DE69329353T2 - Verfahren zur Herstellung und Analyse von Leukozyten in Vollblut unter Verwendung der Durchflusszytometrie - Google Patents

Description

Gebiet der Erfindung
• Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Unterscheiden und Identifizieren von Leukozyten-Subpopulationen in einer Blut- oder Knochenmarksprobe. Insbesondere betrifft die Erfindung Verfahren zur Unterscheidung und Identifizierung von Leukozyten-Subpopulationen in einer Blut- oder Knochenmarksprobe mittels Durchflusszytometrie unter Verwendung von Fluoreszenz- und Lichtstreuungsmerkmalen der Leukozyten.
Hinterrund der Erfindung
• Auf dem Gebiet der Hämatologie ist es oft nützlich, die verschiedenen Arten von weißen Blutzellen (Leukozyten), die im Blut oder Knochenmark vorhanden sind, zu unterscheiden und zu identifizieren. Die Analyse von Subpopulationen von Leukozyten ist im Hinblick auf die Beurteilung von Krankheiten des Immunsystems wie der erworbenen Immunschwächekrankheit (AIDS) ganz besonders interessant. Insbesondere hat die Analyse von Lymphozyten, einem einkernigen, an der Immunantwort beteiligten Leukozyten, klinische Bedeutung für den Umgang mit Störungen des Immunsystems. Es mag z. B. nützlich sein, die Anteile von Untermengen von T-Zellen und B-Zellen, die Helfer- /Induktor-Untermengen von T-Zellen oder die Hemmer-/zytotoxischen Untermengen von Zellen aufzufinden oder zu quantifizieren. Monozyten, Granulozyten (Neutrophile), Eosinophile und Basophile sind weitere Leukozyten-Subpopulationen von klinischem Interesse, zusätzlich zu Lymphozyten. Diese Zellarten können mittels Durchflusszytometrie aufgelöst und analysiert werden.
• Durchflusszytometer sind zum Auffinden von Teilchen wie z. B. Zellen von Nutzen. Diese Instrumente verfügen über Mittel zum Detektieren von nach vorne und seitwärts gestreutem Licht sowie über ein oder mehrere Mittel zum Detektieren von Fluoreszenz. Anhand der Lichtstreuung nach vorne und seitwärts werden physische Parameter wie z. B. Zellgräße und Körnigkeit bestimmt. Mit Hilfe der verschiedenen Fluoreszenzdetektoren werden Zellen unterschieden, die mit Fluorochromen markiert sind, die zur Aussendung von Licht auf unterschiedlichen Wellenlängen angeregt werden können. Beispiele für Fluorochrome, die im Stand der Technik für den Einsatz in der Durchflusszytometrie bekannt sind, sind Fluorescein-Isothiocyanat (FITC), Phycoerythrin (PE), Propidiumiodid (PI) und Peridininchlorophyllprotein (PerCP). AlI diese Fluorochrome können mit Licht mit einer Wellenlänge von 488 nm angeregt werden, ihre Emissionswellenlängen sind jedoch unterschiedlich. FITC emittiert Fluoreszenz auf etwa 530 nm, PE und PI emittieren Fluoreszenz auf etwa 570 nm und PerCP emittiert Fluoreszenz auf etwa 670 nm, was es ermöglicht, drei Fluoreszenzen verschiedener Farbe mittels einer einzigen Anregungswellenlänge aufzufinden.
• Zur Analyse einer speziellen Subpopulation von Leukozyten mittels Durchflusszytometrie wird das Durchflusszytometer so eingestellt, dass es sich bei einem ausgewählten Parameter aktiviert. "Sich aktivieren" bezieht sich auf eine voreingestellte Schwelle für das Detektieren eines Parameters. Es wird typischerweise als Mittel zur Detektion des Durchgangs einer Zelle oder eines anderen Teilchens durch den Laserstrahl verwendet. Die Detektion eines Ereignisses, das die Schwelle für den ausgewählten Parameter überschreitet, löst die Erfassung von Lichtstreuungs- und Fluoreszenzdaten für das Teilchen aus. Für Zellen oder Teilchen, die eine Antwort unterhalb der Schwelle hervorrufen, werden keine Daten erfasst. Der typische Auslöserparameter ist die Detektion von nach vorne gestreutem Licht, hervorgerufen durch den Durchgang einer Zelle oder eines Teilchens durch den Lichtstrahl. Das Durchflusszytometer detektiert und sammelt dann die Lichtstreuungs- und Fluoreszenzdaten für die Zelle.
• Eine spezielle interessierende Subpopulation wird dann mittels "Gating" basierend auf den für die gesamte Population gesammelten Daten weiter analysiert. Zur Auswahl eines geeigneten Gates werden die Daten graphisch dargestellt, um die bestmögliche Trennung von Subpopulationen zu erzielen. Dies erfolgt typischerweise durch graphisches Darstellen von vorwärts gerichteter Lichtstreuung (FSC) gegen Seitenlichtstreuung (d. h. orthogonal) (SSC) auf einer zweidimensionalen Punktegraphik. Der Bediener des Durchflusszytometers wählt dann die gewünschte Subpopulation von Zellen (d. h. die Zellen innerhalb des Gates) aus und schließt Zellen, die nicht innerhalb des Gates sind, aus. Typischerweise wählt der Bediener das Gate aus, indem er mit einem Cursor auf einem Computerbildschirm eine Linie rund um die gewünschte Subpopulation zeichnet. Nur jene Zellen, die innerhalb des Gates sind, werden dann weiter analysiert, indem die anderen Parameter für diese Zellen wie z. B. Fluoreszenz graphisch dargestellt werden. Während Gating ein wirkungsvolles Mittel zum Ausscheiden von Daten für Zellen, die nicht von Interesse sind, ist und somit die Fähigkeit verbessert, die gewünschte Subpopulation zu analysieren, kann es eine Quelle substantieller Fehler sein, wenn die Trennung der Subpopulationen nicht optimal ist.
• Die Auflösung von Leukozyten-Subpopulationen durch Lichtstreuung wird beeinträchtigt, wenn unlysierte oder Vollblutproben mittels Durchflusszytometrie analysiert werden. Dies ist durch den Umstand bedingt, dass in der Probe vorhandene rote Blutzellen (Erythrozyten) mit Lichtstreuungsmessungen und unklaren Signalen von anderen Zellarten interferieren. Die Interferenz ist bei Streuung nach vorne besonders groß, was große Fehler bei der Analyse von Lymphozyten verursacht. Aus diesem Grund lysieren Praktiker typischerweise die roten Blutzellen in einer Probe, wenn eine Analyse der Leukozyten gewünscht ist. Mehrere Reagenzien zur Lyse von Erythrozyten, die im Rahmen der Erfindung von Nutzen sind (z. B. Wasser, Saponin und die anderen, weiter unten besprochenen Lyse-Reagenzien), sind im Stand der Technik bekannt. Das am häufigsten verwendete ist gepuffertes Ammoniumchlorid. Obwohl im Allgemeinen mit Streuungsgating in Ammoniumchloridlösungen eine adäquate Trennung der Zelitrümmer von Lymphozyten erzielt werden kann, bedeutet das Fehlen eines Fixiermittels, dass die biologische Probe eine biologische Gefahr darstellen kann. Die Zugabe eines Fixiermittels wie z. B. Paraformaldehyd zu Ammoniumchlorid-Lyselösungen ist allerdings unbefriedigend, bedingt durch die Bildung von Wasserstoffionen, die den pH-Wert der Probe herabsetzen und die Fluoreszenz aus Fluorescein reduzieren, wodurch eine Immunofluoreszenzanalyse beeinträchtigt wird.
• Lyse-Reagenzien umfassend Formaldehyd, ein Salz einer schwachen Säure und einen Polyalkohol sind auch im Stand der Technik bekannt (US-Patent Nr. 4,902,613 und 4,654,312). Dieses Lyse-Reagens ist bei Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, Kalifornien, unter dem Namen FACS Lysing Solution erhältlich und enthält Diethylenglykol, Heparin, Citratpuffer und Formaldehyd, pH-Wert 7,2. Wegen des Vorhandenseins von Formaldehyd bietet die FACS Lysing Solution den Vorteil, die biologische Gefahr von biologischen Proben zu verringern. Allerdings verursacht dessen Vorhandensein in einer Probe, die mittels Durchflusszytometrie analysiert wird, eine Zellschrumpfung, und es kann zu unbefriedigenden Gehalten an Zelitrümmern kommen, die die dem Gating zu unterziehende Zelipopulation, insbesondere Lymphozyten, unklar machen können. Andere im Stand der Technik bekannte Lyse-Reagenzien werden weiter unten im Zusammenhang mit "Nicht-Waschen"-Probenpräparationsverfahren beschrieben.
• Zur Reduzierung der negativen Auswirkung von Lyse-Reagenzien auf Lichtstreuungsparameter wird die lysierte Probe typischerweise zentrifugiert und gewaschen, um Trümmer, ungebundene Fluorochrom-markierte Antikörper und die Lyselösung selbst zu beseitigen, was alles zu einer dürftigen Lichtstreuungsanalyse beiträgt. Während dieses Verfahren das Problem, Leukozyten-Subpopulationen auf der Grundlage von Lichtstreuungsmerkmalen aufzulösen, teilweise löst, ist es arbeitsaufwendig, fügt dem Verfahren Schritte hinzu, ist schwierig zu automatisieren und kann zu einem Verlust von Zellen führen, was genaue Zellzählungen an der Probe ausschließt. Um beispielsweise genaue CD4+ Lymphozytenzählungen aus lysierten, gewaschenen Blutproben zu erzielen, erfordern die derzeit verfügbaren Verfahren eine Mehrzahl von Schritten und eine komplexe Datenanalyse.
• Es ist deshalb wünschenswert, Verfahren zur Präparation von lysierten Blutproben zur Verfügung zu haben, die vdr der Durchflusszytometrieanalyse keine Entfernung der Lyselösung und kein Waschen erfordern. Solche "Nicht-Waschen"- Probenpräparationsverfahren für die Durchflusszytometrie sind im Stand der Technik bekannt. Caldwell et al. (AJCP 86 : 600-607 (1986)) beschreiben ein Nicht-Waschen- Verfahren für eine immunophänotypische Analyse von Zellen mittels Durchflusszytometrie, bei dem Lymphozyten durch Fraktionierung nach Dichtegradienten von periphären Blutproben isoliert werden, womit sich die Erfordernis einer Erythrozytenlyse erübrigt. Nach immunofluoreszierendem Färben werden die Proben einer durchflusszytometrischen Analyse ohne Waschen unterzogen, wobei die ungebundene fluoreszierende Markierung in der analysierten Probe gelassen wird. Die Lymphozyten werden identifiziert und dem Gating unterzogen, wobei Parameter der vorwärts und seitwärts gerichteten Lichtstreuung verwendet werden.
• Das US-Patent Nr. 5,030,554 offenbart die Behandlung einer Blutprobe mit einem Lyse-Agens, das eine wasserlösliche, organische Carbonsäure mit einem pK-Wert über 3,0, einem ph-Wert von etwa 2,6 bis 4,0 und einem Gegenion, das die Jonenstärke der Probe nicht wesentlich verändert, enthält. Die separaten Färbe-, Lyse- und Quenchingschritte werden in einem einzigen Gefäß durchgeführt, ohne die Erfordernis, vor der Analyse unreagiertes Färbemittel und/oder unverbrauchte Reagenzien aus der Probe zu entfernen. Die Leukozyten-Subpopulationen werden identifiziert und auf die traditionelle Weise aufgelöst, wobei Parameter der nach vorne und seitwärts gerichteten Lichtstreuung verwendet werden. Dieses Nicht-Waschen-Verfahren ist unter dem Namen Q-PREP im Handel beziehbar, und zwar von der Coulter Corporation. Ortho Diagnostic Systems hat auch ein Nicht-Waschen- Probenpräparationsprotokoll, nach dem Ammoniumchlorid verwendet wird, veröffentlicht, worin bemerkt wird, dass im Falle, dass die Analyse der Zellen in der Lyselösung nicht innerhalb von 2 Stunden durchgeführt wird, die Zellen zentrifugiert, gewaschen, wieder in phosphatgepufferter Salzlösung suspendiert und innerhalb von 8 Stunden analysiert werden sollten.
• Die WO 88/07187 offenbart ein Reagens für die Lyse von roten Blutzellen, das eine Carbonsäure mit niedrigem Molekulargewicht, eine Sulfonsäure oder ein aktiviertes Phenol enthält. Die lysierte Probe wird direkt mittels Durchflusszytometrie analysiert, um Leukozyten-Subpopulationen auf der Grundlage von vorwärts gerichteter Lichtstreuung und Winkellichtstreuung zu identifizieren. Es wird gelehrt, dass Fragmente der roten Zellen nicht die photometrische Differenzierung von Leukozyten-Subpopulationen mit diesem Lyse- Reagens stören oder sich nachteilig darauf auswirken.
• Mehrere Verfahren zum Analysieren und für das Gating von Leukozyten- Subpopulationen sind im Stand der Technik bekannt. Das US-Patent Nr. 4,284,412 offenbart eine Vorrichtung und ein Verfahren für das Gating einer Leukozyten-Subpopulation wie z. B. Lymphozyten. Ein Durchflusszytometer wird so modifiziert, dass einer der rechtwinkeligen Fluoreszenz-Kanäle als Wellenlängen-spezifischer Sensor für rechtwinkelige Streuung dient. Eine interessierende Lymphozyten-Unterklasse wird fluoreszenz-markiert und die Probe analysiert, wobei die Detektion von Impulsen von vorwärts gerichteter und rechtwinkeliger Streuung innerhalb spezifizierter Bereiche verwendet wird, um die Erfassung eines Fluoreszenz-Signals auszulösen, wodurch es zum Gating der Lymphozyten-Population kommt. Die Vorrichtung und das Verfahren werden in Verbindung mit Lyse und Waschen von Erythrozyten in der Blutprobe gemäß herkömmlichen Verfahren verwendet.
• Das US-Patent Nr. 4,727,020 offenbart ein Verfahren zum Analysieren von Subpopulationen von Blutzellen, wobei ein Fluoreszenz-Aktivator (Trigger) und entweder lysierte und gewaschene oder unlysierte Proben verwendet werden. Die Antikörper für die Verwendung bei der Aktivierung umfassen anti-HLe-1, und die erfassten Daten werden anhand von zwei Fluoreszenz-Parametern zum Auflösen der Subpopulationen analysiert.
• Terstappen et al. (J. Immunol. Mtds. 123 : 103-112 (1989)) beschreiben ein Nicht- Waschen-Verfahren für eine Durchflusszytometrieprobenpräparation, bei der periphäre Blutzellen mit dem Nukleinsäurefärbemittel LDS-751 markiert werden. Die roten Blutzellen in der markierten Probe werden vor der Messung auf einem Durchflusszytometer in Wasser lysiert. Die Immunofluoreszenz-Auflösung von Leukozyten und der Prozentsatz von Leukozyten-Subpopulationen korrelierten gut mit Ergebnissen, die mit einem klinischen Hämatologie-Analysator erzielt wurden, und das Nukleinsäurefärbemittel ermöglichte eine Unterscheidung intakter Zellen von Geistern, Plättchen und beschädigten kernhaltigen Zellen. Das Nicht-Waschen-, hypotonische Lyseverfahren stellte ein Mittel bereit, absolute Zahlen von Leukozyten-Subpopulationen zu erhalten, wohingegen traditionelle Lyseverfahren, die Zentrifugierungsschritte umfassten, einen signifikanten Verlust von Zellen und/oder einen selektiven Verlust von Lymphozyten-Subpopulationen zeigten.
• Gating-Verfahren, die nicht einzig und allein auf einer Analyse von Parametern der vorwärts und seitwärts gerichteten Lichtstreuung beruhen, sind auch im Stand der Technik bekannt. Hoffmann (Cytometry Supp. 1, S. 36, Abstract Nr. 172 (1987)) beschreibt die Verwendung von Fluoreszenz zum Unterscheiden von Leukozyten-Subpopulationen in unlysierten Blutproben, mit der Aktivierung bei einem Fluoreszenz-Parameter und unter Verwendung von Lichtstreuung zum weiteren Unterscheiden von Leukozyten- Subpopulationen. Allerdings machte ein Zusammentreffen von Erythrozyten und Leukozyten die Verteilungen von rechtwinkeliger Streuung teilweise unklar, wodurch ein suboptimales Lymphozyten-Gating geliefert wurde. Das US-Patent Nr. 4,987.086 offenbart ein Verfahren zur Bestimmung von Leukozyten-Subpopulationen mittels Durchflusszytometrie, wobei ein Gate angelegt wird durch 1) Markieren mit einem Fluorochrom-markierten Antikörper, der mit allen Leukozyten reagiert, und 2) Markieren von Monozyten mit einem Fluorochrom-markierten, für Monozyten spezifischen Antikörper. Dieses Verfahren wird auch von Loken et al. (Cytometry 11 : 453-459 (1990)) gelehrt. Um das Gate anzulegen, werden die Zellen auf vorwärts gerichtete Lichtstreuung und Seitenlichtstreuung sowie die beiden mit den Antikörpern assoziierten Fluoreszenzfarben analysiert. Ein Computeralgorithmus vergleicht die Lichtstreuungsdaten mit der Fluoreszenzanalyse und unterscheidet jene Zellen, die innerhalb des Gates eingeschlossen werden sollten. Die computergesteuerte Gating-Analyse eliminiert viel von der Subjektivität und den Fehlern, die mit visuellen Gating-Verfahren verbunden sind. Allerdings hat dieses Verfahren, obwohl die Genauigkeit des Gating-Verfahrens verbessert wird, den Nachteil, eine separate Präparation von zumindest zwei Probenaliquoten und zumindest zwei separate Durchllusszytometerdurchgänge für die Analyse jeder Probe (d. h. Gating-Röhrchen und Experimentalröhrchen) zu erfordern. Dieses Gating-Protokoll wird von Becton Dickinson Immunocytometry Systems unter dem Namen LEUCOGATE verkauft.
• Horan et al. (PNAS 83 : 8361-8365 (1986)) beschreiben ein Verfahren zur Analyse von Leukozyten-Untermengen, bei dem fünf Zelluntermengen durch Zwei-Farben- Immunofluoreszenz gleichzeitig identifiziert werden. Die Identifikation von Untermengen kann mittels Fluorochrom-Markieren von nur einem einzigen Aliquoten einer Probe durchgeführt werden - im Gegensatz zu früheren Verfahren im Stand der Technik, bei denen eine Mehrzahl von Aliquoten derselben Probe gefärbt werden mußten. Horan et al. verwenden Verdünnungen der Fluorochrom-markierten Antikörperreagenzien, um diskrete Fluoreszenzintensitätsprofile für Zelluntermengen zu erzeugen, die sich sonst überlappen würden oder ununterscheidbar wären, wenn sie mit denselben Fluorochrom tragenden Antikörpern gefärbt wären.
• Die vorliegende Erfindung, so wie in Anspruch 1 definiert, überwindet diese Probleme im Stand der Technik. Sie stellt ein Verfahren zum Aufstellen von Durchflusszytometriegates für Leukozyten-Subpopulationen unter Bedingungen bereit, wo vorwärts gerichtete Lichtstreuung und Seitenlichtstreuung alleine zu diesem Zweck unbefriedigend sind.
• Die Erfindung, so wie in Anspruch 1 definiert, stellt auch ein Verfahren zum Präparieren einer lysierten Blutprobe für eine Analyse von Leukozyten mittels Durchflusszytometrie bereit, das ein Zentrifugieren und Waschen der gefärbten und lysierten Probe vor der Analyse auf einem Durchflusszytometer nicht mit einschließt. Im Rahmen des klinischen Labors werden Ergebnisse für Proben mit weniger als 90% im Gate eingeschlossenen Lymphozyten im Allgemeinen verweigert. Mit den erfinderischen Verfahren zum Ausscheiden von Zelltrümmern ist es leichter zu erreichen, viel mehr als 90% Lymphozyten im Gate einzuschließen. Zusätzlich können die erfinderischen Verfahren dazu verwendet werden, Daten von allen Proben mit weniger als 90% vom Gating erfassten Lymphozyten zu korrigieren, wenn Trümmer oder Nicht-Lymphozytenzellen die Ursache des Gating-Problems sind.
Kurzfassung der Erfindung
• Es wird ein Verfahren der durchflusszytometrischen Analyse von Leukozyten- Subpopulationen bereitgestellt, bei dem in einem einzigen Aliquot der Probe die Leukozyten mit einem Leukozyt-spezifischen Fluorochrom-markierten primären Antikörper markiert werden, der sich in unterschiedlichem Maß an die Zellen der interessierenden Subpopulation und an die Zellen mindestens einer zusätzlichen Subpopulation mit unterschiedlichen Fluoreszenzintensitäten bindet; rote Blutzellen in der Probe werden durch Zugabe eines Lyse-Reagens lysiert; die markierten Leukozyten werden in der lysierten Probe auf einem Durchflusszytometer ohne Trennung der markierten Leukozyten vom Lyse-Reagens analysiert, wobei das Zytometer auf eine Aktivierungsschwelle eingestellt wird, die repräsentativ für eine zuvor bestimmte Fluoreszenzintensität ist, die das Vorhandensein eines primären Antikörpers anzeigt, so dass alle Zellen, bei denen die besagte Schwelle überschritten wird, analysiert werden. Besagtes Analysieren umfasst das Erfassen von Fluoreszenz- und Lichtstreuungsdaten für die markierten Leukozyten und das Identifizieren der interessierenden Zellensubpopulation mittels eines Verfahrens, das das Erzeugen einer ersten Graphik eines Lichtstreuungsintensitätsparameters gegen Antikörperfluoreszenzintensität und das Auswählen einer Gate-Fläche besagter Graphik als besagte Subpopulation von interessierenden Zellen umfasst.
Beschreibung der Zeichnung
• Fig. I veranschaulicht die Tauglichkeit des erfinderischen Verfahrens zum Auflösen von Basophilen gegenüber Lymphozyten (Fig. 1A), wohingegen herkömmliches Streuungs-Gating dies nicht tut (Fig. 1B).
• Fig. 2 veranschaulicht ein erfindungsgemäßes Zwei-Parameter-Gating. Herkömmliches FSC/SSC Streuungs-Gating (R1, Fig. 2A) wird mit dem Zwei-Parameter- Gatingverfahren der Erfindung verglichen (R2, Fig. 2B). Die Fig. 2C und 2D sind Graphiken vom Logarithmus der Fluoreszenz (FL1, anti-Leu-M7-FITC) gegen den Logarithmus der Fluoreszenz (FL2, anti-Leu-M3-PE) jeweils für die Gating-Verfahren von Fig. 2A und Fig. 2B, wobei das Ausmaß der in jedem Gate eingeschlossenen nichtlymphozytischen Kontamination gezeigt wird.
• Fig. 3 veranschaulicht ein erfindungsgemäßes Drei-Parameter-Gating. Fig. 3A zeigt das durch eine Analyse von SSC/FSC-Parametern aufgestellte R1-Lymphozyten-Gate. Fig. 3B zeigt das durch eine Analyse von SSC/FL3-Parametern aufgestellte R2- Lymphozyten-Gate. Fig. 3C zeigt eine Analyse der FL1- und FL2-Parameter der einem R1- Gating unterzogenen Lymphozyten, wobei die markartige Natur der kontaminierenden nichtlymphozytischen Zellen demonstriert wird. Fig. 3 D zeigt eine Analyse der FL 1- und FL2- Parameter der einem (R1+R2)- (d. h. drei-Parameter-) Gating unterzogenen Lymphozyten, wobei die Verringerung bei den kontaminierenden Markzellen durch dieses Verfahren demonstriert wird.
• Fig. 4 veranschaulicht die Tauglichkeit des Gating-Verfahrens der Erfindung, genaue Zellzählungen zu liefern, selbst wenn lysierte Blutproben einen Rest an roten Blutzellen enthalten. Fig. 4A zeigt Zellzählungen, die durch eine Analyse von lysierten, gewaschenen, hinsichtlich SSC/FSC einem Gating unterzogenen Blutproben erzielt wurden. Fig. 4B zeigt Zellzählungen, die durch eine Analyse von lysierten, gewaschenen, hinsichtlich SSC/FL3 einem Gating unterzogenen Blutproben erzielt wurden. Fig. 4C zeigt Zellzählungen, die durch eine Analyse von lysierten, gewaschenen Blutproben erzielt wurden, die einen Rest an hinsichtlich SSC/FSC einem Gating unterzogenen Erythrozyten enthielten. Fig. 4D zeigt Zellzählungen, die durch eine Analyse von lysierten, gewaschenen Blutproben erzielt wurden, die einen Rest an hinsichtlich SSCIFL3 einem Gating unterzogenen Erythrozyten enthielten.
• Fig. 5 veranschaulicht eine dreiteilige differenzielle Blutzählung (T-, B- und NK- Zellen) mit CD4/CD8 T-Zellen-Subsetting unter Verwendung der Lyse-, Nicht-Waschen- Methodologie der Erfindung mit einer Cluster-Analyse, durchgeführt unter Verwendung von "Attraktor"-Software. Fig. 5A zeigt die klassifizierten Lymphozyten nach einer "Attraktor"-Analyse der "Listmode"-Daten. Fig. 5B zeigt die vier durch Fluoreszenz identifizierten Lymphozyten-Subpopulationen.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
• Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren unter Verwendung von Durchflusszytometrie zum Identifizieren und Aufzählen von Zellen bereit, die Subpopulationen von Leukozyten in einer biologischen Probe darstellen, die Leukozyten vermischt mit anderen Blutzellenarten (z. B. Blut- oder Knochenmarksproben) enthält. Das Verfahren verwendet einen Fluoreszenz-Auslöser zum Ausschließen ausgewählter Subpopulationen von Blutteilchen vor einem Gating, und ein durch eine Analyse von erfassten Datenparametern aufgestelltes Gate zum Ausschließen ausgewählter Leukozyten- Subpopulationen von Datenanalysen. Ein Zwei-Parameter-Gate kann auf der Grundlage einer Analyse einer Graphik eines einzelnen Lichtstreuungsparameters gegen einen einzelnen Fluoreszenz-Parameter (z. B. SSC und Fluoreszenz) aufgestellt werden. Alternativ dazu kann ein Drei-Parameter-Gate auf der Grundlage einer kombinierten Analyse von SSC- FSC- und Fluoreszenz-Parametern angelegt werden, einschließlich einer solchen Graphik.
• Zu diesem Zweck wird ein Fluorochrom-markierter Antikörper, der ein Antigen oder einen Marker, der mit allen Leukozyten-Subpopulationen assoziiert ist, erkennt (der "primäre Antikörper"), zum Färben der Zellen der Probe verwendet. Der primäre Antikörper wird so ausgewählt, dass er sich an alle Leukozytenzellenarten bindet, vorzugsweise jedoch mit einer detektierbar unterschiedlichen Intensität an jede Subpopulation. Dies bedeutet, dass der primäre Antikörper gegen ein Leukozyten-Antigen gerichtet wird, das in unterschiedlichem Ausmaß an jeder Leukozyten-Subpopulation vorhanden ist. Der primäre Antikörper bindet sich in keinem maßgeblichen Ausmaß an Trümmer oder andere Zellarten als Leukozyten. Die für jede Leukozyten-Subpopulation charakteristische Fluoreszenzintensität ermöglicht daher in Verbindung mit anderen gemessenen Parametern eine Differenzierung der Leukozyten-Subpopulationen mittels Durchflusszytometrie. Der primäre Antikörper ermöglicht, weil er sich im Wesentlichen nur an Leukozyten bindet, auch eine Unterscheidung zwischen Leukozyten und roten Zellen, Trümmern wie z. B. Zellmembranen (Geistern), Plättchen und anderen Teilchen in der Probe, die eine minimale Bindung des primären Antikörpers zeigen.
• Nach dem Färben der Probe mit dem primären Antikörper, und wahlweise mit zumindest einem sekundären Antikörper laut Beschreibung weiter unten, wird sie auf einem Durchflusszytometer analysiert, vorzugsweise ohne Zentrifugieren oder Waschen der Zellen. Das Durchflusszytometer wird vorzugsweise auf eine Aktivierungsschwelle für die vom Fluorochrom am primären Antikörper emittierte Fluoreszenz eingestellt. Für jede detektierte Zelle werden Lichtstreuungs- und Antikörperfluoreszenzdaten gesammelt. Eine Punktegraphik oder Histogramm der Daten wird erzeugt, wobei die Fluoreszenz des primären Antikörpers (PAbF) und einer der Lichtstreuungsparameter (FSC oder SSC) verwendet werden. Die interessierende Leukozyten-Subpopulation wird dann auf der Graphik identifiziert und mit im Stand der Technik bekannten Verfahren einem Gating unterzogen.
• Das Aufstellen des Gates unter Verwendung von Streuung gegen PAbF (ein Zwei- Parameter-Gate) liefert eine signifikant verbesserte Auflösung der Leukozyten- Subpopulationen gegenüber Plättchen, Trümmern etc. Mit diesem Verfahren ist auch eine Unterscheidung möglich zwischen Lymphozyten und Basophilen, die normalerweise von Lymphozyten nicht getrennt werden können, wenn man mit herkömmlichen Verfahren der Datenanalyse ein Gating durchführt (Fig. 1). Das erfinderische Verfahren stellt daher ein Mittel bereit, basophile Kontamination aus dem Lymphozyten-Gate unter Verwendung eines Zwei-Parameter-Lichtstreuungs-/Fluoreszenzgates zu eliminieren, wobei die Reinheit der einem Gating unterzogenen Lymphozyten erhöht wird.
• Alternativ dazu kann ein Drei-Parameter-Gate für die erfassten Daten aufgestellt werden, um die Auflösung der verschiedenen Leukozyten-Subpopulationen zu verbessern. Typischerweise wird ein erstes Gate (R1) durch eine Analyse von FSC gegen SSC und ein zweites Gate (R2) durch eine Analyse von SSC gegen PAbF aufgestellt. Graphisch dargestellt und zweidimensional analysiert wird dem Drei-Parameter-Gate (R3) eine Analyse von R1 und R2 zugrunde gelegt, um lediglich die in beiden Gates enthaltenen Zellen auszuwählen. Im Allgemeinen wird eine Vollblutprobe mit zumindest zwei Fluorochrommarkierten Antikörpern inkubiert. Einer davon ist der weiter oben beschriebene primäre Antikörper. Einer oder mehrere zusätzliche Fluorochrom-markierte, für ein Antigen oder eine interessierende Zellenart spezifische Antikörper (die "sekundären Antikörper") können auch in die Färbemischung eingeschlossen werden, damit sie zusätzliche fluoreszierende Signale für die Analyse liefern. Die Fluorochrome an den sekundären Antikörpern emittieren Fluoreszenzlicht auf Wellenlängen, die separat detektierbar sind und vom Durchflusszytometer voneinander und von primärer Antikörper-Fluoreszenz unterschieden werden können. Die primären und sekundären Antikörper können dieselben oder unterschiedliche Antigene erkennen und sich an sie binden.
• Die Fluorochrome, die für eine erfindungsgemäße Konjugation an Antikörpern von Nutzen sind, können beliebige aus den in der Durchflusszytometrie üblicherweise verwendeten Fluorochromen sein, die an Proteine wie z. B. Antikörper konjugiert werden können. Fluorescein-Isothiocyanat (FITC), Phycoerythrin (PE) und Peridininchlorophyllprotein (PerCP) werden vorgezogen, weil sie mit Licht derselben Wellenlänge angeregt werden können, es jedoch auf getrennt detektierbaren mit einer durchflusszytometrischen Analyse kompatiblen Wellenlängen emittieren. Jedes dieser Fluorochrome kann zum Markieren der primären und sekundären Antikörper der Erfindung unter Einsatz von im Stand der Technik wohlbekannten Konjugationsverfahren verwendet werden. Vgl. beispielsweise U. S. -Patent Nr. 4,876,190 und darin zitierte Referenzen zwecks Diskussion von kovalenter und nlchtkovalenter Konjugation von Fluorochromen an Proteine wie z. B. Antikörper. Die Offenbarung von U. S. -Patent Nr. 4,876,190 wird hierin durch Bezug darauf aufgenommen.
• Die primären und sekundären Antikörper können polyklonal oder monoklonal sein, sind aber vorzugsweise monoklonale Antikörper. Der primäre Antikörper kann jeder Antikörper sein, der fähig ist, sich an die gesamte interessierende Zellpopulation unter minimaler Bindung an andere Zellarten zu binden. Vorzugsweise werden Leukozyten vom primären Antikörper gebunden. Solche monoklonalen anti-Leukozyt-Antikörper sind im Stand der Technik bekannt und umfassen CD45 (z. B. anti-HLe-1) und CD11a/CDI8 (z. B. anti-LFA-1), sind aber nicht darauf beschränkt. Die Fluorochrom-Markierung am primären Antikörper ist nicht kritisch, es ist aber vorzugsweise FITC, PE oder PerCP. An PerCP konjugiertes CD45, das sich an Leukozyten binden und diese identifizieren wird, ist der am meisten bevorzugte primäre Antikörper bei der Verwendung im Rahmen der Erfindung. CD45 hat den Vorteil, fähig zu sein, sich an fixierte Zellen zu binden, wobei - falls gewünscht - ein Färben nach der Lyse und der Fixierung möglich ist, beispielsweise im Falle, dass das Verfahren der Erfindung zum Korrigieren eines vorherigen Gates, das unbefriedigende Ergebnisse lieferte, verwendet wird.
• Sekundäre Antikörper, die mit einem anderem Fluorochrom als dem am primären Antikörper markiert sind, können ebenfalls entweder polyklonale oder monoklonale Antikörper sein. Monoklonale Antikörper werden wegen ihrer erhöhten Spezifizität bevorzugt. Die sekundären Antikörper werden danach ausgewählt, für jedes beliebige Antigen zur Detektion jedes den Forscher interessierenden zellulären Merkmals spezifisch zu sein und sich daran zu binden. Sekundäre Antikörper können zur Identifizierung entweder der einem Gating unterzogenen Subpopulation von Zellen (z. B. Lymphozyten) oder einer Untermenge der Subpopulation (z. B. T-Zellen oder B-Zellen) verwendet werden. Falls gewünscht, kann der sekundäre Antikörper denselben Antikörper umfassen, der zum Identifizieren der Subpopulationen verwendet wurde (d. h. den Antikörper-Bestandteil des primären Antikörpers), aber an einen anderen als den für den primären Antikörper verwendeten Fluorochrom gebunden ist - so dass er separat detektiert werden kann. Beispielsweise kann CD4 (z. B. anti-Leu-3a) als sekundäre Antikörper verwendet werden, um Helfer-/Induktor-T-Lymphozyten aufzufinden, CD8 (z. B. anti-Leu-2a) kann verwendet werden, um zytotoxische/Hemmer-T-Lymphozyten aufzufinden, CD14 (z. B. anti-Leu-M3) kann verwendet werden, um Monozyten zu detektieren, CD 13 (z. B. anti-Leu-M7) kann verwendet werden, um Markzellen zu detektieren, CD3 (z. B. anti-Leu-4) kann verwendet werden, um T-Lymphozyten aufzufinden, und CD19 (z. B. anti-Leu-12) kann verwendet werden, um B-Lymphozyten aufzufinden. Alle diese Antikörper sowie CD45 können von Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, Kalifornien, bezogen werden. CD56 (z. B. anti-Leu-19 oder anti-NCAM), CD57 (z. B. anti-Leu-7), CD38 (z. B. anti-Leu-17), CD28 und anti-HLA-DR sind auch als Bestandteile von sekundären Antikörpern für bestimmte Anwendungen in der Praxis der Erfindung von Nutzen. Zusätzlich dazu können CD14 und CD13 als Qualitätskontrollmittel zum Beurteilen der Reinheit der einem Gating unterzogenen Lymphozyten verwendet werden.
• Andere Antikörper können erfindungsgemäß zum Auffinden von Leukämiezellen in Blutproben von Nutzen sein. Beispielsweise können Leukozyten unter Verwendung eines primären Antikörpers, der einen CD45 Antikörper enthält, und eines sekundären Antikörpers, der einen für interessierende Leukämiezellen spezifischen Antikörper enthält, gefärbt werden. Alternativ dazu kann eine Blutprobe wie oben beschrieben analysiert werden, und falls das anfängliche Ergebnis auf eine Abnormität deuten lässt, kann die Probe mit einem sekundären Antikörper neuerlich gefärbt werden, der sich an Leukämiezellen binden und sie spezifisch detektieren wird.
• Der besondere, als Bestandteil des sekundären Antikörpers ausgewählte Fluorochrom ist nicht kritisch, es ist aber vorzugsweise FITC, PE oder PerCP. PE und/oder FITC werden am meisten zum Markieren des sekundären Antikörpers bevorzugt, wenn PerCP der Fluorochrom am primären Antikörper ist.
• Um Zellen in der Probe durch Binden an die primären und/oder sekundären Antikörper zu markieren, wird eine Probe wie z. B. Vollblut oder Knochenmark mit den Fluorochrom-markierten primären und sekundären Antikörpern vermischt. Die markierten Antikörper werden im Allgemeinen der Probe im Wesentlichen gleichzeitig zugesetzt und damit vermischt. Zellmarkierungsverfahren, die zur Verwendung im Rahmen der Erfindung geeignet sind, sind im Stand der Technik wohlbekannt. Für die Durchflusszytometrie wird die Blut- oder Knochenmarksprobe volumenmäßig im Allgemeinen etwa 100 ul sein, und etwa 0,05-1,0 ug jedes Antikörpers werden pro Probe zugesetzt werden. Nach Zugabe der gewünschten markierten Antikörper wird die Probe bei Raumtemperatur, vorzugsweise im Dunkeln, für etwa 5-30 min inkubiert. Bei den meisten Anwendungen ist ein Inkubationszeitraum von etwa 15 min im Allgemeinen ausreichend, um ein zufriedenstellendes Binden zu erreichen. Es ist im Allgemeinen möglich, weniger sekundäre Antikörper in den Färbeverfahren der Erfindung zu verwenden (bis zu einer etwa 20fachen Verringerung) als typischerweise bei Proben, die gewaschen werden müssen, weil gebundene Antikörper nicht weggewaschen werden.
• Ein Lyse-Reagens kann der Probe mit den markierten Antikörpern zugesetzt werden, oder es kann vor dem Markieren eine Lyse durchgeführt werden. Allerdings wird ein Markieren der Zellen als erster Schritt mit einer darauf folgenden Erythrozytenlyse einem Maximieren der Bindung der Antikörper vorgezogen. Die Probe wird in Gegenwart eines Lyse-Reagens für etwa 10 min inkubiert. Zu diesem Zweck geeignete Lyse-Reagenzien können Ammoniumchlorid und FACS Lysing Solution umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt.
• Die FACS Lysing Solution wird bevorzugt, weil sie, bezogen auf Seitenstreuung, eine bessere Lymphozyten/Monozyten-Trennung als Ammoniumchlorid liefert, stabile Lichtstreuungs- und Fluoreszenzergebnisse für ausgedehnte Zeitspannen bereitstellt und es ermöglicht, das Lysieren und Fixieren in einem einzigen Schritt durchzuführen. Eine Probe von gefärbtem, ungewaschenem Blut in der FACS Lysing Solution bleibt im Allgemeinen bis zu 48 Stunden stabil, und in manchen Fällen verbessert sich die Lichtstreuung mit längerem Inkubationszeitraum sogar. Zusätzlich dazu kann die verhältnismäßig hohe Formaldehydkonzentration (3%) in der FACS Lysing Solution ein höheres Maß an biologischer Sicherheit als andere Lyse-Reagenzien bieten.
• Da das Vorhandensein einer gewissen Menge von Erythrozyten in der Probe das Gating-Verfahren der Erfindung nicht signifikant stört, ist es zu Zwecken des Gatings und der durchflusszytometrischen Analyse nicht notwendig, dass alle Erythrozyten in der Probe lysiert werden. Es ist daher möglich, weniger Lyse-Reagens zu verwenden als es bei Lyseverfahren üblich ist, bei denen das Zentrifugieren und Waschen der Probe erforderlich ist. Beispielsweise werden einer 100. ul-Blutprobe im Allgemeinen 2 ml FACS Lysing Solution zugesetzt. Bei der Verwendung in den vorliegenden Verfahren liefern 0,5-1,0 ml FACSTM Lysing Solution in 100 ul Blut zufriedenstellende Ergebnisse beim Gating und der durchflusszytometrischen Analyse. Da die Interferenz seitens roter Blutzellen geringer ist, wird die Erfindung auch bessere Ergebnisse bei Proben liefern, die Erythrozyten enthalten, die sich unter Standardbedingungen nicht leicht lysieren lassen (z. B. Proben mit kernhaltigen roten Blutzellen).
• Die Fluorochrom-markierte Probe wird auf einem Durchflusszytometer analysiert. Wenn die Probe vor der Analyse lysiert wird, wird sie im Lyse-Reagens ohne Entfernung des Lyse-Reagens, Zentrifugieren oder Waschen analysiert. Sämtliche handelsübliche Durchflusszytometer, die zur Lichtstreuungs- und zumindest Zwei-Farben-Fluoreszenz- Datenerfassung geeignet sind, können zu diesem Zweck verwendet werden.
• Durchflusszytometer, die geeignet sind, zumindest Drei-Farben-Fluoreszenz-Daten zu erfassen, werden bevorzugt, weil nach dem erfindungsgemäßen Aktivieren und dem Gating unter Verwendung eines Fluoreszenz-Parameters noch immer eine Zwei-Farben-Analyse der interessierenden Zellen durchgeführt werden kann. Ein Beispiel für ein solches Gerät ist der FACSCAN, der bei Becton Dickinson Immunocytometry Systems erhältlich ist. Da das erfundene Verfahren auch auf Analysen anwendbar ist, die eine Detektion von vier oder mehr Fluoreszenz-Parametern umfassen, können auch Geräte wie z. B. der FACSTAR PLUS verwendet werden. Dieses Durchflusszytometer verfügt über zwei Laser, die Licht mit verschiedenen Wellenlängen erzeugen, und ist geeignet, fünf Fluoreszenz-Parameter und zwei Lichtstreuungsparameter zu detektieren. Ein derartiges Gerät bietet einen besonderen Vorteil bei der Verwendung im Rahmen der Erfindung, weil es die Verwendung eines Fluoreszenz-Parameters zum Aktivieren und zum Gating ermöglicht, während die Fähigkeit, eine Drei-(oder Mehr-)Farben-Fluoreszenzanalyse der interessierenden Zellen durchzuführen, bestehen bleibt.
• Das Durchflusszytometer sollte Licht mit einer zur Anregung der ausgewählten Fluorochrome geeigneten Wellenlänge erzeugen. Die Erfassung von FSC, SSC und allen Fluoreszenzdaten über die Zellen in der Probe wird durch Fluoreszenz des zum Markieren des primären Antikörpers ausgewählten Fluorochroms ausgelöst. Auf die hellen PAbF- Ereignisse bezogenes Aktivieren dient dazu, die Mehrheit der Trümmer- und Plättchenereignisse sowie andere, nicht durch Leukozyten bedingte Ereignisse auszuschließen. Alle diese Nicht-Leukozyten-Ereignisse können mit einer FSC-Auflösung interferieren, wenn sie nicht ausgeschlossen werden. Die erfassten Daten werden elektronisch gespeichert und mittels Computer unter Verwendung eines geeigneten Algorithmus zu Daten konvertiert, die in Form einer Punktegraphik zum Gating graphisch dargestellt werden können.
• Zum Zwei-Parameter-Gating wird die Datengraphik unter Verwendung von Lichtstreuung gegen primäre Antikörper-Fluoreszenz erzeugt. Dieses Verfahren wird in Fig. 2 veranschaulicht. Sehr vorzuziehen ist es, wenn der Lichtstreuungsparameter Seitenstreuung (SSC) ist, aber es können auch auf nach vorwärts gerichtete Streuung (FSC) bezogene Daten verwendet werden. Primäre Antikörper-Fluoreszenz (PAbF) wird als zweiter Parameter bevorzugt. Die Punktegraphik Streuung gegen Fluoreszenz wird zum Gating der gewünschten Zellensubpopulation verwendet. Das Gating kann mit jedem im Stand der Technik anerkannten Verfahren durchgeführt werden, bei dem Algorithmen verwendet werden, die mit dem für die Probenanalyse verwendeten Durchflusszytometer kompatibel sind. Beispielsweise kann SIMULSET-, LYSYS- oder PAINT-A-GATE- Datenanalysesoftware (Becton Dickinson Immunocytometry Systems) verwendet werden, um auf dem FACSCAN-Durchflusszytometer erfasste Daten einem Gating zu unterziehen und zu analysieren. Nach erfolgtem Gating der erfassten Daten können für die einem Gating unterzogene Subpopulation erfasste Lichtstreuungs- und Fluoreszenzdaten auf Punktegraphiken, Histogrammen, Konturengraphiken oder mit anderen im Stand der Technik bekannten Mitteln analysiert werden.
• Alternativ dazu kann für die erfassten Daten ein Drei-Parameter-Gate aufgestellt werden, um die Auflösung der verschiedenen Leukozyten-Subpopulationen weiter zu verbessern und Kontamination aus dem Gate zu eliminieren. Dieses Verfahren wird in Fig. 3 veranschaulicht. Als erstes kann R1 durch eine Analyse von SSC und FSC und dann R2 durch eine Analyse von SSC und PAbF aufgestellt werden. R1 und R2 können allerdings umgekehrt werden, wobei als erstes R1 durch eine Analyse von SSC und PAbF und dann R2 durch SSC und FSC aufgestellt wird. Ein Computer-Algorithmus vergleicht dann R1 und R2 und stellt R3 auf, um die sowohl im R1- als auch im R2-Gate enthaltenen Zellen einzuschließen. Das Drei-Parameter-Gating der vorliegenden Erfindung ermöglicht mit einer geeigneten Software auch ein dreidimensionales graphisches Darstellen und eine Analyse der drei Parameter. Solch ein dreidimensionales graphisches Darstellen und/oder Gating verbessert die Auflösung aller fünf Leukozyten-Subpopulationen (Lymphozyten, Monozyten, Neutrophile, Basophile und Eosinophile) signifikant und kann daher eine Berechnung einer fünfteiligen differenziellen Blutzählung mittels Durchflusszytometrie möglich machen. Obwohl solche Analysen mit derzeit erhältlichen Einzelschwellen-Geräten durchgeführt werden können, wäre zu diesem Zweck ein Durchflusszytometrie-Gerät mit Doppelschwellen-Tauglichkeit wünschenswerter, weil es Trümmer und die Anzahl an Zellen verringern würde, die zur Erzielung eines verlässlichen Ergebnisses analysiert werden müssten.
• Eine Zugabe des primären Antikörpers der Erfindung zu im Stand der Technik bekannten Gating-Verfahren wie z. B. LEUCOGATE mit einem auf FL3 bezogenen Aktivieren verringert die Erfassung von Trümmern in lysierten ungewaschenen Blutproben signifikant und verbessert die Auflösung von Leukozyten-Subpopulationen. Diese Verbesserung ist möglich, ohne die Anzahl an zur Datenerfassung und -analyse zur Verfügung stehenden Fluoreszenz-Parametern zu verringern, da die Aktivierungsfluoreszenz nicht gespeichert und als Daten behandelt werden muss. Dies ist ein besonderer Vorteil beim Verwenden von Software, bei der die Anzahl an analysierbaren Fluoreszenz-Parametern begrenzt ist. Beispielsweise kann ein lysiertes ungewaschenes Aliquot einer zu analysierenden Probe gemäß dem Standard-LEUCOGATE-Verfahren gefärbt oder markiert werden, wobei ein an einen ersten Fluorochrom konjugierter anti-Leukozyten-Antikörper und ein an einen separat detektierbaren zweiten Fluorochrom (z. B. anti-HLe-1-FITC und anti-Leu-M3-PE) konjugierter anti-Monozyten-Antikörper verwendet werden. Das Aliquot wird auch mit einem erfindungsgemäßen primären anti-Leukozyten-Antikörper markiert, der einen dritten Fluorochrom umfasst, der vom ersten und zweiten Fluorochrom unterschieden werden kann (z. B. anti-HLe-1-PerCP). Das Aliquot wird dann auf einem Durchflusszytometer analysiert, der darauf eingestellt ist, sich bei FL3 (PerCP) zu aktivieren.
• Wenn es gewünscht wird, die gesamte Fluoreszenz-Parameter-Analysetauglichkeit der Software zur Verfügung zu haben, werden FL3-Daten nicht gespeichert. Die SIMULSET-Software beispielsweise ist auf die Analyse zweier Fluroreszenz-Parameter und zweier Lichtsstreuungsparameter beschränkt. Um zu vermeiden, das System auf eine Analyse eines einzigen Fluoreszenz-Parameters zusätzlich zum Auslöser zu beschränken, würde man FL3-Daten (d. h. den Auslöser) nicht speichern, wobei zwei Fluoreszenz- Parameter zur Datenanalyse verfügbar gehalten würden. Daten über die verbleibendenden zwei Fluoreszenz-Parameter (FL1 und FL2) und die Lichtstreuungsparameter werden erfasst und für Teilchen gespeichert, die die Schwelle überschreiten, und das Gate wird durch die Software aufgestellt. Dies ist das herkömmliche SSC/FSC-Streuungsgate beim Verwenden von SIMULSET. Das mit diesem Verfahren angelegte Gate wird dann auf Daten angewendet, die von einem Testaliquot der Probe, markiert mit demselben primären Antikörper zum Aktivieren und beliebigen zusätzlichen, für die durchflusszytometrische Analyse gewünschten Antikörpern, gewonnen wurden.
• Im Einzelröhrchen-Analyseformat der Erfindung stellt das Verfahren ein Mittel zum Gewinnen einer größtmöglichen Zahl an Informationen unter minimaler Probenbearbeitung bereit, was eine Zeitersparnis sowohl bei der Probenpräparation als auch bei der Geräte- Datenerfassung bringt. Es ist daher ganz besonders zur Verwendung in klinischen Labors geeignet, die Diagnoseprodukte mit hoher Durchsatzleistung für Tests wie z. B. routinemäßige Lymphozyten-Zählung benötigen. In einer bevorzugten Ausführung wird das vorliegende Nicht-Waschen-Analyseverfahren zur Erzielung einer dreiteiligen differenziellen Blutzählung (T-, B- und NK-Zellen) mit T-Zellen-Subsetting in CD4 (Helfer) und CD8 (Hemmer) in einer durchflusszytometrischen Einzelröhrchen-Analyse verwendet. Das Verfahren ermöglicht eine Detektion von zwei oder mehreren Leukozyten- Subpopulationen für jeden Chromophor, beispielsweise unter Verwendung von FITC- und PE-Zwei-Farben-Fluoreszenz auf einem FACScan.
• Für eine dreiteilige differenzielle Analyse mit CD4/CD8-Subsetting werden beispielsweise FSC- und SSC-Daten für die Probe sowie Fluoreszenzdaten für die Fluorochrom-markierten Antikörperkombinationen wie folgt erfasst:
• Ein einzelnes Blutaliquot wird ohne Waschen gefärbt und lysiert und auf dem Durchflusszytometer analysiert, wobei die Aktivierung auf CD45 PerCP-Fluoreszenz, wie weiter oben beschrieben, bezogen ist. B-Zellen werden präsumtiv als CD8-, CD56-, CD3-, CD4--Zellen (d. h. im linken unteren Bereich einer Punktegraphik) identifiziert. NK-Zellen werden als CD8+, CD56+, CD3-, CD4--Zellen (d. h. im linken oberen Bereich einer Punktegraphik) identifiziert. NK-Zellen können auch durch Zusetzen von CD16 zu CD8 + 56 identifiziert werden, da eine kleine Untermenge von NK-Zellen CD 16+, CD56+ sind. Zytotoxische Hemmer-T-Zellen werden als CD8+, CD56-, CD3+, CD4--Zellen (d. h. im rechten oberen Bereich einer Punktegraphik) identifiziert. Helfer-T-Zellen werden als CD8-, CD56-, CD3+, CD4+-Zellen (d. h. im rechten unteren Bereich einer Punktegraphik) identifiziert.
• Ein Zwei- oder Drei-Parameter-Gate kann für die Lymphozyten, wie weiter oben beschrieben, unter Verwendung jedes im Stand der Technik bekannten manuellen oder automatischen Mittels eingestellt werden. Allerdings wird die Verwendung eines Autoclustering-Verfahrens, das geeignet ist, Subpopulationen im mehrdimensionalen oder ndimensionalen Raum zu identifizieren, bevorzugt, um Cluster-Klassifizierungen automatisch den Mehr-Parameter-Ereignissen zuzuordnen, die während der Datenerfassung aufgezeichnet wurden. Ein derartiges Autoclustering-Verfahren wird in Anspruch 4 definiert und in der PCT-Anmeldung US 92/07291, eingereicht am 28. August 1992 (WO-A- 9305478, veröffentlicht am 18. März 1993), offenbart. Der beschriebene Gravitationsattraktor besteht aus einer geometrischen Grenzfläche festgelegter Größe, Form und Ausrichtung, aber variabler Position. Er ist eine Rechenmaschine, anhand derer sich die Grenzfläche selbst zum Einschließen eines Clusters von Mehr-Parameter-Ereignissen optimal positioniert. Eine Klassifizierung von Ereignissen in den erfassten Listmodus-Daten ist ein aus zwei Schritten bestehender Vorgang, bei dem 1) der Datenfluss zu dem Zweck analysiert wird, die Grenzfläche jedes Attraktors auf dem statistischen Massenmittelpunkt des Datenclusters, der klassifiziert werden soll, zu zentrieren, und 2) die Grenze jedes Attraktors an der Verwendungsstelle arretiert wird und eintreffende Datenflussereignisse hinsichtlich der Grenzen zwecks Einschluss- gegen Ausschluss-Entscheidungsfindung getestet werden. Derartige Autoclustering-Verfahren werden gegenüber manuellen Verfahren und zuvor bekannten Autoclustering-Verfahren zur Datenanalyse bevorzugt, weil sie 1) die Datenanalyse in Echtzeit ermöglichen, 2) durch Änderungen bei den Geräten, Probenpräparation und Variationen innerhalb von Proben bedingte Drift zwischen Proben beim Massenmittelpunktwert eines Datenclusters tolerieren, 3) in Fällen, wo Cluster fehlen, stabil sind und 4) eine kontinuierliche Prozessqualitätssicherung während zeitaufwendiger, auf seltene Ereignisse bezogener Versuche ermöglichen. Unter Verwendung der erfinderischen Lyse-, Nicht-Waschen-Methodologie mit einem CD45-PerCP-Auslöser und einer "Attraktor"-Software, wie in PCT-Anmeldung US 92/07291 beschrieben, kann der Praktiker 100% der Lymphozyten ohne Kontamination durch Trümmer, Plättchen oder Markzellen entwickeln und analysieren.
Beispiel 1 Nicht-Waschen-Probenanalyse mit Zwei-Parameter-Gating
• Eine Vollblutprobe (100 uL) wurde mit 0,25 ug HLe- 1 -PerCP-Antikörper, 0,1 ug Leu-4-FITC-Antikörper und 0,25 ug Leu-11+19-PE-Antikörper vermischt (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, Kalifornien). Die PE-Konjugate wurden durch Kationenaustausch und Dimensionierung durch Gelfiltration behandelt, um alles detektierbare freie PE und Mehrfache (2 : 1 und 1 : 2-Konjugate) zu beseitigen, so dass mehr als 90% des Produkts ein PE-Ig-Verhältnis von 1 : 1 aufwiesen. Dieser Vorgang verbesserte die Leistung der Nicht-Waschen-Reagenzien, möglicherweise bedingt durch die Tendenz freien PEs, unspezifisch an Plättchen, die in einer Nicht-Waschen-Probe per definitionem vorhanden sind, zu haften. Die erfinderische Nicht-Waschen-Probenpräparation erforderte zwanzigmal weniger PE zum Färben, wenn ein hoher Anteil von 1 : 1-Konjugaten verwendet wurde, und ergab eine verringerte Hintergrundfluoreszenz.
• Die Mischung wurde 15 min bei Raumtemperatur und im Dunkeln inkubiert. Zwei ml FACS Lysing Solution (Becton Dickinson Immunocytometry Systems) wurden der gefärbten Probe zugesetzt, und sie wurde 10 min bei Raumtemperatur und im Dunkeln inkubiert. Die lysierte, markierte Probe wurde dann auf einem FACSCAN- Durchflusszytometer analysiert, wobei die Aktivierung auf FL3 (anti-HLe-1-PerCP) bezogen war und Fluoreszenz- und Lichtstreuungsdaten mit CONSORT 32-Software erfasst wurden. Eine Analyse der erfassten Daten wurde mit Hilfe von FACSCAN Research-, LYSYS II- oder SIMULSET-Software durchgeführt.
• Die Fig. 2A-D zeigen einen Vergleich von Lymphozyten-Gating bezogen auf SSC gegen FL3 mit Lymphozyten-Gating bezogen auf SSC gegen FSC (Fig. 2A) bei der ungewaschenen, lysierten Probe. Das Gating bezogen auf SSC gegen FL3 (Fig. 2B) verringerte die Zahl der im Gate eingeschlossenen Trümmer signifikant, so wie in der Graphik FL1 gegen FL2 für die einem Gating unterzogene Leukozyten-Subpopulation (vgl. Fig. 2C und Fig. 2D) gezeigt. Im Vergleich zum traditionellen SSC/FSC-Gate können die Trümmer bei Verwendung von SSC gegen FL3 zum Aufstellen des Gates um nicht weniger als 50% verringert werden. Auf FL3 bezogenes Aktivieren ermöglicht die Erfassung einer größeren Anzahl an analysierbaren Zellen in Situationen, wo eine festgelegte Anzahl an Ereignissen erfasst wird, da Ereignisse, die mittels Streuung detektiert werden können, aber unter der Fluoreszenzschwelle liegen, nicht gezählt werden. Unter bestimmten experimentellen Bedingungen kann auf Fluoreszenz bezogenes Aktivieren auch die Geschwindigkeit der Datenerfassung erhöhen.
Beispiel 2 Nicht-Waschen-Probenanalyse mit Drei-Parameter-Gating
• Es wurden Vollblutproben für elf Objekte (vier 100 uL-Aliquote für jedes Objekt) auf dem FACSPREP präpariert, wobei mit 20 uL anti-HLE-1-PerCP, anti-Leu-M7-FITC und anti-Leu-M3-PE (Becton Dickinson Immunocytometry Systems) gefärbt wurde. Die Proben wurden etwa 15 min bei Raumtemperatur und im Dunkeln inkubiert. Im Anschluss an das Markieren wurden jeder Probe 2 ml FACS Lysing Solution zugesetzt. Diese Proben wurden auf dem FACSCAN ohne Entfernung der Lyselösung, ohne Zentrifugieren und ohne Waschen analysiert. Diese Aliquote wurden bei einer auf FL3 (PerCP) und die mit LYSYS für eine Drei-Farben-Analyse erfassten Daten bezogenen Aktivierung analysiert, wobei die Lymphozyten-Subpopulation einem Gating unterzogen wurde.
• Nicht-Waschen-Daten wurden unter Verwendung von (1) LYSYS II mit dem herkömmlichen FSC/SSC-Streuungsgate (R1) und einem manuell eingestellten FL3- Auslöser und (2) LYSYS II mit einem manuell eingestellten FL3-Auslöser und einem Drei- Parameter-Gate auf der Grundlage von SSC gegen FSC (R1) und SSC gegen FL3 (R2) analysiert.
• Zum Vergleich wurden zwei zusätzliche 100 uL-Aliquote jeder Probe auf dem FACSPREP präpariert, wobei mit SIMULTEST Reagenzien-Sätzen (Beeton Dickinson Immunocytometry Systems) gemäß den Anleitungen des Herstellers gefärbt wurde, einschließlich des Zentrifugierens und Waschens der Proben nach dem Lysieren. Diese Aliquote wurden auf dem FACSCAN mit herkömmlichem Aktivieren bezogen auf Lichtstreuung analysiert. Die Daten wurden mit SIMULSET-Software (Becton Dickinson Immunocytometry Systems) für eine Zwei-Farben-Analyse erfasst, wobei die Lymphozyten- Subpopulation einem Gating unterzogen wurde. Für eine gewaschene Probe wurde das Gate automatisch durch die Software eingestellt, und für die zweite wurde das Gate manuell vom Bediener eingestellt.
• Bei den gewaschenen Proben, bei denen das SIMULTEST-Färben, SIMULSET- Software und ein Lichtstreuungsauslöser eingesetzt wurden, misslang es, mit den zwei Gating-Verfahren die Trümmer aus der einem Gating unterzogenen Lymphozyten- Subpopulation zu entfernen (1-8% Kontamination). Die Qualität des Gates wurde etwas verbessert, als der Bediener die Gates neu definierte. Diese einem Gating unterzogenen Lymphozyten-Subpopulationen waren auch mit 0-1% Monozyten und 1-8% Granulozyten kontaminiert.
• Im Gegensatz dazu konnten bei den Nicht-Waschen-Aliquoten mit auf FL3 bezogenem Aktivieren die Trümmer aus dem Lymphozyten-Gate auf Pegel unterhalb der Detektionsgrenzen des Analysesystems beseitigt werden, ungeachtet des Datenerfassungs- und Gating-Verfahrens. Auch Monozyten wurden aus dem Gate im Nicht-Waschen-Format beseitigt, ungeachtet dessen, ob das Streuungsgate oder das Drei-Parameter-Gate angewendet wurde. Die Kontamination der dem Gating unterzogenen Lymphozyten- Population mit Granulozyten wurde durch Drei-Parameter-Gating signifikant verringert (0,2% durchschnittliche Kontamination), wohingegen das Lichtstreuungs-Lymphozytengate zwischen 1% und 6% Granulozyten (möglicherweise hauptsächlich Basophile) einschloss. Im Gegensatz zum herkömmlichen Zwei-Parameter-Lichtstreuungsgating ermöglicht es das Drei-Parameter-Gatingverfahren dem Bediener, im Wesentlichen 100% Lymphozyten in das Gate einzuschließen, mit im Durchschnitt keinen Trümmern, keinen Monozyten und lediglich 0,2% Granulozyten.
• Drei-Parameter-Gating wird in den Fig. 3A-3D veranschaulicht. R1 (Fig. 3A) und R2 (Fig. 3B) werden aufgestellt und die in beiden eingeschlossenen Zellen identifiziert, um R3 zu bilden (Fig. 3D). Die erhöhte Reinheit des Drei-Parameter-Gates wird aus einem Vergleich von Fig. 3D mit Fig. 3C ersichtlich, die R1 alleine veranschaulicht (herkömmliches SSC/FSC-Gate, aber mit einem FL3-Auslöser). Ein Färben der dem Gating unterzogenen Lymphozyten mit anti-Leu-M3 und anti-Leu-M7 quantifiziert den relativen Grad an Kontamination mit Markzellen bei Verwendung der zwei Gating- Verfahren. Wie die Figuren zeigen, wird die Kontamination von einem Gating unterzogenen Lymphozyten mit Markzellen durch Drei-Parametei-Gating signifikant verringert.
Beispiel 3 Analyse von Erythrozyten enthaltenden Blutroben
• Eine Blutprobe wurde mit anti-Leu-3a-PE, anti-Leu-2a-FITC und anti-HLe-PerCP gefärbt, mit Ammoniumchlorid lysiert, zentrifugiert und einmal mit phosphatgepufferter Salzlösung gewaschen. Die Probe wurde dann geteilt, und rote Blutzellen wurden einem Aliquoten in ausreichender Menge zugesetzt, so dass etwa 70-80% der im Gate eingeschlossenen Ereignisse durch RBCs bedingt waren. Die Aliquote wurden auf einem FACSCAN-Durchflusszytometer analysiert, und Lymphozyten-Gates wurden unter Verwendung von SSC gegen FSC (Fig. 4A und 4E) und SSC gegen FL3 (PerCP) (Fig. 4B und 4F) eingestellt. FL1- und FL2-Ereignisse wurden dann graphisch dargestellt und hinsichtlich der einem Gating unterzogenen Lymphozyten gezählt.
• Beim Aliquoten ohne zugesetzte rote Blutzellen gab es bei den zwei Gating- Verfahren im Wesentlichen keinen Unterschied beim Prozentsatz von Leu-3a- und Leu-2apositiven Zellen (vgl. Fig. 4C und Fig. 4D). Beim Aliquoten, der rote Blutzellen enthielt, wurden mittels SSC gegen FL3-Gating genaue Leu-3a-positive und Leu-2a-positive Prozentsätze erzielt, ein SSC gegen FSC-Gating hingegen ergab sehr ungenaue Ergebnisse (Fig. 4H und Fig. 4 G).
• Diese Ergebnisse zeigen, dass, verglichen mit herkömmlichem Streuungsgating, das vorliegende Gating-Verfahren zu keinem Verlust irgendwelcher Zellpopulationen führt. Zusätzlich stellt das Verfahren ein Kompensationsmittel für Lichtstreuungsinterferenz durch rote Blutzellen in unlysierten Blutproben und Lyse-Reagenzien bei Nicht-Waschen- Blutprobenpräparationsverfahren bereit.
Beispiel 4 Dreiteiliges Differential mit CD4/CD8-Subsetting
• Ein einzelnes Blutaliquot wurde gleichzeitig mit anti-HLE-1-PerCP, anti-Leu-3-FITC, anti- Leu-4-FITC, anti-Leu-2-PE und anti-NCAM Leu-19-PE gefärbt und ohne Waschen lysiert (wie zuvor beschrieben). Die gefärbte Probe wurde auf einem FACSCAN analysiert, wobei die Aktivierung auf PerCP-Fluoreszenz bezogen war. FSC-, SSC- und Fluoreszenz-Daten wurden für jedes detektierte Ereignis erfasst und analysiert, wobei Attraktor-Software zum Identifizieren des Lymphozyten-Clusters verwendet wurde. Fig. 5A zeigt die trümmer- und markzellenfreie Lymphozyten-Subpopulation nach einer Analyse mit "Attraktor"-Software. Um T-Helfer-, T-Hemmer-, B- und NK-Zelluntermengen zu identifizieren, wurden Punktegraphiken von anti-Leu-3-FITC + anti-Leu-4-FITC (CD3 + CD4 FITC) gegen anti- Leu-2-PE + anti-NCAM Leu-19-PE (CD8 + CD56 PE) erzeugt (Fig. 5B) und der Prozentsatz sämtlicher Lymphozyten in jeder Untermenge berechnet.

Claims (8)

1. Verfahren zur Bestimmung einer Subpopulation von interessierenden Zellen in einer Leukozyten-Population in einer Blutprobe mittels Durchllußzytometrie, welches Verfahren bei einem einzelnen Aliquot der Probe umfaßt:

a) Markierung der Leukozyten mit einem Leukozyt-spezifischen, Fluorochrommarkierten primären Antikörper, der sich in unterschiedlichem Maß an die Zellen der interessierenden Subpopulation und an die Zellen mindestens einer weiteren Subpopulation bindet;

b) Lyse der roten Blutzellen in der Probe durch Zugabe eines Lyse-Reagens;

c) Analyse der markierten Leukozyten in der lysierten Probe in einem Durchflußzytometer ohne Abtrennung der markierten Leukozyten vom Lyse-Reagens, welches Zytometer auf eine Aktivierungsschwelle eingestellt ist, die für eine vorbestimmte Fluoreszenzintensität, welche auf das Vorhandensein von primären Antikörpern schließen läßt, repräsentativ ist, so daß alle Zellen analysiert werden, bei denen die Schwelle überschritten wird, wobei die Analyse umfaßt:

d) Erfassung von Fluoreszenz- und Lichtsfreuungsdaten für die markierten Leukozyten; und

e) Bestimmung der Subpopulation der interessierenden Zellen mittels eines Verfahrens, welches das Erzeugen einer ersten Graphik eines Lichtstreuungsintensität-Parameters gegen die Antikörper-Fluoreszenzintensität und das Auswählen einer Gate-Fläche der Graphik als Subpopulation der interessierenden Zellen miteinschließt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Bestimmungsschritt umfaßt:

e&sub1;) Aufnahme einer zweiten Graphik von Seitenlichtstreuungsintensität gegen Lichtstreuungsintensität von vorwärts einfallendem Licht;

e&sub2;) Aufnahme einer Graphik von Seitenlichtstreuungsintensität gegen die Fluoreszenzintensität primärer Antikörper als besagte erste Graphik; und

e&sub3;) Aufnahme einer dritten Graphik durch Auswählen der sowohl in der ersten als auch in der zweiten Graphik enthaltenen Zellen, wodurch die Zellen der interessierenden Subpopulation bestimmt werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Leukozyten mit mindestens einem Fluorochrom-markierten sekundären Antikörper markiert werden, der für die Zellen einer Teilmenge der interessierenden Subpopulation spezifisch ist und sich an diese bindet, und wobei die Fluoreszenz der primären Antikörper mittels Durchflußzytometrie von der Fluoreszenz der sekundären Antikörper unterscheidbar ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Bestimmungsschritt ein Autoclustering der Zellen der Subpopulation unter Verwendung eines Verfahrens umfaßt, welches:

i) das Festlegen einer geometrischen Grenzfläche, aber keiner Position, für jede in der Probe erwartete Subpopulation vor dem Autoclustering, um einer in Form, Größe und Ausrichtung fixierten Subpopulation Zusammengehörigkeit zu verleihen;

ii) das Festsetzen eines Keimorts und -radius für jede Subpopulation;

iii) das Übertragen eines Vektors für jede analysierte Zelle in ein Koordinatensystem, in welchem der Vektor aus Werten für jeden erfaßten Parameter besteht;

iv) das Summieren jedes Vektors zur Berechnung eines Vektormittels, wenn die Nähe dieses Vektors geringer als der Radiusabstand von der zentralen Stelle des Vektors ist;

v) das Berechnen der zentralen Stelle als Vektormittel, nachdem eine im voraus festgelegte Anzahl von Vektoren zur Vektorsumme zwecks Berechnung des Vektormittels hinzugefügt wurde;

vi) das Wiederholen der Schritte iii)-v), bis eine im voraus festgelegte Anzahl von Vektoren in die Berechnung des Vektormittels miteinbezogen wurde;

vii) das Einführen einer endgültigen geometrischen Grenze basierend auf der zuletzt brechneten Stelle; und

viii) das Vergleichen aller späteren Zellvektoren mit der endgültigen Grenze zwecks Aufnahme innerhalb oder Ausschlusses außerhalb der Grenze, wodurch die interessierende Subpopulation bestimmt wird, umfaßt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, welches weiters das Markieren der Leukozyten mit mindestens einem sekundären Fluorochrom-markierten Antikörper, der für die Zellen einer Teilmenge der Subpopulation spezifisch ist, wobei die Fluoreszenz der primären Antikörper von der Fluoreszenz der sekundären Antikörper mittels Durchflußzytometrie unterscheidbar ist, und das Bestimmen der Zellen der Teilmenge durch Analyse der Fluoreszenz der sekundären Antikörper der Zellen der Subpopulation umfaßt.

6. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Zellen der Leukozyten-Population mit einem CD45-PerCP Antikörper und die Zellen der Subpopulation mit CD3-FITC, CD4-FITC, CD8-PE und CD56-PE markiert werden.

7. Verfahren nach Anspruch 5, wobei T-Helfer-, T-Hemm-, B- und NK-Zellen mittels Analyse der FITC- und PE-Fluoreszenz der CD45-PerCP-positiven Lymphozyten bestimmt werden.

8. Verfahren zur Bestimmung einer Subpopulation von interessierenden Zellen in einer Leukozyten-Population in einer Blutprobe mittels Durchflußzytometrie nach Anspruch 1, wobei:

- in Stufe a) die Zellen der Population mit einem an einen ersten Fluorochrom (FL 1) konjugierten anti-Leukozyt-Antikörper, mit einem an einen getrennt detektierbaren zweiten Fluorochrom (FL2) konjugierten anti-Monocyt-Antikörper und mit besagtem an einen dritten Fluorochrom (FL3) konjugierten primären anti-Leukozyt-Antikörper markiert werden, welcher dritte Fluorochrom vom ersten und zweiten Fluorochrom unterschieden werden kann;

- in Schritt d) Fluoreszenzdaten (FL1 und FL2) und Lichtstreuungsdaten für die markierten Leukozyten erfaßt werden;

f) das Verfahren weiters die Schritte des Markierens der Zellen der Population in einem zweiten Aliquot der Probe mit besagtem, an den dritten Fluorochrom (FL3) konjugierten primären anti-Leukozyt-Antikörper;

g) des Analysierens des markierten zweiten Aliquots in einem Durchflußzytometer ohne Abtrennung der markierten Leukozyten vom Lyse-Reagens, welches Zytometer auf eine Aktivierungsschwelle eingestellt ist, die für eine vorbestimmte Fluoreszenzintensität, welche auf das Vorhandensein des primären Antikörpers schließen läßt, repräsentativ ist, so daß Zellen analysiert werden, bei denen die Schwelle überschritten wird, wobei das Analysieren die Erfassung von Fluoreszenz- und Lichtstreuungsdaten für die Zellen der markierten Population im zweiten Aliquot umfaßt; und

h) des Anwendens der in Schritt e) ausgewählten Gate-Fläche auf die für das zweite Aliquot erworbenen Daten, umfaßt, wodurch die Zellen der Subpopulation im zweiten Aliquot bestimmt werden.