdauten hIL-3 nach Ala Phe Substitution. Das Signal B fehlt.
Fig. 6 zeigt ein Massenspektrum, das anhand von aufgefangenem Material des Signals A von Fig. 4 aufgezeichnet wurde. MH&spplus;- Ionen werden bei m/z1088 gefunden.
Fig. 7 zeigt ein Massenspektrum, das anhand von aufgefangenem Material des Signals B von Fig. 4 aufgezeichnet wurde. MH&spplus;- Ionen werden bei m/z1159 gefunden.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung zeigt ein Verfahren zur Überwindung von Spaltungsambiguität bei der Herstellung rekombinanter Proteine. Im vorliegenden Kontext ist Spaltungsambiguität definiert als die Produktion von sezernierten rekombinanten Proteinen, die an ihrem N-Terminus heterogen sind, und wobei diese Heterogenität durch die Anwesenheit von mehr als einer Spaltstelle für die Signalpeptidase der verwendeten Wirtszelle bedingt ist. Genauer gesagt, überlappen die Spaltstellen in solcher Weise, daß die -2 Stelle der ersten Spaltstelle mit der -1 Stelle der zweiten und die -3 der ersten mit der -2 der zweiten übereinstimmt. Es versteht sich, daß mehr als zwei überlappende Spaltstellen vorliegen können, die in analoger Weise behandelt werden können.
Die Erfinder fanden erstmalig heraus, daß die Verwendung der a-Amylase-Signalsequenz von Bacillus licheniformes zu einem N-terminal heterogenen Produkt führte. Eine genauere Untersuchung der a-Amylase-Signalsequenz von Bacillus licheniformes zeigte, daß diese Sequenz die folgende C- terminale Aminosäuresequenz aufweist: reifes Protein
Diese Sequenz enthält zwei potentielle Stellen für Signalpeptidaseverdau (wie durch einen Pfeil angezeigt), vorbehaltlich, daß die erste Aminosäure des reifen Proteins nicht mit der Spaltung zwischen den Aminosäuren -1 und +1 interferiert.
Diese Spaltstellen können zu zwei verschiedenen, reifen Proteinen führen, die entweder die korrekte Sequenz oder eine zusätzliche Aminosäure, Ala, am N-Terminus haben. So kann die Verwendung der α-Amylase Signalsequenz aus B. licheniformes für die Sekretion von heterologen oder homologen Proteinen zu einem heterogen Produkt führen, das aus einer Mischung aus reifem Protein und Protein mit einer zusätzlichen Aminosäure am N-Terminus besteht. Diese Heterogenität wird in der vorliegenden Beschreibung als Prozessierungs- (oder Spaltstellen-) Ambiguität bezeichnet
Das zur Überwindung dieser Ambiguität vorgeschlagene Verfahren ist auf jede Kombination von Signalsequenz und reifem Protein anwendbar. Jedoch führt nicht jede Kombination zu diesem Problem, wie während der Analyse von mittels Bacillus-Stämmen produzierten pharmazeutischen Proteinen entdeckt wurde.
Im Allgemeinen kann Spaltungsambiguität durch Ersetzen einer Signalsequenz durch eine andere beseitigt werden. So könnte z.B. die α-Amylase-Signalsequenz von Bacillus licheniformes durch diejenige von Bacillus subtilis oder Bacillus amyloliquefaciens ersetzt werden.
Die vorliegende Erfindung behandelt vorrangig den Austausch von Aminosäuren zwischen Aminosäure -4 des Signalpeptids und Aminosäure +1 des reifen Proteins. Allgemeiner gesagt, vermeidet die vorliegende Erfindung in einer Situation überlappender Spaltstellen, wo die -2 Stelle der ersten Spaltstelle mit der -1 Stelle der zweiten und die -3 der ersten mit der -2 der zweiten übereinstimmt, die Spaltungsambiguität durch eine ortsgerichtete Aminosäurenänderung. Es versteht sich, daß mehr als zwei Spaltstellen vorhanden sein können, die in analoger Weise behandelt werden können.
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, die passende Spaltung zu erzielen und das reife Protein mit seiner natürlichen N-terminalen Aminosäure zu erhalten.
In seiner Grundform besteht das Verfahren im Austausch einer oder mehrerer Aminosäuren am C-Terminus der Signalsequenz in einer Weise, daß die einzig verbleibende, mögliche Spaltstelle sich an der gewünschten Position befindet. Damit dieser Gedankengang stimmt, muß angenommen werden, daß die Spaltung durch die Signalpeptidase als solche von der Kombination der C-terminalen Aminosäuren des Signalpeptids und der NH&sub2;-terminalen Aminosäuren des reifen Proteins abhängt.
Ein anderes Ziel der Erfindung ist die Möglichkeit, spezifische Aminosäuren um Spaltstellen herum hinzuzufügen oder zu deletieren, was wiederum zu einer Reduktion der Spaltungsambiguität führt.
Als Beispiel dient uns die Bacillus licheniformes α-Amylase- Signalpeptidsequenz. Diese Sequenz hat die folgende C- terminale Sequenz:
Darin geben 1 und 2 die Erkennungsstellen der Signalpeptidase an. Der Verdau findet auf der rechten Seite der Erkennungsstellen statt.
Um ein geeignetes reifes Produkt zu erhalten, muß Erkennungsstelle 2 zerstört werden, ohne dabei mit der Erkennungsstelle 1 zu interferieren. Dies bedeutet, daß die Alanin-Reste an den Positionen -4 und/oder -2 geändert werden müssen. Alternativ dazu kann der Alaninrest an Position -4 oder in diesem Fall jedes einzelne der Alanine deletiert werden.
Die Kombination der B. licheniformes α-Amylase- Signalpeptidsequenz mit humanem IL-3 weist sogar eine dritte mögliche Spaltstelle auf, da reifes humanes IL-3 mit Alanin beginnt:
In der Praxis hat sich herausgestellt, daß Spaltstelle 3 nicht verwendet wird. Anscheinend ist die Bacillus- Signalpeptidase nicht aktiv, falls die Ala-X-Ala sich oberhalb eines Prolins befindet.
Ein Vergleich der vorgestellten Sequenz mit denen anderer Bacillus Signalsequenzen legt einige mögliche Änderungen nahe, die zu spaltbaren Signalsequenzen führen und zugleich einen Verlust der Ambiguität bewirken. Es wird erwartet, daß dies zu einer signifikanten Verringerung des Expressionsniveaus führt. Die α-Amylase von Bacillus stearothermophilus hat ein Lys an Position -4, wodurch Stelle 2 zerstört ist.
B. licheniformes Serinprotease hat ein Ser an -4 und an -2, wobei auch bei diesen Aminosäuren die Spaltstelle 2 spezifisch zerstört wird.
Ein anderer Ansatz zur Reduzierung von Spaltungsambiguität basiert auf den Veröffentlichungen von von Heijne (Nucleic Acids Res. (1986) 14, 4683-4690). Von Heijne hat eine systematische statistische Analyse der Aminosäuresequenzen von sowohl eukaryotischen als auch prokaryotischen Signalpeptiden durchgeführt. Diese Analyse brachte ihn zu dem Vorschlag, daß eine akzeptable Spaltstelle die, wie er es nannte, "(-3,-1) Regel" erfüllen sollte. Diese "Regel" besagt, daß die folgenden strukturellen Bedingungen vorliegen sollten, um eine brauchbare Signalpeptidasespaltung zu erhalten. Die Spaltstelle muß vorzugsweise Ala, Ser, Gly, Cys, Thr, oder Gln an Position -1 haben, und sie sollte vorzugsweise keine aromatische (Phe, His, Tyr, Trp), geladene (Asp, Glu, Lys, Arg) oder große polare (Asn, Gln) Aminosäure an Position -3 haben. Schließlich sollte kein Pro zwischen -3 und 1 vorhanden sein.
In der vorliegenden Situation bedeutet dies, daß zu erwarten steht, daß der Austausch von Ala an -4 durch Gly, Lys oder Phe die Spaltstelle 2 zerstört, ohne die Stelle 1 zu beeinflussen. Allgemeiner wurde festgestellt, daß Austausche entlang dieser vorgeschlagenen Linie nicht immer zu den erwarteten Resultaten führen. Von Heijne hat nicht vorgeschlagen, seine Erkenntnisse in der vorliegenden Weise anzuwenden. Wie oben erwähnt, stellt von Heijne lediglich eine statistische Analyse von Signalseqenzen vor.
Die vorliegende Erfindung kann als ein Verfahren zur Reduzierung von Signalpeptidase-Spaltungsambiguität in Signalpeptiden&sub1; welche zwei überlappende Spaltstellen enthalten, beschrieben werden. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß die Signalsequenz in den Codons mutiert wird, die für die Aminosäuren an den Positionen -4 und/oder -2 relativ zur gewünschten Spaltstelle dergestalt mutiert sind, daß diese Positionen eine Kombination von Aminosäuren enthalten, die nicht an den Positionen -3 und/oder -1 einer Signalsequenz des Ausgangsorganismus vorkommen. Alternativ kann es wünschenswert sein, eine Aminosäure dem N-Terminus eines Proteins hinzuzufügen. Dies kann gleichzeitig mit der Spaltungsambiguitätsverringerung durch Modifizieren von Aminosäuren an den Positionen -3 und/oder -1 durchgeführt werden.
Das in der vorliegenden Erfindung offenbarte Verfahren beruht auf der Beobachtung, daß einige Aminosäuren niemals an spezifischen Stellen nahe einer Signalpeptidase-Spaltstelle gefunden werden und daß dieses Phänomen speziesspezifisch ist. Daher können potentielle Spaltstellen durch spezifische Aminosäureaustausche zerstört werden. Insbesondere versucht man, wenn zwei überlappende Signalpeptidase-Spaltstellen gefunden werden, von dem gegebenen Organismus so viele Signalpeptidase-Spaltstellen wie möglich aufzuspüren. Daraufhin wird analysiert, welche Aminosäuren in diesem Organismus nicht an Position -3 und/oder -1 vorkommen. Schließlich mutiert man die DNS, die für die gewünschte Signalsequenz kodiert, dergestalt, daß diese "verbotenen" Aminosäuren an den Positionen -4 und/oder -2 bezüglich der Signalpeptidase-Spaltstelle auftreten.
Das Verfahren ist im Allgemeinen für jeden Organismus 35 anwendbar. Insbesondere wird das Verfahren für Bacillus dargestellt.
Die vorliegende Erfindung offenbart mutante Signalsequenzen, die von einer Wildtypsignalsequenz von Bacillus erhalten worden sind, welche überlappende Signalpeptidase-Spaltstellen enthält, die in den für die Aminosäuren an Position -4 und/oder -2 bezüglich der gewünschten Spaltstelle kodierenden Codons dergestalt mutiert worden sind, daß diese Positionen eine Kombination von Aminosäuren enthalten, die nicht an den Positionen -3 und/oder -1 der Signalsequenz des Ausgangsorganismus auftreten.
Es versteht sich, daß die vorgeschlagene Aminosäuresequenz der Signalsequenz, wie sie nach der oben beschriebenen Analyse ermittelt wird, in unterschiedlicher Weise erhalten werden kann. Die für die modifizierte Signalsequenz kodierende DNS kann synthetisch erhalten und danach kloniert werden. Die DNS kann auch durch Mutagenese einer existierenden Sequenz erhalten werden.
Die vorliegende Erfindung wird durch Verwendung einer mutierten Bacillus α-Amylase-Sequenz verdeutlicht. Die folgenden Sequenzen sind in Verbindung mit IL-3 verwendet worden:
Die Beispiele illustrieren die Durchführbarkeit des beschriebenen Verfahrens. Die Bacillus licheniformes α- Amylase-Signalsequenz/IL-3-Fusion führt zu 20 % humanem Interleukin-3 (hIL-3) mit einem zusätzlichen Ala. Nach Einbau der oben vorgeschlagenen Aminosäurenaustausche konnte kein zusätzliches Ala entdeckt werden. In allen erwähnten Fällen weist dies auf eine klare Reduzierung der Prozessierungsambiguität hin.
Ein ähnliches Ergebnis wurde für die Kombination der Bacillus licheniformes α-Amylase-Signalsequenz/Maus-Epidermaler- Wachstumsfaktor (EGF) erhalten, wo 80 0% des mEGF ein zusätzliches N-terminales Ala enthalten.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wurde ein Ala aus der Kombination α-Amylase-Signalsequenz/Maus-Epidermaler- Wachstumsfaktor (EGF) deletiert, wodurch die Spaltungsambiguität reduziert wurde. Im Falle von Aminosäurendeletionen muß daran gedacht werden, daß die Deletion einer Aminosäure am C-Terminus eines Signalpeptides zu einer zu kurzen Entfernung zwischen dem hydrophoben Kern, der die membranquerende Region des Signalpeptids ist, und dem reifen Protein führen kann. Dies kann die Signalpeptidase- Aktivität beinflussen.
Das beschriebene Verfahren resultiert in einem Protein mit zumindest zu 80% korrektem N-Terminus. Vorzugsweise enthalten 90% des reifen Proteinmoleküls den reifen N-Terminus, insbesondere beträgt die Menge an inkorrekten Proteinen nur 5 %. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform findet sich kein Signal in HPLC-Experimenten, das mit einer N-terminalen Erweiterung des reifen Proteins korrespondiert.
Neben der Reduzierung der Prozessierungsambiguität fanden wir heraus, daß es keine Verminderung der produzierten Menge an Protein gab. Somit gab es eine signifikante Steigerung sowohl in der relativen als auch der absoluten Menge an N-terminal homogenem Produkt.
Falls ein reifes Molekül zu kurz ist oder falls eine zusätzliche Aminosäure am N-Terminus wünschenswert ist, könnten Mutationen auch an der -3 und/oder -1 Stelle durchgeführt werden. Z.B. erhält man im dargestellten IL-3 Fall 100 % reifes IL-3 durch Ändern der Aminosäuren -4 und/oder -2. Durch Ändern der Aminosäuren -3 und/oder -1 erhält man 1-100 % IL-3 mit einem zusätzlichen N-terminalen Ala.

Beispiele

Beispiel 1

Klonierung, Expression, Reinigung und Prozessierungsambiguität von murinem EGF

Für murines EGF kodierende DNS wurde unter Verwendung des Phosphoamidit-Verfahrens, wie von Beaucape et al. (1981, Tetrahedron lett. 22 : 1859-1862) beschrieben, synthetisiert. Die kodierte Sequenz stimmt mit der von Savage und Cohen (1972, J. Biol. Chem., 247 : 7609-7611) offenbarten Sequenz überein. Diese Sequenz wurde dergestallt entwickelt, daß eine perfekte Fusion zwischen der B. licheniformes α-Amylase- Signalsequenz und der EGF-kodierenden DNS zustandekam. Die EGF-Sequenz wurde im Anschluß in den in EP-A-390252 beschriebenen Vektor pGB/IL-322 einkloniert. Insbesondere wurde das PstI-HindIII Fragment ersetzt, wodurch die hIL-3 Sequenz wirksam ersetzt wurde. Das Plasmid wurde in B. licheniformes T9 transformiert und die Zellen wurden in TSB- Medium (30 g/l Trypton-Soja-Medium, 10 mg/l Mangansulfat und 10 µg/ml Neomycin) bei 37ºC gezogen.
Nach Ernten der Zellen wurde das EGF mittels folgender Standardprozedur gereinigt:
Säurefällung, Zentrifugation, Ultrafiltration, Ionenaustauschchromatographie und schließlich RP-HPLC (gemäß O'Keefe und Sharry, J. Chromatogr. Biomed. Appl. 336 73-85 (1984)).
Massenspektroskopische Daten wurden unter Standardbedingungen durch Verwendung eines BIO ION Plasmadesorptions- Massenspektrometers gesammelt. Die Probe wurde auf nitrocellulosebeschichtetes Target gegeben.
Die Massenspektrometrie zeigt an, daß das EGF-Molekül (erwartete Masse 6040 Daltons) 6109 +/-6 beträgt, was etwa 70 Daltons zu viel ist. Also ist in diesem Produkt eine Aminosäure zu viel vorhanden.
Gemäß den HPLC- und Edman-Abbau-Daten hat das EGF zu etwa 80 % eine N-terminale Ala Erweiterung.

Beispiel 2

Klonierung, Expression&sub1; Reinigung und Prozessierungsambiguität von humanem IL-3

Bacillus licheniformes Zellen (StammTg), die pGB/IL-341 enthalten, wurden in TSB-Medium (30 g/l Trypton-Soja-Medium, 10 mg/l Mangansulfat und 10 µg/ml Neomycin) bei 37ºC gezogen. Der Vektor pGB/IL-341 ist in EP-390252 beschrieben.
Der Vektor pGB/IL-341 ist ein mit pUB110 verwandter Vektor mit der Expressionskassette: α-Amylasepromoter; α-Amylase ss- vollständige hIL-3 kodierende cDNS; 3' nichtkodierendes hIL- 3; a-Amylaseterminator.
Für die Reinigung von humanem IL-3 wurden B. licheniformes T9 Transformanten kultiviert, die pGB/IL-341 enthielten.

Reinigung von humanem IL-3

Um ein hochgereinigtes hIL-3 aus Bacillus licheniformes T9 (vgl. WO 88/04691) zu erhalten, wurden Transformanten, welche die gewünschten Plasmide enthalten, kultiviert und die Zellen zentrifugiert. Summarisch beinhaltete die Reinigung die folgenden Schritte (s. auch WO 90/10705):
a) Hydrophobe Wechselwirkungschromatographie, b) Ultrafiltration, c) Anionenaustauschchromatographie und d) Ultrafiltration.
Zellfreies Medium von B. licheniformes T9 wurde in 1M (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; gegeben und mit NaOH auf einen pH-Wert von 7, eingestellt sowie auf eine Säule von Fractogelä TSK-Butyl 650C (5 x 5 cm) gegeben, die mit 1M (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; in 10mM Tris- HCL-Puffer, pH-Wert 7,0, equilibriert war. 1mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) wurde als Proteinaseinhibitor verwendet.
Während man den Hauptteil des Proteins in der Durchlauffraktion fand, wurde hIL-3 an der Säule adsorbiert. Nach ausgiebigem Waschen dieser Säule mit demselben Puffer wurde hIL-3 mittels eines Gradienten von 1M bis 0,1M (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; in 10mM Tris-HCl-Puffer, pH-Wert 7,0, eluiert (600 ml/h). Die Detektion wurde bei 280 nm durchgeführt.
Ultrafiltration in einer 300 ml Amicon -Rührzelle unter Verwendung von 3kd UF Filtern wurde verwendet, um die hIL-3 Fraktion auf einen pH-Wert von 7,8 und eine Leitfähigkeit von 0,7 mS einzustellen.
Dann wurde hIL-3 auf eine Säule von Q Sepharose Fast-Flow (50 x 5 cm) gegeben, die in einem Tris-Puffer mit identischem pH und identischer Leitfähigkeit equilibriert war (bei einem Fluß von etwa 300 ml/h). In diesem Reinigungsschritt betrug das Volumen der konzentrierten Lösung mit hIL-3, das aufgetragen wurde, 6 - 8 % des gesamten Säulenvolumens. Alle aktiven Formen von hIL-3 wurden in den Durchlauffraktionen gefunden. Die Hauptform von hIL-3 war von anderen hIL-3 ähnlichen kleineren Proteinen getrennt, die ebenfalls in Western-Blots mit antihumanem IL-3 Antikörpern positiv waren. Schließlich wurden die Fraktionen mittels Ultrafiltration entsalzt

Analyse von gereinigtem humanen IL-3 Protein

Gereinigtes humanes IL-3 wurde durch Peptidkartierung in Verbindung mit Massenspektrometrie charakterisiert. Nach Verdau mit ausgewählten Peptidasen wurden die Fragmente mit HPLC getrennt und durch Massenspektrometrie analysiert. Nach Verdau mit Endo-Lys-C fanden wir zusätzlich zu der erwarteten Masse, die mit dem erwarteten Fragment von den ersten zehn Aminosäuren übereinstimmte, eine zweite Masse mit 71 Daltons mehr. Um den Prozentsatz der N-terminalen Heterogenität quantifizieren zu können, wurde die unten beschriebende Analyse entwickelt.
Der Inhalt eines Gefässes (5 µg) Endo-Lys-C mit Sequenzierungsgrad (Boehringer Mannheim Kat. Nr. 1047 825) wurde in 160 µl Ammoniumbicarbonatpuffer, pH-Wert 8,5, gelöst. 50 µl Enzymlösung wurden zu 5 nmol lyophilisiertem hIL-3 gegeben und dieser Reaktionsansatz bei 37ºC für 90 min inkubiert.
Zur schnellen Kompletttrennung der interessierenden Fragmente wurde die folgende HPLC-Prozedur verwendet.
Die HPLC (Applied Biosystems 130A) wurde mit einer RP-18 (Applied Biosystems Kat. Nr. 0711-0014) ausgerüstet. Der komplette Verdauansatz wurde in dieses System injiziert und die Trennung wurde durch Anwenden des folgenden linearen Gradienten von 10 % Lösungsmittel A bis 40 oder 60 % Lösungsmittel B in 45 min bei einer Flußrate von 180 µl in der Minute erreicht.
(Lösungsmittel A: 1 ml Trifluoressigsäure in 1 l Wasser; Lösungsmittel B: 0,85 ml Trifluoressigsäure in 300 ml Wasser und 700 ml Acetonitril). Alle bei 214 nm sichtbaren Fraktionen wurden aufgefangen und, falls nötig, für massenspektrometrische Analyse lyophilisiert.
Massenspektrometrische Daten wurden unter Standardbedingungen mit einem BIO ION Plasmadesorptions-Massenspektrometer oder einem AMD 604 Hochauflösungs-Massenspektrometer unter Verwendung von LSIMS als Ionisationsmodus mit DTT/DTE als Matrix gesammelt.
Das HPLC-Chromatogramm (IL-3) zeigt zwei Signale mit einem Verhältnis von 80 zu 20 %. Die mit dem aufgefangenen Material aufgezeichneten Massenspektren zeigten MH&spplus;-Ionen bei m/z1088 bzw. m/z1159. Dies entspricht der Masse des erwarteten N- terminalen Fragments mit Aminosäuren 1-10 sowie dieses Fragments mit einem zusätzlichen Ala am N-Terminus. Basierend auf Daten anderer Verdau-Experimente konnten andere mögliche Substitutionen oder Additionen von Aminosäuren ausgeschlossen werden.

Beispiel 3

Ambiguitätsreduzierung in der Prozessierung der α-Amylase- Signalsequenz/IL-3-Fusion.

Dieses Beispiel beschreibt die Einführung von Änderungen in die B. licheniformes a-Amylase-Signalsequenz mit PCR- Technologie. Die mutierten Plasmide wurden in B. licheniformes zur Expression gebracht und nach Reinigung des hIL-3 Proteins wurde der N-Terminus charakterisiert.
Die folgenden Änderungen in der a-Amylase-Signalsequenz wurden gewählt, wobei auf die detailierte Beschreibung der Erfindung Bezug genommen wird: Position
A. Ser Ser
B. Gly
C. Lys
D. Phe
Diese Änderungen wurden mit Hilfe der PCR eingebaut. Oligos mit den gewünschten Mutationen wurden entworfen (Fig. 3). Zwei getrennte PCRs mit den Oligos 1 und 2 auf der einen Seite und 3 und 4 auf der anderen Seite und eine Fusions-PCR mit den Produkten wurden für jede Mutation A/D durchgeführt (s. Fig. 2). Die PCRs wurden in einem Perkin Elmerä PCR Thermalcycler durchgeführt, zum Verfahren siehe Chargenanalyse AmpliTaqä DNS Polymerase (Perkin Eimer Cetusä). Die verwendete Menge an MgCl&sub2; betrug 2 mM, des Vektors pGB/IL-341 10 ng, der Oligos 1 und 4 0,5 µg und der Oligos 2 und 3 50 ng.
Die Fusions-PCR wird mit 100 ng beider PCR-Fragmente und 0,5 µg der Oligos durchgeführt. Lauf: 25 Zyklen; 2' bei 94ºC, 2' bei 55ºC, 3' bei 72ºC. Die PCR-Fusionsfragmente wurden in die EcoRI Schnittstelle des pTZ18R Vektors einkloniert. Die Plasmide wurden in E.coli JM109 transformiert, wobei die CaCl&sub2;-Methode verwendet wurde, um die Zellen kompetent zu machen (Sambrook et al., S.1.82 (1989)). Die Transformanten wurden für Blau/Weiß-Screening auf X-Gal und IPTG enthaltenden LB-Agar Platten ausplattiert. Von weißen Kolonien wurde die Plasmid-DNS durch alkalische Lyse isoliert (Sambrook et al., S.1.25-1.28 (1989)) und nach Verdau mit verschiedenen Restriktionsenzymen auf Agarosegelen analysiert. Die pTZ18R-PCR Plasmide wurden bezüglich der Abwesenheit von PCR-Mismatch mittels Sequenase DNS Sequenzierungskit (USB Corporation) sequenziert.
Um die Wildtyp-α-Amylase-Signalsequenz gegen eine mutierte auszutauschen, wurde das pGB/IL-341 Plasmid mit NdeI und EcoRI partiell verdaut. Um das richtige DNS-Fragent zu isolieren, wurde die DNS auch mit PstI verdaut. Nach Trennung auf Gel wurde das 3,9 kb große NdeI-EcoRI DNS-Fragment ausgeschnitten und durch Elektroelution isoliert. Die pTZ18R- PCR Plasmide wurden mit EcoRI und Ndel verdaut und die DNS- Fragmente auf einem 0,7 % Agarosegel aufgetrennt. Die PCR- Bande von 430 bp wurde mit dem Mermaid -Kit (BIO 101 ) aus dem Gel isoliert. Die PCR-Bande wurde in das 3,9 kb- Vektorfragment einligiert und in B.subtilis transformiert.
Die Transformation von B.subtilis wurde im wesentlichen wie durch Niaudet und Ehrlich (1979, Plasmid 2 48-58) beschrieben durchgeführt.
Eine einzelne Kolonie einer Minimalmediumagarplatte mit B. subtilis Zellen (Stamm 1A40) wurde in 10 ml 2x Spizizen&spplus;- Medium (2x Spizizen: 160 mM K&sub2;HPO&sub4;; 88 mM KH&sub2;PO&sub4;; 30 mM (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;; 7 mM MgSO&sub4;; pH 7,0-7,4, 2x Spizizen&spplus;: 2x Spizizen mit 0,5 % Glucose; 0,02 % Casaminosäuren; 50 µg/ml Tryptophan; 20 µg/ml Methionin; 20 µg/ml Lysin) in einen 500 ml konischen Kolben überführt. Die Zellen wurden über Nacht bei 37ºC in einem sacht schüttelnden Wasserbad gezogen. Am nächsten Morgen wurde die Kultur bis zu einer OD&sub6;&sub0;&sub0; 0,1 verdünnt und bei 37ºC und 250-300 U/min inkubiert. Die Kultur wurde für 5-6 h bis zu einer OD&sub6;&sub0;&sub0; 1,0-1,1 gezogen und 1:1 mit 2x Spizizen-Medium verdünnt. Nach einer weiteren Inkubation von 90 min bei 37ºC und 250-300 U/min waren die Zellen kompetent. In einem Universalröhrchen wurden 1 ml kompetenter Zellen und 1 µg DNS für 1 h bei 37ºC und 250-300 U/min inkubiert. Die Zellen wurden auf Minimalagarplatten mit 10 µg/ml Neomycin auspiattiert und bei 37ºC inkubiert. Nach 48 - 72 h erschienen die Transformanten.
Plasmid-DNS wurde aus den Transformanten durch alkalische Lyse isoliert (Sambrook et al., S.1.25-1.28 (1989)), die Zellpellets wurden in Lysepuffer mit Lysozym (Endkonz. 2 mg/ml) aufgenommen und für 5 min bei 37ºC inkubiert, bevor NaOH/SDS zugegeben wurde. Die Plasmide wurden nach Verdau mit mehreren Restriktionsenzymen in einem Gel auf ihre Größe analysiert. Die Plasmide mit der mutierten Signalsequenz wurden mit Protoplasten in B.licheniformes transformiert.
Die Transformation von B. licheniformes wird in EP 134048 beschrieben.
Plasmid-DNS wurde aus B. licheniformes Transformanten mit demselben Verfahren, das bei B. subtilis angewandt wurde, der alkalischen Lyse, isoliert. Die Mutationen der a-Amylase Signalsequenz wurden durch Sequenzanalyse analysiert. Die Mutanten wurden über Nacht in TSB-Medium mit 10 µg/ml Neomycin bei 37 C kultiviert, der Überstand wurde auf ein SDS-PAGE Gel gebracht und auf Nitrocellulose transferiert (Sambrook et al., Molecular Cloning; a laboratory manual (2. Auflage), Cold Spring Harbor Laboratory Press, S.18.47-18.75 (1989)), um durch immunologische Detektion die Größe und die Menge an hIL-3 zu bestimmen. Die Produktivität aller Mutanten scheint sich auf einem "normalen" Niveau für diese Kulturen in Schüttelkolben zu bewegen, und die Größe von hIL-3 weicht nicht von derjenigen des Transformanten mit der Wildtyp a- Amylase-Signalsequen ab.

SEQUENZ PROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE ANGABEN:

(i) ANMELDER:GIST-BROCADES N.V.
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Modifizierte Signalsequenzen
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 18

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 5 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 8 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 29 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 5:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 29 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 6:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 29 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 7:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 29 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 8:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 9:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 33 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 10:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 33 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 11:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 36 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 11:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 12:

(1) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 36 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 12:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 13:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 36 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 13:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 14:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 36 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 14:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 15:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 36 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 15:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 16: (i) SEQUENZKENNZEICHEN: 30 (A) LANGE: 36 Basenpaare (B) ART: Nudeinsäure (C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 16:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 17:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 36 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 17:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 18:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 21 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 18:

Claims

1. Verfahren zur Reduzierung von Signalpeptidase- Spaltungsambiguität in Signalpeptiden, die überlappende Signalpeptidasespaltstellen enthalten, wobei eine DNS- Sequenz, die ein Signalpeptid kodiert, das überlappende Signalpeptidasespaltstellen enthält, in den Codons für die Positionen -4 und/oder -2 relativ zur gewünschten Spaltstelle dergestalt mutiert ist, daß zumindest eine potentielle Signalpeptidasespaltstelle zerstört wird.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die DNS-Sequenz in den Codons für die Positionen -4 und/oder -2 relativ zur gewünschten Spaltstelle dergestalt mutiert ist, daß diese Positionen eine Kombination von Aminosäuren enthalten, die an den Positionen -3 und/oder -1 von Signalsequenzen des Elternorganismus nicht vorkommen.

3. Verfahren zur Reduzierung von Signalpeptidase- Spaltungsambiguität in Signalpeptiden mit zumindest vier Alaninen an ihrem C-Terminus, dadurch gekennzeichnet, daß das Alanin an Position -4 durch einen Glycin-, einen Lysin-, einen Phenylalaninrest oder durch einen Serinrest in Verbindung mit einem Serin an Position -2 ersetzt wird, oder Alanin deletiert ist.

4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die DNS-Sequenz für ein Bacillus-Signalpeptid kodiert.

5. Vektor, umfassend eine DNS-Sequenz, die für eine aktive Signalsequenz kodiert, ausgewählt aus der folgenden Gruppe:

6. Vektor gemäß Anspruch 5, enthaltend eine Proteinkodierende DNS-Sequenz, die mit derjenigen DNS-Sequenz operativ verbunden ist, die für die Signalsequenz kodiert.

7. Mikroorganismus, enthaltend einen Vektor gemäß den Ansprüchen 5 oder 6.

8. Mikroorganismus gemäß Anspruch 7, wobei der Mikroorganismus Bachlus licheniformes ist

9. Verfahren zur Präparation eines Proteins, das umfasst:

- Kultivierung eines Mikroorganismus gemäß Anspruch 7 oder 8 in einem geeigneten Medium, und

- Wiedergewinnung des sezernierten Proteins aus dem Medium.