DE69332374T2

DE69332374T2 - Verfahren,zusammensetzungen und vorrichtungen zur erhaltung und zur züchtung menschlicher stammzellen und/oder hämatopoetischer zellen

Info

Publication number: DE69332374T2
Application number: DE69332374T
Authority: DE
Inventors: G. Emerson; O. Palsson; M. Schwartz
Original assignee: University of Michigan Ann Arbor
Current assignee: University of Michigan Ann Arbor
Priority date: 1992-03-04
Filing date: 1993-03-04
Publication date: 2003-06-12
Anticipated expiration: 2013-03-05
Also published as: EP0629236A1; AU3914893A; ATE225847T1; AU685743B2; KR100271284B1; EP0629236A4; EP0629236B1; JPH07504570A; WO1993018132A1; DE69332374D1; CA2131385C; CA2131385A1

Description

Technisches Gebiet

Das Gebiet der Erfindung sind Verfahren und Vorrichtungen zum Züchten normaler Säugerzellen in Kultur, einschließlich des Unterhalts und der selektiven Züchtung humaner Stammzellen und/oder hämatopoetischer Zellen.

Stand der Technik

Es besteht ein starkes Interesse, Zellen für zahlreiche verschiedene therapeutische Zwecke verwenden zu können. Das hämatopoetische System dient als Beispiel für die außergewöhnlichen Vielfalt von Zellen, die am Schutz von Säuger-Wirtsorganismen vor Pathogenen, Toxinen, neoplastischen Zellen und anderen Krankheiten beteiligt sind. Man nimmt an, daß sich das hämatopoetische System aus einer einzelnen Stammzelle entwickelt, von der sich alle Linien des hämatopoetischen Systems ableiten. Die besondere Art und Weise, mit der sich die Stammzelle vermehrt und differenziert, um so in ihrer Linie festgelegt zu werden, ist nicht vollständig bekannt, noch sind es die bestimmenden Faktoren. Sobald die Stammzelle jedoch auf eine bestimmte Linie festgelegt ist, scheint es eine Reihe von Faktoren zu geben, beispielsweise Kolonien stimulierende Faktoren oder 'Colony Stimulating Factors', die die Stammzelle zu einer bestimmten reifen Linie werden lassen und sie in diese Richtung dirigieren.
Blutzellen erfüllen viele Zwecke. Thrombozyten dienen zum Schutz gegen Blutungen sowie als Quelle für aus Thrombozyten stammende Wachstumsfaktoren. Rote Blutzellen können bei Transfusionen zur Unterstützung des Sauerstoff transports Anwendung finden. Bestimmte Lymphozyten können bei der Behandlung verschiedener Krankheiten zur Anwendung kommen, bei denen der Lymphozyt spezifisch für ein Epitop eines Antigens sensibilisiert ist. Stammzellen können zur Gentherapie sowie zur Hilfe bei hochdosierter Chemotherapie gegen Krebs eingesetzt werden. Diese und andere Zwecke sind denkbar.
Um diese Zellen bereitzustellen, ist es erforderlich, Mittel vorzusehen, mit denen die Zellen in Kultur gezüchtet werden können und zur gewünschten reifen Zelle führen, und zwar entweder vor oder nach Gabe an einen Säuger-Wirtsorganismus. Es ist bekannt, daß die hämatopoetischen Zellen als Teil des Knochenmarks zu verschiedenartigen Graden im Knochen wachsen und reifen. Es ist daher von Interesse, ein System zu schaffen, das im wesentlichen dasselbe Milieu liefert, wie es im Knochenmark vorliegt, und in der Lage zu sein, diese Zellen, die in Kultur gezüchtet werden, in die Richtung einer bestimmten Linie zu lenken.
In diesem Sinne beschreibt US-Patent 4,721,096 ein dreidimensionales System zur Züchtung von hämatopoetischen Zellen, das Stromazellen beinhaltet. Siehe auch die hier zitierten Literaturstellen. Glanville et al., Nature (1981) 292: 267-269, beschreiben das Metallothionein I-Gen der Maus. Wong et al., Science (1985) 228: 810-815, beschreiben humanen-GM-CSF. Lemischka et al., Cell (1986), 45: 917-927, beschreiben Retrovirenvermittelten Gentransfer als Marker für hämatopoetische Stammzellen und das Verfolgen des Schicksals dieser Zellen nach Transplantation. Yang et al., Cell (1986) 47: 3-10, beschreiben humanes IL-3. Chen et al., Okayama, Mol. Cell. Biol. (1987) 7: 2745-2752, beschreiben die Transformation von Säugerzellen durch Plasmid-DNA. Greaves et al., Cell (1989) 5: 979-986, beschreiben das humane CD2-Gen. Civin et al., J. Immunol. (1984) 133: 1576-165, beschreiben das CD34-Antigen. Martin et al., Cell (1990) 63: 203-211, beschreiben humanen S-CSF.
Forrester et al., J. Cell Science. (1984) 70: 93-110, diskutieren eine parallele Strömungskammer. Coulombel et al., J. Clin Invest., (1986) 75: 961, beschreiben den Verlust von WP-Zellen in statischen Kulturen.
Gewebe-Engineering ist ein neuer und wachsender Zweig der Biotechnologie. Sein Ziel ist es, ganz oder teilweise funktionstüchtiges humanes Gewebe in vitro zu rekonstituieren, um verschiedene klinische oder andere Anwendungen zu ermöglichen. In jüngster Zeit wurden mehrere Untersuchungen mit dem Ziel durchgeführt, funktionstüchtiges humanes Gewebe in vitro zu rekonstituieren. Die Kultivierung menschlicher Haut war vielleicht bislang am erfolgreichsten.
Die Entwicklung produktiver in vitro-Systeme für humanes Knochenmark ist seit langem erwünscht, da solche Systeme einen breiten Bereich klinischer und wissenschaftlicher Anwendungen ermöglichen würden. Solche Anwendungen beinhalten:
(1) Untersuchung der Grunddynamik hämatopoetischer Differenzierung,
(2) verbesserte autologe und allogene Knochenmarkstransplantationen,
(3) Depletion unerwünschter Zellen wie T-Zellen und maligner Zellen nach Knochenmarkstransplantationen,
(4) Gentherapie des Blutzellen-Systems und
(5) Produktion reifer Blutzellen, wie roter Blutzellen und Thrombozyten, in industriellem Maßstab.
Obwohl die Langzeitkulturen von humanem Knochenmark (LTHBMCs), die in den späten 1970er- und frühen 1980er- Jahren entwickelt wurden, anfänglich hinsichtlich Langlebigkeit und Produktivität enttäuschend waren [siehe Greenberger (1984) 'Long-term Hematopoietic Cultures', S. 203-242 in "Hematopoiesis", D. W. Golde, Hrsg., Churchill- Livingston, NY), wurde ihr Leistungsvermögen durch Fortschritte, die in jüngerer Zeit gemacht wurden, deutlich verbessert. Diese Verbesserungen werden jedoch mit üblichen Gewebekulturapparaturen im Labormaßstab mit einer sub-klinischen Anzahl von Knochenmarkszellen durchgeführt. Daher besteht ein zwingender und großer Bedarf, Verfahren, Zusammensetzungen und Vorrichtungen bereitzustellen, die eine klinisch bedeutsame Zahl humaner Knochenmarkszellen hervorbringen können, um so die oben beschriebenen Therapien und Anwendungen zu ermöglichen.
Diese jüngeren Verbesserungen im Leistungsvermögen von LTHBMC machen sich eine in vivo-Stimulierung in einem Versuch zunutze. Kulturbedingungen zu schaffen, die zu einer in vitro-Rekonstitution der hämatopoetischen Funktion führen. Eine Reihe von Untersuchungen haben gezeigt, daß dieser Ansatz erfolgreich ist. Es wurde gezeigt, daß die Funktion der tragenden Stromazellenschicht (größtenteils Fibroblasten zusammen mit einigen Adipozyten und Endothelzellen) durch die Perfusionsgeschwindikgkeit des Mediums oder den Zeitpunkt des Medienaustauschs signifikant beeinflußt wird. Es wurde gezeigt, daß sowohl die Stoffwechselfunktion, das Wachstum und - vielleicht am wichtigsten - die Sekretion von Wachstumsfaktoren bei normalen humanen Knochenmarksfibroblasten (Caldwell et al., J. Cell. Physiol., (1991) 147: 344-353) und sogar bei transfizierten NIH-3T3-Zellen (Caldwell et al., Biotech. Prod., (1990) 7: 1-8) durch die Austauschrate des Mediums beeinflußt werden.
Von den Erfindern wurde gezeigt, daß die Fähigkeit von Stroma, die humane Hämatopoese in vitro zu fördern, durch raschen Medienaustausch und hohe Zelldichten verbessert wird. Siehe Schwartz et al., Proc. Nat. Acad. Bei. (USA), (1991), 88: 6760-6764. Bei raschem Medienaustausch und hohen Zelldichten können LTHBMCs bis zu 20 Wochen lang die stabile Produktion von Nachkommenzellen in Kultur unterhalten und die Granulopoese auf bis zu 19 Wochen verlängern. Das vorstehende Ergebnis ist insoweit bemerkenswert, als es zeigt, daß diese Kulturbedingungen Bedingungen liefern können, über längere Zeiträume zum In-Kultur-halten und zur in vitro-Proliferation von Stammzellen geeignet sind.
Die überlegte Verwendung zusätzlicher löslicher Wachstumsfakturen kann das Leistungsvermögen dieser Kulturen weiter verbessern. Man nimmt an, daß einige hämatopoetische Wachstumsfaktoren wie Interleukin 3 (IL-3) und 'Granulocyte-Makrophage Colony-Stimulating Factor' (GM-CSF) die Differenzierung früher hämatopoetischer Zellen stimulieren. Andere Wachstumsfaktoren wie Erythropoetin (EPO) sind vermutlich terminale Differenzierungsfaktoren, die die Produktion reifer Zellen einer bestimmten Zellinie stimulieren. Es wurde beobachtet, daß die Zugabe von löslichem IL-3, GM-CSF und EPO in schnell perfundierten humanen Knochenmarkskulturen die Produktion von reifen Zellen und von Nachkommenzellen über eine Dauer von 6-8 Wochen stimulieren kann. Während dieser Dauer beträgt die Regenerationsgeschwindigkeit der Zellkultur (die Zeit, die benötigt wird, um so viele nicht adhärente Zellen zu produzieren, wie ursprünglich ausgesät wurden) etwa 2 Wochen (die geschätzte in vivo-Geschwindigkeit beträgt im Vergleich dazu etwa 2 Tage), und man beobachtet während der ganzen 20-wöchigen Kultivierungsdauer Erythropoese. Beide Ergebnisse sind bemerkenswert, da sich alle früheren Versuche, humanes Knochenmark in vitro zu expandieren, als erfolglos erwiesen haben und die Erythropoese in herkömmlichen LTHBMCs von kurzer Dauer ist (Dauer weniger als 2 Wochen).
Die Anpassung der Kulturbedingungen zur besseren Simulierung der in vivo-Bedingungen hat die Produktivität von LTHBMCs für Nachkommenzellen und nicht adhärente Zellen dramatisch verbessert. Ferner führten diese Bedingungen zur Rekonstitution von anderen Blut-Zellinien als der Makrophagen-Zellinie, bei der beobachtet wurde, daß sie die Zusammensetzung der nicht adhärenten Zellpopulation in LTHBMCs und in Knochenmarkskulturen anderer Lebewesenspezien dominiert (siehe Überblick in R. M. Schwartz, 'Optimization of Long-Term Bone-Marrow Cultures', Ph.D.-Thesis, 1991, University of Michigan). Eine weitere Supplementierung des Mediums mit dem Stammzellenfaktor (SCF, auch als "c-kif"-Ligand des Mastzellen-Wachstumsfaktors bekannt) und den Interleukinen 1 und 6 führt zu einer noch stärkeren Expansion der Zellzahlen. Bislang wurde diese Zusammensetzung der Öffentlichkeit nicht zugänglich gemacht.
Die Entdeckung von Produktivbedingungen für den Langzeit- Unterhalt und die Langzeit-Proliferation früher humaner hämatopoetischer Zellen in vitro mit Laborapparaturen zur Kultivierung von Zellen im kleinen Maßstab ist von offensichtlicher Bedeutung. Noch wichtiger ist die Entwicklung von Verfahren, Vorrichtungen und Zusammensetzungen, die das In-Kultur-halten und die Proliferation dieser Zellen in klinisch bedeutsamen Mengen erlauben, so daß die oben beschriebenen wichtigen therapeutischen Anwendungen durchgeführt werden können.
Es wurden Geräteformen für Bioreaktoren vorgeschlagen, die sich mit der Frage der Ernte der in dem Bioreaktor produzierten Zellen beschäftigen. Interessanterweise ermöglichen diese vorgeschlagenen Geräteformen nur ein diskontinuierliches (batchweises) Ernten der Zellen, indem der Reaktor geöffnet wird, sobald eine ausreichende Zahl von Zellen erhalten wurde, wodurch die Kultivierung unterbrochen wird. Beispielsweise beschreibt US-Patent 5,010,014 eine Zellkulturkammer-Apparatur mit einem Bereich für die Zellkultivierung und einem davon durch eine gaspermeable Wand getrennten Gasbereich, die ein batchweises Ernten der Zellen erlaubt. US-Patent 4,839,292 beschreibt einen Kolben zur Kultivierung von Zellen, der zwei durch eine gaspermeable Membran getrennte Kammern umfaßt. Es wird beschrieben, daß jede Kammer sowohl mit Mitteln für den Einlaß als auch für den Auslaß versehen ist, und es wird beschrieben, daß der Kolben zum batchweisen Ernten der Zellen geeignet ist, indem man die gaspermeable Membran aus dem Reaktor entfernt.
US-Patent 4,948,728 beschreibt einen Bioreaktor und die Verwendung einer Membran, die aus einer Keramikschicht und einer hydrophoben Schicht besteht, wobei an dem Keramikfilm ein Biofilm angebracht ist. Dieses Patent beschäftigt sich jedoch nicht mit der Frage des Ernten der Zellen.
Außerdem besteht Bedarf an einem Bioreaktor, der das Unterhalten einer (was den Zelltyp betrifft) im Gleichgewicht befindlichen oder ausgewogenen komplexen Kultur von Primärzellen erlaubt. Kulturen humaner Stammzellen oder hämatopoetischer Zellen reagieren auf ihr dynamisches (d. h. Geschwindigkeit der Zufuhr und des Entzugs von Gas/Nährstoffen/Wachstumsfaktoren) und chemisches Umfeld sehr empfindlich. Bis heute erlaubt keine Bioreaktorform in zufriedenstellender Weise ein solches Unterhalten einer im Gleichgewicht, befindlichen komplexen Kultur von Primärzellen.
Die erhältlichen Geräteformen sehen also kein Verfahren zum Ernten von Zellen ohne Unterbrechung der Kultur oder zum Unterhalten einer im Gleichgewicht befindlichen komplexen Kultur von Primärzellen vor, geschweige den von beidem. Daher wird eine geeignete Geräteform benötigt, die das In-Kultur-halten und die Proliferation humaner Stammzellen und/oder früher hämatopoetischer Zellen in vitro erlaubt und die vorteilhaft außerdem ein Ernten der in dem Reaktor produzierten Zellen ohne Unterbrechung der Kultur erlaubt. Es besteht ein starker Bedarf an einer solchen Geräteform.
Dokument WO-A-92/11355, das Stand der Technik unter Art. 54(3) und (4) EPC ist, und Dokument WO-A-90/15877 offenbaren einen Bioreaktor zur Kultivierung von Stromazellen und hämatopoetischen Zellen. Keines dieser Dokumente betrifft jedoch einen Bioreaktor, der eine Zellkammer beinhaltet, die so ausgebildet ist, daß in ihr nicht nur für eine im wesentlichen radiale Strömung gesorgt wird, sondern die auch eine gaspermeable und flüssigkeitspermeable Membran einsetzt, die die kontrollierte Zufuhr von Atmungsgasen und von Medien erlaubt.
Dokument EP-A-0 531 631 offenbart eine Zellkulturvorrichtung, bei der es sich um eine Vorrichtung auf Basis von Hohlfasern handelt.
Dokument EP-A-0 112 155 offenbart ein Verfahren und ein System zur Kultivierung und zum Behandeln von Stoffen, die in einer strömenden Kulturflüssigkeit verteilt sind, mit einer rechteckigen Kammer, wobei an den Seiten des rechtwinkligen Reaktors einzelne Einlaßöffnungen und Auslaßöffnungen angebracht sind.
Dokument US-A-4,851,483 offenbart einen kontinuierlichen Reaktor und ein kontinuierliches Verfahren mit einer rechtwinkligen Kammer mit einer mehrschichtigen biologischen Membran.

Offenbarung der Erfindung

Dementsprechend beinhaltet der in den anhängenden Ansprüchen 1-28 definierte Gegenstand der Erfindung das Bereitstellen von Bioreaktorformen, die das Unterhalten und die Proliferation von humanen Stammzellen und/oder frühen humanen hämatopoetischen Zellen, einschließlich komplexer Kulturen von Primärzellen, vorsehen, wobei der Reaktor das Ernten der in dem Bioreaktor produzierten Zellen ohne Unterbrechung der Kultur erlaubt. Die Erfinder haben nun Geräteformen gefunden, die den obigen Anforderungen der Erfindung und anderen Anforderungen, die aus der nachfolgenden Beschreibung der Erfindung deutlich werden, genügen.
Es werden Verfahren bereitgestellt, bei denen Reaktoren und Zusammensetzungen eingesetzt werden, die eine effiziente Proliferation von humanen Stammzellen und/oder hämatopoetischen Zellen in Kultur erlauben, insbesondere von Zellen in einem frühen Reifestadium, einschließlich humaner Stammzellen. Die Verfahren setzen gegebenenfalls Stromazellen ein, die üblicherweise transformiert sind, die für eine konstitutive oder induzierbare Produktion von Wachstumsfaktoren sorgen, wobei die Zellen physisch getrennt sind, um eine leichte Abtrennung von den hämatopoetischen Zellen zu ermöglichen. Durch die Bereitstellung einer kontinuierlichen Perfusion und durch zweckmäßiges Abziehen oder Im-Kreis-führen von Zellen haben die Erfinder gefunden, daß sich ex vivo eine Teilung humaner Stammzellen erhalten läßt und daß hohe Dichten und Ausbeuten lebensfähiger hämatopoetischer Zellen erreicht werden können. Der Reaktor benutzt gegebenenfalls eine Proteinoberfläche für die Stromazellen und entweder die Oberfläche oder andere Barrieren, um eine Trennung von Stromazellen und hämatopoetischen Zellen aufrechtzuerhalten.
Es werden auch Verfahren bereitgestellt, bei denen Bioreaktoren, Verfahren und Zusammensetzungen eingesetzt werden, die ein In-Kultur-halten, eine effiziente Proliferation und eine Steuerung der Zellinie der humanen Stammzellen und/oder der hämatopoetischen Zellen in vitro erlauben. Die effiziente Proliferation betrifft besonders hämatopoetische Zellen in einem frühen Reifestadium, einschließlich toti- und pluripotenter hämatopoetischer humaner Stammzellen. Die Verfahren erlauben Bedingungen, die einerseits die in vivo-Bedingungen simulieren und andererseits spezielle Änderungen erlauben, die die obigen wichtigen klinischen Anwendungen ermöglichen. Die erfindungsgemäßen Bioreaktoren erlauben kontinuierliches, periodisches oder diskontinuierliches Ernten von Zellen, ohne daß die Kultivierung unterbrochen wird. Die Zellen werden periodisch geerntet, wenn die Erntezyklen a priori festgelegt werden. Sie werden diskontinuierlich geerntet, wenn sie als Reaktion auf eine prozeßgekoppelte Messung der Kultur geerntet werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist eine schematische Ansicht einer Perfusionskammer;
Fig. 2 ist eine schematische Darstellung und ein Flußdiagramm des Wegs des Perfusionsmediums;
Fig. 3a ist eine schematische Ansicht einer Strömungskammer zur Messung der Scherspannung für das Abtrennen von Zellen;
Fig. 3b ist eine Seitenansicht der Strömungskammer von Fig. 3a;
Fig. 3c ist eine Kurve des Scherspannungsprofils für hämatopoetische Zellen;
Fig. 6a-g sind Schema Zeichnungen, die die Hauptkomponenten der hämatopoetischen Flachbett- Bioreaktoren der Erfindung zeigen;
Fig. 9 ist eine Abbildung eines automatisierten Zellkultivierungssystems;
Fig. 10a-10c stellen die Expansion von Gesamtzellen, GM bzw. BFU als Funktion (i) des Typs der Gasmembran und (ii) der O&sub2;-Konzentration dar;
Fig. 11a-11c stellen einen erfindungsgemäß ausgestalteten Bioreaktor dar, der speziell für die Zellernte, einschließlich selektiver Zellernte, ausgelegt ist.

Beste Ausführungsform zur Durchführung der Erfindung

Es werden Bioreaktoren zum Züchten von humanen Stammzellen und/oder hämatopoetischen Zellen in Kultur bereitgestellt, bei denen gegebenenfalls Fibroblastenzellen, die üblicherweise transformiert sind, eingesetzt werden, um Wachstumsfaktoren zu liefern, wobei den Mischungen aus optionalen Fibroblastenzellen und humanen Stammzellen oder hämatopoetischen Zellen proteinhaltige Komponenten zugesetzt werden und entweder eine periodische, diskontinuierliche oder im wesentlichen kontinuierliche Perfusion, gegebenenfalls mit Rückführung, erfolgt, um ein für die Züchtung effektives Milieu aufrechtzuerhalten.
Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung Verfahren und Bioreaktoren bereit, die das Unterhalten einer (was die Zelltypen betrifft) im Gleichgewicht befindlichen (ausgewogenen) komplexen Kultur von Primärzellen erlauben, was bislang nicht möglich war. In bevorzugten Ausführungsformen erlaubt die vorliegende Erfindung die Co-Kultivierung adhärenter humaner Stromazellen, adhärenter humaner Stamm-/Nachkommenzeilen und nicht adhärenter hämatopoetischer Zellen.
Die Beschreibung der Erfindung läßt sich in die Beschreibung des Reaktors und seines inneren Aufbaus, der Perfusionsbedingungen und der transformierten Stromazellen, z. B. Fibroblasten, unterteilen.
Die Entwicklung einer funktionierenden (i) Teilung humaner Stammzellen ex vivo und (ii) humanen Hämatopoese in vitro erfordert folgendes:
1. Eine Kulturkammer, in der die Zellen in einem pH- äquilibrierten flüssigen Medium einer speziellen Zusammensetzung gezüchtet werden. Die Zellen werden in die Kulturkammer eines (hämatopoetischen) Bioreaktors gegeben, der es erlaubt, den Zellen kontinuierlich, periodisch oder diskontinuierlich Atmungsgase und flüssiges Kulturmedium zuzuführen. Ähnlich erlaubt er, toxische oder hemmende Stoff wechselprodukte und physiologisch wirksame hemmende. Verbindungen kontinuierlich, periodisch oder diskontinuierlich durch die Strömung des Mediums oder durch Dialyse durch eine Membran von den Zellen abzuziehen.
2. Eine Oberfläche für die Adhäsion und das Wachstum der Zellen. Eine aktive (hämatopoetische) Zellkultur besitzt sowohl adhärente als auch nicht adhärente Zellpopulationen. In einer hämatopoetischen Zellkultur, die humane hämatopoetische Stammzellen enthält, umfaßt die adhärente Zellpopulation Stromazellen (wie Fibroblasten, Endothelzellen, Adipozyten etc.) und hämatopoetische Zellen. Die nicht adhärente Zellpopulation setzt sich hauptsächlich aus hämatopoetischen Zellen, insbesondere differenzierteren Zellen zusammen. Die Kulturkammer muß daher eine geeignete Oberfläche für die Adhäsion und das Wachstum der adhärenten Zellpopulation bereitstellen. Diese Oberflächenbereitstellung muß sich im Gleichgewicht mit den Austauschraten für Gas und Medium befinden.
Die Zelldichten in den erfindungsgemäßen Bioreaktoren erreichen bis zu sieben Millionen Zellen pro Quadratzentimeter. Es ist bekannt, daß der Sauerstoffbedarf für eine Million aktive Zellen etwa 0,05 bis 0,5 Mikromol pro Stunde beträgt (Thomas 'Mammalian Cell Technology', Kap. 5, W. G. Thilly, Hrsg., Butterworths (1986)). Dementsprechend sollte der erfindungsgemäße Bioreaktor für jeden Quadratzentimeter Zellwachstumsfläche ausreichend Membranfläche für den Gasaustausch bieten, damit sich ein Transport von 0,35 bis etwa 3,5 Mikromol Sauerstoff pro Stunde erreichen läßt. Wenn in dem vorliegenden Reaktor eine gaspermeable Membran verwendet wird, hängt eine solche Sauerstoff austauschrate, wie bekannt, in erster Linie von der Permeabilität der Gasmembran ab, und, als solches, muß die Sauerstoff rate, die durch die Gasmembran transportiert wird, nicht unbedingt 0,35 bis 3,5 Mikromol Sauerstoff pro Quadratzentimeter gaspermeabler Membranfläche betragen. Ähnlich wird der Nährstoff bedarf der erfindungsgemäß verwendeten Zellkulturfläche durch Regelung der Perfusionsgeschwindigkeit des Mediums eingestellt.
Die Oberfläche für die Adhäsion der Zellen kann dieselbe Oberfläche sein wie die, an der der Gasaustausch erfolgt, muß es aber nicht (siehe nachfolgend Punkt 6). Wenn das Medium mit allen vom Stroma stammenden Komponenten Supplementiert werden kann, wird es einfacher, die Fläche für das Zellwachstum bereitzustellen.
3. Mediumzusammensetzung und Perfusion: Das flüssige Medium im Bioreaktor, das eine geeignete Zusammensetzung auf weist, muß kontinuierlich, periodisch oder diskontinuierlich ausgetauscht werden (siehe unten). Dieses Erfordernis setzt daher die Gegenwart von Ein- und Auslaßöffnungen voraus, durch die der Medienaustausch erfolgen kann. Das Medium enthält Nährstoffe, Wachstumsfaktoren und andere chemische Verbindungen, die für das Wachstum und den Unterhalt der Zellen benötigt werden (siehe unten). Häufig ist dieses Erfordernis nicht vollständig bestimmt und es werden komplexe chemische Zusammensetzungen wie Tier- oder Humanseren eingesetzt (siehe unten).
4. Ernten nicht adhärenter Zellen: Das Hauptprodukt aus dem (hämatopoetischen) Bioreaktorsystem sind die (hämatopoetischen) Zellen selbst, besonders wichtig die Stamm- und Nachkommenzellen. Daher müssen Mittel bereitgestellt werden, um diese Zellen in einem klinisch verwertbaren Zustand ernten zu können. Ein solches Ernten von Zellen kann kontinuierlich, periodisch oder diskontinuierlich erfolgen und darf, wenn es während der Kultivierung erfolgt, die adhärente Zellschicht im Bioreaktor nicht signifikant stören. Spezielle mechanische Vorrichtungen zum Ernten können den Einsatz der Schwerkraft zum Absetzen der Zellen und sogar zum selektiven Ernten mittels Schrägsedimentation beinhalten, um eine Zellpopulation zu ernten, die mit Stamm- und Nachkommenzellen angereichert ist. Ein solches Ernten kann mittels einer Öffnung zum Sammeln der Zellen erfolgen, die gleich oder ungleich der Öffnung sein kann, durch die das Medium entfernt wird.
5. Ernten adhärenter Zellen: Zu einem bestimmten Zeitpunkt nach der Etablierung einer aktiven (hämatopoetischen) Kultur kann es erwünscht sein, einige oder sämtliche adhärente Zellpopulationen zu ernten, (die Etablierung einer aktiven hämatopoetischen Kultur läßt sich durch Beobachten der bei der Kultivierung produzierten Zellen oder durch Zählen nicht adhärenter Zellen, die aus dem Bioreaktor aufgefangen werden, bestimmen. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Stromaschicht eingesetzt. Die Etablierung einer solchen Stromaschicht dauert etwa eine Woche (zwei bis drei Wochen bis zur Konfluenz). Die Kammer und die Oberfläche für das Zellwachstum müssen also das Ernten der adhärenten Zellpopulation in einem klinisch verwertbaren Zustand erlauben. Mechanische Vorgehensweisen zum Ernten von Zellen beinhalten physikalische Bewegung (z. B. Schütteln oder rasche Perfusion) und biologische Manipulation (d. h. Einsatz von lytischen Enzymen, monoklonalen Antikörpern oder Mitteln, die die Adhäsion blockieren).
6. Sauerstoffzufuhr und Entfernung von Kohlendioxid: Das Erfordernis adäquater Mengen von Atmungsgasen muß erfüllt sein. Sauerstoff sollte in adäquatem Strom und in nicht-hemmender Menge zugeführt werden. Physiologische Sauerstoffkonzentrationen entsprechen etwa 30 bis 60 mmHg. Normalerweise hemmen Mengen oberhalb etwa 88 mmHg die Zellaktivität, und Konzentrationen oberhalb etwa 160 mmHg können toxisch sein. Sauerstoffhemmung und Toxizität hängen von der Zellinie ab. Die Erfinder vermuten, daß Knochenmarkszellen relativ empfindlich sind. (760 mmHg Sauerstoff entsprechen etwa 1 mM bei 37ºC.) Das erzeugte Kohlendioxid muß entfernt werden. Der Bioreaktor kann eine freie Gas-Flüssig-Grenzfläche für den Gasaustausch auf weisen, vorzugsweise wird jedoch eine gaspermeable Membran verwendet.
Um hohe Zelldichten erreichen zu können, erfordert die volumetrische Gaszufuhrrate, daß eine Gasaustauschmembran mit einer ausreichen großen spezifischen Fläche (Membranfläche pro Volumeneinheit Zellkultur) vorhanden ist. Eine wünschenswerte Zelldichte liegt minimal bei etwa 5 bis 10 Millionen Zellen pro ml. Daher werden beispielsweise bei einer Million Zellen pro cm² etwa 5 bis 10 cm² pro ml benötigt. Die entsprechend benötigte Gasaustauschfläche hängt, wie oben beschrieben, von den Eigenschaften der Membran ab. Diese Membran teilt den Bioreaktor in zwei Kompartimente; eine Gaskammer, durch die die Gase strömen, und eine Zellkulturkammer, durch die die Flüssigkeit perfundiert wird und in der die Zellen wachsen. Letztgenanntes Kompartiment liefert sowohl die Oberflächen für den Gasaustausch als auch für das Wachstum und die Adhäsion der Zellen. Diese Oberflächen können, müssen aber nicht identisch sein.
Die Fläche eines jeden Oberflächentyps muß sich hinsichtlich Gaspermeabilität und Zellatmungsraten im Gleichgewicht befinden. Die Atmungsraten werden am signifikantesten durch die Zelldichte beeinflußt. Wenn beispielsweise eine Million Zellen 0,05 Mikromol Sauerstoff pro Stunde benötigen, dann benötigt eine Kultur mit einer Million Zellen pro ml die Zufuhr von 0,05 Mikromol Sauerstoff pro Stunde, wogegen eine 10-mal so dichte Kultur mit 10 Millionen Zellen pro ml 0,5 Mikromol Sauerstoff pro Stunde benötigt. Die Atmungsraten hängen also direkt von der Zelldichte und damit dem Sauerstoffeintrag und der spezifischen Fläche für den Sauerstoffeintrag ab.
Alternativ können die Atmungsgase in das flüssige Kulturmedium eingetragen werden, bevor dieses in die Kulturkammer des Bioreaktors gelangt. Dieser Eintrag läßt sich mit bekannten Methoden und Mitteln zur Zugabe eines sauerstoffhaltigen Gases oder von reinem Sauerstoff zu einer wäßrigen Lösung erreichen. Vorzugsweise wird Kohlendioxid aus dem flüssigen Kulturmedium entfernt. Aufgrund der geringen Löslichkeit von Sauerstoff in Wasser verlangt eine solche Anordnung zwangsläufig nach einer hohen Perfusionsgeschwindigkeit des flüssigen Mediums (beispielsweise verbraucht ein Reaktor mit 100 Millionen Zellen pro ml (bei Zellen mit langsamem Verbrauch) 0,5 Mikromol Sauerstoff pro Stunde pro ml Reaktorvolumen. Bei der nicht-hemmenden Menge von 60 mmHg, entsprechend 0,08 mM gleich 80 Mikromol, würde es etwa 10 Minuten brauchen, bis der Sauerstoff verbraucht ist. Die Perfusionsgeschwindigkeit der Flüssigkeit, die benötigt wird, um den Sauerstoff zuzuführen, wäre also 1 ml Medium pro 1 ml Reaktorvolumen pro 10 Minuten.), vermeidet aber das Erfordernis einer Gasaustauschmembran auf Kosten hoher, durch das Fluid mechanisch induzierter innerer Scherspannungen (siehe Punkt 8). Eine solche Bioreaktoranordnung entspricht z. B. der Form des in den Fig. 6a-e dargestellten Bioreaktors, besteht jedoch lediglich aus der Bioreaktoroberseite 600 mit ihren drei Öffnungen 609, 610 und 611, einem Dichtungselement 602 und der Bioreaktorunterseite 601, bei der die Öffnungen 607 und 608 weggelassen wurden.
7. Hohe Zelldichten und Beladung mit Zellen: Hämatopoese findet In vivo in dichten Nischen statt. Produktive hämatopoetische Bioreaktoren müssen daher das Wachstum und den Unterhalt von Zellen bei hohen Zelldichten gewährleisten. Eine solche Zelldichte sollte einige Millionen Zellen pro Milliliter übersteigen und vorzugsweise im Bereich von 10 bis 500 Millionen Zellen pro Milliliter liegen. Eine derart hohe Dichte erfordert eine hohe spezifische Fläche (z. B. beträgt die benötigte spezifische Fläche für 10 Millionen Zellen pro ml bei 1 Million Zellen pro Quadrat Zentimeter 10 cm² pro ml und beträgt ähnlich bei 500 Millionen Zellen pro ml 500 cm² pro ml) für den Gasaustausch und die Zelladhäsion. Außerdem muß die Beladung mit Zellen groß genug sein (die untere praktische Grenze für die Beladung mit Zellen liegt bei insgesamt etwa 5 bis 10 Millionen einkerniger Zellen. Dies liegt daran, daß Stammzellen vermutlich nur in einer Menge von etwa eins oder weniger als eins in einer Million vorkommen, so daß man ein paar Millionen Zellen braucht, um sicherzustellen, daß sich wenigstens eine Stammzelle in der Probe befindet. Um eine klinisch bedeutsame Zellzahl zu erhalten, benötigt man Beladungen mit wenigstens etwa 50 bis 100 Millionen Zellen), um effektiv in vivo-Zellsynergie zu rekonstituieren. Insbesondere müssen ausreichende Mengen früher hämatopoetischer Zellen vorhanden sein (wie nämlich oben festgestellt, kommen Stammzellen vermutlich nur in einer Menge von etwa eins oder weniger als eins in einer Million vor. Daher benötigt man wahrscheinlich wenigstens 10 bis 100 Millionen Zellen für eine aktive Langzeitkultur).
8. Geringe Scherspannungen: Hämatopoetische Zellen und Stammzellen sind in vivo nur geringen, durch Fluide mechanisch induzierten Scherspannungen ausgesetzt. Die (hämatopoetischen) Zellen müssen vor schädlichen Scherspannungen in den Bioreaktoren geschützt werden. In manchen Fällen muß man für eine definierte Scherspannung sorgen, um ein bestimmtes Verhalten zu reproduzieren. Beispielsweise kann die Depletion von malignen Zellen die Implementation einer geringen Scherspannung nötig machen, die genügt, um maligne Zellen physikalisch zu entfernen (siehe unten).
Sobald diese Anforderungen in einem in Betrieb befindlichen Bioreaktormodul erfüllt sind, wird dieses eine Komponente eines Gesamtsystems (dargestellt in Fig. 9), das vorteilhaft Mittel zur zweckmäßigen Aufbewahrung von ungebrauchtem Medium, Mittel zum Ernten von Zellen aus dem Bioreaktor, Mittel zum Zuführen von Gasen in den und zum Abführen von Gasen aus dem Bioreaktor, Mittel zur Aufbewahrung von verbrauchtem Medium und Mittel zur Überwachung wichtiger Variabler während der Kultivierung, beispielsweise pH und Potential von gelöstem Sauerstoff, beinhaltet.
Während der vergangenen Dekade wurde viel Mühe auf die Entwicklung von Bioreaktoren für die Kultivierung von Säugerzellen verwendet, und man könnte denken, daß diese Technologie für die oben beschriebenen Zwecke unmittelbar anwendbar ist. Beispielsweise führte die Produktion monoklonaler Antikörper durch Hybridomzellen und die Produktion therapeutischer Proteine, wie Gewebeplasminogen-Aktivator (tPA) und Erythropoetin (EPO), durch genetisch manipulierte Zellen zu einer starken Nachfrage nach optimierten Systemen für die Kultivierung von Säugerzellen.
Obgleich diese Bemühungen zur Entwicklung effizienter Bioreaktorsysteme zur Produktion therapeutischer Proteine aus Säugerzellen führten, unterscheiden sich die Anforderungen, die an ein Bioreaktorsystem für humane Stammzellen oder hämtopoetische Zellen gestellt werden, hiervon deutlich. Frühere Bioreaktorsysteme für den industriellen Maßstab unterstützten das Wachstum reiner transformierter Säugerzellpopulationen, die relativ leicht zu züchten sind. Ein Bioreaktorsystem für hämatopoetische Zellen oder humane Stammzellen muß auf der anderen Seite das Wachstum einer Mischpopulation von Primärzellen unterstützen, die aus Stromazellen (wie Fibroblasten, Endothelzellen) und hämatopoetischen Zellen in verschiedenen Differenzierungsstadien (Stammzellen, Nachkommenzellen, erythroide, granulozytische und monozytische Vorläufer) besteht. Humane Primärzellen lassen sich weitaus schwerer in Kultur züchten als transformierte kontinuierliche Zellinien. Am wichtigsten ist aber, daß das Produkt aus einem hämatopoetischen Bioreaktorsystem die Zellen selbst sind und nicht das sekretierte Proteinmolekül, was Mittel zum Sammeln der Zellen während der Kultivierung erforderlich macht. Weitere Anforderungen ergeben sich auch aus der beabsichtigten Verwendung der von menschlichen Patienten produzierten Zellen. Diese Unterschiede sind bedeutsam und verlangen die Entwicklung einer neuen Generation von Bioreaktorsystemen.
Das Erfordernis von Stromazellen und von physischer Nähe von Stromazellen und hämatopoetischen Zellen schließt die Möglichkeit aus. Suspensionskulturen und Kultivierungsmethoden auf Basis von Mikrocarriern zu verwenden. Das Erfordernis, daß die Zellen leicht abgetrennt werden können, macht Hohlfasermodule zur Zellproduktion ungeeignet und außerdem wurde von unserem Labor und von anderen (Saroni et al. (1991) Paper 259e des 'Annual Meeting of the American Institute of Chemical Engineers', 17.-22. Nov., Los Angeles, California) gefunden, daß Hohlfaser-Reaktoren unter den üblichen Betriebsbedingungen das Wachstum von humanem Knochenmark nicht unterstützen. Die Verwendung von makroporösen Kügelchen verlangt nach enzymatischer Behandlung der Zellen und nach komplexen Verfahren für die Zellernte. Die Verwendung von makroporösen Kügelchen kann daher die klinische Verwertbarkeit verhindern. Außerdem haben die Erfinder gefunden, daß es nicht möglich ist, das erforderliche Gleichgewicht zwischen hämatopoetischen Zellen der Zellpopulation und Stromazellen aufrechtzuerhalten, wenn Knochenmark auf makroporösen Kollagenkügelchen gezüchtet wird. Die Stromazellen überwachsen die makroporösen Kügelchen und ersticken sämtliche hämatopoetische Aktivität. Es besteht also offenkundig ein signifikanter Bedarf an der Bereitstellung von Vorrichtungen und Verfahren zur Kultivierung klinisch bedeutsamer Mengen humaner Stammzellen oder hämatopoetischer Zellen.
Der Reaktor umfaßt also ein Gefäß, das jede geeignete Form haben kann, die die notwendige Zellverteilung, das Einbringen von Nährstoffen und Sauerstoff, die Entfernung von metabolischen Abfallprodukten, gegebenenfalls das Abtrennen oder Im-Kreis-führen hämatopoetischer Zellen, die Substitution von Stromazellen und das Ernten hämatopoetischer Zellen erlaubt.
Der Reaktor sollte Bedingungen bieten, die im wesentlichen der der Knochenperfusion ähneln. In vivo werden etwa 0,08 ml bis 0,1 ml Serum pro ml Knochenmark pro Minute perfundiert. Dies entspricht etwa 0,2 ml bis 0,3 ml Serum pro 10&sup6; Zellen pro Tag. Abhängig von der Zelldichte werden die Medien daher durchschnittlich alle 24 Stunden zu 50% bis 100% ausgetauscht, so daß eine Menge von Stoffwechselprodukten beibehalten wird, die nicht wachstumshemmend ist. Die Austauschrate liegt im allgemeinen zwischen etwa 0,2 ml, vorzugsweise etwa 0,5 ml, und 1/0 ml Perfusionsmedium pro 10&sup6; Zellen pro Tag, wodurch die in vivo-Perfusionsgeschwindigkeiten empirisch nachgebildet werden. Die genaue Geschwindigkeit kann von der Art des eingesetzten Serums abhängen.
Die Perfusionsgeschwindigkeit in dem Bioreaktor schwankt abhängig von der Zelldichte im Reaktor. Für Zellen, die mit 2-10 · 10&sup6; Zellen/ml kultiviert werden, beträgt diese Geschwindigkeit 0,25 bis 3,0 ml/ml Reaktorvolumen pro 24 Stunden, wobei das Medium 20% Serum, entweder 10% fötales Kälberserum und 10% Pferdeserum oder 20% fötales Kälberserum, enthält. Für höhere Zelldichten wird die Perfusionsgeschwindigkeit proportional erhöht, um einen konstanten Serumstrom pro Zelle pro Zeit zu erreichen. Wenn die Zellen also bei 5 · 10&sup8; Zellen/ml kultiviert werden, beträgt die Perfusionsgeschwindigkeit 0,1 ml/ml Reaktorvolumen pro Minute.
Diese Strömungsraten, mit denen Serum- und Medienstromgeschwindigkeit an die Zelldichte angepaßt werden, sind wesentlich, um die endogene Produktion hämatopoetischer Wachstumsfaktoren bei den optionalen normalen humanen Stromazellen des Knochenmarks in der Kultur zu stimulieren. Die durch diese Serum- und Medienstromgeschwindigkeiten induzierten hämatopoetischen Wachstumsfaktoren umfassen GM-CSF und können auch Kit- Ligand, SCF (Stammzellenfaktor), IL-6 und G-CSF sowie andere hämatopoetische Wachstumsfaktoren beinhalten. Diese Geschwindigkeiten werden so in den Bioreaktoren etabliert, daß die Scherspannung, der die Stammzellen und Nachkommenzellen durch die Longitudinal Strömung an ihren Anhaftungsstellen an den Stromazellen ausgesetzt sind, unter etwa 1,0 und 5,0 dyn/cm² liegt.
Zur Züchtung von hämatopoetischen Zellen und Stammzellen können verschiedene Medien eingesetzt werden. Beispielhafte Medien umfassen MEM, IMDM und RPMI, die mit Kombinationen aus 5-20% (V/V) fötalem Kälberserum, 5-20% (V/V) Kälberserum, 5-50% (V/V) Humanserum, 5-50% (V/V) Humanplasma und 5-15% (V/V) Pferdeserum supplementiert sein können, und/oder serumfreie Medien, die mit PDGF, EGF, FGF, HGF oder anderen Wachstumsfaktoren supplementiert sind, um Stromazellen oder Stammzellen zu stimulieren. Um die Wachstumsfaktoren zu supplementieren, die von den transformierten Fibroblasten geliefert werden, können dem Perfusionsmedium weitere Wachstumsfaktoren zugefügt werden, insbesondere wenn dedizierte Zellen einer bestimmten Zellinie gewünscht sind. Zu den Wachstumsfaktoren, die dem Perfusionsmedium entweder durch Sekretion der Stromazellen oder durch Zugabe zugefügt werden können, gehören GM-CSF, G-CSF oder M-CSF, Interleukin 1-7, insbesondere 1, 3, 6 und 7, TGF-α oder β, Erythropoetin usw., insbesondere humane Faktoren. Von besonderem Interesse ist die Anwesenheit von 0,5-20, vorzugsweise 5-10 ng/ml GM-CSF und von 0,5-2, vorzugsweise 1 ng/ml IL-3 sowie von 0,1-2 U/ml Endkon zentration Erythropoetin, von etwa 100-300 ng/ml G-CSF und von etwa 1-100, vorzugsweise etwa 10 ng/ml Stammzellenfaktor (SCF, MGF, auch als Mastzellenfaktor oder Kit-Ligand bezeichnet). In einer Ausführungsform der Erfindung werden ein oder mehrere, vorzugsweise wenigstens zwei der Wachstumsfaktoren durch die Sekretion von transformierten Zellen bereitgestellt, die in einer Menge vorliegen, die ausreicht, um die gewünschte Menge der Wachstumsfaktoren im Perfusionsmedium zu erhalten.
Zweckmäßig ist die Temperatur in dem Reaktor physiologische Temperatur, nämlich 37ºC, obgleich auch niedrigere Temperaturen einschließlich 33ºC aber üblicherweise nicht unter 25ºC angewandt werden können. Die Feuchte liegt im allgemeinen bei etwa 100%, wobei das Sauerstoffhaltige Gas, z. B. Luft oder ein Gas, das 1- 5% (V/V), vorzugsweise 5-20% (V/V) O&sub2; enthält, etwa 5% (V/V) Kohlendioxid enthält. Das Perfusionsmedium kann außerhalb des Reaktors oder innerhalb des Reaktors oxygeniert werden, wobei für die interne Oxygenierung verschiedene Mittel vorgesehen sind. Die interne Oxygenierung läßt sich mit porösem Sinterglas, Silikonschläuchen oder anderen Membranen geeigneter Porosität und Hydrophobizität erreichen. Die Nährstoffmenge und die Menge an Stoffwechselprodukten wird üblicherweise in einem relativ engen Bereich gehalten. Die Glucosemengen liegen üblicherweise im Bereich von etwa 5 bis 20 mM, üblicherweise von etwa 10 bis 20 mM. Die Lactatkonzentration wird üblicherweise unter etwa 35 mM gehalten und darf über 20 mM liegen. Die Glutaminkonzentration wird im allgemeinen im Bereich von etwa 1 bis 3 mM, üblicherweise von 1,5 bis 2,5 mM gehalten, während die Ammoniakkonzentration üblicherweise unter etwa 2,5 mM, vorzugsweise unter etwa 2,0 mM gehalten wird.
Der Fluidstrom erfolgt mit Hilfe der Schwerkraft, einer Pumpe oder durch andere Mittel, wobei der Strom abhängig von der Natur des Innenaufbaus des Reaktors in irgendeine Richtung oder in zahlreiche Richtungen gehen kann.
Zweckmäßig wird eine Laminarströmung angewandt, wenn der Strom im wesentlichen horizontal durch den Reaktor läuft, oder es kommt eine Vertikal Strömung zur Anwendung, wenn der Strom im Reaktor von unten nach oben oder umgekehrt fließt.
Wenn anzunehmen ist, daß die Quelle für die humanen hämatopoetischen Zellen neoplastische Zellen enthält, z. B. leukämische Lymphome oder Karzinome, kann die Perfusionsströmung so gewählt werden, daß die normalen Nachkommenzellen von den neoplastischen hämatopoetischen Zellen abgesondert werden. Es wurde gefunden, daß normale hämatopoetische Nachkommenzellen mit einer Affinität an Stroma und Matrixproteine adhärieren, die einer Spannung durch longitudinale Fluidströmung von etwa 1,5-2,0 dyn/cm² standhalten kann. Im Gegensatz dazu besitzen neoplastische Zellen und ihre Nachkommenschaft eine deutlich schwächere Stromaaffinität, die im Bereich von etwa 0,05-1,2 dyn/cm² liegt. Indem man für eine Geschwindigkeit der Perfusionsströmung sorgt, die Scherspannungsraten liefert, die intermediär zwischen denjenigen liegt, die von normalen und von neoplastischen Nachkommenzellen toleriert werden, im allgemeinen größer 1 dyn/cm², kann man erreichen, daß die neoplastischen Nachkommenzellen von den normalen Nachkommenzellen abgetrennt werden, wobei die Perfusion im allgemeinen über wenigstens etwa zwei Tage, vorzugsweise wenigstens etwa fünf Tage und besonders bevorzugt sieben oder mehr Tage, beibehalten wird.
Auf diese Weise kann man normale hämatopoetische Zellen eines menschlichen Patienten expandieren und gleichzeitig unter Anwendung geeigneter Strömungsgeschwindigkeiten neoplastische Zellen abtrennen. Auf diese Weise kann man autologe hämatopoetische Zellen aus einem Patienten gewinnen, der an Neoplasie leidet, die normalen hämatopoetischen Zellen während einer Behandlungsperiode des Patienten mittels Chemotherapie oder Röntgenbestrahlung expandieren und dann die normalen hämatopoetischen Zellen des Patienten erneuern, um die Hämatopoese und das Immunsystem des Patienten wieder instand zu setzen.
Beispielhaft für die Verwendung der Scherspannung zur Abtrennung hämatopoetischer Tumorzellen von normalen hämatopoetischen Zellen ist die Situation bei chronischer myelogener Leukämie (CML). Die Scherspannungstoleranz für CML-Zellen liegt im Bereich von 0,05-1,2 dyn/cm². Dieser Unterschied erlaubt eine effiziente Entfernung von CML-Zellen aus einer individuellen Knochenmarksprobe. Durch eine Scherspannung von etwa 1,2-1,5 dyn/cm, vorzugsweise 1,3 dyn/cm², lassen sich CML-Zellen effizient abtrennen.
Die Scherspannungstoleranz bei Knochenmarkszellen eines Individuums läßt sich mit einer spitz zulaufenden Radialströmungskammer bestimmen. In der Radialströmungskammer nimmt die Scherspannung, der die Zelle ausgesetzt ist, mit dem Abstand "d" vom Anfang der Kammer als Funktion von 1/d ab. Zellbanden können dann hinsichtlich ihrer Zellpopulation und der für die gewünschte Zellpopulation festgestellten beizubehaltenden Scherspannung analysiert werden. Zur Entfernung von leukämischen Stammzellen werden Nachkommenzellen und Stammzellen aus Knochenmarksproben von Patienten mit Leukämie als erstes in eine Radialströmungskammer gegeben.
Die Radialströmungskammer besteht aus zwei parallelen Platten aus Polycarbonat oder Glas, die die Adhäsion von Stromazellen des Knochenmarks an die tiefer gelegenen Platten erlauben. Die Messungen zu Beginn können durchgeführt werden, indem man entweder (1) vor der Infusion der hämatopoetischen Zellen ein vorgebildetes konfluentes Monolayer aus Stromazellen des Knochenmarks etabliert und dann nach 12-24 Stunden einen Fluidstrom initiiert, oder indem man (2) das Knochenmark des Patienten ohne Verwendung eines vorgebildeten Stroma- Monolayers direkt in die Strömungskammer inokuliert und dann 3-4 Tage wartet, bevor man den Fluidstrom, üblicherweise 0,05-1,0 cc/min. etabliert. Die genaue Strömungsgeschwindigkeit für das Erreichen einer gewünschten Scherspannung hängt vom Abstand der parallelen Platten ab.
Die Platten sind an den Kanten durch eine Gummidichtung abgedichtet und werden durch Stellschrauben zusammengehalten. Am engen Ende, dem Infusionsende der Kammer bringt ein Schlauch Fluid aus einem Reservoir in die Kammer, das durch eine Pumpe mit konstantem Druck (z. B. vom Spritzentyp) zugeführt wird. Am weiten Ende, dem Ende zum Sammeln, werden das Fluid und die abgetrennten Zellen durch einen separaten Schlauch gesammelt (siehe die Fig. 3a und 3b). Nach der Perfusion (üblicherweise 3-7 Tage) werden die nicht adhärenten Zellen entfernt und die Platten werden getrennt, Zellen von jedem der 3-5 Bereiche werden mittels Aufsaugen und Gummiwischer separat entfernt, und jede Fraktion wird mit Hilfe von Standardverfahren (üblicherweise Karyotypanalyse durch Chromosomenbänderung) auf das Vorhandensein leukämischer Zellen untersucht. Ein Vergleich der leukämischen Analysen jeder Fraktion zeigt, in welcher Fraktion (d. h. bei welcher Scherspannung) die leukämischen Zellen nicht mehr an das Stroma adhärieren und abgetrennt werden. In diesen Kammern nimmt die Scherspannung, die die Zellen fühlen, exponentiell als Funktion des Abstands vom Einlaß ab. (Siehe Fig. 3c.) Üblicherweise sind die nicht adhärenten Zellen alle oder fast alle leukämisch, während die Zellen, die in der engsten Hälfte der Kammer adhärieren, alle oder fast alle normal sind.
Andere Zellen als diejenigen des hämatopoetischen Systems lassen sich ebenfalls mit Hilfe der differentiellen Toleranz gegenüber der Scherspannung auftrennen. Wenn es also in einer komplexen Mischung aus Zellen verschiedene Subpopulationen von Zellen gibt, können die oben beschriebenen Verfahren dazu verwendet werden, um einen interessierenden Zelltyp aus einer hiervon abstammenden Zellsuspension auszusondern, z. B. Haut, Leber, Muskel, Nerven oder Endothel. Von besonderem Interesse ist die Abtrennung von Tumorzellen aus einer Population normaler Zellen. Die aufzutrennende Zellpopulation wird, wie unten beschrieben, mit einem geeigneten Stromasubstrat, beispielsweise einem gereinigten Protein oder einer gereinigten Zellkomponente, an das oder an die die interessierenden Zellen adhärieren, in Kontakt gebracht. Die Scherspannungstoleranz wird, wie oben beschrieben, für jede adhärente Subpopulationen bestimmt. Der Fluidstrom wird dann zweckmäßig so eingestellt, daß die gewünschte Subpopulation von Zellen am Stroma festgehalten wird. Die gewünschten Zellen werden dann wie oben beschrieben gesammelt.
In dem Reaktor können zahlreiche verschiedene Packungen verwendet werden, um für ein adhärentes Wachstum der Zellen zu sorgen, wobei eine gewisse physische Trennung zwischen den Stromazellen und den hämatopoetischen Zellen beibehalten wird und wobei ein gewisser Kontakt zwischen oder ein enges Nebeneinander von Stromazellen und hämatopoetischen Zellen erlaubt wird. Auf diese Weise können die von den Stromazellen sekretierten Faktoren leicht von den hämatopoetischen Zellen aufgenommen werden, so daß ihre Proliferation und, falls zweckmäßig, ihre Differenzierung und Reifung gefördert wird.
Die Proteinmatrix, die die Zellen tragen soll, kann die Form von zerkleinerten Kollagenpartikeln, z. B. Schwämmen oder porösen Kollagenkügelchen, von Schwämmen oder Kügelchen, die aus extrazellulärem Knochenmatrixprotein von Knochenmark bestehen, oder von proteinbeschichteten Membranen annehmen, wobei das Protein Kollagen, Fibronektin, Hämonektin, RGD-basiertes Peptid, gemischtes Knochenmarksmatrixprotein o. ä. sein kann. Die Porengrößen der Membranen liegen im allgemeinen im Bereich von etwa 1 bis 5 u, um eine Wechselwirkung zwischen den verschiedenen Zelltypen zuzulassen und dennoch eine physische Trennung beizubehalten.
Es können Membranen eingesetzt werden, die proteinbeschichtet sind. Es können verschiedenartige Membranmaterialien eingesetzt werden, beispielsweise Polypropylen, Polyethylen, Polycarbonat, Polysulfonat etc. Es können verschiedenartige Proteine eingesetzt werden, insbesondere Kollagen und andere Proteine, die bereits früher aufgeführt wurden. Die Poren der Membran sollten klein genug sein, damit die transformierten Zellen nicht durch die Membranen wandern, aber auf einer Seite der Membran wachsen und eine konfluente Schicht bilden und Teile der Zellmembran in die Poren erstrecken können. Im allgemeinen liegt die Porengröße im Bereich von etwa 1 bis 5 u. Auf diese Weise können die hämtopoetischen Zellen auf der gegenüberliegenden Seite der Membran wachsen und mit den transformierten Zellen in Wechselwirkung treten, wodurch Faktoren direkt von den transformierten Zellen zu den hämatopoetischen Nachkommenzellen transportiert werden können. Die Nachkommenzellen und die Stammzellen sind in der Lage, sich an die in die Poren eingedrungenen zytoplasmatischen Projektionen anzuheften. Die hämatopoetische Differenzierung der Stammzellen erfolgt auf der einen Seite der Membran, und die - differenzierte Nachkommenschaft ist nicht in der Lage, sich durch die Poren zurück zu quetschen, die bereits zum größten Teil durch die Schicht aus Stromazellen besetzt sind, sobald sie sich der Konfluenz nähern oder diese erreichen (d. h. durch zytoplasmatische Projektionen der Fibroblasten). Wenn hämatopoetische Zellen reifen und differenzieren, werden sie von der Membran und in das Nährmedium freigesetzt.
Der Transfer der hämatopoetischen Zellen läßt sich durch geeignete Strömungsgeschwindigkeiten oder durch andere passende Maßnahmen erreichen. Man kann verschiedene Vertiefungen in der Kammer vorsehen, die durch geeignete Wände getrennt sind, und nach Ansäen einer Vertiefung werden die Zellen, wenn die Zellen konfluent geworden sind, in die nächste Vertiefung wandern und die nächste Vertiefung subkonfluent ansäen. Eine weitere Modifikation des Systems besteht darin, daß die hämatopoetischen Zellen nach 8-12 Tagen in Kultur den nun proliferierenden Stromazellen ausgesetzt werden. Dies erfolgt auf einem von mehreren möglichen Wegen. Die Exposition gegenüber Stromazellen erfolgt auf einem von mehreren möglichen Wegen.
Nach der ersten Methode wird die Kultur in verschiedener Weise 3-5 Minuten mit EDTA behandelt, welches die hämatopoetischen Zellen von den Stromazellen löst. Die abgelösten Zellen werden dann in ein neues Kulturgefäß transferiert, das selbst Stromazellen von Knochenmark enthalten kann, die 3-7 Tage zuvor ausgesät wurden. Dieser Prozeß wird alle 8-12 Tage wiederholt. Ein alternativer Ansatz besteht darin, noch mehr Oberfläche bereitzustellen, indem man das Volumen der Kulturen vergrößert und nach 8-12 Tagen zusätzliche Kollagenkügelchen in die Kulturen gibt. Schließlich können den Kulturen alle 3-7 Tage kleine organische Moleküle oder Proteine, insbesondere Hormone, zugegeben werden, beispielsweise Thrombozyten-Wachstumsfaktor (100-500 ng/ml), Interleukin 1-α, Tumornekrosefaktor-α oder basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor oder andere für Fibroblasten mitogene Moleküle. Die Exposition gegenüber mitogenen stimulatorischen Stromafaktoren fördert die kontinuierliche Proliferation von Stromazellen des Knochenmarks und ihre kontinuierliche Produktion hämatopoetischer Wachstumsfaktoren. So läßt sich also für den kontinuierlichen subkonfluenten Zustand der Stromazellen sorgen.
Ein kontinuierlicher Fluidstrom kann auch dazu verwendet werden, normale Zellen selektiv von Krebszellen in einer Knochenmarkspopulation abzutrennen. Bei diesem Ansatz wird zuerst eine Radialströmungskammer verwendet, um die spezifischen Stroma-Adhäsionseigenschaften von normalen Zellen gegenüber Krebszellen zu bestimmen, und dann wird, um die normalen Zellen und die Krebszellen präoperativ zu trennen, eine rechtwinklige Strömungskammer mit Strömungsgeschwindigkeiten verwendet, die so angepaßt sind, daß eine Scherspannung erreicht wird, die ausreicht, um die Krebszellen abzutragen.
Das vorliegende Verfahren und die vorliegende Vorrichtung sehen auch die Möglichkeit vor. Stammzellen, die durch den Strom des Perfusionsmediums verloren gegangen sind, im Kreislauf zurückzuführen. Der Membranoberflächenproteinmarker CD34 trennt unreife hämatopoetische Zellen im wesentlichen von reifen hämatopoetischen Zellen ab. Indem man solche Zellen, die CD34&spplus; sind, wegfängt und zurückführt, läßt sich also der Verlust von Stammzellen an das Medium vermeiden.
Zum Wegfangen und Rückführen der unreifen Zellfraktion in den Reaktor lassen sich verschiedene Verfahren verwenden. Beispielsweise könnte man die Zellen mit einem Antikörper markieren, der für CD34 spezifisch ist, und dann Antikörper gegen diesen Antikörper einsetzen, um die CD34&spplus;-Zellen zu sammeln und in den Reaktor zurückzuführen. Alternativ zur positiven Selektion könnte man eine negative Selektion durchführen, wobei man die reifen Zellen entfernen würde, indem man Antikörper gegen verschiedene, mit reifen Zellen assoziierte Marker einsetzt, beispielsweise Antikörper gegen Glycophorin A, CD33, M01, OKT3, OKT4, OKT8, OKT11, OKT16, OKM1, OKM5, Leu7, Leu9, Leu M1, Leu M3 usw. Für Marker, die für reife Zellen der verschiedenen hämatopoetische Zellinien, lymphoid, myeloid und erythroid, spezifisch sind, stehen verschiedene Antikörper zur Verfügung, und diese Antikörper können dazu verwendet werden, um reife Zellen aus dem Medium, das aus dem Reaktor strömt, zu entfernen, gefolgt vom Ernten der verbleibenden Zellen und deren erneuter Etablierung im Reaktor. Auf diese Weise läßt sich die zwangsläufige Abnahme in den Kulturen aufgrund des Verlustes von Stammzellen vermeiden und ein unbegrenztes Überleben der Stammzellen in vitro gewährleisten.
Die Auftrennung mit Antikörpermarkern läßt sich auf verschiedene Weise erreichen, wobei Standardverfahren, einzeln oder in Kombination, eingesetzt werden, beispielsweise 'Panning', fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung, Antikörper, die an verschiedene Oberflächen, z. B. Polystyroloberflächen, metallische Mikrokügelchen und Magnete usw., gebunden sind. Die Antikörper werden an eine Oberfläche gebunden, die eine Trennung zwischen adhärenten und nicht adhärenten Zellen zuläßt, oder die Antikörper werden markiert, direkt oder indirekt, was eine Selektion zwischen markierten und unmarkierten Zellen erlaubt.
Indem man sich an die vorliegenden Verfahrensvorschriften hält, läßt sich eine deutlich verlängerte Wachstumsdauer von hämatopoetischen Zellen in vitro erreichen, die im allgemeinen ex vivo in Kultur eine humane Hämatopoese über wenigstens sechs Monate liefert, wobei Granulopoese über wenigstens vier Monate und Erythropoese über wenigstens drei Monate unterstützt werden. Zusätzlich werden über den gesamten Kulturverlauf kontinuierliche hämatopoetische Nachkommenzellen erzeugt, was zu einer Netto-Expansion von Nachkommenzellen führt, die mehr als das 10-fache der eingesetzten Zellen beträgt.
Indem man sich an die vorliegenden Verfahrensvorschriften hält, wird auch eine erhöhte Zellteilungsrate der Stammzellen gefördert, was eine effiziente Insertion von retroviral transfiziertem genetischen Material erlaubt. Gene, die mit Hilfe des passenden retroviralen Vektors während einer anfänglichen zweiwöchigen Infektionsdauer inseriert wurden, können in bis zu 10-30% aller Nachkommen- und Vorläuferzellen, die während der anschließenden Kultivierung über vier Monate in Kultur entstehen, exprimiert werden. Die vorliegenden Verfahren fördern also den erfolgreichen Transfer von genetischem Material in eine hochproliferative humane hämatopoetische Stammzelle.
In den Figuren bedeuten gleichartige Bezugszeichen in den verschiedenen Ansichten identische oder einander entsprechende Teile. Hierbei ist Fig. 1 eine schematische Ansicht einer Perfusionskammer. Reaktor 10 mit Deckplatte 12 und Bodenplatte 14 wird durch Schrauben 16 zusammengehalten, die durch Flügelmuttern 18 in Position gehalten werden. Um ein Verziehen zu vermeiden, werden drei Schrauben verwendet.
Die Kammer 20 weist drei Zonen auf, wobei die mittlere Zone 22 die Trägermatrix für die Stromazellen, das Bett aus Stromazellen und die Knochenmarkszellen enthält. Die zentrale Zone 22 ist von der oberen Zone 24 und der unteren Zone 26 durch Membranen oder Siebmaschen 28 bzw. 30 getrennt. Zweckmäßig kann eine Polysulfonmembran oder ein Edelstahlsieb eingesetzt werden, dessen Maschengröße klein genug ist, um Zellen in der mittleren Zone der Kammer zurückzuhalten. Die trennende Grenzfläche kann mit Hilfe des inneren Zylinders 27 in die Kammer eingebaut werden, der unterteilt ist, um mechanische Unterstützung für die Trennmembran zu bieten. Die obere Zone 24 und die untere Zone 26 müssen nicht gleich sein und weisen Schlauchleitungen oder Membranen auf, durch die flüssiges Medium und Gase ausgetauscht werden. Die Gase werden durch einen hydrophoben Schlauch, z. B. Aus Silikon, ausgetauscht, dessen Länge (und damit Gas/Flüssig- Kontaktfläche) variiert werden kann, um ausreichend Gasstrom zuzulassen, damit dem Bedarf der in der mittleren Zone metabolisierenden Zellpopulation nachgekommen wird. Die Medien können durch Öffnung 32 direkt aus der oberen oder unteren Zone abgepumpt oder abgezogen werden und durch Zuleitungsschlauch 34 zugefüttert werden.
Falls gewünscht, können die obere und untere Zone bei Verwendung eines externen Oxygenierapparats weggelassen werden. In dieser Situation wird die Trennmembran unter dem Glaszylinder 36 in Position gehalten, der in die zylindrisch vertieften Platten 12 und 14 paßt, und die Fläche innerhalb der zylindrischen Vertiefung soll für gute Strömungsverteilung durch die Membran sorgen. Diese Geometrie erlaubt es, daß sich das Fluid aus der begrenzten Zahl von Einlaßöffnungen vermischt und sich für den Radialdruck ein Gleichgewicht einstellt, was zu einem uniformen Flüssigkeitsstrom durch die Trennmembran führt. Dieser Aufbau eignet sich für Kammern mit relativ wenig Zellen, so daß die Oxygenierung nicht limitierend wird.
In Fig. 2 ist eine schematische Darstellung des Regelkreises gezeigt, der die Perfusionskammer mit dem seitlichen Medienreservoir, dem Oxygenator, der Sensorkammer und den Proben-/Einspritzöffnungen verbindet.
Eine externe Frischmedium-Quelle 50 wird mittels Pumpe 52 durch Leitung 56 in ein Medienreservoir gepumpt, und verbrauchtes Medium wird mittels Pumpe 52 durch Leitung 58 aus Reservoir 54 zur Weiterverarbeitung in den Behälter 60 für verbrauchtes Medium abgeführt. Eine zweite Pumpe 62 pumpt Medium aus dem Medienreservoir 54 durch Leitung 64 durch einen Hohlfaseroxygenator 66. Das Medium wird durch Leitung 68 in die erste Kammer von Bioreaktor 70 geleitet. Falls zweckmäßig, wird ein Mittel zum Einspritzen von Medienkomponente 82 bereitgestellt, um die Komponente zum Transport durch das Medium in die erste Kammer von Bioreaktor 70 in Leitung 68 einzuspeisen. Bei der Komponente kann es sich um Testkomponenten, zusätzliche Faktoren o. ä. handeln. Das Medium aus Bioreaktor 70 wird durch die mittlere Kammer 72 in die zweite Kammer 74 des Bioreaktors geleitet. Von dort wird das Medium durch Leitung 76 zu den in Reihe liegenden Sensoren 78 geleitet, um die Veränderungen in der Medienzusammensetzung festzustellen.
Beispielsweise ist es wünschenswert, daß das Verhältnis von Glutamin : Glucose (Gew./Gew.), abhängig von den verwendeten Zellinien, im Bereich von etwa 1: 5-8 liegt;
beispielsweise bevorzugt 1 : 8 für transfizierte 3T3- Zellen. Außerdem liegt die Ammoniumkonzentration vorzugsweise unter etwa 2,0 mM und die Lactatkonzentration beträgt vorzugsweise weniger als 35 mM. Durch Überwachen des aus dem Reaktor ausströmenden Mediums kann das in den Bioreaktor eingebrachte Medium modifiziert werden, der Sauerstoffpartialdruck kann verändert werden, die Gasstromgeschwindigkeit kann geändert werden, verschiedene Komponenten können vermehrt werden oder die Perfusionsgeschwindigkeit kann erniedrigt oder erhöht werden. Von den Sensoren 78 wird das Medium mittels Pumpe 62 durch Leitung 80 in Reservoir 54 geleitet.
Über den oben beschriebenen Fließweg wird das Medium im seitlichen Reservoir mit Hilfe einer separaten Pumpe langsam ausgetauscht. Diese Organisation erlaubt eine getrennte Regelung der Medienaustauschgeschwindigkeit (der äußeren Pumpe) und der Durchströmgeschwindigkeit durch den Oxygenator und die Perfusionskammer. Erstere wird eingesetzt, um die längerfristige Änderung in der Medienzusammensetzung und die Perfusion zu regeln, während letztere eingesetzt werden kann, um das Potential des gelösten Sauerstoffs und die Strömungsmuster in der Kammer zu regeln. Die Verwendung einer engmaschigen biokompatiblen Membran erlaubt eine Pfropfen- oder Kolbenströmung in der Kammer und erlaubt somit die genaue Steuerung der Zufuhr von Wachstumsfaktoren und von anderen speziellen Verbindungen, die man in sehr genauen Mengen in die hämatopoetischen Zellen und die Stromazellen einschleusen möchte.
Nach Autoklavieren der Kammer und der Komponenten des Regelkreies wird der Reaktor in einer sterilen Umgebung zusammengebaut. Das Medium kann einige Tage im Kreis durch den seitlichen Regelkreis und die Kammer geführt werden, wobei auf Zeichen von Verunreinigungen überprüft wird. Wenn ein steriler Zusammenbau erfolgt ist, wird die mittlere Zone der Kammer entweder mit der extrazellulären Matrix allein oder mit einem zuvor inokulierten Träger für die extrazelluläre Matrix, der die Stromazellen enthält, inokuliert. Die Stromazellen werden dann entweder: (1) über einige Tage in der Kammer gehalten, wobei ihre Stoffwechselleistung und/oder ihr Ansprechen auf Wachstumsfaktoren überwacht wird, und wenn die Ergebnisse zufriedenstellend sind, wird das Knochenmark inokuliert; oder (2) unmittelbar mit Knochenmark angesät.
In beiden Fällen wird die Zellschicht am Boden der mittleren Zone der Perfusionskammer gehalten. Die Zellen legen zusätzliche extrazelluläre Matrix ab und die Zellschicht adhäriert an die Trennmembran. Zu diesem Zeitpunkt kann die Kammer umgedreht werden und die Zellschicht kann sich dann an der Decke der mittleren Zone befinden. Bei dieser Anordnung setzen sich die reifenden Zellen am Boden der mittleren Zone ab, da sie ihre Adhäsionsfähigkeit an die Stromaschicht verlieren. Dieses Charakteristikum ist wichtig, um Schädigungen zu verhindern, die reife Zellen an der Stromaschicht und/oder an weniger reifen hämatopoetischen Zellen verursachen. Dieses Charakteristikum erleichtert auch das kontinuierliche Abtragen reifer Zellen.
Diese Zellen werden geerntet, indem die Zellen mittels einer Spritze entnommen werden oder indem man die Zellen, durch den Druck des perfundierten Mediums, kontinuierlich durch die Austrittsschlauchleitung aus der Kammer strömen läßt.
Die Stromazellen sind größtenteils Fibroblasten, die mit ein oder mehr Genen transformiert sind, die die gewünschten hämatopoetischen Wachstumsfaktoren liefern.
Es können die gleichen oder verschiedene Zellen mit den Genen transfiziert werden, abhängig von der jeweiligen Wahl der Wirtszellen können die gleichen oder verschiedene Zellen für eine Vielzahl von Genen verwendet werden.
Es können zahlreiche verschiedene normale Zellen oder stabile Linien eingesetzt werden. Es wurde jedoch gefunden, daß nicht alle Zellstämme zulässig sind, da die Transformation einiger Zellinien zu einem Überwachstum der Zellen führen kann. Zweckmäßig sind die eingesetzten Zellen nicht neoplastisch, sondern benötigen die Adhäsion an einen Träger. Bei den Säugerzellen muß es sich nicht um Humanzellen und nicht einmal um Primatenzellen handeln. Ebenso kann die adhärente Zellschicht auch eine Vielzahl nicht-transformierter Zellen beinhalten, einschließlich normaler humaner adhärenter Knochenmarkszellen, normaler humaner adhärenter Milzzellen und normalen Thymusepithels.
Verfahren zum Transformieren von Säugerzellen, einschließlich Fibroblasten, sind allgemein bekannt, und es gibt umfangreiche Literatur, von der zuvor lediglich ein paar wenige Fundstellen angegeben wurden. Die Konstrukte können die natürlich vorkommende regulatorische Initiationsregion für die Transkription verwenden, die den Promotor und, falls zweckmäßig, den Enhancer umfaßt, oder es kann eine andere transkriptionelle Initiationsregion beteiligt sein, die induzierbar oder konstitutiv ist.
Es steht eine große Zahl von Initiationsregionen für die Transkription zur Verfügung, die induzierbar oder konstitutiv sind und mit einem natürlich vorkommenden Enhancer assoziiert sein können, oder es kann ein Enhancer vorgesehen sein, nur in einem bestimmten Zelltyp induziert werden, oder in einer Vielzahl oder in allen Zelltypen funktionsfähig sein. Die Initiationsregion für die Transkription kann aus einem Virus oder einem natürlich vorkommenden Gen stammen, kann synthetisch sein oder eine Kombination von all diesem darstellen.
Promotoren, die verfügbar sind und Anwendung gefunden haben umfassen die chromosomalen Promotoren, beispielsweise die Metallothionein I- und II-Promotoren von Maus und Mensch, den Actinpromotor etc., oder virale Promotoren, beispielsweise die SV40-Promotoren der frühen Gene, den CMV-Promoter, Adenovirus-Promotoren, Promotoren, die mit den LTRs von Retroviren assoziiert sind etc. Diese Promotoren stehen zur Verfügung und lassen sich leicht in geeignete Vektoren inserieren, die Polylinker zur Insertion der Initiationsregion für die Transkription sowie der interessierenden Gene umfassen. Für andere Fälle stehen Expressionsvektoren zur Verfügung, die einen Polylinker zwischen einer Initiationsregion für die Transkription und einer Terminationsregion für die Transkription bieten, wobei auch für die verschiedenen Signale im Zusammenhang mit der Prozessierung des Messengers für die Translation gesorgt wird, d. h. die Cap-Site und das Polyadenylierungssignal. Die Konstruktion der Expressionskassette, die die regulatorischen Regionen und das Strukturgen umfaßt, kann mit Hilfe von ein oder mehreren Restriktionsenzymen, Adaptern, Polylinkern, durch in vitro-Mutagenese, Auffüllen von Primern ('Primer-Repair'), Ausschneiden o. ä. erfolgen.
Die Expressionskassette ist gewöhnlich Teil eines Vektors, der einen Marker und ein oder mehr Replikationssysteme beinhaltet. Der Marker erlaubt den Nachweis und/oder die Selektion von Zellen, in die die Expressionskassette und der Marker eingebaut wurden. Es können verschiedene Marker eingesetzt werden, insbesondere Marker, die Resistenz gegen ein Toxin, insbesondere ein Antibiotikum, vermitteln. Bevorzugt wird eine Neomycin-Resistenz verwendet, die einem Säugerzellenwirt Resistenz gegen G418 verleiht. Die Replikationssysteme können ein prokaryontisches Replikationssystem umfassen, das eine Klonierung während der verschiedenen Schritte erlaubt, bei denen die einzelnen Komponenten der Expressionskassette zusammengebaut werden. Das andere Replikationssystem kann dazu verwendet werden, ein episomales Element in der Wirtszelle zu halten, obgleich das Replikationssystem in den meisten Fällen so gewählt werden wird, daß es die Integration der Expressionskassette in ein Chromosom des Wirts erlaubt.
Zum Einbringen der Expressionskassette in den Wirt kann jede üblicherweise eingesetzte Methode verwendet werden, einschließlich Transformation mit Caicium-präzipitierter DNA, Transfektion, Infektion, Elektroporation, ballistischer Teilchen o. ä. Sobald die Wirtszellen transformiert sind, können sie in einem geeigneten Nährmedium mit einem Selektionsmittel amplifiziert werden, um diejenigen Zellen zu selektionieren, die den Marker enthalten. Überlebende Zellen können dann amplifiziert und eingesetzt werden.
Witszellen, die eingesetzt werden können umfassen die Zellinie CV1 der afrikanischen grünen Meerkatze, NIH-3T3- Mauszellen, normale humane Knochenmarksfibroblasten und normale Milzfibroblasten aus Mäusen. Es ist zu beachten, daß die Zellen in manchen Fällen, abhängig von der Wahl des Vektors und der Zellinie, neoplastisch werden können. Es ist wichtig, daß die resultierenden transformierten Zellen zur Adhäsion in der Lage sind, wodurch die transformierten Zellen an einem Träger, beispielsweise Proteinschwämme, proteinbeschichtete Membranen o. ä., gebunden bleiben.
Wenn der Vektor zur Expression des geeigneten Wachstumsfaktors konstruiert worden ist, kann er mit Hilfe beliebiger geeigneter Methoden zur Transformation von Zellen verwendet werden. Die resultierenden transformierten Zellen können dann zum Ansäen der bereits beschriebenen Träger verwendet werden. Diese Träger können in den Reaktor eingebracht werden oder können sich zum Zeitpunkt des Ansäens im Reaktor befinden. Man läßt die Zellen ausreichend lang wachsen, um sicherzustellen, daß die Zellen lebensfähig sind und in der Lage sind, die gewünschten Wachstumsfaktoren zu produzieren.
Der Reaktor kann dann in zweckmäßiger Weise mit den hämatopoetischen Zellen angesät werden. Bei den hämatopoetischen Zellen kann es sich um im wesentlichen reine Stammzellen, um eine Mischung hämatopoetischer Zellen ein oder mehrerer Zellinien, die im wesentlichen frei von reifen Zellen ist, oder um eine Mischung handeln, die alle oder im wesentlichen alle verschiedenen Zellinien des hämatopoetischen Systems in ihren verschiedenen Reifestadien umfaßt.
Man läßt die Zellen unter im wesentlichen kontinuierlicher Perfusion durch den Reaktor wachsen, wobei man die verschiedenen beteiligten Nährstoffe und Faktoren überwacht. Zum größten Teil werden die primären Faktoren von den Stromazellen geliefert, so daß man gewöhnlich zu einer Gleichgewichtskonzentration der Wachstumsfaktoren kommt. Da gefunden wurde, daß konditionierte Überstände beim Wachstum der hämatopoetischen Zellen wirksam sind, kann man ein Verhältnis von Stromazellen zu hämatopoetischen Zellen vorsehen, bei dem der Wachstumsfaktor im Reaktor auf einer geeigneten Konzentration gehalten wird.
Transfizierte Stromazellen können zum Einschleusen von Genen in humane Stammzellen dienen. Bei Mäusen wird der retroviral vermittelte Gentransfer in Stammzellen ermöglicht, indem man die Mäuse mit 5-FU vorbehandelt und dann die geernteten Knochenmarkszellen in konditioniertem WEHI-Medium, das IL-3 und GM-CSF enthält, wachsen läßt (Lemischka, Cell (1986) 4: 917). Das künstliche Stroma, gezüchtet mit einer retroviralen Huckepack-Zellinie, die den interessierenden retroviralen Vektor sekretiert, kann dazu verwendet werden, um Gene effizient in humane Stammzellen einzuschleusen. Beispielsweise könnten humane T-Zellen gegen HIV-Infektionen resistent gemacht werden, indem Stammzellen mit dem retroviralen Vektor, der eine HIV-Antisense-Sequenz unter der Kontrolle einer regulatorischen CDC&sub2;-Sequenz enthält (Greaves, Cell, (1989) 56: 979-986), infiziert werden, was eine gewebespezifische Expression in T-Zellen erlauben würde. Von der retroviralen Huckepack-Zellinie würde ein Faktor geliefert, der für die Replikation des Retrovirus essentiell ist; dieser Faktor wäre in der hämatopoetischen Target-Zelle nicht vorhanden. Sobald das Virus in die hämatopoetische Target-Zelle transferiert wird, wäre es nicht mehr zur Replikation in der Lage.
In den Fig. 3a und b ist die Radialströmungskammer 100 mit Einlaß 102 und Auslaß 104 und mit Kammer 106 dargestellt, wobei die Pfeile 108 die Strömungsrichtung angeben. Auf einer Stromaschicht 112 in der Kammer werden hämatopoetische Zellen angesät und wachsen gelassen. Die Strömungsgeschwindigkeit bestimmt, welche Zellen adhärieren können, wobei nicht adhärente Zellen 114 durch den Auslaß 104 ausströmen. In den Fig. 4a und 4b wird die Wachstumskammer 120 mit Einlaß 122 und Auslaß 124 gezeigt. In Fig. 4b umfaßt Einlaß 122 ein Verteilerstück 128, das einzelne Kammern 126 speist, die Zellen 110 und Stroma 112 für Wachstum und Auftrennung enthalten.

I. Der Bioreaktor

Die oben aufgezählten Spezifikationen für den (hämatopoetischen) Bioreaktor lassen sich in verschiedener Weise verkörpern. Drei hier beschriebene bevorzugte Ausführungsformen sind: (1) ein (hämatopoetischer) Flachbett-Bioreaktor (Fig. 6a-g), (2) ein (hämatopoetischer) Flachbett-Bioreaktor mit einer konischen Zone zur Entnahme von Zellproben und zur Zellernte (Fig. 7a und b), (3) ein geneigter (hämatopoetischer Bioreaktor (Fig. 8a und b) und (4) ein horizontaler oder geneigter Bioreaktor mit einem spitz zulaufenden Strömungsprofil (Fig. 11a-c). Diese vier Ausführungsformen werden nun ausführlicher beschrieben.

I. 1 (Hämatopoetischer) Flachbett-Bioreaktor mit ein oder mehr Oberflächen

Dieser Bioreaktor umfaßt wenigstens zwei maschinell bearbeitete oder geformte flache Teile 600 und 601, die aus Materialien gefertigt sind, die für die kultivierten Zellen nicht toxisch sind, beispielsweise Polycarbonat, Polysulfon, Polystyrol etc., die eine Bioreaktor- Oberseite 600 und eine Bioreaktor-Unterseite 601 bilden oder umgekehrt, und zwischen der Reaktorober- und -unterseite, 600 und 601, zwei Dichtungselemente, 602, die aus jedem beliebigen zur Herstellung von Dichtungselementen geeigneten Material hergestellt werden können, das für die kultivierten Zellen nicht toxisch ist, beispielsweise aus Silikonkautschuk.
Wenn der Bioreaktor, wie in den Fig. 6a-g dargestellt, die verschiedene Ausführungsformen des Bioreaktors zeigen, zusammengebaut ist, wird eine Membran 603 zwischen zwei Dichtungselemente 602 eingebaut, und diese Baueinheit wird dann wiederum zwischen die Bioreaktor- Oberseite 600 und die Bioreaktor-Unterseite 601 eingebaut. Die ganze Baueinheit kann durch beliebige bekannte zweckmäßige Mittel, beispielsweise Klammern oder Schrauben (letztere sind in den Figuren dargestellt) zusammengehalten werden. Löcher 606, durch die die Schrauben eingeführt werden können, sind in den Fig. 6a-e gezeigt, jedoch sind auch andere Schraubenanordnungen möglich. Durch den Zusammenbau wird ein Gehäuse gebildet, das zwei Kammern festlegt, die eine zur Zellkultur 614. die andere eine Gaskammer 615. Die Oberseite des Bioreaktors 600 und die Unterseite des Bioreaktors 601 können eine unterschiedliche Zahl an Öffnungen aufweisen. Beispielsweise ist in den Fig. 6a-g eine Bioreaktor-Unterseite 601 mit zwei Gasöffnungen 607 und 608 gezeigt, eine für den Gaseinlaß und eine für den Gasauslaß, oder umgekehrt, wogegen die Bioreaktor- Oberseite 600 mit drei Öffnungen gezeigt ist: eine Einlaßöffnung 610 für flüssiges Medium und eine Auslaßöffnung 611 für flüssiges Medium, oder umgekehrt, und eine Öffnung 609 zur Entnahme von Zellproben oder zur Zellernte (die mit einem geeigneten Pfropfen (nicht gezeigt) verschlossen werden kann, damit sich eine leckfreie Dichtung ergibt. Auslaßöffnung 611 kann so konstruiert sein, daß relativ zur Ebene der Haupt ober flächen von Oberteil 600 ein Winkel ungleich Null gebildet wird, um ein durch Schwerkraft induziertes Absetzen von nicht adhärenten Zellen zu ermöglichen, die von der Kulturkammer 614 zur Auslaßöffnung 611 treiben.
Die Geometrie des in Fig. 6 dargestellten Lochs in den Dichtungselementen 613 ist kreisförmig, es kann aber auch eine elliptische oder anders geformte Öffnung verwendet werden, wobei die Einlaß- und Auslaßöffnungen im Fokus der Form eingebaut sind, um eine bessere Fluidverteilung zu erreichen (siehe unten). In ähnlicher Weise können andere Geometrien verwendet werden, um die gewünschten Scherspannungsbereiche und die gewünschte Fluidströmungsverteilung zu ermöglichen.
In einer anderen, einfacheren Anordnung wird nur ein Dichtungselement 602 und keine Membran 603 verwendet. In dieser Ausführungsform umfaßt das Gehäuse keine separaten Zellkultur- und Gaskammern, und das über Einlaßöffnung 610 in das Gehäuse gespeiste flüssige Medium ist mit den notwendigen Atmungsgasen für die Zellen beladen.
Anordnung Nr. 1, die in Fig. 6f dargestellt ist, sieht zwei Kompartimente vor; Zellkulturkammer 614 und Gaskammer 615. Eine Doppelmembrananordnung trennt die beiden Kammern (beispielsweise eine keramische Membran für Zellwachstum/Zelladhäsion 605 über einer hydrophoben Gasaustauschmembran 604, beispielsweise einer Silikonmembran). Durch die Zellkulturkammer 614 wird in Verbindung mit Einlaßöffnung 610 für flüssiges Medium und Auslaßöffnung 611 für flüssiges Medium flüssiges Medium perfundiert, während man Gas in Verbindung mit Gaseinlaßöffnung 607 und Gasauslaßöffnung 608 durch die Gaskammer 615 zirkulieren läßt. In Kulturkammer 614 wachsen Zellen 612 oben auf der keramischen Zelladhäsions-/Zellwachstumsmembran 605.
Anordnung Nr. 2, die in Fig. 6g dargestellt ist, ist die umgekehrte Anordnung Nr. 1. Hier wachsen die Zellen 612 an der Oberfläche 625 der Unterseite des Bioreaktors 601 am Boden von Kulturkammer 614. Die Oberfläche 625 ist vorteilhaft auf Zellwachstum/Zelladhäsion abgeteilt. Bei dieser Anordnung wird lediglich eine einzige Gasaustauschmembran 604 und keine Zelladhäsions-/Zellwachstumsmembran 605 benötigt. Bei dieser Anordnung wird, wie bei allen anderen Anordnungen, flüssiges Medium durch Kulturkammer 614 perfundiert und Gas wird durch Gaskammer 615 perfundiert.
Die Schlauchleitung zum Zuführen von Medium und Gasen in den Bioreaktor ist mit der Oberseite des Bioreaktors, 600, und der Unterseite des Bioreaktors, 601, verbunden, wobei beliebige geeignete Verbindungsstücke, wie Polypropylenverbindungen und "Luer-Locks" 0-Silikonringe, eingesetzt werden können, von denen bekannt ist, daß sie gute Dichtungseigenschaften und keine Leckprobleme haben.

I.2 Innen geneigter hämatopoetischer Bioreaktor

Die Fig. 11a, b und c erläutern eine andere Ausführungsform des Bioreaktors der vorliegenden Erfindung. In dieser Ausführungsform ist der Bioreaktor über Mittel zum Drehen 627 drehbar auf einem Gestell 626 angebracht. Bei dieser Ausführungsform werden ein oder mehrere Gaseinlaßöffnungen 607 zusammen mit mehreren Gasauslaßöffnungen 608 verwendet, und eine Vielzahl von Einlaßöffnungen 610 für flüssiges Kulturmedium wird in Verbindung mit einer Vielzahl von Auslaßöffnungen 611 für verbrauchtes flüssiges Kulturmedium verwendet. Bei dieser Ausführungsform wird vorzugsweise ein dreieckiges Gehäuse Anordnung von Gaskammer und Zellkulturkammer eingesetzt, das, wie dargestellt, durch Verwendung von dreieckig in den Dichtungselementen 602 ausgebildeten Öffnungen erzeugt wurde.
Die in den Fig. 11a, b und c erläuterte Form des Bioreaktors eignet sich zum kontinuierlichen Ernten von Zellen aus der Bioreaktorkammer, wobei sich der Bioreaktor entweder in horizontaler oder geneigter Stellung befindet. Wie in der Figur gezeigt, liegen die Ein- und Auslaßöffnungen für das flüssige Kulturmedium auf gegenüberliegenden Seiten der Zellkulturkammer, wobei sich das flüssige Zellkulturmedium im allgemeinen in der Mitte der Zellkulturkammer befindet. In dieser Ausführungsform kann der Bioreaktor drehbar auf einem Gestell angebracht sein, so daß die Neigung des Bioreaktors (und folglich die Neigung des Zellbetts) nach Wunsch eingestellt werden kann. Mit dieser Anordnung können die Auslaßöffnungen 611 für das flüssige Kulturmedium nach oben gekippt werden, was eine effiziente Inokulation mit Zellen und eine effiziente Entfernung von verbrauchtem Medium erlaubt. Anschließend kann der Reaktor vorteilhaft in eine horizontale Stellung gebracht werden, wodurch sich die Zellen auf der Adhäsions-/Wachstumsoberflache 625 für die Adhäsion und das Wachstum der Stromazellen und der frühen Stammzellen und Nachkommenzellen absetzen können.
Bei dieser Anordnung kann flüssiges Zellkulturmedium (kontinuierlich) durch die Zellkulturkammer perfundiert werden, wenn sich der Bioreaktor in horizontaler Stellung befindet. Um nicht adhärente Zelen aus der Bioreaktorkammer zu ernten, kann der Bioreaktor geneigt werden, wobei die Auslaßöffnungen 611 für das flüssige Zellkulturmedium nach oben geneigt sind, so daß in der Zellkulturkammer eine Auftrennung der Zellen auf Dichtebasis erfolgt, was das Ernten spezifischer Zelltypen ermöglicht.
In einer weiteren Ausführungsform kann der Bioreaktor in eine vertikale Orientierung gedreht werden, so daß sich die Einlaßöffnungen 610 für das flüssige Kulturmedium oben befinden und sich die Auslaßöffnungen 611 für das flüssige Kulturmedium unten befinden. Zellkulturmedium mit den nicht adhärenten Stammzellen, den Nachkommen z eilen oder den reifen Zellen, kann dann nach unten fließen und (kontinuierlich) über die Auslaßöffnungen 611 für das flüssige Kulturmedium entfernt werden. Diese Anordnung kann vorteilhaft dazu eingesetzt werden, um reife Zellen, die die Hämatopoese hemmen können, zu entfernen, wodurch produktivere Kulturen entstehen. Umgekehrt kann das flüssige Zellkulturmedium, bei vertikaler Stellung, von den Öffnungen 610 nach 611 fließen, wobei sich die Zellen bei Scheitelpunkt 628 absetzen, welche Zellen zu jedem beliebigen Zeitpunkt aus der Zellkulturkammer entfernt werden können, indem man verbrauchtes flüssiges Zellkulturmedium selektiv über die vom Scheitelpunkt 628 entferntest liegenden Auslaßöffnung(en) bis zu der oder den vom Scheitelpunkt 628 nächst liegenden Auslaßöffnungen abführt.

II. Hilfskomponenten und Gesamtflußschema

Ein Flußschema des Verfahrens eines beispielhaften (hämatopoetischen) Bioreaktor-Expansionssystems ist in Fig. 9 gezeigt, einschließlich der zusätzlichen Komponenten, die für den Betrieb notwendig sind.
Flüssiges Medium 900, daß kühl gehalten wird (z. B. bei etwa 4ºC), um eine Zersetzung chemisch instabiler Medienkomponenten, wie Glutamin und Wachstumsfaktoren, zu verhindern, wird mit einer Pumpe 901 (z. B. einer Spritzenpumpe, einer peristaltischen Pumpe etc.) durch Schlauchleitung 903, die vorzugsweise wasserundurchlässig ist, um Änderungen in der Osmolarität des Mediums vor dem Eintritt in die Zellkulturkammer 614 zu verhindern, in die Zellkulturkammer 614 von Bioreaktor 902 gepumpt. Die Schlauchleitung 903 kann einen "Durchhang" aufweisen, so daß Pumpe 901 und/oder Reservoir 900 für frisches Medium transportiert werden können, z. B. zwischen einem Ort für kühle Lagerung 910 und einem Abzug mit Laminar Strömung (nicht gezeigt), wo die gewünschten Manipulationen in steriler Umgebung durchgeführt werden können. Die Extraschlauchleitung 903 wird z. B. in einem Kühlschrank (nicht gezeigt) gehalten, so daß nur ein kurzer Schlauchabschnitt Raumtemperatur oder Inkubatortemperatur ausgesetzt ist.
Gas wird der Gaskammer 615 von Bioreaktor 902 entweder aus einer Stahlflasche 904 mit vorgemischten Gasen (einer Mischung aus 1-50% (V/V), vorzugsweise 5-20% (V/V) O&sub2;, 5% (V/V) CO&sub2; und dem Rest N&sub2;) zugeführt oder wird einfach dem Inneren eines Inkubators (nicht gezeigt) entnommen (üblicherweise eine Mischung aus Luft und 5% (V/V) CO&sub2;). Die Strömungsgeschwindigkeit und die Zusammensetzung des Gasstroms lassen sich also mit bekannten Methoden leicht regeln. Das Gas kann mit einer Pumpe (nicht gezeigt) durch einen Sandstein in einen üblichen Zellkulturbefeuchter 906 gepumpt werden, um die Gasmischung zu ergeben, die in die Gaskammer 615 geführt wird. Eine relative Feuchte von nahezu 100% ist möglich. Gasleitung 907 kann gegebenenfalls ein Sterilfilter enthalten.
Das verbrauchte Medium kann aus 914 über Schlauchleitung 909 in einem Reservoir 908 gesammelt werden. Dem Reservoir 908 können vorteilhaft Proben des verbrauchten Mediums zur Analyse der Medienkomponenten entnommen werden. Verbrauchtes Gas wird über Schlauchleitung 911 entsorgt, von der es mit jedem zweckmäßigen Gasanalysator (nicht gezeigt) analysiert werden kann. Die Analyse des verbrauchten flüssigen Mediums und/oder des verbrauchten Gases kann vorteilhaft als zusätzliches Mittel zur Überwachung der Zellkultur verwendet werden. Außerdem kann man mit Hilfe von Mitteln 912 vorteilhaft wichtige Eigenschaften der Zellkultur überwachen, beispielsweise pH und Potential des gelösten Sauerstoffs.
Alle drei hier beschriebenen Bioreaktoren genügen den oben aufgezählten Kriterien. Beispiele für ihre Konstruktion, ihren Betrieb und ihr Leistungsvermögen sind nachfolgend gegeben.
Nach der allgemeinen Beschreibung läßt sich die Erfindung nun besser verstehen, wenn auf bestimmte spezielle Beispiele, die hier lediglich der Erläuterung dienen und, falls nicht anders angegeben, keine Beschränkung darstellen sollen, Bezug genommen wird.

EXPERIMENTELLER TEIL

I. Bildung von Transformanten

Der humane Wachstumsfaktor GM-CSF (Wong, Science. (1985) 228: 810-815) wurde in einen eukaryontischen Expressionsvektor inseriert. Die CDNA von HGM-CSF (EcoRI- AhaIII, ca. 700 bp-Fragment) wurde in ein EcoRI-PstI- Fragment von pSP65 kloniert. (Melton, Nucl. Acids Res. (1984) 2: 7035-7056). Das resultierende Plasmid war pSP65GM-CSF. Der Metallothioneinpromotor der Maus (Glanville, Nature (1981) 292: 267-269) wurde mit EcoRI und BglII verdaut und das etwa 2 kb große Fragment, das den Promotor enthielt, wurde in das EcoRI-BamHI-Fragment von pSP65 inseriert, wobei p65MT entstand. Das Plasmid pMT GM-CSF wurde dann konstruiert, indem pSP65GM-CSF mit EcoRI verdaut wurde, die überhängenden Enden mit dem Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I aufgefüllt wurden und die resultierende linearisierte DNA anschließend mit Hindi 11 verdaut wurde, um das 700 bp-Fragment zu isolieren, das die für GM-CSF codierende Region umfaßte. Dieses Fragment wurde in die aufgefüllte SalI/HindIII- Stelle von p65MT subkloniert. Das 2,7 kb-Fragment, das den Metallothioneinpromotor und die für GM-CSF codierende Region umfaßte, wurde dann isoliert und in pSV2neo (Southern und Berg, J. Mol. Appl. Genet (1982) 1: 327) eingebaut, aus dem der SV40-Promotor entfernt worden war. Dies führt zum SV40-Poly A-Signal stromabwärts der für GM-CSF codierenden Sequenz.
Das das Gen für die Neomycinresistenz, das Resistenz gegen das Antibiotikum Gentamycin (G418) vermittelt, wurde pSV2neo entnommen, indem das etwa 3 kb große PvuII- EcoRI-Fragment isoliert und an die PyuII-Stelle EcoRI- Linker angebaut wurden. Das Neo-Resistenzgen mit den EcoRI-Enden wurde unter Bildung des Plasmids MTGM-CSFneo in die EcoRI-Stelle des GM-CSF-Expressionsplasmids subkloniert.
Das Plasmid MTGM-CSFneo wurde allein und als Cotransfektion mit dem Plasmid (Yang, Cell (1986) 47: 3-10), das das IL-3-Gen von Gibbonaffen unter der Kontrolle des SV40-Promotors und eine Poly A-Stelle enthält, durch Elektroporation linearisierter DNA in die Zellen der Zellinie CV1 afrikanischer grüner Meerkatzen und der Mäusezellinie NIH 3T3 transfiziert. Transformanten wurden durch Selektion in Medien selektioniert, die 500 mg/ml G418 enthielten, isoliert und mittels eines Bioassays der Überstände mit AML-193- Zellen (Adams et al., Leukemia (1989) 3: 314) auf Produktion von GM-CSF oder IL-3 gescreent. Mehrere der positiven Zellinien wurden dann als Stroma für humane Knochenmarkszellen in Dexter-Kultur eingesetzt.
Zusätzlich wurden normale Knochenmarkszellen von Mäusen mit dem obigen Plasmid transfiziert, wobei die Calcium/Phosphat-Methode von Okayama (Chen, Mol. Cell. Biol. (1987) 7: 2745-2752) angewandt wurde. Es wurde gefunden, daß sie Zellen die eingebrachten Gene effizient exprimieren.
Die Sekretion von GM-CSF und IL-3 durch die transfizierten Fibroblasten wurde untersucht. Überstände von 72-stündigen serumfreien Kulturen wurden von den NIH- 3T3-Zellen erhalten und mittels ³H-Aufnähme an durch neutralisierende Kaninchen-anti-GM-CSF-Antikörper oder Kaninchen-anti-IL-3-Antikörper inhibierbaren Targetzellen auf hGF-Sekretion getestet. Durch 20 mg/ml GM-CSF induzierte Proliferation wurde als 100 Units GM-CSF definiert und die durch 10 ng/ml IL-3 induzierte Proliferation wurde als 100 Units IL-3 definiert. Die cotransfizierten Zellen produzieten etwa 35 Units/ml GMCSF und etwa 57 Units/ml IL-3.
II. PerfusionskammerDie Perfusionskammer ist ein Glaszylinder mit Deirin- Kappen, um ein Autoklavieren ohne Deformation und um Biokompatibilität zu gewährleisten. Die Kappen haben zylindrische Vertiefungen, in die der Glaszylinder paßt. Am Boden der Vertiefung wird ein O-Ring plaziert, um das Lumen der Kammer abzudichten. Die Kappen weisen mehrere Löcher auf, in denen Luer (Luer Lock)-Verbindungsstücke vorgesehen sind, in die Leitungen für Medien- und Gaszufuhr eingesetzt werden, sowie einen verlängerter Schlauch in die zentrale Zone der Kammer, um Proben von adhärenten und/oder nichtadhärenten Zellen zu entnehmen. Die Kappen werden mit drei langen Schrauben im Abstand von 120º, die außerhalb des Glaszylinders angebracht sind, befestigt; Flügelschrauben und Dichtungsringe werden zum Festziehen der Anordnung verwendet.
Die Kammer wird an ein seitliches Reservoir gehängt. Der Regelkreis enthält zusätzlich zu dem seitlichen Medienreservoir eine Pumpe, eine Kammer mit prozeßgekoppelten Sensoren, einen Oxygenator und Öffnungen zur Probenentnahme und zum Einspritzen. Das Medium im seitlichen Reservoir wird dann mit einer separaten Pumpe langsam ausgetauscht. Diese Anordnung erlaubt eine getrennte Regelung der Medienaustauschgeschwindigkeit und der Strömungsgeschwindigkeit durch den Oxygenator und die Perfusionskammer. Erstere wird eingesetzt, um die längerfristige Änderung in der Medienzusammensetzung und die Perfusion zu regeln, während letztere eingesetzt werden kann, um das Potential des gelösten Sauerstoffs und die Strömungsmuster in der Kammer zu regeln. Die Verwendung einer engmaschigen Polysulfonatmembran erlaubt eine Pfropfenströmung in der Kammer und die genaue Steuerung der Zufuhr von Wachstumsfaktoren und anderen speziellen Verbindungen, die man in sehr genauen Mengen in den Bioreaktor einschleusen möchte.
Die transfizierten Stromazellen werden entweder über einem Bett aus zerkleinertem Kollagenschwamm ausgesät oder man plaziert die Stromazellen auf einer Seite eines porösen 5 u-Polycarbonatfliters, der mit Kollagen vorbeschichtet ist, und läßt die Stromazellen über mehrere Stunden an den Filter adhärieren. Man läßt die Zellen in einem geeigneten Nährmedium wachsen, bis die Zellen an einer Seite konfluent werden, während sie zytoplasmatische Projektionen durch die Poren strecken. Dann werden Knochenmarkszellen auf der anderen Seite der Membran ausgesät und die Stammzellen heften sich an die eingedrungenen zytoplasmatischen Projektionen, die durch die Poren gelangt sind.
Nach Autoklavieren der Kammer und der Komponenten des Regelkreises wird der Reaktor in einer sterilen Umgebung zusammengebaut. Das Medium wird dann einige Tage im Kreis durch den seitlichen Regelkreis und die Kammer geführt, wobei auf Zeichen von Verunreinigungen überprüft wird. Die mittlere Zone des Bioreaktors wird dann entweder mit der extrazellulären Matrix allein oder mit einem zuvor inokulierten Träger für die extrazelluläre Matrix, der die Stromazellen enthält, inokuliert. Die Stromazellen können dann für einige Tage in der Kammer gehalten werden, wobei ihre Stoffwechselleistung und/oder ihr Ansprechen auf Wachstumsfaktoren überwacht wird, und wenn die Ergebnisse zufriedenstellend sind, wird das Knochenmark inokuliert oder es wird unmittelbar mit Knochenmark angesät. In beiden Fällen wird die Zellschicht am Boden der mittleren Zone der Perfusionskammer gehalten.
Die Zellen legen zusätzliche extrazelluläre Matrix ab und die Zellschicht adhäriert an den Träger. Wenn die Membran verwendet wird, kann die Kammer umgedreht werden und die Zellschicht befindet sich dann an der Decke der mittleren Zone. Bei dieser Anordnung setzen sich die reifenden Zellen am Boden der mittleren Zone ab, da sie ihre Adhäsionsfähigkeit an die Stromaschicht verlieren. Die nicht adhärenten Zellen werden dann mit Hilfes des konstanten Strom von Zellen in die Austrittsschlauchleitung, getrieben durch den Perfusionsdruck des Mediums, geerntet.
In einem typischen Lauf wurde die Kammer an Tag 1 mit NIH-3T3-Zellen auf einem zerkleinerten Kollagenschwamm als Träger inokuliert. Über die ersten 40 Tage wurden die Perfusionsgeschwindigkeiten und andere Betriebsvariable eingestellt. An Tag 40 wurde ein angemessenes Gleichgewicht erreicht, das über etwa 20 Tage aufrechterhalten wurde. An Tag 64 wurde die Kammer mit 33 · 10&sup6; humanen Knochenmarkszellen angesät. Über die ersten 10 Tage sank die Zahl der geernteten Zellen, bis sich ein Gleichgewicht von etwa 7-8 · 10&sup5; Zellen, die alle drei Tage produziert wurden, einstellte. Eine Analyse mittels Durchflußzytometrie zeigte, daß eine konstante Fraktion, etwa 20% der geernteten Zellen, HLA-DR-positiv war. An Tag 90 fiel eine Pumpe aus und der pH fiel über Nacht unter 6,9. Nachdem die Perfusionsgeschwindigkeit wiederhergestellt war, erholte sich die Produktion nicht adhärenter Zellen und näherte sich der früheren Gleichgewichtsproduktionsrate an, als eine Kontamination mit Bakterien auftrat. Zu diesem Zeitpunkt wurde die Untersuchung beendet.
Die obigen Ergebnisse zeigten, daß eine Perfusionskammer in der Lage ist, ex vivo eine Hämatopoese zustande zu bringen, und daß sich die Hämatopoese nach einem pH- Abfall wiederherstellen läßt, und die Werte für die Glucosekonzentration zeigten, daß die hämatopoetischen Zellen primär aerob auf Glucose wachsen, da die Glucosekonzentration nach Inokulation ohne Zunahme der Lactatkonzentation abfällt, was anzeigt, daß die Oxygenierung limitierend ist. Der (anaerobe) Glucose/Lactat-Metabolismus scheint in erster Linie auf dem NIH-3T3-Stromabett zu beruhen. Ähnlich erreichen die Glutamin- und Ammoniakkonzentrationen Werte vor der Inokulation, sobald die Zahl hämatopoetischer Zellen abnimmt, was impliziert, daß der Glutaminverbrauch der Knochenmarkszellen weit geringer ist als der des Stromabetts.
Ill. Überwachung der Stoffwechselprodukte Der Verbrauch und die Bildungsraten von Glucose und Lactat sowie von Glutamin und Ammoniak wurden für transfizierte NIH-3T3-Zellen bestimmt. (Das Medium war IMDM plus 20% PCS). Ein erhöhter Glucoseverbrauch wurde nur bei täglich gefütterten T-Kolben beobachtet, während alle weniger häufig gefütterten Kulturen den gleichen Mustern einer langsam abnehmenden Glucoseaufnahmegeschwindigkeit folgen. Kulturen, die täglich zu 50% ausgetauscht wurden, wurden an Tag 18 auf ein tägliches 100%iges Austauschschema umgestellt, was zu einer unmittelbaren Zunahme des Glucoseverbrauchs führte, der dem gleichen Trend folgte wie der, der für Kulturen beobachtet wurde, die von Tag 1 an täglich zu 100% ausgetauscht wurden. Die Produktionsgeschwindigkeiten für Lactat folgen einem ähnlichen Muster, da die Lactatausbeute auf Glucose im wesentlichen eine Konstante ist (0,9 Lactat/Glucose; dies zeigt einen größtenteils anaeroben Stromastoffwechsel an).
Die Glutamin- und Ammoniakkonzentrationen zeigen ein Muster, das dem Glucose/Lactat-Stoffwechsel analog ist. Bei Verwendung von Werten, die hinsichtlich der chemischen Zersetzung von Glutamin bei 37ºC korrigiert sind, zeigt die Geschwindigkeit des Glutaminverbrauchs gegenüber der Geschwindigkeit des Glucoseverbrauchs, daß die Aufnahmeraten konstant sind, nämlich etwa 1 : 8 für Glutamin : Glucose. Das vorhergesagte optimale Verhältnis schwankt mit der Sauerstoffaufnahmerate, das Verhältnis sinkt bei zunehmender optimaler Aufnahmerate.
Analoge Schlußfolgerungen werden durch Stoffwechseldaten für Glucose/Lactat unterstützt, die von normalen Fibroblasten von Knochenmarksstroma stammen. Unter Bedingungen eines selteneren Medienaustauschs waren die Kulturen in erster Linie anaerob, wobei rasch hohe Gleichgewichtsspiegel von Lactat erreicht und aufrechterhalten wurden. Bei häufigerem Medienaustausch wurde der Zellstoffwechsel schneller und der Glucoseverbrauch und die Lactatproduktion nahmen zu. Es wurde kein nachweisbarer Glutaminverbrauch beobachtet, nachdem die Daten hinsichtlich der spontanen chemischen Zersetzung korrigiert worden waren. Sowohl 3T3-Zellen als auch normale humane Knochenmarkszellen teilen sich weiter und sammeln sich an, wenn die Austauschrate von Serum/Medium oberhalb eines anscheinend kritischen Austauschschemas liegt.
Um die relative Bedeutung der Perfusionsgeschwindigkeit von Serum gegenüber der von Nährstoffen festzustellen, wurden die folgenden Experimente durchgeführt: (1) eine Reihe T-Kolben mit Medium mit 20% Serum mit täglichem Austausch; (2) zwei Reihen T-Kolben, eine mit 20% Serum, wobei das Medium alle zwei Tage ausgetauscht wird, und eine mit 20% Serum, wobei das Medium täglich ausgetauscht wird; (3) zwei Reihen T-Kolben, eine mit 10% Serum, wobei das Medium alle zwei Tage ausgetauscht wird, eine mit 5% Serum, wobei das Medium täglich ausgetauscht wird; (4) zwei Reihen T-Kolben, eine mit 5% Serum, wobei das Medium alle zwei Tage ausgetauscht wird, und eine mit 2,5% Serum, wobei das Medium täglich ausgetauscht wird. Die Austauschrate des Serums ist innerhalb jeder Gruppe gleich, während die Austauschrate der nährstoffhaltigen Medien variiert. Die Ergebnisse dieser Experimente zeigen, daß es die Austauschrate des Serums ist, die kritisch ist. Während bei Experiment 1) der Glucoseverbrauch zunahm und an Tag 4 auf eine Rate von etwa 9,5 mmol/pro Tag abgeflacht war, begann der Glucoseverbrauch in allen anderen Fällen unterhalb des ursprünglichen Glucoseverbrauchs der Gruppe I und fiel im wesentlichen in linearer Weise ab, gleichgültig ob die doppelte Serummenge eingesetzt wurde und alle zwei Tage ausgetauscht wurde oder ob die Hälfte der Serummenge eingesetzt wurde und das Medium jeden Tag gewechselt wurde. Dies unterstreicht die Notwendigkeit einer kritischen Perfusionsgeschwindigkeit für das Serum oder ein oder mehrere Serumkomponenten, die das metabolische Wachstumsverhalten der Stromazellen beeinflussen.
Aus den obigen Ergebnissen wird deutlich, daß man hämatopoetische Zellen auf effiziente Weise in einem Bioreaktor züchten kann. Stromazellen lassen sich aus homologen oder heterologen Quellen bereitstellen, wenn die Stromazellen mit Genen transfiziert wurden, um die wichtigen Wachstumsfaktoren zu liefern. Auf diese Weise muß dem Medium kein Serum zugegeben werden, um das Wachstum der Zellen zu fordern. Indem Stromazellen bereitgestellt werden, die so an einen Träger adhärieren, daß die Abtrennung von hämatopoetischen Zellen von den Stromazellen ermöglicht wird, können die hämatopoetischen Zellen kontinuierlich zur Verwendung geerntet werden. Durch geeignete Wahl von Kombinationen von Wachstumsfaktoren können spezifische Zellinien der hämatopoetischen Zellen gezüchtet werden. Falls gewünscht, können die Stromazellen außerdem als Reservoir für transfizierende Viren zum Einschleusen von Genen in die hämatopoetischen Zellen dienen.

Beispiel 1

Es wird nun eine spezielle Ausführungsform des Flachbett- Membranbioreaktors (siehe 1.1 oben) und seine Funkion in einem Gesamtsystem beschrieben.

Betriebsweise

A. Inbetriebnahme der Perfusionskammern

Zellen. Die Zellen werden vor Inokulation in gleicher Weise behandelt, wie bei der Vorbereitung für Dexter- Kulturen. Nach Absaugen von einem Donor werden einkernige Zellen auf einem diskontinuierlichen Dichtegradienten (Ficoll-Paque) aufgetrennt und dann mehrmals in Kulturmedium gewaschen. Wenn ein angereichertes Inokulum gewünscht wird, kommen in diesem Stadium Verfahren zur Anreicherung von Nachkommenzellen und Stammzellen zur Anwendung. Dieses Verfahren dauert üblicherweise etwa einen halben Tag.
Medium. Das eingesetzte Medium ist das übliche Dexter- Medium, 10% Pferdeserum, 10% fötales Kälberserum 10&supmin;&sup5; M Hydrocortison und IMDM. Zusätzlich werden, wie zuvor beschrieben, hämatopoetische Wachstumsfaktoren wie IL-3, GM-CSF und EPO (Schwartz et al., 1991) und c-Kit-Ligand eingesetzt.
Pert us ionskammern. Die Vorbereitung der Perfusionskammern beginnt einen Tag vor Inokulation. Der Zusammenbau eines Satzes von 6-10 Perfusionskammern dauert etwa 6 bis 8 Stunden. Dies beinhaltet Dimensionierung/Schneiden von Schlauchleitungen, Einbau von Verbindungsstücken in die Kammer, Vorbereitung der Medienflaschen etc. Am Ende des Tages wird der vollständige Kammeraufbau (ohne die Schlauchleitung und Zusatzgeräte für den Gasaustausch) ohne Medium autoklaviert (alle Komponenten sind autoklavierbar). Der Satz Kammern kann dann in einem sterilen Abzug für die Kultivierung aufbewahrt werden. Zu einem späteren Zeitpunkt wird der vollständige Komponentensatz im Abzug zusammengebaut, das Medium eingebracht, die Beschichtung auf die Membran aufgebracht (z. B. PepTite 2000), die Zellen inokuliert, die Kammern in den Inkubator gestellt, die Spritzen in die Pumpen eingesetzt und im Kühlraum aufbewahrt. Die Vorbereitung der Kammer, die Handhabung der Zellen und die Inokulation dauern üblicherweise zwei volle Tage. Die Perfusion beginnt üblicherweise, nachdem sich die Zellen in der Kammer 12 bis 24 Stunden abgesetzt haben.
Membranen. In diesem Beispiel wurde entweder eine Silikonmembran (Spezifikation) oder eine Teflon®-Membran (mit einer Dicke von 0,001") als Gasaustauschmembran verwendet. Für das Zellwachstum und die Zelladhäsion wurde eine keramische Membran verwendet (AnoTec®, 0,01 u, unbehandelt).

B. Betrieb der Perfusionskammern

Austausch von Spritzen. Für dieses Beispiel wurden Spritzenpumpen verwendet. Die Spritzen werden nach einem festen Schema ausgetauscht. Beispielsweise wurden 10 ml-Spritzen während der anfänglichen Läufe mit den Kammern bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 2 ml pro Tag verwendet. Die Spritzen wurden also alle fünf Tage ausgetauscht. Die Spritzenpumpe wird vom Kühlraum zum Abzug transportiert, wo die Spritzen in einer sterilen Umgebung ausgetauscht werden. Dieser Transport der Pumpe wird, wie oben beschrieben, durch den "Durchhang" in der Einlaßleitung für das Medium möglich.
Mikroskopische Untersuchung. Die Ober- und Unterseite der Perfusionskammer und die Gasaustauschmembran sind transparent. Die anorganische Membran wird transparent, sobald sie hydratisiert wird, so daß man die Zellen in der Kammer während des Betriebs durch ein Mikroskop untersuchen kann. Für diesen Zweck benötigt man ein Objektiv mit langer Brennweite.
Entnahme von Zellproben. Für die periodische Entnahme von Zellproben kamen zwei Methoden zur Anwendung. Erstens, man läßt die Zellen durch Schwerkraft zwei Stunden absetzen und tauscht dann 2 ml in der Kammer aus, indem man Flüssigkeit durch die Einlaßöffnung drückt und sie aus der Auslaßleitung auffängt. Zweitens, man zog direkt durch die Probenentnahmeöffnung 2 ml ab, wobei ein Luftraum in der Kammer zurückbleibt, der dann innerhalb eines Tages mit dem eindringenden Medium verschwindet. Die zweite Methode ist invasiver und liefert eine höhere Zellzahl (etwa vierfach). Die Entnahme der Zellprobe erfolgt in einem Abzug mit Laminarströmung. Der Satz Kammern wird vom Inkubator zum Abzug transportiert; die Länge der Einlaßleitung für das Medium sollte diesen Transport erlauben. Die adhärenten Zellen können auf ähnliche Weise durch Trypsinierung abgelöst werden.

C. Leistungsvermögen

Wir beschreiben nun die Ergebnisse mehrerer Tests dieser Bioreaktoren. Mehrere Modelle eines kleinen Bioreaktors, deren spezifische Dimensionen in den Fig. 6a-i beschrieben sind, wurden simultan unter verschiedenen Bedingungen betrieben.

Beispiel 2

Züchtung von humanem Knochenmark in Bioreaktoren bei verschiedenen Oxygenierungsraten

Gruppen hämatopoetischer Bioreaktoren wurden wiederholt erfolgreich laufen gelassen.
Wir geben hier Daten für den Betrieb eines Satzes von Kammern mit den in den Fig. 6a-e angegebenen Dimensionen bei verschiedenen Oxygenierungsraten an.

Vorbereitung der Bioreaktoren

Anordnung. 2-Kammer-Anordnung, d. h. 0 oberes Kompartiment/Mediumstrom unterer Teil. Die Zellen wurden auf einer Polycarbonatoberflache gezüchtet, die die untere Wand des Reaktors bildet. Durch das untere Zellkompartiment wurde ein Medium zugeführt und durch Spritzennadeln, die durch eine Silikondichtung eingeführt wurden ('medical grade"), abgezogen.
Oxygenierungsmembranen. Die beiden Kompartimente wurden durch eine gaspermeable Membran für die Oxygenierung getrennt. Um die Oxygenierungsrate für eine Zellschicht auf der Polycarbonatoberfläche zu optimieren, wurden drei Membranen getestet. Teflon 100 (Dicke 0,001"), Silikon 1500 (0,015") und Silikon 3000 (0,03"). Die zwei Silikonmembranen waren 'medical Grade" und mit einem Dacron-Netz verstärkt.
Dimensionen. Die Tiefe der Zellwachstumskammer betrug 3 mm, während die für den Gasstrom 1,5 mm betrug. Der Durchmesser aller Kammern betrug etwa 30 mm.
Sterilisierung. Die Reaktoren wurden ohne Anziehen der Schrauben zusammengebaut und 30 Minuten bei Flüssigkeitskreislauf autoklaviert. Nach Abkühlen und Trocknen über Nacht in einem Abzug mit Laminar Strömung wurden alle Schrauben und Verbindungsstücke angezogen. Die Reaktoren wurden mit 10 ml Hanks gepufferter Salzlösung ("Hanks balanced salts solution; HBSS) gespült, bevor Medium eingeführt wurde.
Medium. In DEXTER-Medium wurden zu dem üblichen Dexter- Medium (d. h. 10% V/V fötales Kälberserum, 10% Pferdeserum plus 80% Medium, in diesem Fall Isove's Modified Dulbecco's Medium) Wachstumsfaktoren in folgenden Konzentrationen gegeben: IL-3 (5 Units/ml) GM-CSF (5 ng/ml), EPO (0,1 Units/ml) und MGF (10 ng/ml).
Bioreaktorbetrieb. Bioreaktoren wurden mit verschiedenen gaspermeablen Membranen, wie sie oben beschrieben wurden, unter verschiedenen Sauerstoffkonzentrationen im Gaskompartiment betrieben. Die getesteten Sauerstoff mengen waren 5% (enthält auch 5% CO, der Rest N&sub2;) und 20% (Luft mit 5% CO&sub2;). Die beiden Gase wurden mit sterilem Wasser gesättigt, bevor sie in die Bioreaktoren eingeleitet wurden. Jede Bedingung wurde dreimal getestet (siehe nachfolgende Tabelle). Jeder Reaktor wurde mit 7,0 Millionen Zellen, die nach einem üblichen Ficoll- Verfahren gereinigt worden waren, inokuliert. Die Perfusionsgeschwindigkeit des Mediums betrug 0,75 ml/Tag und die Temperatur der Zellkultur betrug 37ºC in einem Wärmeraum. Aufbau der Bioreaktoren
+ Näherungsindikator von relativer Sauerstoffaustauschrate zu Rate durch die Teflonmembran unter 20% Sauerstoff. Die angegebenen Zahlen bezeichnen eine bestimmte Bioreaktoreinheit.
Probenentnahme. Es wurde ein Ein-Wochen-Schema für die Probenentnahme verwendet. Über die erste Woche wurden nichtadhärente Zellen in einem Volumen von 0,6 bis 0,8 ml entnommen. Am Ende einer zweiwöchigen Inkubation wurden nicht adhärente Zellen durch Auffangen des Mediums und durch dreimaliges Waschen mit HBSS (insgesamt 8 bis 11 ml) geerntet. Adhärente Zellen wurden bei Raumtemperatur 15 bis 20 Minuten trypsiniert. Alle Zellproben wurden für den Test auf Nachkommenzellen auf Methylcellulose ausplattiert, mit Dichten von 2,5 · 10&sup4; Zellen/ml für die Proben der ersten Woche und von 1 · 10&sup5; für die Proben der zweiten Woche.

Ergebnisse

Die Ergebnisse sind tabellarisiert (Tabelle 1, graphisch gezeigt in den Fig. 10a-c) als Expansionen von 1) Gesamtzellen, 2) Granulozyten-Makrophagen-Nachkommen (GM-CFU) und 3) erythroiden 'Burst Forming units' (BFU). Die Expansion ist als die kumulative Produktion relativ zum Inokulum definiert. Das Verhalten der adhärenten Zellschicht war wie folgt:
1. Bedeckung der Oberfläche mit Zellen. In der ersten Woche der Kultivierung bedeckten die Zellen mehr als 40 bis 50% der Oberfläche in allen Reaktoren. Die höchste Bedeckung wurde in Reaktoren unter 20% O&sub2; und mit Silikon 1500 gefunden. Am Ende der zweiten Woche des Betriebs schien das Zellbett in den Reaktoren mit einer Silikon 3000-Membran am gesündesten zu sein. Unter den meisten Bedingungen war die Bedeckung in der Mitte der Reaktoren geringer als an der Peripherie.
2. Stromazellen. Adhäsion von Fibroblasten in einer Region mit geringer Zelldichte auf der Polycarbonatoberflache war beobachtet worden, bevor nicht adhärente Zellen konfluent wurden. Die Stromazellenschicht war nach zwei Wochen nicht vollständig konfluent, sondern nur in einigen Bereichen.

Schlußfolgerungen

Die Kammern unterstützen die Expansion von humanen Knochenmarkszellen. Das Leistungsvermögen verbesserte sich durch höhere Sauerstoff Verfügbarkeit. Die besten Ergebnisse wurden bei 20% Sauerstoff mit den beiden Silikonmembranen erhalten. Unter diesen Bedingungen nahm die Gesamtzellzahl nahezu um einen Faktor 3 zu. Die Dichte von GM-CFU nahm in der Gesamtzellpopulation um einen Faktor von etwa 3 zu, was zu einer nahezu 9-fachen Expansion von GM-CFUs führte.

Beispiel 3

Zehnfache Maßstabsvergrößerung

Die obigen Ergebnisse wurden in einer Apparatur mit einer 10-fach größeren Fläche zur Adhäsion von Zellen wiederholt. Die vertikalen Dimensionen wurden wie in Beispiel 2 beibehalten. Das Fluidströmungsmuster wurde leicht abgeändert. Der Einlaß erfolgte durch die mittlere Öffnung und drei Öffnungen wurden an der Peripherie in Abständen von 120 Grad eingebaut. Diese drei Öffnungen wurden für den Medienausfluß verwendet.
Die Werte für die Zellproduktion sind in Tabelle 2 gezeigt. Die Kammer wurde mit 35 Millionen Zellen inokuliert und die kumulative Zellproduktion war 300 Millionen Zellen oder eine 8,6-fache Expansion in der Gesamtzellzahl. Wie in Beispiel 1 wurde eine Anreicherung in der Zelldichte der GM-CFU-Nachkommenzellen beobachtet, die zu einer mehr als 31-fachen Expansion führte. Die Gesamtzahl an produziertem GM-CFU war über 2 Millionen. Ein typisches Transplantat hat etwa 10 Millionen GM-CFU. die von den Erfindern beschriebenen Bioreaktoren können also eine klinisch bedeutsame Zahl hämatopoetischer Nachkommenzellen aus einem einzigen Aspirat produzieren.
+ Theoretischer Indikator für Sauerstoffaustauschrate basierend auf der Rate durch Teflon unter 20% Sauerstoff. Tabelle 2
Zahl inokulierter Zellen 3,50 E + 07
Wachstumsfaktoren IL-3 (5 U/ml) + GM-CSF (5 ng/ml) + EPO (0,1 U/ml) + (10 ng/ml)
Perfusionsgeschwindigkeit des Mediums 7,2 = 8,6 ml/Tag
Die Ausführungsformen der Fig. 3 und 11 minimieren aufgrund der fortlaufenden Änderung der Form des Strömungswegs des in ihnen perfundierenden Mediums "tote" Flächen im Fluidströmungsmuster und fördern so eine einheitliche Verweilzeit für alle Teile des perfundierenden Mediums im Reaktor.
Im Licht der obigen Lehre sind offensichtlich zahlreiche Modifikationen und Abwandlungen der vorliegenden Erfindung möglich.

Claims

1. Bioreaktor zum Kultivieren von Humanzellen und/oder -gewebe, einschließlich humaner Stammzellen oder humaner hämatopoetischer Zellen, umfassend:

ein Gehäuse (600, 601), das eine Zellkulturkammer (614) definiert, in die Humanzellen und/oder -gewebe, einschließlich humaner Stammzellen oder humaner hämatopoetischer Zellen, eingebracht und worin sie kultiviert werden können, wobei diese Zellkulturkammer so ausgebildet ist, daß sie eine Vielzahl von Einlaßöffnungen (610) im wesentlichen äquidistant zu einer Vielzahl von Auslaßöffnungen (611) enthält, damit Zellkulturmedium hindurchströmen kann;

Mittel zum Perfundieren eines flüssigen Zellkulturmediums durch die Zellkulturkammer;

Mittel (607, 603) zum In-Kontakt-Bringen des flüssigen Zellkulturmediums, das durch die Zellkulturkammer perfundiert wird, mit einer Sauerstoff quelle, so daß das flüssige Zellkulturmedium, das durch die Zellkulturkammer perfundiert wird, mit Sauerstoff angereichert wird, wobei diese Mittel zum In-Kontakt-Bringen eine für Gas permeable und für Flüssigkeit impermeable Membran (603) enthalten; und

Mittel zum kontinuierlichen, periodischen oder diskontinuierlichen Ernten nicht adhärenter Zellen aus der Zellkulturkammer durch die Strömung des Kulturmediums.

2. Bioreaktor nach Anspruch 1 zum Kultivieren von Humanzellen und/oder -gewebe, einschließlich humaner Stammzellen oder humaner hämatopoetischer Zellen, enthaltend:

die für Gas permeable und für Flüssigkeit impermeable Membran (603) so in das Gehäuse eingebaut, daß das Gehäuse in die Zellkulturkammer (614) auf der einen Seite der Membran und in eine Gaskammer (615) auf der anderen Seite der Membran unterteilt wird, und Mittel (904, 905, 906, 907, 911) zum Perfundieren von Atmungsgasen durch diese Zellkultur, die Mittel (607) zum Zuführen der Atmungsgase zu der Gaskammer umfassen, wodurch die Atmungsgase durch die Membran strömen und dabei durch die Zellkulturkammer hindurchtreten, und Mittel (608) zum Abziehen verbrauchter Atmungsgase aus der Gaskammer (615).

3. Bioreaktor nach Anspruch 2 zum Kultivieren von Humanzellen und/oder -gewebe, einschließlich humaner Stammzellen oder humaner hämatopoetischer Zellen, wobei die Mittel zum Perfundieren eines flüssigen Zellkulturmediums durch die Zellkulturkammer Mittel (903, 910) zum Zuführen von frischem flüssigen Zellkulturmedium zu der Zellkulturkammer und Mittel (908, 909, 914) zum Abziehen von verbrauchtem flüssigen Zellkulturmedium aus der Zellkulturkammer umfassen.

4. Bioreaktor nach Anspruch 2 zum Kultivieren von Humanzellen und/oder -gewebe, einschließlich humaner Stammzellen oder humaner hämatopoetischer Zellen, wobei die Membran (603) in der Lage ist, für einen Sauerstoff transport von ungefähr 0,35 bis ungefähr 3,5 Mikromol pro Stunde pro Quadratzentimeter Zellwachstumsfläche zu sorgen.

5. Bioreaktor nach Anspruch 1 zum Kultivieren von Humanzellen und/oder -gewebe, einschließlich humaner Stammzellen oder humaner hämatopoetischer Zellen, wobei die Zellkulturkammer eine für die Adhäsion und das Wachstum von Zellen geeignete Oberfläche umfaßt und worin die Mittel zum kontinuierlichen, periodischen oder diskontinuierlichen Ernten nicht adhärenter Zellen aus der Zellkulturkammer Mittel zum auf der Zelldichte basierenden selektiven Ernten der nicht adhärenten Zellen umfassen.

6. Bioreaktor nach Anspruch 1 zum Kultivieren von Humanzellen und/oder -gewebe, einschließlich humaner Stammzellen oder humaner hämatopoetischer Zellen, wobei das die Zellkulturkammer definierende Gehäuse eine für die Adhäsion von Zellen geeignete Oberfläche umfaßt.

7. Bioreaktor nach Anspruch 6 zum Kultivieren von Humanzellen und/oder -gewebe, einschließlich humaner Stammzellen oder humaner hämatopoetischer Zellen, wobei die für die Adhäsion von Zellen geeignete Oberfläche eine bioaktive Oberfläche zur spezifischen Adhäsion von Zellen ist.

8. Bioreaktor nach Anspruch 1 zum Kultivieren von Humanzellen und/oder -gewebe, einschließlich humaner Stammzellen oder humaner hämatopoetischer Zellen, welcher Mittel zur Probeentnahme adhärenter Zellen (609) umfaßt.

9. Bioreaktor nach Anspruch 1 zum Kultivieren von Humanzellen und/oder -gewebe, einschließlich humaner Stammzellen oder humaner hämatopoetischer Zellen, wobei das Gehäuse eine dreieckige Form aufweist und die Ein- und Auslaßöffnungen (610, 611) für das flüssige Kulturmedium an gegenüberliegenden Seiten der Zellkulturkammer liegen, wobei sich das flüssige Zellkulturmedium im allgemeinen in der Mitte der Zellkulturkammer befindet.

10. Bioreaktor nach Anspruch 9 zum Kultivieren von Humanzellen und/oder -gewebe, einschließlich humaner Stammzellen oder humaner hämatopoetischer Zellen, wobei der Bioreaktor drehbar auf einem Gestell (626, 627) angebracht ist, so daß die Neigung des Bioreaktors nach Wunsch eingestellt werden kann.

11. Bioreaktor nach Anspruch 1 zum Kultivieren von Humanzellen und/oder -gewebe, einschließlich humaner Stammzellen oder humaner hämatopoetischer Zellen, welcher Mittel zum Wegfangen unreifer Zellen in der Zellkulturkammer umfaßt.

12. Bioreaktor nach Anspruch 11 zum Kultivieren von Humanzellen und/oder -gewebe, einschließlich humaner Stammzellen oder humaner hämatopoetischer Zellen, wobei die Mittel zum Wegfangen unreifer Zellen in der Zellkulturkammer einen Antikörper umfassen, der für die unreifen Zellen spezifisch ist.

13. System zur Expansion von Humangewebe, einschließlich Humanzellen und/oder humaner Stammzellen oder humaner hämatopoetischer Zellen, umfassend:

einen Bioreaktor zum Kultivieren von Humanzellen und/oder -gewebe/einschließlich humaner Stammzellen oder humaner hämatopoetischer Zellen, umfassend

Mittel zum stabilen Aufbewahren eines flüssigen Zellkulturmediums (910);

Mittel zum Perfundieren des flüssigen Zellkulturmediums durch die Zellkulturkammer; eine Quelle für Gase für die Zellatmung (904); und

Mittel zum Perfundieren (607) der Gase für die Zellatmung durch die Zellkulturkammer.

14. System nach Anspruch 13, wobei die Quelle für die Gase für die Zellatmung eine komprimierte Gasmischung ist.

15. System nach Anspruch 14 zur Expansion von Humanzellen und/oder -gewebe, einschließlich humaner Stammzellen oder humaner hämatopoetischer Zellen, wobei die Membran in der Lage ist, für einen Sauerstofftransport von 0/35 bis ungefähr 3,5 Mikromol Sauerstoff pro Stunde pro Quadratzentimeter Zellwachstumsfläche zu sorgen.

16. System nach Anspruch 13, wobei die Quelle für die Gase für die Zellatmung ein Inkubator ist.

17. System nach Anspruch 13, enthaltend eine Pumpe zum Perfundieren des flüssigen Zellkulturmediums durch die Zellkulturkammer.

18. System nach Anspruch 17, enthaltend eine Pumpe zum Perfundieren der Gase für die Zellatmung durch die Zellkulturkammer.

19. System nach Anspruch 13, enthaltend Mittel zum Befeuchten (906) der Gase für die Zellatmung vor deren Perfusion durch die Kulturkammer.

20. System nach Anspruch 13, wobei die für Gas permeable und für Flüssigkeit impermeable Membran (603) so in das Gehäuse eingebaut ist, daß sie das Gehäuse in die Zellkulturkammer (614) auf der einen Seite der Membran und in eine Gaskammer (615) auf der anderen Seite der Membran unterteilt, und

der Bioreaktor Mittel (904, 905, 906, 907, 911) zum Perfundieren von Atmungsgasen durch die Zellkultur umfaßt, die Mittel (607) zum Zuführen der Atmungsgase zu der Gaskammer umfassen, so daß die Atmungsgase durch die Membran strömen und so durch die Zellkulturkammer hindurchtreten, und

Mittel (608) zum Abziehen verbrauchter Atmungsgase aus der Gaskammer (615).

21. System nach Anspruch 20, wobei die Mittel zum Perfundieren eines flüssigen Zellkulturmediums durch die Zellkulturkammer Mittel (903, 910) zum Zuführen von frischem flüssigen Zellkulturmedium in die Zellkulturkammer und Mittel (908, 909, 914) zum Abziehen von verbrauchtem flüssigen Zellkulturmedium aus der Zellkulturkammer umfassen.

22. System nach Anspruch 20, wobei die Zellkulturkammer eine für die Adhäsion und das Wachstum von Zellen geeignete Oberfläche umfaßt und worin die Mittel zum kontinuierlichen, periodischen oder diskontinuierlichen Ernten nicht adhärenter Zellen aus der Zellkulturkammer Mittel zum auf der Zelldichte basierenden selektiven Ernten der nicht adhärenten Zellen umfassen.

23. System nach Anspruch 13 zur Expansion von Humangewebe/einschließlich Humanzellen und/oder humaner Stammzellen oder humaner hämatopoetischer Zellen, wobei das Gehäuse eine dreieckige Form hat und die Ein- und Auslaßöffnungen (610, 611) für das flüssige Kulturmedium an gegenüberliegenden Seiten der Zellkulturkammer liegen, wobei sich das flüssige Zellkulturmedium im allgemeinen in der Mitte der Zellkulturkammer befindet.

24. System nach Anspruch 23 zur Expansion von Humangewebe, einschließlich Humanzellen und/oder humaner Stammzellen oder humaner hämatopoetischer Zellen, wobei der Bioreaktor drehbar auf einem Gestell (626, 627) angebracht ist, so daß die Neigung des Bioreaktors nach Wunsch eingestellt werden kann.

25. System nach Anspruch 13 zur Expansion von Humanzellen und/oder -gewebe, einschließlich humaner Stammzellen oder humaner hämatopoetischer Zellen, welcher Mittel zum Wegfangen unreifer Zellen in der Zellkulturkammer umfaßt.

26. System nach Anspruch 25 zur Expansion von Humanzellen und/oder -gewebe, einschließlich humaner Stammzellen oder humaner hämatopoetischer Zellen, wobei die Mittel zum Wegfangen unreifer Zellen in der Kulturkammer einen Antikörper umfassen, der für die unreifen Zellen spezifisch ist.