DE69319528T2

DE69319528T2 - Konfokales Rastermikroskop mit kontinuierlicher Anzeige

Info

Publication number: DE69319528T2
Application number: DE69319528T
Authority: DE
Inventors: Roger Y Tsien
Original assignee: University of California Berkeley
Current assignee: University of California Berkeley
Priority date: 1992-10-05
Filing date: 1993-08-18
Publication date: 1999-03-11
Anticipated expiration: 2013-08-19
Also published as: EP0592089B1; US5283433A; DE69319528D1; EP0592089A3; JPH06201999A; EP0592089A2

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

1. Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft im allgemeinen konfokale Mikroskope zum Abtasten und insbesondere Mikroskope dieser Art, die durch das Abtasten einer Probe mit ultraviolettem Licht und das Detektieren der sich ergebenden Fluoreszenz gewonnene Daten verarbeiten und eine ununterbrochene Anzeige von Abtastdaten liefern.

2. Beschreibung des Standes der Technik

Auf dem wissenschaftlichen Gebieten der Physiologie, Zytobiologie usw. ist es von Bedeutung, das Verhalten der intrazellulären Ionen von Kalzium, Natrium, Magnesium usw. zu erforschen. Dies ist erforderlich, weil angenommen wird, daß diese Ionen eng durch intrazelluläre Physioaktivierung verbunden sind. Als Teil eines Untersuchungsverfahrens für das Verhalten der intrazellulären Ionen werden bekannterweise fluorogene Stoffe in die Zellen injiziert. Diese fluorogenen Stoffe verbinden sich allein mit der bestimmten Art von Ionen in den Zellen und fluoreszieren, wenn sie mit einem Erregungslicht einer speziellen Wellenlänge bestrahlt werden, sichtbar oder ultraviolett.
Beispielsweise sind fluoreszierende Proben Indo-1, Fura-2, Fluo-3 und Rhod-2 bekannte fluorogene Stoffe, die bei der Detektierung von Kalziumionen nützlich sind. Jede dieser fluoreszierenden Proben kann verwendet werden, um die Anwesenheit von Kalziumionen in den Zellen zu detektieren. Beispielsweise fluoresziert die Probe Indo-1 mit Wellenlängen von entweder 405 Nanometern (nm) oder 485 nm in Abhängigkeit von der Konzentration der Kalziumionen in Antwort auf die Erregung durch eine ultraviolette Bestrahlung mit einer Wellenlänge von etwa 350 Nanometern. Die Probe Fura-2 fluoresziert andererseits mit einer Wellenlänge von etwa 500 nm in Antwort auf die Erregung durch eine ultraviolette Bestrahlung mit einer Wellenlänge von etwa 340 nm oder 380 nm.
Wenn die fluoriszierende Probe sich mit den Kalziumionen verbunden hat und durch das ultraviolette Licht erregt wird, fluorisziert sie mit einem Betrag, der sich in Übereinstimmung mit der Konzentration der Kalziumionen ändert. Aus diesem Grunde kann die Konzentration der Kalziumionen in jedem örtlichen Bereich einer Probe durch Messen der Intensität des fluoreszierenden Lichtes bestimmt werden. Die Erregung und die Detektierung der Fluoreszenz kann über der Probenoberfläche ausgeführt werden, wobei ein zweidimensionales Videobild erhalten werden kann. Außerdem können eine Vielzahl von Videobildern in Zeitreihen erhalten werden, wobei das zeitliche Verhalten der Ionen im einzelnen untersucht werden kann.
Wenn das Verhältnis zwischen den Intensitäten der beiden Spitzen der Fluoreszenzspektren bei der ultravioletten Erregung der Fluoreszenzprobe Indo-1 detektiert wird oder wenn das Verhältnis zwischen den Intensitäten der jeweiligen Spitzen der Fluoreszenzspektren bei den alternativen Erregungsoperationen der Fluorenzprobe Fura-2 mit den beiden Wellenlängen der ultravioletten Bestrahlung detektiert wird, kann eine genaue Messung der Kalziumionenkonzentration zuverlässig erhalten werden.
Ein geeignetes konfokales Mikroskop zum Abtasten einer die sich ergebende Fluoreszenz detektierenden Probe ist in der anhängigen und gemeinsam übertragenen US-Patentanmeldung, Serial No. 07/862,633, angemeldet am 1. April 1992, (EP-A-0 564 178) beschrieben und als "konfokales Rastermikroskop zum Abtasten" bezeichnet. Das beschriebenen Mikroskop erzeugt Sätze von digitalen Datenwörternn, die eine Folge von zweidimensio nalen Bildern der Probe in den beiden Fluoreszenzwellenlängen darstellen.
Das in der anhängigen Anmeldung beschriebene konfokale Mikroskop zum Abtasten ist in hohem Maße wirksam bei der Erzeugung von Daten, die Bilder der Fluoreszenz einer Probe darstellen. Es besteht jedoch noch ein Bedürfnis an einem konfokalen Mikroskop zum Abtasten dieser Art, das ferner einen Prozessor zum richtigen Verarbeiten und Umformen der Daten in ein Format aufweist, das die sachdienliche dynamische Information über die Probe optimal übermittelt und es ermöglicht, daß der Benutzer selektiv die Daten manipuliert, um sie an das Erfordernis für spezifische Informationen anzupassen.
Aus der EP-A-363931 gehen ein Lasermikroskop zum Abtasten, das die in dem Oberbegriff des Patentanspruches 1 definierten Merkmale aufweist, und insbesondere eine Abtasteinrichtung, eine Photodetektoranordnung, ein Bildrahmenspeicher und eine Videoanzeigeeinrichtung hervor. In separaten Zwischenspeichern gespeicherte Bildrahmen, die unterschiedlichen Wellenlängen entsprechen, werden miteinander kombiniert, um Details der Probe zu vergrößern.
In der DE-A-28 18 841 ist ferner ein Abtastmikroskop zur Fluoreszenzanzeige und zur Verhältnisbildung in zwei Wellenlängenbändern beschrieben. Die US-A-5,149,972 beschreibt die Durchschnittsbildung von Daten, um schlechten Lichtbedingungen gewachsen zu sein, wobei ein Fluoreszenz-Bildmikroskop verwendet wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Mikroskop gemäß dem Patentanspruch 1 und ein Abtastverfahren gemäß dem Patentanspruch 10.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein konfokales Mikroskop zum Abtasten einer Probe, die mit einem vorbestimmten fluo reszierenden Indikator dotiert ist, wobei das Mikroskop einen Datenprozessor zur Erzeugung einer von einem Operator ausgewählten Verarbeitung von detektierten Fluoreszenzdaten aufweist, um ausgewählte Informationen über die Proben aufzuzeichnen und anzuzeigen. Eine Abtasteinrichtung tastet wiederholt einen Laserstrahl in zwei Dimensionen über die Probe, woraufhin die Probe mit wenigstens einer ersten und einer zweiten vorbestimmten Wellenlänge fluoresziert. Detektoren detektieren von der Probe in diesen Wellenlängen emittiertes Licht und erzeugen unbearbeitete Bilddaten, die eine Folge von verwandten Paaren von zweidimensionalen Bildern der Probe repräsentieren. Der Prozessor bildet dann einen Mittelwert aus den unbearbeiteten Bilddaten, die für eine ausgewählte Anzahl von aufeinanderfolgenden Bildern in jeder der beiden Fluoreszenzwellenlängen erzeugt wurden. Dadurch wird eine Folge von verwandten Paaren von Durchschnittsbilddaten erzeugt, die in einer abwechselnden Folge auf einer einzigen Spur einer nicht flüchtigen Datenspeicher-Einrichtung aufgezeichnet werden. Durch die Mittelwertbildung aus den Daten in dieser Weise können das Rauschen verringert und die Sehschärfe verbessert werden.
Der Datenprozessor des konfokalen Mikroskops enthält ferner eine Vorrichtung zum ins Verhältnis setzen der Durchschnittsbilddaten für jedes verwandte Paar von Bildern, um eine Folge von ins Verhältnis gesetzten Bildern zu erzeugen, die im wesentlichen in Bezug auf irgendwelche Änderungen in der Intensität des Abtaststrahles oder in der örtlichen Konzentration des fluoriszierenden Indikators unempfindlich sind. Diese ins Verhältnis gesetzten Bilder können selektiv an einer Videoanzeigeeinrichtung angezeigt werden. Dadurch, daß es dem Operator ermöglicht wird, die Anzahl von aufeinanderfolgenden Bildern zur Mittelwertbildung auszuwählen, wird er oder sie in die Lage versetzt, den Prozessor zur Optimierung der Sichtbarmachung einer dynamischen Information für die besondere Probe, die gerade abgetastet wird, zu bemessen.
Die Videoanzeigeeinrichtung liefert eine ununterbroche aktualisierte Anzeige der ins Verhältnis gesetzten Bilder und die angezeigten Bilder reflektieren alle Daten, die in den Durchschnittsbilddaten enthalten sind. Auf diese Weise gehen keine von den Detektoren erzeugten Daten verloren oder werden diese nicht verwendet, während frühere Daten zur Speicherung und/oder Anzeige verarbeitet werden.
Das konfokale Mikroskop dieser Ausführungsform enthält gerade drei Rahmenspeicher, von denen zwei benutzt werden, um laufende Summen zur Verwendung bei der Erzeugung der Durchschnittsbilddaten für die beiden Wellenlängen anzusammeln und einer verwendet wird, um die Verhältnisdaten zu erzeugen. Einer der beiden Rahmenspeicher, die zur Ansammlung der laufenden Summen verwendet werden, enthält eine zweite Funktion zur Speicherung der Durchschnittsbilddaten für eine Rahmenzeit, während der der Speicher sonst nicht benutzt würde. Dadurch wird es ermöglicht, daß die Durchschnittsbilddaten für die beiden Wellenlängen in der nicht flüchtigen Datenspeichereinrichtung abwechselnd gespeichert werden.
Weitere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung gehen aus der folgenden Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen hervor, welche im Zusammenhang mit den Figuren erfolgt, die beispielhaft die Prinzipien der Erfindung zeigen.

KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN

Fig. 1 zeigt ein schematisches Diagramm eines erfindungsgemäßen konfokalen Mikroskops zum Abtasten.
Fig. 2 zeigt eine Darstellung des örtlichen Abtastbereiches einer Probe, die mit dem konfokalen Mikroskop der Fig. 1 abgetastet wird.
Fig. 3 zeigt eine perspektivische Ansicht des Ronchi-Beugungsgitters, das in dem konfokalen Mikroskop zum Abtasten der Fig. 1 enthalten ist.
Fig. 4 zeigt ein vereinfachtes Blockschaltbild des Datenprozessorbereiches des konfokalen Mikroskops zum Abtasten gemäß der Fig. 1.
Fig. 5 zeigt ein schematisches Blockschaltbild der Anordnung der Zeilenspeicher zur Ansammlung von Videodaten.
Fig. 6 zeigt ein schematisches Zeitdiagramm, das die Anordnung der Bilddaten zeigt, aus denen durch den Datenprozessor der Fig. 4 ein Mittelwert gebildet wird und die durch diesen aufgezeichnet werden.
Fig. 7A bis 7D zeigen vereinfachte Versionen des Datenprozessors der Fig. 4 und die Signalwege, denen während vier getrennter Phasen der Operation des Prozessors gefolgt wird.

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Gemäß den Figuren und insbesondere gemäß Fig. 1 kann ein konfokales Mikroskop zum Abtasten eine Probe 16 abtasten und die Konzentration der Kalziumionen in der Probe messen, die mit einer Fluoreszenzprobe, wie z. B. Indo-1, dotiert ist. Der optische Bereich dieses Mikroskops ist im Detail in der anhängigen und gemeinsam übertragenen Anmeldung: US-Anmeldung Serial No. 07/862,633, angemeldet am 1. April 1992, offenbart und mit "konfokales Mikroskop zum Abtasten" bezeichnet. Diese anhängige Anmeldung ist auch Inhalt der vorliegenden Anmeldung.
Gemäß Fig. 1 emittiert eine Laserlichtquelle 1 einen kollimierten Strahl LB einer ultravioletten Strahlung mit einer Wellenlänge von 351 nm, der durch eine Strahlaufweiteinrichtung aufgeweitet wird, die konvexe Linsen 2a und 2b umfaßt. Der Laserstrahl läuft durch ein räumliches Filter, wie beispielsweise ein Diaphragma 3 mit einem Stiftloch bzw. eine Lochblende, die zwischen den konvexen Linsen 2a und 2b angeordnet ist. Danach verläuft er durch einen Strahlteiler 4, eine Blende 5, einen optischen Dämpfer 6 und eine Öffnung 7 und erreicht schließlich einen primären dichroitischen Spiegel 8. Der Laserstrahl LB wird durch den dichroitischen Spiegel 8 reflektiert und dann in zwei Dimensionen durch einen horizontalen Abtastspiegel 9 und einen vertikalen Abtastspiegel 10 abgetastet. Der Abtaststrahl wird dann in ein Mikroskopobjektiv 15 über ein reflektierendes übertragendes optisches System, das zwei konkave Spiegel 11 und 14 und einen konvexen Spiegel 13 enthält, eingeführt. Eine Betrachungsiris 12 ist zwischen den Spiegeln 12 und 13 angeordnet und begrenzt den Betrachtungsbereich der Probe.
Das Mikroskopobjektiv 15 hat eine fokussierende Wirkung, wobei Aberrationen für ultraviolettes und sichtbares Licht korrigiert werden, wie dies bei gewöhnlichen optischen Mikroskopen der Fall ist. Der Laserstrahl LB von dem übertragenden optischen System wird durch das Objektiv 15 auf die Probe 16 konzentriert und der Strahl tastet die Probe 16 in zwei Dimensionen durch die Operation der beiden Abtastspiegel 9 und 10 ab. Der horizontale Abtastspiegel 9 ist eine Galvanometer- Abtasteinrichtung mit einer hohen Geschwindigkeit, die mit ihrer Resonanzfrequenz um eine Drehachse 91 senkrecht zur Zeichenebene in Schwingung versetzt wird. Der Spiegel 9 tritt in Antwort auf ein sinusförmiges Eingangssignal mit einer Frequenz von etwa 8 KHz in Resonanz. Der vertikale Abtastspiegel 10 ist andererseits eine Galvanometer-Abtast- Einrichtung mit einer niedrigen Geschwindigkeit. Um das übliche verschachtelte Abtasten eines NTSC-Systems zu realisieren, wird der Spiegel 10 um eine Drehachse 101 parallel zur Zeichenebene und in Antwort auf eine sägezahnförmige Welle mit einer Frequenz von etwa 60 Hz in Schwingung versetzt, die gleich der Feldrate eines üblichen NTSC-Videosignales ist.
Wenn die Fluoreszenzprobe, die der Probe 16 zugegeben wurde, mit dem abtastenden Laserstrahl LB bestrahlt wird, fluoresziert sie mit einer Wellenlängencharakteristik gemäß dem Ausmaß der Konzentration der Kalziumionen. Wenn die Fluoreszenzprobe Indo-1 als ein fluoreszierender Stoff verwendet wird, weist das Spektrum der ausgestrahlten Fluoreszenz Wellenlängenspitzen bei 405 nm und 485 nm auf. Es wird darauf hingewiesen, daß andere Fluoreszenzproben alternativ verwendet werden können, um die Konzentration von Kalzium oder anderen Ionen in der Probe 16 zu messen. In jedem Fall stellt das Verhältnis der Intensitäten der beiden Fluoreszenzwellenlängen ein Maß dieser Ionenkonzentration dar.
Ein Bereich der Fluoreszenzemissionen wird nach außen geleitet und durch das Mikroskopobjektiv 15 konzentriert, hinter dem es wieder denselben Weg wie denjenigen des einfallenden Laserstrahles LB verfolgt und durch den primären dichoitischen Spiegel 8 hindurchtritt. Nachfolgend wird der Fluoreszenzstrahl FL durch einen Reflektor 17 reflektiert und durch ein Sammellinsensystem 18 zu einem Diaphragma 19 mit einem Stiftloch bzw. einer Lochblende geführt.
Nach dem Hindurchtreten durch das Diaphragma wird der Fluoreszenzstrahl FL durch einen sekundären dichroitischen Spiegel 20 in eine erste Wellenlängenkomponente, die die Wellenlänge 405 nm enthält, und eine zweite Wellenlängenkomponente getrennt, die die Wellenlänge 485 nm enthält. Eine der getrennten Fluoreszenzkomponenten verläuft durch ein Filter 21 und wird durch eine Fotovervielfacherröhre (PMT) 22 detektiert, während die andere Fluoreszenzkomponente durch ein Filter 25 hindurchgeführt wird und durch eine Fotovervielfacherröhre 26 detektiert wird. Die Ausgangssignale der jeweiligen Fotovervielfacherröhren 25 und 26 werden durch Analog/Digital-Wandlerkreise 23 und 27 (A/D) in Antwort auf einen Abtasttakt SC, der unten näher erläutert wird, digitalisiert. Die sich ergebenden digitalen Datenwörter werden als Videodaten in Rahmenspeichern gespeichert, die in einem Datenprozessor 30 enthalten sind. Die gespeicherten Videodaten werden selektiv an einer Farbvideoanzeigeeinheit 31 angezeigt und in einem Datenaufzeichnungssytem 32 gespeichert.
Wie dies in der Fig. 2 dargestellt ist, tastet der einfallende Laserstrahl LB, der von dem jeweiligen horizontalen und vertikalen Abtastspiegeln 9 und 10 reflektiert wurde, rastermäßig den örtlichen Abtastbereich 160 der Probe 16 entlang der Abtastlinien 161 ab. Das dargestellte Abtastmuster wird durch eine Kombination der Verschiebungen der Abtastpositionen in einer Y-Richtung, die durch den vertikalen Abtastspiegel bewirkt wird und die Hin- und Herbewegung der Abtastung in einer X-Richtung, die durch den horizontalen Abtastspiegel 9 bewirkt wird, hergestellt. Der örtliche Abtastbereich 160 kann mit einer Standard-NTSC-Zeilenfrequenz von 15,75 KHz auf der Basis der Hin- und Herbewegung der rasterförmigen Abtastung in dem dargestellten Abtastmuster abgetastet werden. Als ein Ergebnis kann das Videobild der Probe mit einer Videorate von 30 Rahmen pro Sekunde gebildet werden.
Ein Referenzstrahl RB zur Überwachung der Schwingungen des horizontalen Abtastspiegels 9 wird verwendet, um den oben erwähnten Abtasttakt SC zu erzeugen. Gemäß Fig. 1 wird der Referenzstrahl RB durch den Strahlteiler 4 erzeugt, der einen Teil des Laserstrahles LB zu einem Spiegel 41 reflektiert, der wiederum den Strahl in Richtung auf den horizontalen Abtastspiegel 9 reflektiert. Der Referenzstrahl RB und der Laserstrahl LB treffen auf einen identischen Punkt am Abtastspiegel 9 auf, wobei die beiden Strahlen um gleiche Beträge abgelenkt werden, unabhängig von irgendeiner mechanischen Verzerrung des Spiegels. Um zu verhindern, daß der Referenzstrahl RB den vertikalen Abtastspiegel 10 stört, fällt er auf den horizontalen Abtastspiegel 9 mit einem Einfallswinkel ein, der sich von demjenigen des Laserstrahls LB unterscheidet. Der Referenzstrahl RB, der durch den horizontalen Abtastspiegel 9 reflektiert wurde, wird durch eine fΘ Linse 42 gesammelt und durch einen Spiegel 43 zur Bildung eines Strahlenpunktes auf einem Ronchi-Beugungsgitter 44 reflektiert.
Wie dies in der Fig. 3 dargestellt ist, weist das Ronchi- Beugungsgitter 44 abwechselnd transparente und undurchsichtige Bereiche auf einer transparenten Glas-Basisplatte auf. Die transparenten und undurchsichtigen Bereiche besitzen die gleiche Breite. Alternativ hat das Beugungsgitter periodische Lichtübertragungsbereiche, die bei gleichen Intervallen auf einer Glas-Basisplatte angeordnet sind, die mit einem undurchsichtigen Film bedeckt ist. Der Fleck des Referenzstrahles RB tastet sich hin- und her bewegend die Oberfläche des Ronchi-Beugungsgitters 44 entlang der Richtung der abwechselnden Bereiche in Antwort auf die Schwingungen des horizontalen Abtastspiegels 9 ab.
Der Referenzstrahl RB, der durch das Ronchi-Beugungsgitter übertragen wurde, wird durch eine Sammellinse 45 gesammelt und dann durch eine Fotovervielfacherröhre PMT 46 detektiert. Die Sammellinse ist vorzugsweise von dem Ronchi- Beugungsgitter derart beabstandet, daß der Strahl immer auf denselben Bereich der Fotovervielfacherröhre PMT 46 auftrifft, unabhängig von seiner Position auf dem Ronchi- Beugungsgitter. Als Ergebnis wird der Referenzstrahl RB detektiert, ohne daß er durch eine nicht gleichmäßige räumliche Empfindlichkeit der Fotovervielfacherröhre PMT beeinträchtigt wird. Das von der Fotovervielfacherröhre ausgesendete Signal wird an einen Zeitgeberkreis 47 geliefert, um den Abtasttakt SC zu erzeugen.
Die Zeitgabe der Datenabtastoperationen in dem A/D- Wandlerkreisen 23 und 27 wird nun erläutert. Wie dies oben bereits festgestellt wurde, wird der horizontale Abtastspiegel 9 in Antwort auf ein sinusförmiges Eingangssignal angetrieben. Die positionsmäßige Veränderung des Spiegels 9 in der Richtung seiner Breite pro Zeiteinheit ist daher in der Mitte seiner Schwingungen größer und in der Nähe der beiden Enden der Schwingungen kleiner. Demgemäß weist der einfallende Laserstrahl LB, der die Oberfläche der Probe 16 abtastet, eine Abtastgeschwindigkeit auf, die in der Mitte jeder Abtastzeile 161 (siehe Fig. 2) am schnellsten und in der Nähe der beiden Enden jeder Abtastzeile am langsamsten ist. Aus diesem Grund ist es zum Erhalt eines verzerrungslosen Videobildes erforderlich, die Datenabtastoperationen in dem A/D- Wandlerkreisen 23 und 27 bei zeitlich ungleichen Intervallen auszuführen, die einer solchen Abtastcharakteristik entsprechen.
Wie dies früher erwähnt wurde, enthält das Ronchi- Beugungsgitter 44 eine abwechselnde Folge von transparenten und undurchsichtigen Bereichen gleicher und gleichmäßiger Breiten. Der Fleck des Bezugsstrahles RB weist einen Durchmesser auf, der mit diesen Breiten vergleichbar ist. Der Signalausgang von der Fotovervielfacherröhre PMT 46 ist daher eine beschnittene Sinuswelle mit einer Frequenz, die sich von einem hohen Wert, wenn der Strahl einen mittleren Punkt des Beugungsgitters abtastet, zu einem niedrigen Wert verändert, wenn der Strahl jedes Ende des Beugungsgitters abtastet.
Der Zeitgeberkreis 47 (Fig. 1) filtert das Ausgangssignal von der Fotovervielfacherröhre PMT 46 durch einen Hochpass filter, um Gleichstrom und verschiedene niederfrequente Komponenten zu entfernen, und vergleicht das gefilterte Signal mit einem Schwellenwert. Ein Taktsignal SC, das einen kurzen Impuls einer festen Länge für jede detektierte Überkreuzung des Schwellenwertes enthält, wird dann zur Verwendung beim Takten der beiden Fotovervielfacherröhren 22 und 26 erzeugt. Auf diese Weise werden zwei Taktimpulse für jeden transparenten Bereich des Ronchi-Beugungsgitters erzeugt und die Taktgabe ist für die zwei entgegengesetzten Abtastrichtungen reproduzierbarer.
Es wird darauf hingewiesen, daß jeder Impuls im Taktsignal SC die Bewegung des abtastenden Bezugsstrahles RB und daher auch des einfallenden Laserstrahles LB um einen festen Betrag repräsentiert, der dem Abstand der undurchsichtigen Bereiche in dem Ronchi-Beugungsgitter 44 entspricht. Die Abtastung der Fotovervielfacherröhren 22 und 26 erzeugt dadurch Daten, die für lineare Abtastungen der Probe 16 repräsentativ sind, trotz der Anwendung eines Abtastspiegels 9, der in einer nicht linearen, sinusförmigen Weise abtastet.
Der Datenprozessor 30 des konfokalen Mikroskops zum Abtasten ist ausführlicher in der Fig. 4 dargestellt. Die Bilddaten werden an den Datenprozessor von den A/D-Wandlern 23 und 27 geliefert und in die Speicher 302 und 304 jeweils eingegeben. Weil die Bilddaten eine sich hin- und herbewegende rasterförmige Abtastung repräsentieren, wie dies die Fig. 2 zeigt, müssen sie in ein Standard-NTSC-Format umgewandelt werden. Aus diesem Grund enthält jeder der beiden Spiegel 302 und 304 zwei Arten von Zeilenspeichern, wie dies die Fig. 5 zeigt. Ein erster Zeilenspeicher 306 ist ein First-in, First-out (FIFO)-Speicher, in den die Folge von Bilddatenwörtern eingeschrieben wird, die abgetastet werden, wenn die ungeradzahligen Abtastzeilen erhalten werden. Ein zweiter Zeilenspeicher 308 ist ein Last-in, First-out (LIFO)-Speicher, in den die Folge der Bilddatenwörter eingeschrieben wird, die erzeugt werden, wenn geradzahlige Abtastzeilen abgetastet werden. Die beiden Zeilenspeicher 306 und 308 senden daher Daten aus, die einem Standard-NTSC-Muster folgen, bei einer Folge von Abtastungen von links nach rechts.
Gemäß Fig. 4 weist der Datenprozessor 30 Addiereinrichtungen 310 und 312 in der Form von arithmetischen und logischen Einheiten auf, um die Folge von Datenwörtern, die von den entsprechenden Speichern 302 und 304 erhalten werden, mit einer Folge von Datenwörtern, die von dem 16-bit tiefen Rahmenspeichern 314 und 316 jeweils empfangen werden, zusammen zu addieren. Die aufeinanderfolgenden Datenwörter, die von den Addiereinrichtungen 310 und 312 ausgesendet werden, werden über Schalter 318 und 320 als Eingangssignale an die jeweiligen Rahmenspeicher 314 und 316 gegeben. Für einen ersten Satz von Schaltpositionen sammeln daher die Rahmenspeicher eine Aufsummierung von Datenwörtern für eine Folge von Bildrahmen, bis sie durch ein Rücksetzsignal zurückgesetzt werden.
Ein zweiter Satz von Positionen für die Schalter 318 und 320 koppelt die aufeinanderfolgenden Datenwörter, die durch die Addiereinrichtung 310 und 312 ausgesendet werden, an durch 2N teilende Einrichtungen 322 bzw. 324. Die ganze Zahl 2N wird so ausgewählt, daß sie der Anzahl von Rahmen entspricht, deren Daten addiert und in den Rahmenspeichern 314 und 316 gespeichert werden. Wenn die Schalter in ihren zweiten Positionen sind, senden daher die durch 2N teilenden Einrichtungen eine Folge von Datenwörtern aus, die die durchschnittlichen Pixelwerte für diese N-Rahmen repräsentieren. Wenn N = 2 kann jede durch 2 N teilende Einrichtung ein geradeaus schiebendes 1-bit Schieberegister bilden.
Der Datenprozessor 30 enthält ferner eine Verhältniseinrichtung 326 in der Form einer 16-bit mal 16-bit Nachschlagetabelle zur Berechnung des Verhältnisses der aufeinanderfolgenden Durchschnittsdatenwörter, die durch die durch 2N teilen den Einrichtungen 322 und 324 ausgesendet wurden. Diese Verhältnisse drücken die Konzentrationen der Kalziumionen in der gerade abgetasteten Probe 16 aus und sind im wesentlichen gegenüber Änderungen der Intensität des Abtaststrahles LB oder Änderungen in der Übertragung der zahlreichen optischen Komponenten unempfindlich. Die berechneten Verhältnisse werden in der Form von 8-bit-Wörtern an eine Hälfte eines 16-bit Zweiwege-Rahmenspeichers 328 für eine Zwischenspeicherung geliefert. Von dort werden die 8-bit Wörter an einen Digital/Analog (D/A)-Wandler 330 und an die Farbvideoanzeigeeinrichtung 31 angelegt.
Auf diese Weise enthält der Datenprozessor 30 drei Rahmenspeicher, von denen jeder 60 bit tief ist und die durch die Bezugszeichen 314, 316 und 328 bezeichnet sind. In jedem Fall werden die für jedes Pixel gespeicherten Daten sofort ausgelesen, bevor neue Daten für dieses Pixel eingeschrieben werden. Aus diesem Grund liest jeder Speicher aus, was in ihn während des vorhergehenden Rahmens einschrieben wurde und nimmt dann den neuen Eingang für den gegenwärtigen Rahmen entgegen. Bei einer alternativen Betriebsart kann jeder Rahmen während jedes vorgegebenen Rahmens eingefroren werden, d. h. es kann verhindert werden, daß er irgendwelche weiteren Eingangsdaten annimmt. Die Rahmenspeicher 314, 316 sind den Addiereinrichtungen 310 und 312 jeweils zugeordnet und speichern Ansammlungen der aufsummierten Daten für bis zu 2N Rahmen, wobei N irgendeine gewählte ganze Zahl bis zu 8 ist.
Der Rahmenspeicher 328 ist zweiwegig ausgebildet, so daß seine eine Hälfte einen einzigen Rahmen der Verhältnisdaten speichert, die das Verhältnis der Durchschnittspixelwerte für Blöcke von 2N-Rahmen in den beiden Fluoreszenzwellenlängen repräsentieren. Die verbleibende Hälfte des zweiwegigen Rahmenspeichers 328 wird verwendet, um 8 bits jedes der aufeinanderfolgenden 16-bit Wörter aufzuzeichnen, die von dem durch 2N teilenden Kreis 324 ausgesendet werden und Durchschnitt lichspixelwerte für die zweite Fluoreszenzwellenlänge repräsentieren. Diese gespeicherten Daten werden zusammen mit den entsprechenden Daten für die erste Fluoreszenzwellenlänge, die von dem Rahmenspeicher 314 geliefert werden, an einen Schalter 332 angelegt und danach an einen D/A-Wandler 334. Der Schalter verändert sich zwischen seinen zwei Positionen jede Rahmenzeit einmal. Die sich ergebenden analogen Daten können dann in dem Datenaufzeichnungssystem 32 aufgezeichnet werden, das beispielsweise die Form eines optischen Plattenrekorders aufweisen kann. Die Verwendung nur eines einzigen Rekorders für beide Wellenlängenbestandteile ist wünschenswert sowohl aus ökonomischen Gründen, wie auch um sicherzustellen, daß die beide Bilder darstellenden Daten zusammengehalten werden.
Es wird darauf hingewiesen, daß die Durchschnittspixelwerte für die erste und zweite Fluoreszenzwellenlänge und nicht die Verhältnisse dieser Werte in dem Datenaufzeichnungssystem 32 aufgezeichnet werden. Dies erfolgt aus mehreren Gründen. Erstens sind die Durchschnittswerte < N1 + N2> und < D1 + D2> nicht notwendigerweise perfekte Maße von Durchschnittspixelintensitäten, weil sie nicht Basiszeilenpegel < N0 + N1> entsprechend den Ausgangssignalen der Detektoren 26 und 27 in der Abwesenheit der Fluoreszenzprobe beinhalten. Solche Basiszeilenpegel sind manchmal bis die Abtastung der Probe 16 abgeschlossen ist, nicht verfügbar. Um sie so in die gewünschte Verhältnisformel, d. h. [< N1+N2> -N0]/[< D1+D2> -D0] einzubauen, ist es daher erforderlich, die Werte < N1 + N2> und < D1 + D2> zu konservieren.
Zweitens können 8-bit-ganze Zahlen und analoge Videorekorder mit optischen Platten nur einen begrenzten Bereich von Verhältnissen repräsentieren und der Operator weiß nicht im voraus welcher Bereich von Verhältnissen erhalten wird. Die Abspeicherung der unbearbeiteten Zähler und Nenner ermöglicht es, daß der Operator die beiden Werte relativ zueinander in einer richtigen Weise skaliert, um den richtigen Bereich der codierbaren Verhältnisse auszuwählen und wichtige Information nicht zu verlieren.
Drittens geben optische Videoplattenrekorder im allgemeinen nicht dieselben Werte exakt wieder, die sie zuvor zur Aufzeichnung empfangen haben. Statt dessen geben sie eine lineare Transformation derselben, d. h. "Playback-Wert = A x (Eingangswert) + B" wieder, wobei A und B Konstante sind. Wenn Verhältnisse aufgezeichnet wurden, müßten die Konstanten A und B bekannt sein. So lange jedoch A und B während der Aufzeichnung der verschiedenen Zähler, beispielsweise < N1 + N2> , und Nenner, beispielsweise < D1 + D2> und während der Aufzeichnung der Basiszeilenwerte N0 und D0 stabil bleiben, heben sich dann bei der Berechnung der Endformel des Verhältnisses [< N1+N2> -N0] / [< D1+D2> -D0] A und B auf, wobei die Berechnung auf den Playback-Werten basiert. Folglich müssen die Werte A und B nicht bekannt sein.
Der Betrieb des Datenprozessors 30 wird nun im Zusammenhang mit den Fig. 6 und 7A bis 7D erläutert. Diese Figuren stellen den Betrieb des Datenprozessors für den speziellen Fall dar, in dem N als die ganze Zahl 1 ausgewählt wird, was bedeutet, daß aus den Datenwörtern für zwei aufeinanderfolgende Bildrahmen zusammen ein Mittelwert gebildet wird. Es wird darauf hingewiesen, daß alternativ auch andere ganze Zahlen als 1 ausgewählt werden könnten.
Fig. 6 zeigt ein Zeitdiagramm, das in der Zeile (a) die Folge der Bilddatenrahmen D1, D2, ... von dem Zeilenspeicher 302 zeigt, die der ersten Fluoreszenzwellenlänge entsprechen und das in Zeile (e) die Folge von Bilddatenrahmen N1, N2, vom Zeilenspeicher 304 zeigt, die der zweiten Fluoreszenzwellenlänge entsprechen. Die von der durch 2 N teilenden Vorrichtung 322 ausgesendeten Durchschnittsdaten sind in der Zeile (b) dargestellt, wobei jeder Rahmen der Durchschnittsdaten von der durch 2 N teilenden Einrichtung innerhalb des letzten (in diesem Falle des zweiten) der beiden Rahmen, aus denen der Mittelwert gebildet wird, ausgesendet wird. In einer ähnlichen Weise zeigt die Zeile (d) die von der durch 2 N teilenden Einrichtung 324 ausgesendeten Durchschnittsdaten, wobei jeder Datenrahmen gleichzeitig mit dem zweiten der beiden Rahmen, aus denen der Mittelwert gebildet wird, ausgesendet wird. Es wird darauf hingewiesen, daß jedes Paar der entsprechenden Durchschnittsdatenrahmen Fluoreszenzbilder darstellt, die gleichzeitig in der Probe 16 erscheinen. Da ein Verhältnis aus den beiden Rahmen der Durchschnittsdaten zu berechnen ist, ist es von Bedeutung, daß diese gleichzeitige Bilder in den beiden Fluoreszenzwellenlängen darstellen.
Die Zeile (c) der Fig. 6 zeigt die Zeitgabe der Aufzeichnung der Verhältnisdaten auf einer Aufzeichnungspur in dem Datenaufzeichnungssystem 32. Jeder Rahmen von Durchschnittsdaten für die erste Fluoreszenzwellenlänge wird auf der Spur eine Rahmenzeit nach seiner Erzeugung aufgezeichnet. Diese Zeitverzögerung wird durch den Speicher 314 erreicht. Umgekehrt wird der Rahmen der Durchschnittsdaten für die zweite Fluoreszenzwellenlänge auf der Spur zwei Rahmenzeiten nach seiner Erzeugung aufgezeichnet. Diese Zeitverzögerung wird durch den Rahmenspeicher 328 erreicht.
Der Datenprozessor 30 führt so vier getrennten Betriebsphasen aus, von denen jede eine Dauer von einer Rahmenzeit, d. h. 1/30 Sekunden besitzt. Der Datenfluß in diesen vier Phasen ist in den Fig. 7A bis 7D gezeigt. In allen Phasen werden die verschiedenen Komponenten des Datenprozessors synchron mit dem Abtasttakt SC des Zeitgeberkreises 47 unter den Befehlen vom Steuersytem 50 (Fig. 1) gesteuert.
In der ersten Phase, die in der Fig. 7A dargestellt ist, werden die ersten Bilddaten D1 für den ersten Rahmen vom Zeilenspeicher 302 empfangen und in den Rahmenspeicher 314 ein geschrieben, nachdem sie durch die Addiereinrichtung 310 gelaufen sind. Zur selben Zeit werden die Bilddaten N1 für den ersten Rahmen von dem Zeilenspeicher 304 empfangen und in den Rahmenspeicher 316 eingeschrieben, nachdem sie durch die Addiereinrichtung 312 gelaufen sind.
In der Phase 2, die in der Fig. 7B gezeigt ist, werden an die Addiereinrichtungen 310 und 312 jeweils die Bilddaten D2 und N2 für den zweiten Rahmen angelegt. Die Addiereinrichtung 310 erzeugt die addierten Daten D 1 + D2 aus den angelegten Bilddaten D2 und den vom Rahmenspeicher 314 ausgelesenen Bilddaten D1 und die durch 2N, d. h. durch zwei teilende Einrichtung 322 liefert die Durchschnittsdaten < D1 + D2> an die Verhältniseinrichtung 326. Gleichzeitig erzeugt die Addiereinrichtung 312 die addierten Daten < N1 + N2> aus den gelieferten Bilddaten N2 und den von dem Rahmenspeicher 316 ausgelesenen Bilddaten N1 und liefert die durch 2 N teilende (d. h. durch zwei teilende) Einrichtung 324, die Durchschnittsdaten < N1 + N2> an die Verhältniseinrichtung. Die Verhältniseinrichtung berechnet wiederum das Verhältnis der individuellen Datenwörter, d. h. < N1 + N2> / < D1 + D2> . Diese Verhältnisse sind Indikatoren für die Konzentration der Kalziumionen in der abgetasteten Probe 16. Die Verhältnisdaten werden in einer Hälfte des Zweiwege-Rahmenspeichers 328 sichergestellt.
In der zweiten Phase werden auch die Durchschnittsdatenwörter < D1 + D2> und < N1 + N2> für die spätere Aufzeichnung (während der nächsten zwei Phasen) in dem Datenaufzeichnungssytem (312) gespeichert. Insbesondere wird das Durchschnittsdatenwort < D1 + D2> in dem Rahmenspeicher 314 gespeichert, während die Durchschnittsdatenwort < N1 + N2> in einer Hälfte des Zweiwegerahmenspeichers 328 gespeichert wird. In beiden Fällen wird jedes Datenwort unmittelbar nachdem das zuvor in seinem dafür vorgesehenen Speicherort gespeicherte Wort ausgelesen wird, in den Speicher eingegeben.
Der Rahmenspeicher 314 dient auf diese Weise zwei unterschiedlichen Funktionen. Die erste besteht darin, eine laufende Summe von den eingehenden Datenwörtern für die erste Wellenlänge zu speichern und die zweite besteht darin, das Durchschnittsdatenwort für die erste Wellenlänge zu speichern. Die letztere Funktion wird während der besonderen Rahmenzeit in jedem Zyklus ausgeführt, wenn eine laufende Summe von eingehenden Datenwörtern nicht gefordert wird.
In der dritten Phase, die in der Fig. 7C gezeigt ist, werden die gegenwärtig in dem Rahmenspeicher 328 sichergestellten Verhältnisdaten < N1 + N2> / < D1 + D2> an den D/A-Wandler 330 geliefert und dann an die Farbvideoanzeige 31. Ein spezielles Pseudofarbbild der abgetasteten Probe 16 wird dadurch erzeugt. Zu dieser Zeit werden die Durchschnittsdaten < D1 + D2> , die gegenwärtig in dem Rahmenspeicher 314 sichergestellt sind, über den Schalter 332 an den D/A-Wandler 334 geliefert und dann auf eine Aufzeichnungsspur des Datenaufzeichnungssystem 32 aufgeschrieben. Während dieser selben Zeitperiode werden an die Addiereinrichtungen 310 und 312 jeweils die nächsten Bilddaten D3 und N3 geliefert. In derselben Weise wie in der Phase 1 werden die Daten D3 in dem Rahmenspeicher 314 sichergestellt und werden die Daten N3 in dem Rahmenspeicher 316 sichergestellt.
In der Phase 4, die die Fig. 7D zeigt, wird das aus den Verhältnisdaten < N1 + N2> / < D1 + D2> abgeleitete Verhältnisbild weiterhin an der Anzeigeeinheit 131 angezeigt, während zu den nächsten an die Addiereinrichtung 313 gelieferten Bilddaten D4 die Bilddaten D3 hinzuaddiert werden, die gegenwärtig in dem Rahmenspeicher 314 sichergestellt sind. Die sich ergebende Summe wird in der durch 2 N teilenden Einrichtung 322 durch zwei geteilt und zwar in derselben Weise wie in der Phase 2. Die so erhaltenen Durchschnittsdaten < D3 + D4> werden an den Rahmenspeicher 314 angelegt. Diese Durchschnittsdaten < D3 + D4> werden auch an die Verhältniseinrichtung 326 angelegt.
In einer ähnlichen Weise werden zu den an die Addiereinrichtung 312 gelieferten Bilddaten N4 die Bildaten N3 hinzuaddiert, die gegenwärtig in dem Rahmenspeicher 316 sichergestellt sind. Die sich ergebende Summe wird in der durch 2 N teilenden Einrichtung 324 durch zwei geteilt. Die Durchschnittsdaten < N3 + N4> , die so erhalten wurden, werden an die Verhältniseinrichtung 326 angelegt. Die Verhältniseinrichtung berechnet das Verhältnis der individuellen Datenwörter < N3 + N4> / < D3 + D4> , die Indikatoren für die Konzentration der Kalziumionen in der Probe 16 sind, die abgetastet wird. Diese Verhältnisdaten werden im Rahmenspeicher 328 sichergestellt.
In der Phase 4 werden auch die Durchschnittsdaten < N1 + N2> vom Rahmenspeicher 328 über den Schalter 332 an den D/A- Wandler 334 angelegt und wiederum auf die Aufzeichnungspur des Datenaufzeichnungssystems 332 geschrieben. Die Durchschnittsdaten < N3 + N4> werden in den Speicher 328 eingeschrieben, wenn die Durchschnittsdaten < N1 + N2> ausgelesen werden.
Durch wiederholte Operationen, die diejenigen der oben beschriebenen Phasen 3 und 4 ähneln, werden die Verhältnisbilder der ersten und zweiten Fluoreszenzwellenlängen in Echtzeit an der Videoanzeigeeinrichtungen 31 angezeigt. Außerdem werden die Durchschnittsdaten, die auf der ersten Fluoreszenzwellenlänge basieren und die Durchschnittsdaten, die auf der zweiten Fluoreszenzwellenlänge basieren, auf einer einzigen Aufzeichnungsspur des Datenaufzeichnungssystems 32 abwechselnd aufgezeichnet. In der gerade beschriebenen Ausführungsform werden die Durchschnittsnenner (z. B. < D1 + D2> ) vor den Durchschnittszählern (z. B. < N1 + N2> ) gespeichert, obwohl diese Reihenfolge willkürlich ist und durch Neuprogrammierung der Nachschlagtabelle, die die Verhältniseinrichtung 326 bildet, leicht umgekehrt werden kann.
Es wird darauf hingewiesen, daß das erfindungsgemäße konfokale Mikroskop so beschaffen ist, daß es eine ununterbrochene Anzeige der gegenwärtigen Bilddatenverhältnisse an der Anzeigeeinrichtung 31 liefert. Der angezeigte Rahmen wird wiederholt aktualisiert, wenn jeder neue Rahmen der Bilddatenverhältnisse verfügbar wird. Es wird auch darauf hingewiesen, daß das Mikroskop die Probe 16 ununterbrochen abtastet und daß alle der sich ergebenden Abtastdaten sichergestellt werden. Diese Daten werden sowohl zur ununterbrochenen Anzeige von Bilddatenverhältnissen, wie auch bei der Berechnung von Durchschnittsdaten zur permanenten Speicherung in dem Videoplattenrekorder 32 verwendet. Dieses Merkmal stellt sicher, daß das dynamische Verhalten der Probe in seiner Gesamtheit erfaßt wird.
Die oben beschriebene Ausführungsform wurde beispielhaft in dem Fall beschrieben, in dem die Durchschnittsbilddaten für zwei aufeinanderfolgende Rahmen auf der Aufzeichnungsspur aufgezeichnet werden. Alternativ ist es auch möglich, die Durchschnittsdaten einer vorbestimmten Anzahl von aufeinanderfolgenden Rahmen, beispielsweise vier Rahmen, acht Rahmen oder sechzehn Rahmen, aufzuzeichnen, wobei in jedem Falle die Durchschnittsdaten der ersten Fluoreszenzwellenlänge sich mit den Durchschnittsdaten der zweiten Fluoreszenzwellenlänge abwechseln.
Wenn die ganze Zahl N so ausgewählt wird, daß sie zwei oder mehr beträgt, wobei aus vier oder mehr Rahmen der Mittelwert gebildet werden muß, unterscheidet sich die Operation des Datenprozessors 30 in zwei Hinsichten von derjenigen, die oben beschrieben wurde. Erstens werden während einiger Zeitrahmen Daten hinzugefügt, ohne daß durch 2N geteilt wird. Zweitens werden während anderer Rahmen Daten nicht aufgezeichnet.
Genauer gesagt bleiben dann, wenn die ganze Zahl N so ausgewählt wird, daß sie zwei oder mehr beträgt, die Operationen während der ersten Rahmen jedes Aquisitionszyklus dieselben wie in den Fig. 7A und 7C. Während der zweiten bis (2N - 1)ten Rahmen, werden die laufenden Summen, die in den Rahmenspeichern 314 und 316 enthalten sind, zu den jeweiligen Addiereinrichtungen 310 und 312 zurückgegeben, so daß sie zu den eingehenden neuen Daten aufsummiert werden, während die Schalter 318 und 320 so eingestellt werden, daß sie die durch 2N teilenden Einrichtungen 322 und 324 überbrücken. Während des letzten, d. h. des 2Nten Rahmens, werden die Schalter 318 und 320 so zurückgesetzt, daß sie die letzte Summe durch die durch 2 N teilenden Einrichtungen 322 und 324 hindurchgeben. Das aufzuzeichnende Durchschnittsbild der ersten Wellenlänge vom Rahmenspeicher 314 wird immer an den Datenrekorder 32 gesendet, während des ersten vollständigen Rahmens nachdem der Durchschnitt berechnet wurde, der normalerweise der erste Rahmen des folgenden Aquisitionszyklus ist. Das aufzuzeichnende Durchschnittsbild der zweiten Wellenlänge von der unteren Hälfte des Rahmenspeichers 328 wird immer an den Datenrekorder 32 während des nächsten vollständigen Rahmens gesendet, der normalerweise der zweite Rahmen des nachfolgenden Aquisitionszyklus ist. Während der verbleibenden (2N - 2) Rahmen dieses nachfolgenden Aquisitionszyklus werden keine Daten in dem Redorder aufgezeichnet.
Bei einer alternativen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden 30 Verhältnispaare pro Sekunde aufgezeichnet, wobei wieder nur ein einziger optischer Plattenrekorder verwendet wird. Dies erfolgt dadurch, daß Felder von Daten anstatt von Rahmen von Daten aufgezeichnet werden. Die vertikale Verschachtelung der alternativen Felder wird ignoriert. Auf diese Weise beziehen sich < N1 + N2> und < D1 + D2> jeweils auf zwei Videofelder, aus denen ein Mittelwert gebildet wird. Jedes wird in dem Rekorder als ein Feld eines einzigen Rah mens gespeichert und jedes enthält nur eine Hälfte der Anzahl der Zeilen eines normalen Rahmens. Dies rechtfertigt die vertikale Auflösung, ist jedoch keineswegs äquivalent zur örtlichen räumlichen Mittelwertbildung, die das Signal-Rausch- Verhältnis um einen Faktor der Quadratwurzel von 2 verbessert.
Bei einer anderen Ausführungsform kann die Verhältniseinrichtung 340 so beschaffen sein, daß sie entweder die Durchschnittsdaten für die erste Fluoreszenzwellenlänge oder die Durchschnittsdaten für die zweite Fluoreszenzwellenlänge durchläßt. Auf diese Weise können Bilder der Probe entweder in der ersten Wellenlänge oder der zweiten Wellenlänge auf der Videoanzeige 31 angezeigt werden.
Obwohl die vorliegende Erfindung ausführlich nur unter Bezugnahme auf die bevorzugte Ausführungsform erläutert wurde, kann ein Fachmann zahlreiche Modifikationen vornehmen, ohne den Schutzbereich der Erfindung zu verlassen. Die vorliegende Erfindung ist daher ausschließlich nur durch die vorliegenden Patentansprüche definiert.

Claims

1. Konfokales Mikroskop zum Abtasten einer Probe (16), die mit einem vorbestimmten fluoreszierenden Indikator dotiert ist, mit:

einer Abtasteinrichtung (9, 10) zum wiederholten Abtasten eines Laserstrahles (LB) in zwei Dimensionen über die Probe, woraufhin die Probe mit einer ersten und einer zweiten vorbestimmten Wellenlänge fluoresziert,

einer ersten (22) und einer zweiten (26) Detektoreinrichtung zum Detektierten von von der Probe mit der ersten und der zweiten Wellenlänge emittiertem Licht und zur Erzeugung einer Folge von Rahmen von Bilddaten, die eine Folge von miteinander in Beziehung stehenden Paaren von zweidimensionalen Bildern der Probe mit der ersten und zweiten Wellenlänge repräsentieren,

einer ersten (302) und einer zweiten (304) Rahmen- Speichereinrichtung zum zeitweisen Speichern individueller Rahmen von Bilddaten für die erste bzw. zweite Wellenlänge,

einer nicht flüchtigen Daten-Speichereinrichtung (32),

einer Übertragungseinrichtung (332, 334) zum Übertragen von Bilddaten, die von den von der ersten und zweiten Detektoreinrichtung erzeugten Daten abgeleitet sind zu der nicht flüchtigen Daten-Speichereinrichtung und

einer Video-Anzeigeeinrichtung (31) zur Erzeugung einer wiederholt aktualisierten Anzeige der abgetasteten Probe,

dadurch gekennzeichnet, daß die individuellen Rahmen von Bilddaten für die jeweiligen Wellenlängen aus gleichzeitigen zweidimensionalen Bildern der Probe bestehen, die gleichzeitig von den Detektoreinrichtungen erhalten werden,

daß die Übertragungseinrichtung (332, 334) zur Übertragung der Bilddaten in einer abwechselnden Weise von den Detektoreinrichtungen zu der nicht flüchtigen Daten- Speichereinrichtung dient,

daß eine erste (310, 314) und eine zweite (312, 316) einen Mittelwert bildende Einrichtung zur Mittelwertbildung aus einer ausgewählten Anzahl von aufeinanderfolgenden Rahmen von Bilddaten, die die jeweilige erste und zweite Wellenlänge repräsentieren, vorgesehen ist, um eine Folge von zueinander in Beziehung stehenden Paaren von Durchschnittsbilddaten zur Auslieferung an die Verhältnis-Einrichtung zu erzeugen,

daß eine Verhältnis-Einrichtung (326) zum wiederholten Berechnen und zeitweisen Speichern des Verhältnisses der zueinander in Beziehung stehenden Paare von Durchschnittsbilddaten aus der entsprechenden ersten und zweiten einen Mittelwert bildenden Einrichtung vorgesehen ist und

daß eine Viedeo-Einrichtung (328, 330) vorgesehen ist, um die Folge der Verhältnisse von durch die Verhältnis- Einrichtung erzeugten Durchschnittsbilddaten zu empfangen und um ein Signal zu erzeugen, das für die Kopplung an die Video- Anzeigeeinrichtung (31) geeignet ist, um eine wiederholte aktualisierte Anzeige der abgetastete Probe zu erzeugen, die im wesentlichen nicht von irgendwelchen Änderungen in der Intensität des abtastenden Laserstrahles oder in der örtlichen Konzentration des fluoreszierenden Indikators in der Probe beeinträchtigt ist.

2. Konfokales Mikroskop nach Anspruch 1, bei dem die Video-Anzeigeinrichtung (31) vorgesehen ist, um eine ununterbrochene Anzeige des Verhältnisses von gegenwärtig in der Verhältnis-Einrichtung gespeicherten Bilddaten zu erzeugen, bis das nächstfolgende Verhältnis von Durchschnittsbilddaten empfangen wird.

3. Konfokales Mikroskop nach Anspruch 2, bei dem die Abtasteinrichtung (9, 10) angeordnet ist, um den Laserstrahl über die Probe kontinuierlich abzutasten, die erste und zweite Detektoreinrichtung ununterbrochen von der Probe emittiertes Licht detektieren und die Folge von Rahmen von Bilddaten ununterbrochen erzeugen und die von der Übertragungseinrichtung zu der nicht flüchtigen Daten-Speichereinrichtung (32) übertragenen Rahmen von Bilddaten alle Daten der von der ersten und zweiten Detektoreinrichtung erzeugten Daten wiedergeben.

4. Konfokales Mikroskop nach Anspruch 3, bei dem die Übertragungseinrichtung (332, 334) Rahmen von Bilddaten zu der nicht flüchtigen Daten-Speichereinrichtung (32) mit einer Rahmenrate übertragen kann, die dieselbe ist, wie die Rahmenrate, mit der die erste und zweite Detektoreinrichtung Rahmen von Bilddaten erzeugen.

5. Konfokales Mikroskop nach Anspruch 1, bei dem die erste und zweite Durchschnittssteuerungseinrichtung (310, 316) jeweils

eine Addiereinrichtung zum Addieren des gegenwärtigen Bilddatenrahmens zu einer vorhergehenden Summe von Bilddatenrahmen zur Erzeugung einer gegenwärtigen Summe von Bilddatenrahmen,

eine Einrichtung zum Ausliefern der gegenwärtigen Summe von Bilddatenrahmen zum Speichern in der zugeordneten ersten oder zweiten Rahmenspeichereinrichtung,

eine Einrichtung zum selektiven Ausliefern des gegenwärtig in der zugeordneten Rahmen-Speichereinrichtung gespeicherten Bilddatenrahmens zu der Addiereinrichtung und

eine Einrichtung enthält, die während der Zeit, während der der letzte Rahmen in jeder Folge von Bildrahmen gemittelt wird, betätigbar ist, um die gegenwärtige Summe von von der Addiereinrichtung erzeugten Bilddatenrahmen durch eine vorgegebene ganze Zahl zu dividieren, um die Durchschnittsbilddaten zur Auslieferung an die Verhältnis-Einrichtung zu erzeugen.

6. Konfokales Mikroskop nach Anspruch 1, bei dem

die Verhältniseinrichtung (326) eine einzige zweiteilige Rahmen-Speichereinrichtung enthält,

die Übertragungseinrichtung Rahmen von Durchschnittsbilddaten für die erste und zweite Wellenlänge an die nicht flüchtige Daten-Speichereinrichtung (32) abwechselnd überträgt,

jeder der aufeinander folgenden Durchschnittsbilddatenrahmen für die erste Wellelänge während der Dauer eines Rahmens in der ersten Rahmen-Speichereinrichtung gespeichert wird und

jeder der aufeinander folgenden Durchschnittsbilddatenrahmen für die zweite Wellenlänge während der Dauer von zwei Rahmen in einer Hälfte der zweigeteilten Rahmen- Speichereinrichtung der Verhältniseinrichtung gespeichert wird.

7. Konfokales Mikroskop nach Anspruch 6, bei dem die erste und zweite Rahmen-Speichereinrichtung und die Rahmen-Speichereinrichtung der Verhältnis-Einrichtung dieselbe vorbestimmte Größe besitzen und

jede der ersten und zweiten Rahmen- Speichereinrichtungen gerade nur einzigen Rahmen von Bilddaten speichert und Daten zum Speichern unmittelbar nach dem Auslesen zuvor gespeicherter Daten empfängt.

8. Konfokales Mikroskop nach Anspruch 1, bei dem

die Abtasteinrichtung (9, 10) angeordnet ist, um über die Probe in einem rasterförmigen Abtastmuster abzutasten und die erste und zweite Detektoreinrichtung Daten erzeugen, die Videosignale für jede der ersten und zweiten Wellenlänge darstellen.

9. Konfokales Mikroskop nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Abtasteinrichtung einen Laser (1) zur Erzeugung eines Laserstrahles (LB), eine Mikroskopobjektiv- Einrichtung (15) zum Positionieren des Mikroskopobjektivs neben der abzutastenen Probe und eine Einrichtung (9, 10) zur wiederholten Abtastung des Laserstrahles in einem rasterförmigen Abtastmuster über die Probe aufweist.

10. Verfahren zum Abtasten einer Probe (16), die mit einem vorbestimmten fluoreszierenden Indikator dotiert ist und zur Erzeugung einer Videoanzeige der Probe mit den folgenden Schritten:

wiederholtes Abtasten (9, 10) eines Laserstrahles (LB) in zwei Dimensionen über die Probe, woraufhin die Probe mit einer ersten und einer zweiten vorbestimmten Wellenlänge fluoresziert,

Detektieren (22, 26) von von der Probe mit der ersten und zweiten Wellenlänge emittiertem Licht und Erzeugen einer Folge von Rahmen von Bilddaten, die eine Folge von zueinander in Beziehung stehenden Paaren von zweidimensionalen Bildern der Probe repräsentieren, mit der ersten und zweiten Wellelänge,

zeitweiliges Speichern von individuellen Rahmen von Bilddaten für die jeweilige erste und zweite Wellenlänge in einer ersten (302) und einer zweiten (304) Rahmen- Speichereinrichtung,

Übertragen (332, 334) von von den Daten für die erste und zweite Wellenlänge, die beim Schritt der Detektierung erzeugt wurden, abgeleiteten Bilddaten, zu einer nicht flüchtigen Daten-Speichereinrichtung (32),

und Anzeigen der abgetasteten Probe auf einer Video- Anzeigeeinrichtung (31),

dadurch gekennzeichnet, daß die zueinander in Beziehung stehenden Paare von zweidimensionalen Bildern der Probe aus gleichzeitig detektierten Bildern bestehen,

daß die Bilddaten zu der nicht flüchtigen Daten- Speichereinrichtung (32) abwechselnd zwischen der ersten und zweiten Wellenlänge übertragen werden,

daß ein Schritt zur Bildung eines Mittelwertes (310, 316) aus einer ausgewählten Anzahl von aufeinanderfolgenden Rahmen von Bilddaten, die die erste und zweite Wellelänge repräsentieren, ausgeführt wird, um eine Folge von zueinander in Beziehung stehenden Paaren von Durchschnittsbilddaten zu erzeugen,

daß ein Schritt des wiederholten Berechnens (326) und des zeitweiligen Speicherns des Verhältnisses der Durchschnittsbilddaten für die entsprechende erste und zweite Wellenlänge ausgeführt wird, um eine Folge von Bilddatenverhältnissen zu erzeugen,

und daß ein Schritt des Empfanges (328, 330) der Folge der Verhältnisse von Durchschnittsbilddaten und zur Lieferung eines Videosignales, das zur Kopplung an eine Video- Anzeigeeinrichtung (31) geeignet ist, ausgeführt wird, um eine wiederholt aktualisierte Anzeige der Folge von Verhältnissen von Durchschnittsbilddaten zu erzeugen, die im wesentlichen nicht durch irgendwelche Veränderungen in der Intensität des abtastenden Laserstrahles oder in der örtlichen Konzentration des fluorezierenden Indikators in der Probe beeinträchtigt wird.

11. Verfahren nach Anspruch 10, bei dem der Schritt des Empfangens eine ununterbrochene Anzeige des Verhältnisses von gegenwärtig beim Schritt des wiederholten Berechnens gespeicherten Durchschnittsbilddaten liefert, bis das nächstfolgende Verhältnis von Durchschnittsbilddaten empfangen wird.

12. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem der Schritt des wiederholten Abtastens ununterbrochen ausgeführt wird,

der Schritt des Detektierens ununterbrochen ausgeführt wird, so daß die Folge von Rahmen von Bilddaten ununterbrochen ist und

die Rahmen von Bilddaten, die zu der nicht flüchtigen Daten-Speichereinrichtung beim Schritt des Übertragens übertragen werden, alle beim Schritt des Detektierens erzeugten Daten wiedergeben.

13. Verfahren nach Anspruch 12, bei dem der Schritt des Übertragens einen Schritt enthält, bei dem selektiv Rahmen von Bilddaten zu der nicht flüchtigen Daten- Speichereinrichtung mit einer Rahmenrate übertragen werden, die dieselbe ist, wie die Rahmenrate, mit der der Schritt des Detektierens Rahmen von Bilddaten erzeugt.

14. Verfahren nach Anspruch 10, bei dem der Schritt der Durchschnittsbildung die folgenden Schritte umfaßt:

Addieren des gegenwärtigen Bilddatenrahmens zu einer vorhergehenden Summe von Bilddatenrahmen, zur Erzeugung einer gegenwärtigen Summe von Bilddatenrahmen,

Ausliefern der gegenwärtigen Summe von Bilddatenrahmen zur Speicherung in der zugeordneten ersten oder zweiten Rahmen-Speichereinrichtung,

selektives Ausliefern des gegenwärtig in der zugeordneten Rahmen-Speichereinrichtung gespeicherten Bilddatenrahmens zu der Addiereinrichtung und

während der Zeit, während der ein Durchschnittswert aus dem letzten Rahmen in jeder Folge von Bildrahmen erzeugt wird, Teilen der gegenwärtigen Summe von in dem Addierschritt erzeugten Bilddatenrahmen durch eine vorbestimmte ganze Zahl, zur Erzeugung von Durchschnittsbilddaten zur Verwendung in dem Schritt des wiederholten Berechnens.

15. Verfahren nach Anspruch 10, bei dem:

der Schritt des wiederholten Berechnens eine einzige zweiteilige Rahmen-Speichereinrichtung verwendet, der Schritt des Übertragens Durchschnittsbilddatenrahmen für die erste und zweite Wellenlänge zu der nicht flüchtigen Daten-Speichereinrichtung abwechselnd überträgt,

jeder der aufeinanderfolgenden Durchschnittsbilddatenrahmen für die erste Wellenlänge während der Dauer eines Rahmens in der ersten Rahmen-Speichereinrichtung gespeichert wird

und jeder der aufeinanderfolgenden Durchschnittsdatenrahmen für die zweite Wellenlänge während der Dauer von zwei Rahmen in einer Hälfte der zweiteiligen Rahmen- Speichereinrichtung gespeichert wird, die beim Schritt des wiederholten Berechnens verwendet wird.

16. Verfahren nach Anspruch 15, bei dem:

die erste und zweite Rahmen-Speichereinrichtung, die beim Schritt des zeitweisens Speicherns verwendet werden und die Rahmen-Speichereinrichtung, die beim Schritt des wiederholten Berechnens verwendet wird, dieselbe vorbestimmte Größe besitzen

und der Schritt des wiederholten Speicherns einen Schritt umfaßt, bei dem Daten zum Speichern in der ersten und zweiten Rahmen-Speichereinrichtung unmittelbar nach dem Auslesen vorhergehend gespeicherter Daten empfangen werden.

17. Verfahren nach Anspruch 10, bei dem:

der Schritt des wiederholten Abtastens einen Schritt des Abtastens über die Probe in einem rasterförmigen Abtastmuster umfaßt und

der Schritt des Detektierens einen Schritt der Erzeugung von Daten umfaßt, die Videosignale für jede der ersten und zweiten Wellenlängen darstellen.