DE69433007T2

DE69433007T2 - Peptide zum induzieren einer antwort der zytotoxischen t-lymphozyten gerichtet gegen das hepatitis b virus

Info

Publication number: DE69433007T2
Application number: DE1994633007
Authority: DE
Inventors: Francis V. Chisari
Original assignee: Scripps Research Institute
Current assignee: Scripps Research Institute
Priority date: 1993-02-26
Filing date: 1994-02-25
Publication date: 2004-06-09
Anticipated expiration: 2014-02-26
Also published as: DE69433007D1; KR960700745A; US5788969A; JP3657603B2; JP2004161778A; JP3616390B2; EP1375511B1; ES2204912T3; AU6355994A; AU695261B2; EP1375511A3; DE69434954D1; ATE359089T1; EP0687182A4; EP1375511A2; EP0687182A1; NZ263030A; CN1118573A; DE69434954T2; WO1994019011A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Zytotoxische T-Lymphozyten ("CTLs") spielen eine wesentliche Rolle bei der Bekämpfung von Zellen, die mit Viren, intrazellulären Bakterien und Parasiten infiziert sind, sowie von Tumorzellen. Sie tun das durch direkte Zytotoxizität und durch Bereitstellung spezifischer und nichtspezifischer Unterstützung an andere Immunozyten, wie beispielsweise Makrophagen, B-Zellen und andere T-Zellen. Infizierte Zellen oder Tumorzellen verarbeiten ein Antigen durch intrazelluläre Vorgänge, die Proteasen involvieren. Das prozessierte Antigen wird auf der Zelloberfläche in Form von Peptiden dargeboten, die an Moleküle der HLA-Klasse I zu T-Zell-Rezeptoren auf CTLs gebunden sind. Moleküle der MHC-Klasse I können auch exogene Peptide binden und bieten sie ohne intrazelluläre Prozessierung an CTLs dar.
Derzeit ist es schwierig, aufgrund der Sequenz eines antigenen Proteins genau vorauszusagen, wie das Protein prozessiert wird und welche Peptidabschnitte Moleküle der HLA-Klasse I binden und CTLs dargeboten werden. Für einige Moleküle der HLA-Klasse I wurden jedoch, basierend auf Sequenzanalysen von Peptiden, die aus diesen Molekülen eluiert worden waren, Bindungsmotive vorausgesagt (Falk et al., Nature 351, 290 (1991)). Außerdem ist derzeit noch nicht voraussagbar, welche der Peptide, die prozessiert werden und sich an HLA-Klasse I binden, CTL-erkennbare Epitope enthalten werden.
Das Hepatitis-B-Virus ("HBV") ist ein nichtlytisches Virus, mit dem derzeit etwa 250 Millionen Menschen weltweit infiziert sind. Bei Erwachsenen führt eine HBV-Infektion in den meisten Fällen zu einer akuten Erkrankung, in einigen wenigen Fällen zu einem chronischen Krankheitszustand. Dieses Verhältnis zwischen akut und chronisch wird umgekehrt, wenn die Infektion kurz nach der Geburt stattfindet. Bei chronischer HBV-Infektion steigt die Häufigkeit von primären Leberzellkarzinomen. Ein kleiner Prozentsatz von Personen, die als Erwachsene mit HBV infiziert werden, entwickeln von einer starken Immunantwort begleitete, fulminante Hepatitis mit hoher Letalität.
Obwohl es keine wirksame Behandlung gegen HBV-Infektionen gibt, wurden in den letzten Jahren Vakzinen zur Prävention von HBV-Infektionen entwickelt. Die Vakzinen setzen entweder HBV-Oberflächenantigene (BHsAg), die aus dem Plasma von chronischen HBV-Trägern gereinigt wurden, oder HBsAg, das durch DNA-Rekombinationstechnik hergestellt wird, ein. Vakzinen auf synthetischer HBsAg-Peptid-Basis wurden ebenfalls vorgeschlagen. Siehe beispielsweise die US-Patente Nr. 4.599.230 und 4.599.231. Die Anti-HBsAg-Vakzinen bieten jedoch nur bei etwa 90% der immunisierten Personen Schutz. Nicht immunisierte oder immunisierte, aber ungeschützte Personen weisen ein bedeutendes Infektionspotential auf.
HBsAg-Peptide, die zur Stimulierung von Reaktionen von T-Helferzellen in Mäusen fähig sind, wurden identifiziert (Greenstein et al., J. Immunol. 148, 3970–3977 (1992)).
Der Beitrag von CTLs zur Immunität gegen HBV-Antigene ist schwer abzuschätzen. Chisari et al. (Microbial Pathogen. 6, 31 (1989)) haben vorgeschlagen, dass eine Schädigung von Leberzellen durch eine auf HLA-Klasse I beschränkte, zytotoxische CD8⁺-T-Zellreaktion auf von HBV kodierte Antigene ausgelöst werden kann. Für eine Reihe von anderen Viren, wie beispielsweise Influenza, wurden auf Haupthistokompatibilität(MHC-) Klasse I beschränkte, zytotoxische T-Lymphozyten-Reaktionen identifiziert. Townsend et al., Cell 44, 959 (1986) haben beispielsweise berichtet, dass Epitope eines Influenzavirus-Nukleoproteins, das von zytotoxischen T-Lymphozyten erkannt wurde, durch synthetische Peptide definiert werden könnte. Beim Versuch, die Reaktion von zytotoxische T-Lymphozyten auf HBV zu definieren, zeigte sich, dass Lymphozyten des peripheren Blutes von Patienten mit akuten und chronischen HBV autologe Hepatozyten in vitro abtöten könnten, aber die Spezifität ihrer zytologischen Aktivität, ihre HLA-Restriktionselemente und der zelluläre Phänotyp wurden nicht bestimmt. Siehe Mondelli et al., ). Immunol. 129, 2773 (1982), und Mondelli et al., Clin. Exp. Immunol. 6, 311 (1987). Moriyama et al., Science 248, 361–364 (1990), haben berichtet, dass das HBV-Haupthüllen-Antigen an der Hepatozytenoberfläche in einer Form exprimiert wird, die von hüllenspezifischen Antikörpern und von MCH-Klasse-I-restringierten, zytotoxischen CD8⁺-T-Lymphozyten erkannt werden kann.
Da es eine große Anzahl an chronisch mit HBV infizierten Personen gibt, wäre es wünschenswert, die Immunantwort dieser Personen zu stimulieren, so dass sie auf geeignete HBV-Antigene ansprechen und dadurch ihre Infektion abtöten. Es wäre auch wünschenswert, die Entwicklung einer chronischen HBV-Infektion bei Personen zu verhindern, die an akuter Phaseninfektion leiden. Darüber hinaus wäre es wünschenswert, da die derzeit genehmigten HBV-Vakzinen bei etwa 10% der immunisierten Personen keine Schutzimmunität erzeugen, wirksamere Immunität bereitzustellen, beispielsweise durch Erhöhung oder Diversifizierung der Immunogenität der Vakzinen. Überraschenderweise erfüllt die vorliegende Erfindung diese und andere damit im Zusammenhang stehende Bedürfnisse.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt Peptide bereit, die auf MCH-Klasse I beschränkte, zytotoxische T-Lymphozyten-Reaktionen gegen HBV-Antigene induzieren. Die Peptide, die von Interesse sind, stammen von der HBV-Hülle. Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung das Peptid HBenv183-191 (Seq.-ID Nr. 1) Phe-Leu-Leu-Thr-Arg-Ile-Leu-Thr-Ile oder ein Fragment davon bereit, worin sich das Peptid oder Fragment an ein HLA-A2-Molekül bindet, um einen Komplex zu bilden, der von zytotoxischen T-Zellen erkannt wird, wobei die T-Zellen ein natives HBV-Antigen erkennen.
Das Peptid kann gegebenenfalls an einem oder beiden der N- und C-Termini flankiert und/oder modifiziert sein. An nicht entscheidenden Restpositionen innerhalb des gewählten Peptids können herkömmliche Substitutionen, Deletionen und Additionen vorgenommen werden, ohne seine biologischen Aktivität beträchtlich negativ zu beeinflussen.
In den verschiedenen Ausführungsform des Peptids versteht sich, dass die Peptide poIymerisiert sein können, entweder mit sich selbst, um größere Homopolymere zu bilden, oder mit anderen Peptiden, um Heteropolymere zu bilden. In manchen Fällen werden Peptide in einer Zusammensetzung als Gemisch kombiniert und nicht verbunden. Das Peptid kann auch an Lipide enthaltende Moleküle, die zur Verstärkung einer T-Lymphozyten-Reaktion fähig sind, oder an ein anderes Peptid konjugiert werden, das eine T-Helferzellreaktion induziert.
Zusammensetzungen werden bereitgestellt, die ein Peptid gemäß vorliegender Erfindung umfassen, das mit einem zusätzlichen Peptid, einem Liposom, einem Adjuvans und/oder einem pharmazeutisch annehmbaren Träger formuliert ist. So können pharmazeutische Zusammensetzungen eingesetzt werden, um akute HBV-Infektionen zu behandeln, vor allem, um das Fortschreiten der Infektion zu einem chronischen oder Trägerzustand zu verhindern. Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung in einem weiteren Aspekt die Verwendung der oben genannten Peptide zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prävention von Hepatitis-B-Infektion in einem Wirt bereit, der einen HLA-A2-Haplotyp aufweist. Diese Medikamente können eingesetzt werden, um chronische HBV-Infektionen und HBV-Trägerzustände zu behandeln, wobei die pharmazeutischen Zusammensetzungen in Mengen an infizierte Personen verabreicht werden, die ausreichen, um immunogen wirksame zytotoxische T-Zellreaktionen gegen HBc-Epitope zu stimulieren. Zur Behandlung dieser Infektionen kann es besonders wünschenswert sein, die Peptide, die MHC-Klasse-I-restringierte, zytotoxische T-Lymphozyten-Reaktionen gegen HBV-Antigene induzieren, mit anderen Peptiden oder Proteinen zu kombinieren, die Immunantworten gegen andere HBV-Antigene, wie beispielsweise HBV-Kerne, induzieren. Um Personen mit chronischen oder Trägerzustandsinfektionen zu behandeln kann die Zusammensetzung je nach Notwendigkeit in wiederholten Dosen über einen längeren Zeitraum verabreicht werden, um die Infektion und/oder die Abgabe des Virus zu stoppen oder stark abzuschwächen.
Zusammensetzungen von Vakzinen zur Prävention von HBV-Infektionen, insbesondere chronischen HBV-Infektionen, werden sind ebenfalls bereitgestellt. Die Vakzinen-Zusammensetzungen umfassen eine immunogen wirksame Menge eines oben genannten HBV-Hüllenpeptids, das eine MHC-Klasse-I-restringierte, zytotoxische T-Lymphozyten-Reaktion induziert, wie beispielsweise HLA-A2, und typischerweise auch ein Adjuvans, z.B. ein inkomplettes Freund-Adjuvans oder Aluminiumhydroxid. Um höheren Schutz gegen HBV zu erzielen, kann die Vakzine außerdem Komponenten umfassen, die eine schützende Antikörperreaktion gegen das HBV-Hüllenantigen induzieren.
KURZBESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
1 zeigt, dass HBsAg335-343, WLSLLVPFV, das minimale optimale CTL-Epitop ist, das von CTL stimuliertem HBsAg329-348 erkannt wird. Ein CTL-Klon vom Patienten A-1 und eine CTL-klonierte Linie vom Patienten A-3, die durch Stimulierung mit HBsAg329-348 gebildet wurde, wurden gegen JY-Zielzellen getestet, die entweder mit Trunkierungen (oberes Diagramm) oder mit überlappenden 9-Meren oder 10-Meren (unteres Diagramm), die HBsAg329-348 abdeckten, vorgepulst waren.
2 bestätigt weiter, dass ein optimales Epitop innerhalb von HBsAg329-348 zur Invitro-CTL-Induktion HBsAg335-343 ist.
3 zeigt die HBV-spezifische CTL-Reaktion bei Patienten mit akuter Hepatitis-B-Infektion, solchen mit chronischer Hepatitis-B-Infektion und nicht infizierten Personen. PBMC von akuten Patienten (A-1 bis A-12), chronischen Patienten (C-1 bis C-6) und nicht infizierten Personen (N-1 bis N-6) wurden mit den folgenden synthetischen Peptiden stimuliert: 1 = HBcAg18-27, 2 = HBsAg201-210, 3 = HBsAg251-259, 4 = HBsAg260-269, 5 = HBcAg335-343, 6 = HBsAg338-347, 7 = HBsAg348-357, 8 = HBsAg378-387.
4 zeigt die Ergebnisse von kompetitiven Bindungshemmungsassays mit HLA-A2.1, dargestellt als prozentuelle Hemmung von HBcAg18-27-spezifischer Lyse in einem 4 Stunden dauernden ⁵¹Cr-Freisetzungsassay.
5 zeigt, dass die CTL-Reaktion auf HBsAg335-343 und HBsAg348-357 gruppenspezifisch bzw. subtypenspezifisch ist, und dass die synthetischen Peptide Epitope enthalten, die auch durch die endogene Verarbeitung der großen, mittleren und wichtigsten HBV-Hüllen-Polypeptide innerhalb von infizierten Zellen gebildet werden.
BESCHREIBUNG DER SPEZIFISCHEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die vorliegende Erfindung stellt Peptide, wie sie in Anspruch 1 angeführt sind, bereit, die von HBV-Hüllenproteinen stammen und zur Verwendung in Zusammensetzungen zur Behandlung, Prävention und Diagnose von HBV-Infektionen bestimmt sind. Die Peptide stimulieren MHC-HLA-Klasse-I-restringierte, zytotoxische T-Lymphozytenreaktionen gegen HBV-infizierte Zellen. Die stimulierten zytotoxischen T-Lymphozyten sind fähig, die infizierten Zellen abzutöten oder ihre virale Replikation zu hemmen und so Infektionen, einschließlich chronischer HBV-Infektionen, zu unterbrechen oder im Wesentlichen zu verhindern. Ein Peptid, das wirksam zur Induktion einer zytotoxischen T-Zellreaktion eingesetzt werden kann, kann auch mit einem Immunogen kombiniert werden, das zur Induktion einer T-Helfer-Reaktion fähig ist.
Die in der Erfindung eingesetzten Peptide stammen aus den Regionen HBenv183-191 (Seq.-ID Nr. 1), worin die Numerierung nach Galibert et al., w.o. vorgenommen wurde.
Unter einem zytotoxischen, T-Lymphozyten induzierenden HBV-"Peptid" oder -"Oligopeptid" gemäß vorliegender Erfindung ist eine Kette aus zumindest vier HBV-Aminosäuresequenzresten, vorzugsweise zumindest sechs, noch bevorzugter acht oder neun, manchmal zehn bis zwölf Resten, und üblicherweise weniger als etwa fünfzig Resten, noch häufiger weniger als etwa fünfunddreißig, vorzugsweise weniger als fünfundzwan zig, z.B. acht bis siebzehn, Aminosäureresten zu verstehen, die von einer HBc-Sequenz stammen. Manchmal ist es wünschenswert, die Peptide gemäß vorliegender Erfindung auf eine Länge von acht bis zwölf Aminosäurereste zu optimieren, was der Größe von endogen prozessierten viralen Peptiden entspricht, die an Moleküle der MHC-Klasse I auf der Zeltoberfläche gebunden sind. Für allgemeine Informationen dazu siehe Schumacher et al., Nature 350, 703–706 (1991); Van Bleek et al., Nature 348, 213–216 (1990); Rotzschke et al., Nature 348, 252–254 (1990); und Falk et al., Nature 351, 290–296 (1991). Wie weiter unten im Detail erläutert, weisen die Peptide üblicherweise zumindest eine Mehrheit an Aminosäuren auf, die homolog zu einem entsprechenden Abschnitt von benachbarten Resten der hierin identifizierten HBV-Sequenzen sind, und enthalten ein CTL-induzierendes Epitop.
Die Peptide können "synthetisch", wie hierin im Folgenden beschrieben wird, oder durch DNA-Rekombinationstechnik hergestellt werden. Obwohl die Peptide vorzugsweise im Wesentlichen frei von anderen natürlich vorkommenden HBV-Proteinen und Fragmenten davon sind, können die Peptide in manchen Ausführungsformen synthetisch an native Fragmente oder Teilchen konjugiert werden. Der Begriff Peptid wird in der vorliegenden Beschreibung austauschbar mit Polypeptid verwendet, um eine Reihe von Aminosäuren zu bezeichnen, die durch Peptidbindungen zwischen den α-Amino- und α-Carboxylgruppen benachbarter Aminosäuren miteinander verbunden sind. Die Polypeptide oder Peptide können entweder in ihren natürlichen (unveränderten) Formen oder in Form von Salzen mit unterschiedliche Längen vorliegen und entweder frei von Modifikationen, wie beispielsweise Glykosylierungen, Seitenkettenoxidationen oder Phosphorylierungen, sein oder solche Modifikationen enthalten, sofern die Modifikation nicht die hierin beschriebene biologische Aktivität der Polypeptide zerstört.
Wünschenswerterweise ist das Peptid so klein wie möglich, ohne jedoch viel von der biologischen Aktivität eines großen Peptids zu verlieren. Mit biologischer Aktivität ist seine Fähigkeit gemeint, sich an geeignete MHC-Moleküle zu binden und eine zytotoxische T-Lymphozytenreaktion gegen HBV-Antigene oder Antigenmimetika auszulösen.
Mit zytotoxischer T-Lymphozytenreaktion ist eine CD8⁺-T-Lymphozytenreaktion gemeint, die für ein HBV-Antigen von Interesse spezifisch ist, worin MHC-Klasse-I-restringierte CD8⁺-T-Lymphozyten aktiviert werden. Die aktivierten T-Lymphozyten scheiden Lymphokine (z.B. Gamma-Interferon) aus und setzen Produkte (z.B. Serinesterasen) frei, die virale Replikation in infizierten autologen Zellen oder transfizierten Zellen mit oder ohne Zellabtötung hemmen.
Die Begriffe "homolog", "im Wesentlichen homolog" und "wesentliche Homologie" bezeichnen hierin eine Sequenz von Aminosäuren mit zumindest 50% Identität, worin eine Sequenz mit einer Referenzsequenz von Aminosäuren verglichen wird. Der Prozentsatz der Identität oder Homologie wird berechnet, indem zwei miteinander verglichen werden, wenn sie mit entsprechenden Abschnitten der Referenzsequenz ausgerichtet sind.
Ein CTL-induziertes HBV-Peptid gemäß vorliegender Erfindung aus der Nukleokapsid-Region umfasst sechs bis fünfunddreißig Aminosäuren und enthält zumindest eine HLArestringierte CTL-Epitopstelle der Peptidregion Bhenv183-191 (Seq.-ID Nr. 1). Der Großteil der Aminosäuren des Peptids ist identisch mit oder im Wesentlichen homolog zu den Aminosäuren der entsprechenden Abschnitte der natürlich vorkommenden HBenv-183-191-Region, worin HBenv183-191 die folgenden Sequenz aufweist:
Die auf dieser HBenv183-191-Region basierenden Peptide können, je nach Wunsch, gegebenenfalls an einem oder beiden der N- und C-Termini durch Aminosäuren, um die Bindung zu erleichtern, andere N- und C-terminate Modifikationen, die an Träger gebunden sind, usw. flankiert und/oder modifiziert sein, wie hierin im Folgenden beschrieben ist. Das Peptid HBenv183-191 löst eine zytotoxische T-Lymphozytenreaktion aus, die durch zumindest das Molekül der MHC-Klasse I HLA-A2 vermittelt wird.
Andere HBenv-Peptide können als zweite immunogene Peptide in Zusammensetzungen enthalten sein. Beispiele dafür umfassen Peptide, die aus der Region von HBenv248-260 hergestellt werden. Peptide aus dieser Region enthalten zumindest eine CTL-induzierende HLA-Klasse-I-restringierte Epitopstelle und umfassen typischerweise zumindest sieben Aminosäuren, noch häufiger neun, zehn, elf oder mehr Aminosäuren. Der Großteil der Aminosäuren des Peptids sind identisch mit oder im Wesentlichen homolog zu den Aminosäuren der entsprechenden Abschnitte der natürlich vorkommenden HBenv-248-260-Sequenz, worin HBenv248-260 die folgenden Sequenz aufweist (für HBV-Subtyp ayw):
Das Peptid aus der HBenv248-260-Region kann an einem oder beiden Termini flankiert und/oder modifiziert sein, wie hierin beschrieben ist.
Repräsentative CTL-induzierende Peptide, die aus der Region von HBenv248-260 hergestellt wurden, umfassen die folgenden 9- und 10-Mer-Peptide:
Die oben genannten Peptide enthalten ein HLA-restringiertes CTL-induzierendes Epitop, das typischerweise zumindest HLA-A2-restringiert ist, und können an einem oder an beiden Termini flankiert und/oder modifiziert sein, wie oben für Peptid I erklärt wurde.
Weitere zweite immunogene Peptide umfassen Peptide, die das 10-Mer-Peptid HBenv-260-169 umfassen sowie Peptide von HBen260-269, die eine oder mehrere CTL-induzierende HLA-Klasse-I-restringierte Epitopstellen aus zumindest sieben benachbarten Aminosäuren enthalten. Der Großteil der Aminosäuren des Peptids ist identisch oder im Wesentlichen homolog zu den Aminosäuren der entsprechenden Abschnitte der natürlich vorkommenden HBenv-260-269-Sequenz, worin HBenv-260-269 die folgende Sequenz aufweist:
Ein Peptid, das aus dieser Region hergestellt ist, kann an einem oder an beiden Termini flankiert oder modifiziert sein, wie hierin beschrieben ist. Das Peptid HBenv260-269 (Seq.-ID Nr. 4) löst eine zytotoxische T-Lymphozytenreaktion aus, die durch zumindest das HLA-A2-Molekül der MHC-Klasse I vermittelt ist.
Weitere CTL-induzierende zweite immunogene Peptide stammen aus der Region von HBenv335-343 (Seq.-ID Nr. 10) und umfassen Peptide, die von HBenv335-343 (Seq.-ID Nr. 10) stammen, die eine oder mehrere CTL-induzierende HLA-Klasse-I-restringierte Epitopstellen aus zumindest sieben benachbarten Aminosäuren enthalten. Der Großteil der Aminosäuren des Peptids ist identisch oder im Wesentlichen homolog zu den Aminosäuren der entsprechenden Abschnitte der natürlich vorkommenden HBenv335-343-Sequenz, worin HBenv335-343 die folgende Sequenz aufweist:
worin das gewählte Peptid an einer oder an beiden Termini flankiert oder modifiziert sein kann, wie hierin beschrieben ist.
Weitere CTL-induzierende zweite immunogene Peptide stammen aus der Region von HBenv152-161 (Seq.-ID Nr. 11) und umfassen Peptide, die von HBenv152-161 (Seq.-ID Nr. 11) stammen, die eine oder mehrere CTL-induzierende HLA-Klasse-I-restringierte Epitopstellen aus zumindest sieben benachbarten Aminosäuren enthalten. Der Großteil der Aminosäuren des Peptids ist identisch oder im Wesentlichen homolog zu den Aminosäuren der entsprechenden Abschnitte der natürlich vorkommenden HBenv152-161-Sequenz, worin HBenv152-161 die folgende Sequenz aufweist (adw-Subtyp):
worin das gewählte Peptid an einer oder an beiden Termini flankiert oder modifiziert sein kann, wie hierin beschrieben ist.
Weitere CTL-induzierende, zweite immunogene Peptide stammen aus der Region von HBenv177-185 (Seq.-ID Nr. 12) und umfassen Peptide, die von HBenv177-185 (Seq.-ID Nr. 12) stammen, die eine oder mehrere CTL-induzierende HLA-Klasse-I-restringierte Epitopstellen aus zumindest sieben benachbarten Aminosäuren enthalten. Der Großteil der Aminosäuren des Peptids ist identisch oder im Wesentlichen homolog zu den Aminosäuren der entsprechenden Abschnitte der natürlich vorkommenden HBenv177-185-Sequenz, worin HBenv177-185 die folgende Sequenz aufweist (adw-Subtyp):
worin das gewählte Peptid an einer oder an beiden Termini flankiert oder modifiziert sein kann, wie hierin beschrieben ist.
Weitere CTL-induzierende, zweite immunogene Peptide stammen aus der Region von HBenv204-212 (Seq.-ID Nr. 13) und umfassen Peptide, die von HBenv204-212 (Seq.-ID Nr. 13) stammen, die eine oder mehrere CTL-induzierende HLA-Klasse-I-restringierte Epitopstellen aus zumindest sieben benachbarten Aminosäuren enthalten. Der Großteil der Aminosäuren des Peptids ist identisch oder im Wesentlichen homolog zu den Aminosäuren der entsprechenden Abschnitte der natürlich vorkommenden HBenv204-212-Sequenz, worin HBenv204-212 die folgende Sequenz aufweist (adw-Subtyp):
worin das gewählte Peptid an einer oder an beiden Termini flankiert oder modifiziert sein kann, wie hierin beschrieben ist.
Weitere CTL-induzierende zweite immunogene Peptide stammen aus der Region von HBenv370-379 (Seq.-ID Nr. 14) und umfassen Peptide, die von HBenv370-379 (Seq.-ID Nr. 14) stammen, die eine oder mehrere CTL-induzierende HLA-Klasse-I-restringierte Epitopstellen aus zumindest sieben benachbarten Aminosäuren enthalten. Der Großteil der Aminosäuren des Peptids ist identisch oder im Wesentlichen homolog zu den Aminosäuren der entsprechenden Abschnitte der natürlich vorkommenden HBenv370-379-Sequenz, worin HBenv370-379 die folgende Sequenz aufweist (adw-Subtyp):
worin das gewählte Peptid an einer oder an beiden Termini flankiert oder modifiziert sein kann, wie hierin beschrieben ist.
Wie oben erwähnt, können zusätzliche Aminosäuren an den Termini eines Oligopeptids oder Peptids hinzugefügt werden, um die Bindung von Peptiden untereinander, die Kopplung an einen Träger oder ein größeres Peptid – aus hierin ausgeführten Gründen – zu erleichtern, oder um die physikalischen oder chemischen Eigenschaften des Peptids oder Oligopeptids und dergleichen zu modifizieren. Aminosäuren, wie beispielsweise Tyrosin, Cystein, Lysin, Glutamin- oder Aspartinsäure und dergleichen, können am C- oder N-Terminus des Peptids oder Oligonukleotids hinzugefügt werden. Außerdem können sich Peptid- oder Oligopeptidsequenzen insofern von der natürlichen Sequenz unterscheiden, als sie durch terminale NH₂-Acylierung, z.B. Acetylierung oder Thioglykolsäure-Amidierung, terminate Carboxyl-Amidierung z.B. mit Ammoniak, Methylamin usw., modifiziert sind. In manchen Fällen können diese Modifikationen Stellen zur Bindung an einen Träger oder ein anderes Molekül bereitstellen.
Es versteht sich, dass die HBV-Peptide gemäß vorliegender Erfindung oder deren Analoge, die zytotoxische T-Lymphozyten-stimulierende Aktivität aufweisen, modifiziert werden können, um andere gewünschte Merkmale aufzuweisen, beispielsweise verbesserte pharmakologische Eigenschaften, während die biologische Aktivität des unmodifizierten Peptids erhöht oder zumindest beibehalten wird. Beispielsweise können die Peptide durch das Verlängern, Verkürzen oder Substituieren von Aminosäuren in der Peptidsequenz modifiziert werden, z.B. durch Addition oder Deletion von Aminosäuren entweder am aminoterminalen und/oder carboxyterminalen Ende von Peptiden, die von den hierin geoffenbarten Sequenzen stammen. Die Peptide können so modifiziert werden, dass sie die CTL-induzierende Aktivität im Wesentlichen verstärken, so dass die modifizierten Peptidanaloge eine stärkere CTL-Aktivität aufweisen als ein Peptid der Wildform-Sequenz. Beispielsweise kann es wünschenswert sein, die Hydrophobie des N-Terminus eines Peptids zu erhöhen, vor allem wenn der zweite Rest des N-Terminus hydrophob ist an der Bindung an das HLA-Restriktionsmolekül mitwirkt. Durch Erhöhung der Hydrophobie am N-Terminus kann die Wirksamkeit der Präsentation gegenüber T-Zellen erhöht werden. Peptide, die aus mit anderen Erkrankungen zusammenhängenden Antigenen produziert werden, vor allem solche, die CTL-induzierende Epitope enthalten, für welche ein Wirt eventuell keine bedeutende CTL-Aktivität aufweist, kann durch Substituieren von hydrophoben Resten am N-Terminus des Peptids, wo der zweite Rest normalerweise hydrophob ist, CTL-induzierend gemacht werden.
Die in der vorliegenden Erfindung eingesetzten Peptide müssen nicht mit den Peptiden HBenv183-191 (Seq.-ID Nr. 1), HBenv248-260 (Seq.-ID Nr. 2), HBenv248-257 (Seq.-ID Nr. 3), HBenv249-257 (Seq.-ID Nr. 4), HBenv249-258 (Seq.-ID Nr. 5), HBenv250-258 (Seq.-ID Nr. 6), HBenv251-259 (Seq.-ID Nr. 7), HBenv251-260 (Seq.-ID Nr. 8), HBenv260-269 (Seq.-ID Nr. 9), HBenv335-343 (Seq.-ID Nr. 10), HBenv152-161 (Seq.-ID Nr. 11), HBenv177-185 (Seq.-ID Nr. 12), HBenv204-212 (Seq.-ID Nr. 13) oder HBenv370-379 (Seq.-ID Nr. 14) ident sein, solange die betreffenden Verbindungen zytotoxische T-Lymphozytenaktivität gegen zumindest eine der vier Hauptsubtypen von HBV bereitstellen können. Obwohl unterschiedliche Stämme von HBV existieren, weisen alle zumindest eine gemeinsame Hüllendeterminante auf, die als "a" bezeichnet wird. Jeder Stamm weist außerdem zwei andere Hüllendeterminanten auf, von denen eine entweder "d" oder "y" und die andere entweder "w" oder "r" ist. Somit gibt es vier mögliche Subtypen des Virus: adw, ayw, adr und ayr. Das Klonieren, Sequenzieren und Exprimieren von HBV sind in der GB 2034323, EP 13828, US 4.935.235, und die gesamte Sequenz der HBV-Hüllenregion in Galibert et al., Nature 281, 646 (1979) beschrieben. Aminosäuresequenzen sind in der GenBank-72-Datenbank für 20 verschiedene HBV-Stämme – 7 des adw-Subtyps, 5 des ayw-Subtyps, 7 des adr-Subtyps und 1 Stamm des ayr-Subtyps – beschrieben, wobei die GenBank-Sequenzen durch Verweis hierin aufgenommen sind.
Daher können die Peptide verschiedene Veränderungen, wie beispielsweise Insertionen, Deletionen und Substitutionen konservativer oder nichtkonservativer Art durchlaufen, wenn solche Veränderungen bestimmte Vorteile für ihre Verwendung mit sich bringen. Unter konservativen Substitutionen ist die Ersetzung eines Aminosäurerests durch einen anderen zu verstehen, der biologisch und/oder chemisch ähnlich ist, beispielsweise die Ersetzung eines hydrophoben Rests durch einen anderen. Zu Substitutionen zählen Kombinationen wie beispielsweise Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; und Phe, Tyr. Üblicherweise unterscheidet sich der Abschnitt der Sequenz, der ein zytotoxisches HBV-T-Lymphozyten-stimulierendes Epitop im Wesentlichen imitieren soll, nicht um mehr als etwa 20% von der Sequenz zumindest eines Subtyps von HBV, außer wenn zusätzliche Aminosäuren an beiden Termini hinzugefügt werden können, um die physikalischen oder chemischen Eigenschaften des Peptids zu modifizieren, damit beispielsweise die Bindung oder Kopplung und dergleichen vereinfacht wird. In Situationen, in denen sich Regionen der Peptidsequenzen unter HBV-Subtypen als polymorph herausstellen, kann es wünschenswert sein, eine oder mehrere Aminosäuren zu variieren, um unterschiedliche zytotoxische T-Lymphozyten-Epitope unterschiedlicher HBV-Stämme oder -Subtypen wirksamer zu imitieren.
Innerhalb der Peptidsequenzen, die gemäß vorliegender Erfindung identifiziert werden, einschließlich der oben angeführten repräsentativen Peptide, gibt es Reste (oder solche, die im Wesentlichen funktionell gleichwertig sind), die es dem Peptid ermöglichen, seine biologische Aktivität beizubehalten, d.h. die Fähigkeit, eine Klasse-I-restringierte zytotoxische T-Lymphozytenreaktion auf HBV-infizierte Zellen oder Zellen, die ein HBV-Antigen exprimieren, zu stimulieren. Diese Reste können durch einzelne Aminosäuresubstitutionen, -deletionen oder -insertionen identifiziert werden. Außerdem können die Beiträge der Seitenketten der Reste mittels systematischen Scannens mit einer spezifischen Aminosäure (z.B. Ala) sondiert werden. Peptide, die mehrere Substitutionen vertragen, umfassen im Allgemeinen solche Substitutionen wie kleine, relativ neutrale Moleküle, wie beispielsweise Ala, Gly, Pro oder ähnliche Reste. Die Anzahl und Art der Reste, die substituiert, addiert oder subtrahiert werden können, hängt vom notwendigen Abstand zwischen den wesentlichen Epitop-Punkten und bestimmten wünschenswerten Konformations- und Funktionseigenschaften ab (z.B. Hydrophobie im Gegensatz zu Hydrophilie). Gegebenenfalls kann die Bindungsaffinität von Peptidanalogen an ihr MHC-Molekül zur Präsentation gegenüber einem zytotoxischen T-Lymphozyten auch durch solche Veränderungen erzielt werden. Im Allgemeinen sollten alle Spacer-Substitutionen, -Additionen oder -Deletionen zwischen Epitope betreffenden und/oder konformationell wichtigen Resten Aminosäuren oder Gruppierungen einsetzen, die aus gewählt sind, um sterische und auf die Ladung bezogene Beeinträchtigungen zu verhindern, welche die Bindung stören könnten.
Peptide, die multiple Substitutionen unter Beibehaltung der gewünschten biologischen Aktivität vertragen, können auch als D-Aminosäure mit Peptiden synthetisiert werden. Ein derartiges Peptid kann als "Inverso"- oder "Retro-Inverso"-Form synthetisiert werden, d.h. durch Ersetzen von L-Aminosäuren einer Sequenz durch D-Aminosäuren oder durch Umkehrung der Sequenz der Aminosäuren und Ersetzen der L-Aminosäuren durch D-Aminosäuren. Da die D-Peptide wesentlich widerstandsfähiger gegenüber Peptidasen und daher in Serum und Geweben stabiler sind als ihre L-Peptid-Gegenstücke, kann die Stabilität von D-Peptiden unter physiologischen Bedingungen den Affinitätsunterschied gegenüber dem entsprechenden L-Peptid mehr als kompensieren. Außerdem können L-Aminosäure enthaltende Peptide mit oder ohne Substitutionen mit einer D-Aminosäure verkappt werden, um eine Exopeptidase-Zerstörung des antigenen Peptids zu hemmen.
Neben den hierin beschriebenen exemplarischen Peptiden stellt die Erfindung auch Verfahren zur Identifikation anderer Epitopregionen bereit, die mit den genannten Peptidregionen zusammenhängen, welche zur Induktion von MHC-restringierten zytotoxischen T-Lymphozytenreaktionen gegen HBV fähig sind. Die Verfahren umfassen das Gewinnen von peripheren Blutlymphozyten (PBL) von infizierten oder nicht infizierten Personen und das Aussetzen (Stimulieren) der Zellen synthetischen Peptid- oder Polypeptidfragmenten, die von einer Peptidregion von HBenv183-191 (Seq.-ID Nr. 1), HBenv248-260 (Seq.-ID Nr. 2), HBenv260-269 (Seq.-ID Nr. 9), HBenv335-343 (Seq.-ID Nr. 10), HBenv152-161 (Seq.-ID Nr. 11), HBenv177-185 (Seq.-ID Nr. 12), HBenv204-212 (Seq.-ID Nr. 13) oder HBenv370-379 (Seq.-ID Nr. 14) stammen. Pools aus überlappenden synthetischen Peptiden, von denen jedes typischerweise etwa 8 bis 20 Reste, vorzugsweise 9 bis 12 Reste, lang ist, können verwendet werden, um die Zellen zu stimulieren. Aktive Peptide können aus Pools ausgewählt werden, die zytotoxische T-Lymphozytenaktivität induzieren. Die Fähigkeit der Peptide, spezifische zytotoxische Aktivität zu in duzieren, wird durch Inkubieren der stimulierten PBL mit autolog markierten (z.B. ⁵¹Cr) Zielzellen (beispielsweise HLA-angepasste Makrophagen, T-Zellen, Fibroblasten oder B-Lyphoblastoidzellen), die mit den subgenomischen HBV-Fragmenten davon infiziert oder transfiziert sind, so dass das gewünschte Antigen von der Zelle endogen synthetisiert wird (oder die Zelle mit dem gewünschten Peptid gepulst wird), und Messen der spezifischen Freisetzung der Markierung bestimmt.
Sobald ein Peptid mit einer Epitopregion, die eine zytotoxische Z-Lymphozytenreaktion stimuliert, identifiziert ist, kann das MHC-Restriktionselement der Reaktion bestimmt werden. Das umfasst das Inkubieren der stimulierten PBL oder kurzfristiger Linien davon mit einer Reihe von (markierten) Zielzellen bekannter HLA-Typen, die mit dem genannten Peptid gepulst wurden, oder geeigneter Kontrollen. Das/die HLA-Allel(e) dieser Zellen, die durch CTL lysiert sind, werden mit Zellen verglichen, die nicht lysiert sind, und das/die HLA-Restriktionselemente) für die zytotoxische T-Lymphozytenreaktion auf das Antigen von Interesse wird identifiziert.
Carbone et al., J. Exp. Med. 167, 1767 (1988), haben berichtet, dass eine Stimulierung mit Peptiden zytotoxische T-Lymphozyten mit geringer Affinität zu entsprechenden endogenen Proteinen induzieren kann, so dass eine wiederholte Peptidstimulierung zytotoxische T-Lymphozyten ergeben kann, die Peptide, nicht aber native Antigene, erkennen. Da die Unfähigkeit stimulierter zytotoxischer T-Lymphozyten, native HBV-Proteine zu erkennen, in der Entwicklung von HBV-Peptid-Therapeutika und Vakzinen-Zusammensetzungen unerwünscht wäre, werden Verfahren eingesetzt, um diese mögliche Einschränkung zu umgehen. Eine sequentielle Restimulierung von zytotoxischen T-Zellen wird in der vorliegenden Erfindung eingesetzt, um T-Zellen mit höherer Affinität zu natürlich prozessierten Antigenen als zu synthetischen Peptiden zu identifizieren und auszuwählen. Kurzfristige zytotoxische T-Lymphozytenlinien werden durch Restimulieren aktivierter PBL gebildet. Zellen, die mit Peptiden stimuliert wurden, werden mit Peptiden und rekombinanten oder nativen HBV-Antigenen, wie beispielsweise HBsAg, restimuliert. Zellen mit Aktivität werden ebenfalls mit einem geeigneten T-Zellen-Mitogen, wie beispielsweise Phytohemagglutinin (PHA), stimuliert. Die restimulierten Zellen werden mit bestrahlten Allogen-PBLs als nichtspezifische Antigen-Quelle von T-Zellen-Unterstützung und HBV-Antigenen versehen. Um die Population von zytotoxischen T-Lymphozyten, die native HBV-Antigene erkennen, und langfristige Linien zu bilden, werden PBL von einem Patienten zuerst mit Peptiden und rekombinanten oder nativen HBV-Antigenen stimuliert und danach mit HLA-angepassten B-Lymphoblastoidzellen, die das entsprechende HBV-Antigen-Polypeptid stabil exprimieren, restimuliert. Die Fähigkeit der Zelllinien, endogen synthetisierte Antigene unter Verwendung autologer und allogenischer B-Lymphoblastoiden oder anderer Zellen, die mit geeigneten Antigenen transfiziert oder infiziert sind, zu erkennen, wird erneut bestätigt.
Nach dem Identifizieren unterschiedlicher Peptide gemäß vorliegender Erfindung, die dazu beitragen, bei einem oder mehreren Patienten oder HLA-Typen zytotoxische Anti-HBV-T-Lymphozytenreaktionen zu stimulieren, kann es in bestimmten Fällen wünschenswert sein, zwei oder mehr Peptide in einer Zusammensetzung zu verbinden. Die Peptide in der Zusammensetzung können identisch oder unterschiedlich sein, wobei sie gemeinsam für gleichwertige oder höhere biologische Aktivität sorgen sollten als das/die Ausgangspeptid(e). Unter Einsatz der hierin beschriebenen Verfahren können beispielsweise zwei oder mehr Peptide unterschiedliche oder überlappende zytotoxische T-Lymphozyten-Epitope aus einer bestimmten Region definieren, beispielsweise die Peptide HBenv248-257 (Seq.-ID Nr. 3), HBenv249-257 (Seq.-ID Nr. 4), HBenv249-258 (Seq.-ID Nr. 5), HBenv250-258 (Seq.-ID Nr. 6), HBenv251-259 (Seq.-ID Nr. 7), HBenv251-260 (Seq.-ID Nr. 8), wobei diese Peptide in einem "Cocktail" kombiniert werden können, um verstärkte Immunogenität für zytotoxische T-Lymphozytenreaktionen bereitzustellen. Außerdem können Peptide einer Region auch mit Peptiden anderer HBV-Regionen auf demselben oder einem anderen HBV-Protein kombiniert werden, vor allem wenn ein zweites oder darauffolgendes Peptid ein MHC-Restriktionselement aufweist, das sich vom ersten unterscheidet Andere CTL-induzierende HBV-Peptide sind in der Parallelanmeldung USSN 07/935.898 beschrieben. Diese Zusammensetzung von Peptiden kann wirksam dazu eingesetzt werden, immunologischen Schutz zu erhöhen, den The rapie-, Vakzinen- oder Diagnoseverfahren und Zusammensetzungen gemäß vorliegender Erfindung innerhalb einer diversen Population bieten. Die unterschiedliche Häufigkeit von HLA-Allelen innerhalb der am weitesten verbreiteten ethnischer Gruppen (Weißen, Asiaten und schwarzen Afrikanern) sind beispielsweise in der folgenden Tabelle I angeführt. Therapeutische oder Vakzinenzusammensetzungen gemäß vorliegender Erfindung können formuliert werden, um einem möglichst großen Teil einer Population mögliche Therapien bereitzustellen oder Immunität zu verleihen. Tabelle I Häufigkeit von HLA-Allelen innerhalb der am weitesten verbreiteten ethnischen Gruppen
Die Peptide gemäß vorliegender Erfindung können mittels Verbindung zur Bildung von Polymeren (Multimeren) kombiniert oder in einer Zusammensetzung ohne Verbindung formuliert sein. Wenn das gleiche Peptid mit sich selbst verknüpft wird und dadurch ein Homopolymer bildet, werden viele sich wiederholende Epitopeinheiten präsentiert. Wenn sich die Peptide unterscheiden, beispielsweise in Form eines Cocktails aus unterschiedlichen HBV-Subtypen, unterschiedlichen Epitopen innerhalb eines Subtyps, unterschiedlichen HLA-Restriktionsspezifitäten, oder Peptiden, die T-Helfer-Epitope enthalten, vorliegen, werden Heteropolymere mit Grundeinheiten bereitgestellt. Neben kovalenten Bindungen sind auch nichtkovalente Bindungen möglich, die intermolekulare und intrastrukturelle Bindungen eingehen können.
Bindungen für Homo- oder Heteropolymere oder zur Kopplung an Träger können auf unterschiedliche Weise bereitgestellt werden. Beispielsweise können Cysteinreste am Amino- und Carboxylterminus hinzugefügt werden, wobei die Peptide mittels kontrollierter Oxidation der Cysteinreste kovalent gebunden werden. Außerdem eigenen sich eine Vielzahl an heterobifunktionellen Mitteln, die eine Disulfidbindung an einem Ende mit funktioneller Gruppe und eine Peptidbindung am anderen erzeugen, z.B. N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)proprionat (SPDP). Dieses Reagens erzeugt in einem Protein eine Disulfidbindung zwischen sich selbst und einem Cysteinrest und im anderen eine Amidbindung durch das Amino auf einem Lysin oder einer anderen freien Aminogruppe. Eine Reihe solcher Disulfid/Amid-bildenden Mittel ist bekannt. Siehe beispielsweise Immun. Rev. 62, 105 (1982). Andere bifunktionelle Kopplungsmittel bilden einen Thioether statt einer Disulfidbindung. Viele dieser Thioether bildenden Mittel sind im Handel erhältlich und enthalten reaktive Ester von 6-Maleimidocapronsäure, 2-Bromessigsäure, 2-Iodessigsäure, 4-(N-Maleimidomethyl)cyclohexan-1-carbonsäure und dergleichen. Die Carboxylgruppen können aktiviert werden, indem sie mit Succinimid oder 1-Hydroxy-2-nitro-4-sulfonsäure-natriumsalz kombiniert werden. Ein besonders bevorzugter Koppler ist Succinimidyl-3-(N-maleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat (SMCC). Es versteht sich, dass die Bindung die beschriebene Funktion der verbundenen Gruppen nicht nennenswert beeinträchtigen soll, z.B. die Funktion als zytotoxische HBV-T-Zellen-Determinante, Peptidanaloge oder T-Helferzellen-Determinante.
In einem weiteren Aspekt können die Peptide gemäß vorliegender Erfindung mit anderen Peptiden kombiniert oder gekoppelt werden, die HBV-T-Helferzellen-Epitope präsentieren, d.h. Epitope, die T-Zellen stimulieren, die an der Induktion zytotoxischer T-Zellen gegen HBV mitwirken. Die T-Helferzellen können beispielsweise entweder der T-Helfer-1- oder der T-Helfer-2-Phenoytp sein. T-Helfer-Epitope von HBV-Sequenzen wurden an HBcl-20 identifiziert und weisen die folgende Sequenz auf: Met-Asp-Ile-Asp-Pro-Tyr-Lys-Glu-Phe-GIy-Ala-Thr-Val-Glu-Leu-Leu-Ser-Phe-Leu-Pro (Seq.-ID Nr. 17). Andere T-Helfer-Epitope werden durch Peptide der Region HBc50-69 bereitgestellt und weisen die folgende Sequenz auf: Pro-His-His-Tyr-Ala-Leu-Arg-Gln-Ala-Ile-Leu-Cys-Trp-Gly-Glu-Leu-Met-Tyr-Leu-Ala (Seq.-ID Nr. 18), sowie von der Region HBc100-119 mit der Sequenz: Leu-Leu-Trp-Phe-His-Ile-Ser-Cys-Leu-Thr-Phe-Gly-Arg-Glu-Thr-Val-Ile-Glu-Tyr-Leu (Seq.-ID Nr. 19) (worin Ile₁₁₆ im HBV adw-Subtyp Leu ist), HBc117-131 mit der Sequenz Glu-Tyr-Leu-Val-Ser-Phe-Gly-Val-Trp-Ile-Arg-Thr-Pro-Pro-Ala (Seq.-ID Nr. 20) und Peptid HBc120-139 mit der Sequenz Val-Ser-Phe-Gly-Val-Trp-Ile-Arg-Thr-Pro-Pro- Ala-Tyr-Arg-Pro-Pro-Asn-Ala-Pro-Ile (Seq.-ID Nr. 21). Siehe Ferrari et al., J. Clin. Invest. 88, 214–222 (1991), und das US-Patent 4.882.145.
Die Peptide gemäß vorliegender Erfindung können auf verschiedenste Weise hergestellt werden. Aufgrund ihrer relativ geringen Größe können die Peptide in einer Lösung oder auf einem festen Träger gemäß herkömmlicher Verfahren synthetisiert werden. Verschiedene automatische Synthetisatoren sind im Handel erhältlich und können unter Einhaltung bekannter Arbeitsvorschriften verwendet werden. Siehe beispielsweise Stewart und Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", 2. Ausgabe, Pierce Chemical Co. (1984); Tam et al., ). Am. Chem. Soc. 105, 6442 (1983); Merrifield, Science 232, 341–347 (1986); und Barany und Merrifield, "The Peptides", S. 1–284, Gross und Meienhofer (Hrsg.), Academic Press, New York, (1979).
Alternativ dazu kann DNA-Rekombinationstechnik eingesetzt werden, wobei eine Nukleotidsequenz, die für ein Peptid von Interesse kodiert, in einen Expressionsvektor insertiert, transformiert oder in eine geeignete Wirtszelle transfiziert und unter für die Expression geeigneten Bedingungen kultiviert wird. Diese Verfahren sind auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt und von Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1982), und von Ausubel et al. (Hrsg.), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Inc., New York (1987), sowie in den US-Patenten Nr. 4.237.224, 4.273.875, 4.431.739, 4.363.877 und 4.428.941 beschrieben, wobei diese Veröffentlichungen hierin durch Verweis aufgenommen sind. So können Fusionsproteine, die eine oder mehrere Peptidsequenzen gemäß vorliegender Erfindung umfassen, dazu verwendet werden, die zytotoxischen HBV-T-Zellen-Determinanten zu präsentieren. Beispielsweise wird ein rekombinantes Hüllenprotein gemäß vorliegender Erfindung hergestellt, in dem die HBenv-Aminosäuresequenz so verändert ist, dass Epitope von hierin beschriebenen Peptidregionen effizienter präsentiert werden, um eine zytotoxische T-Lymphozytenreaktion zu stimulieren. Auf diese Weise wird ein Polypeptid verwendet, das mehrere T-Zellen-Epitope umfasst.
Da die Kodierungssequenz für Peptide der hierin geoffenbarten Länge durch chemische Techniken synthetisiert werden kann, beispielsweise mittels des Phosphotriester-Verfahrens von Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc. 103, 3185 (1981), kann die Modifikation erfolgen, indem einfach die geeignete(n) Base(n) durch jene ersetzt wird/werden, die für die native Peptidsequenz kodiert/kodieren. Die Kodierungssequenz kann dann mit geeigneten Linkern versehen und in auf dem Gebiet zur Verfügung stehende Expressionsvektoren ligiert werden, wobei Vektoren dazu dienen, geeignete Wirte zu transformieren, um das gewünschte Fusionsprotein zu produzieren. Derzeit stehen einige solcher Vektoren und geeignete Wirtsysteme zur Verfügung. Zur Expression der Fusionsproteine wird die Kodierungssequenz mit operabel verbundenen Start- und Stopcodons, Promotor- und Terminatorregionen und üblicherweise einem Replikationssystem versehen, um einen Expressionsvektor zur Expression im gewünschten Zellwirt bereitzustellen. Beispielsweise sind Promotorsequenzen, die mit bakteriellen Wirten verträglich sind, in Plasmiden zu finden, die geeignete Restriktionsstellen zur Insertion der gewünschten Kodierungssequenz enthalten. Die resultierenden Expressionsvektoren werden in geeignete bakterielle Wirte transformiert. Auch Hefe- oder Säugetierzellenwirte können unter Einsatz geeigneter Vektoren und Kontrollsequenzen verwendet werden.
Die Peptide gemäß vorliegender Erfindung und deren pharmazeutische und Vakzinen-Zusammensetzungen eignen sich zur Verabreichung an Säugetiere, insbesondere Menschen, zur Behandlung und/oder Prävention von HBV-Infektion. Da die Peptide dazu dienen, zytotoxische T-Lymphozyten-Reaktionen auf HBV-infizierte Zellen zu stimulieren, kann man die Zusammensetzungen zur Behandlung oder Prävention akuter und/oder chronischer HBV-Infektionen heranziehen.
Für pharmazeutische Zusammensetzungen werden die oben beschriebenen Peptide gemäß vorliegender Erfindung an eine bereits mit HBV infizierte Person verabreicht. Personen in der Inkubationsphase oder in der akuten Infektionsphase können mit den immunogenen Peptiden je nach Bedarf separat oder in Kombination mit anderen Therapien behandelt werden. Bei therapeutischen Anwendungen werden Zusammensetzun gen in einer Menge an einen Patienten verabreicht, die ausreicht, um eine wirksame zytotoxische T-Lymphozytenreaktion auf HBV hervorzurufen und seine Symptome und/ oder Komplikationen heilt oder zumindest teilweise stoppt. Eine Menge, mit der dies erreicht wird, wird als "therapeutisch wirksame Dosis" definiert. Dafür geeignete Mengen hängen beispielsweise von der Peptidzusammensetzung, der Verabreichungsart, dem Stadium und der Schwere der behandelten Krankheit, dem Gewicht und dem allgemeinen Gesundheitszustand des Patienten sowie dem Urteil des verschreibenden Arztes, liegt im Allgemeinen jedoch im Bereich von etwa 1 μg bis etwa 2.000 μg Peptid für einen 70 kg schweren Patienten, wobei Dosen im Bereich von etwa 10 μg bis etwa 10 mg Peptid häufiger eingesetzt werden, gefolgt von Auffrischungsdosen von etwa 1 μg bis etwa 1 mg Peptid über Wochen bis Monate, je nach der CTL-Reaktion eines Patienten, die durch Messung der HBV-spezifischen CTL-Aktivität in PBLs des Patienten bestimmt wird. Man muss berücksichtigen, dass die Peptide und Zusammensetzungen gemäß vorliegender Erfindung im Allgemeinen in schweren Krankheitsfällen, d.h. in lebensbedrohlichen oder möglicherweise lebensbedrohlichen Situationen, eingesetzt werden können. In diesen Fällen ist es angesichts der minimal vorhandenen externen Substanzen und der relativen nichttoxischen Beschaffenheit der Peptide möglich und vom Standpunkt des behandelnden Arztes möglicherweise auch wünschenswert, beträchtliche Überschüsse dieser Peptidzusammensetzungen zu verabreichen.
Einzelne oder mehrfache Verabreichungen der Zusammensetzungen können mit vom behandelnden Arzt ausgewählten Dosiswerten und Dosismustern durchgeführt werden. Auf jeden Fall sollten die pharmazeutischen Formulierungen eine Menge an zytotoxischen, T-Lymphozyten-stimulierenden Peptiden der Erfindung bereitstellen, die zur wirksamen Behandlung des Patienten ausreicht.
Für die therapeutische Verwendung sollte die Verabreichung beim ersten Anzeichen einer HBV-Infektion oder kurz nach der Diagnose im Falle akuter Infektionen einsetzen und solange fortgesetzt werden, bis zumindest Symptome im Wesentlichen abgeklungen sind, und sogar noch länger. Bei starken und chronischen Fällen sind möglicherwei se Erhaltungsdosen gefolgt von Auffrischungsdosen erforderlich. Die Induktion einer wirksamen zytotoxischen T-Lymphozytenreaktion auf HBV während der Behandlung von akuter Hepatitis minimiert die Möglichkeit einer anschließenden Entwicklung chronischer Hepatitis, eines HBV-Trägerzustands und eines Leberzellkarzinoms.
Die Behandlung einer infizierten Person mit den Zusammensetzungen gemäß vorliegender Erfindung kann den Rückgang der Infektion bei akut infizierten Personen beschleunigen, von denen etwa 90 % zur natürlichen Rückbildung der Infektion fähig sind. Für jene Personen, die für die Entwicklung chronischer Infektion anfällig (oder prädisponiert) sind, eignen sich die Zusammensetzungen besonders in Verfahren zur Verhinderung der Weiterentwicklung einer akuten Infektion zu einer chronischen Infektion. Wenn anfällige Personen vor oder während der Infektion beispielsweise wie hierin beschrieben identifiziert werden, können die Zusammensetzungen auf sie abgezielt werden, wodurch die Notwendigkeit der Verabreichung an eine größere Population minimiert wird.
Die Peptidzusammensetzungen können auch zur Behandlung chronischer Hepatitis und zur Stimulierung des Immunsystems von Trägern herangezogen werden, um virusinfizierte Zellen zu reduzieren oder sogar zu eliminieren. Patienten mit chronischer Hepatitis können etwa 3 bis 6 Monate nach der Infektion als viruspositiv identifiziert werden. Da Personen aufgrund einer inadäquaten (oder fehlenden) zytotoxischen T-Lymphozytenreaktion während der akuten Phase ihrer Infektion eine chronische HBV-Infektion entwickeln können, ist es wichtig, eine Menge des immunpotenzierenden Peptids in einer Formulierung und Verabreichungsweise bereitzustellen, die ausreicht, um eine zytotoxische T-Zellen-Reaktion wirksam zu stimulieren. Bei der Behandlung chronischer Hepatitis liegt daher eine repräsentative Dosis für einen 70 kg schweren Patienten im Bereich von 1 μg bis 1.000 mg, vorzugsweise etwa 5 μg bis 100 mg, pro Dosis. Die Verabreichung sollte fortgesetzt werden, bis zumindest klinische Symptome oder Laborindikatoren anzeigen, dass die HBV-Infektion eliminiert wurde oder deutlich abgeklungen ist, und noch länger. Möglicherweise sind Immunisierungsdosen und anschließende Er haltungs- oder Auffrischungsdosen in festgelegten Intervallen, z.B. 1 bis 4 Wochen, eventuell über einen längeren Zeitraum, notwendig, um die Infektion zu bekämpfen. Bei der Behandlung chronischer und Träger-HBV-Infektionen kann es wünschenswert sein, die CTL-Peptide mit anderen Peptiden oder Proteinen zu kombinieren, die Immunreaktionen auf andere HBV-Antigene induzieren.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen für die therapeutische Behandlung sind zur parenteralen, topischen, oralen oder lokalen Verabreichung bestimmt. Vorzugsweise werden die. pharmazeutischen Zusammensetzungen parenteral verabreicht, beispielsweise intravenös, subkutan, intradermal oder intramuskulär. Somit stellt die Erfindung Zusammensetzungen zur parenteralen Verabreichung bereit, die eine Lösung der zytotoxischen T-Lymphozyten-stimulierenden Peptide umfassen, die in einem annehmbaren Träger, vorzugsweise einem wässrigen Träger, gelöst oder suspendiert sind. Eine Reihe verschiedener Träger kann verwendet werden, beispielsweise Wasser, gepuffertes Wasser, 0,4% Salzlösung, 0,3% Glycin, Hyaluronsäure und dergleichen. Diese Zusammensetzungen können durch herkömmliche, allgemein bekannte Sterilisationsverfahren sterilisiert oder sterilfiltriert werden. Die resultierenden wässrigen Lösungen können in diesem Zustand zur Verwendung verpackt oder lyophilisiert werden, wobei das lyophilisierte Präparat vor der Verabreichung mit einer sterilen Lösung kombiniert wird. Die Zusammensetzungen können pharmazeutisch annehmbare Zusatzsubstanzen enthalten, die notwendig sind, um physiologische Bedingungen anzupassen, wie beispielsweise pH-Regler und Puffer, Tonizitätsregler, Netzmittel und dergleichen, z.B. Natriumacetat, Natriumlactat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid, Sorbitanmonolaurat, Triethanolaminoleat usw.
In einigen Ausführungsformen kann es wünschenswert sein, in die pharmazeutische Zusammensetzung zumindest eine CTL primende Komponente aufzunehmen. Lipide wurden als Mittel identifiziert, die CTL in vivo gegen virale Antigene primen können, beispielsweise Tripalmitoyl-S-glycerylcysteinylserylserin (P₃CSS), das virusspezifische zytotoxische T-Lymphozyten effektiv primen kann, wenn es kovalent an ein geeignetes Pep tid gebunden ist. Siehe Deres et al., Nature 342, 561–564 (1989). Peptide gemäß vorliegender Erfindung können beispielsweise an P₃CSS gebunden sein, und das Lipopeptid kann an eine Person verabreicht werden, um spezifisch eine zytotoxische T-Lymphozytenreaktion auf HBV zu primen. Da die Induktion neutralisierender Antikörper auch mit P₃CSS geprimt werden kann, das an ein Peptid konjugiert ist, das ein geeignetes Epitop, wie beispielsweise HBsAg-Epitope, aufweist, können die zwei Zusammensetzungen kombiniert werden, um wirksamer sowohl humorale als auch zellmediierte Reaktionen auf HBV-Infektion hervorzurufen.
Die Konzentration der zytotoxische T-Lymphozyten-stimulierenden Peptide gemäß vorliegender Erfindung in den pharmazeutischen Formulierungen kann stark variieren, d.h. von weniger als etwa 1, üblicherweise von (zumindest) etwa 10, bis 20 bis 50 oder mehr Gew.-%, und wird vor allem in Hinblick auf die Flüssigkeitsvolumina, Viskositäten usw. entsprechend der jeweiligen Verabreichungsart ausgewählt.
Somit könnte eine typische pharmazeutische Zusammensetzung zur die intravenösen Infusion 250 ml sterile Ringer-Lösung und 100 mg Peptid enthalten. Tatsächliche Verfahren zur Herstellung parenteral verabreichbarer Verbindungen sind Fachleuten auf dem Gebiet bekannt und ausführlich in beispielsweise "Remington's Pharmaceutical Sciences", 17. Ausg., Mack Publishing Company, Easton, PA, USA (1985), beschrieben.
Die Peptide der Erfindung können auch über Liposomen verabreicht werden, die dazu dienen, die Peptide auf ein bestimmtes Gewebe, wie z.B. Lymphgewebe, abzuzielen. Liposomen können auch verwendet werden, um die Halbwertszeit der Peptidzusammensetzung zu verlängern. Die in der vorliegenden Erfindung verwendbaren Liposomen umfassen Emulsionen, Schäume, Mizellen, unlösliche Monoschichten, Flüssigkristalle, Phospholipid-Dispersionen, lamellare Schichten und dergleichen. In diesen Präparaten ist das abzugebende Peptid als Teil eines Liposoms alleine oder in Kombination mit einem Molekül, das sich beispielsweise an einen Rezeptor bindet, der unter Lymphzellen vorherrscht, beispielsweise monoklonale Antikörper, die sich an das CD45-Antigen binden, oder zusammen mit anderen therapeutischen oder immunogenen Zusammensetzungen enthalten. Liposomen, die mit einem gewünschten Peptid der Erfindung gefüllt sind, können demnach zur Stelle der Lymph- oder Leberzellen geleitet werden, an der die Liposomen dann die ausgewählten therapeutischen/immunogenen Peptidzusammensetzungen abgeben. Liposomen, die sich zur Verwendung gemäß vorliegender Erfindung eignen, bestehen aus herkömmlichen Bläschen bildenden Lipiden, die im Allgemeinen neutrale und negativ geladene Phospholipide und ein Sterin wie etwa Cholesterin enthalten. Die Auswahl der Lipide wird im Allgemeinen von Faktoren wie etwa Liposomengröße und Stabilität der Liposome im Blutstrom bestimmt. Eine Vielzahl von Verfahren steht zur Erzeugung von Liposomen zur Verfügung; siehe beispielsweise Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9, 467 (1980), die US-Patente Nr. 4.235.871, 4.501.728, 4.837.028 und 5.019.369. Zum Abzielen auf die Immunzellen kann ein im Liposom enthaltener Ligand beispielsweise Antikörper oder Fragmente davon enthalten, die für Zelloberflächen-Determinanten der gewünschten Immunsystemzellen spezifisch sind. Eine Liposomen-Suspension mit einem Peptid kann intravenös, lokal, topisch usw. in einer Dosis verabreicht werden, die je nach Verabreichungsart, dem abzugebenden Peptid und dem Stadium der behandelten Krankheit variiert.
Für feste Zusammensetzungen können konventionelle, nichttoxische, feste Träger verwendet werden, die beispielsweise pharmazeutisch reines) Mannit, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Talk, Cellulose, Glucose, Saccharose, Magnesiumcarbonat und dergleichen aufweisen. Zur oralen Verabreichung wird eine pharmazeutisch annehmbare, nichttoxische Zusammensetzung hergestellt, indem beliebige der normalerweise verwendeten Exzipienten, wie beispielsweise die oben angeführten Träger, und im Allgemeinen 10 bis 95% des Wirkstoffs, d.h. ein oder mehrere Peptide gemäß vorliegender Erfindung, noch bevorzugter in einer Konzentration von 25 bis 75%, aufgenommen werden.
Zur Aerosol-Verabreichung werden die zytotoxische T-Lymphozyten-stimulierenden Peptide vorzugsweise in feinteiliger Form zusammen mit einem Tensid und einem Treibmittel zugeführt. Typische Prozentsätze der Peptide reichen von 0,01 bis 20 Gew.-%, vorzugsweise 1 bis 10 Gew.-%. Das Tensid muss natürlich nichttoxisch sein und ist vorzugsweise im Treibmittel löslich. Repräsentative Beispiele für solche Mittel sind die Ester oder partiellen Ester von Fettsäuren mit 6 bis 22 Kohlenstoffatomen, beispielsweise Capron-, Octan-, Laurin-, Palmitin-, Sterin-, Linol-, Linolen-, Olesterin- und Ölsäure, mit einem aliphatischen mehrwertigen Alkohol oder dessen zyklischem Anhydrid. Gemischte Ester, wie beispielsweise gemischte oder natürliche Glyceride, kommen ebenfalls in Frage. Das Tensid kann 0,1 bis 20 Gew.-%, vorzugsweise 0,25 bis 5 Gew.-%, der Zusammensetzung ausmachen. Der Rest der Zusammensetzung ist üblicherweise Treibmittel. Ein Träger kann gegebenenfalls auch enthalten sein, beispielsweise Lecithin für die intranasale Zufuhr.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung Vakzinen, die als Wirkstoff eine immunogen wirksame Menge eines hierin beschriebenen zytotoxischen T-Lymphozyten-stimulierenden Peptids enthalten. Das oder die Peptid(e) kann/können in einen Wirt, einschließlich Menschen, eingeführt werden, und zwar verbunden mit dem eigenen Träger oder als Homopolymer oder Heteropolymer von aktiven Peptideinheiten. Solch ein Polymer besitzt den Vorteil einer verstärkten immunologischen Reaktion und, bei Verwendung unterschiedlicher Peptide zur Bildung des Polymers, die zusätzliche Fähigkeit, Antikörper und/oder zytotoxische T-Zellen zu induzieren, die mit verschiedenen antigenen Determinanten von HBV reagieren. Geeignete Träger sind auf dem Gebiet allgemein bekannt und umfassen beispielsweise Thyroglobulin, Albumine, wie z.B. Humanserum-Albumin, Tetanustoxoid, Polyaminosäuren, wie z.B. Poly(D-Lysin:D-Glutaminsäure) und dergleichen. Die Vakzinen können auch einen physiologisch verträglichen (annehmbaren) Verdünnen, wie beispielsweise Wasser, eine phosphatgepufferte Salzlösung oder eine Salzlösung enthalten und umfassen ferner typischerweise ein Adjuvans. Adjuvantien, wie beispielsweise unvollständiges Freund-Adjuvans, Aluminiumphosphat, Aluminiumhydroxid oder Alaun sind auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt. Wie oben erwähnt können zytotoxische T-Lymphozytenreaktionen durch Konjugieren von Peptiden gemäß vorliegender Erfindung an Lipide, wie beispielsweise P₃CSS, geprimt werden. Nach Immunisierung mit einer hierin beschriebenen Peptidzusammensetzung mittels Injektion, Aerosol, orale, transdermale oder eine andere Art der Verabreichung reagiert das Immunsystem des Wirts auf die Vakzine, indem große Mengen an für das HBV-Antigen spezifischen zytotoxischen T-Lymphozyten produziert werden und der Wirt zumindest teilweise gegen die HBV-Infektion immun oder gegen die Entwicklung chronischer HBV-Infektion resistent wird.
Vakzinen-Zusammensetzungen, welche die Peptide gemäß vorliegender Erfindung enthalten, werden an einen Patienten verabreicht, der für HBV-Infektionen anfällig ist oder sonst Gefahr läuft, daran zu erkranken, um die patienteneigenen Immunreaktionsfähigkeiten zu stärken. Die verabreichte Menge wird als "immunologisch wirksame Dosis" definiert. Bei der Verwendung hängen die genauen Mengen wieder vom Gesundheitszustand und dem Gewicht des Patienten, von der Verabreichungsart, von der Beschaffenheit der Formulierung usw. ab, doch im Allgemeinen reichen sie von etwa 1,0 μg bis etwa 500 mg für einen 70-kg-Patienten, noch häufiger von etwa 50 μg bis etwa 200 mg pro 70 kg Körpergewicht. Die Peptide werden an Personen eines geeigneten HLA-Typs verabreicht, beispielsweise werden diese für Vakzinen-Zusammensetzungen von den Regionen von HBenv183-191 (Seq.-ID Nr. 1), HBenv248-260 (Seq.-ID Nr. 2), HBenv-260-269 (Seq.-ID Nr. 9), HBenv335-343 (Seq.-ID Nr. 10), HBenv152-161 (Seq.-ID Nr. 11), HBenv177-185 (Seq.-ID Nr. 12), HBenv204-212 (Seq.-ID Nr. 13) oder HBenv370-379 (Seq.-ID Nr. 14) an zumindest HLA-A2-Personen verabreicht.
In einigen Fällen kann es wünschenswert sein, die Peptidvakzinen gemäß vorliegender Erfindung mit Vakzinen zu kombinieren, die neutralisierende Antikörperreaktionen auf HBV, insbesondere auf HBV-Hüllenantigene, induzieren, wie beispielsweise rekombinante HBVenv-kodierte Antigene oder Vakzinen aus gereinigten Plasmapräparaten, die von HBV-infizierten Personen erhalten werden. Eine Vielzahl an HBV-Vakzinenpräparaten wurde beschrieben, die vor allem auf HBsAg und Polypeptidfragmenten davon beruhen. Beispiele für Vakzinen, die mit den Peptiden gemäß vorliegender Erfindung formuliert werden können, finden sich in den EP 154.902 und EP 291.586 sowie in den US- Patenten Nr. 4.565.697, 4.624.918, 4.599.230, 4.599.231, 4.803.164, 4.882.145, 4.977.092, 5.017.558 und 5.019.386. Die Vakzinen können kombiniert und gleichzeitig oder als getrennte Präparate verabreicht werden.
Für therapeutische oder Immunisierungszwecke können die Peptide gemäß vorliegender Erfindung auch durch abgeschwächte virale Wirte, wie beispielsweise Vaccinia, exprimiert werden. Diese Vorgangsweise umfasst die Verwendung eines Vaccinia-Virus als Vektor zum Exprimieren von Nukleotidsequenzen, die für die HBV-Peptide gemäß vorliegender Erfindung kodieren. Nach Einsetzen in einen akut oder chronisch HBV-infizierten Wirt oder in einen nicht-infizierten Wirt exprimiert das rekombinante Vaccinia-Virus das HBV-Peptid und ruft so eine zytotoxische T-Lymphozytenreaktion auf HBV im Wirt hervor. Vaccinia-Vektoren und Verfahren für Immunisierungs-Arbeitsvorschriften finden sich beispielsweise im US-Patent Nr. 4.722.848. Ein weiterer Vektor ist BCG (Bacille Calmette Guerin). BCG-Vektoren wurden von Stover et al., Nature 351, 456–460 (1991), beschrieben. Eine Vielzahl anderer Vektoren, die sich zur therapeutischen Verabreichung oder Immunisierung der Peptide gemäß vorliegender Erfindung eignen, z.B. Salmonella-typhi-Vektoren und dergleichen, ergeben sich für Fachleute auf dem Gebiet der vorliegenden Beschreibung.
Die Zusammensetzungen und Verfahren gemäß vorliegender Erfindung können auch für Ex-vivo-Therapien eingesetzt werden. Mit Ex-vivo-Therapien sind therapeutische oder immunogene Manipulationen gemeint, die außerhalb des Körpers durchgeführt werden. Beispielsweise können Lymphozyten oder andere Zielzellen aus einem Patienten entfernt und mit hohen Dosen des genannten Peptids behandelt werden, wodurch eine stimulierende Konzentration von Peptiden im Zellmedium bereitgestellt wird, die weit über den Werten liegt, die vom Patienten erzielt oder toleriert werden könnten. Nach einer Behandlung zur Stimulierung der CTLs werden die Zellen wieder in den Wirt zurückgeführt, um die HBV-Infektion zu behandeln. Die Wirtszellen können auch Vektoren ausgesetzt werden, die für die Peptide kodierende Gene tragen, wie oben beschrieben ist. Sobald sie mit den Vektoren transfiziert sind, können die Zellen in vitro ver mehrt oder in den Patienten zurückgeführt werden. Die Zellen, die in vitro vermehrt werden, können nach Erreichen einer vorbestimmten Zellendichte wieder in den Patienten zurückgeführt werden.
Die Peptide können auch als diagnostische Reagenzien verwendet werden. Beispielsweise kann ein Peptid gemäß vorliegender Erfindung dazu dienen, die Anfälligkeit einer bestimmten Person gegenüber einem Behandlungsregime zu bestimmen, bei dem das Peptid oder ähnliche Peptide zum Einsatz kommen, und kann somit dabei helfen, eine bestehende Behandlungsarbeitsvorschrift zu modifizieren oder eine Prognose für eine betroffene Person zu erstellen. Darüber hinaus können die Peptide auch dazu dienen, vorherzusagen, welche Individuen ernsthaft Gefahr laufen, eine chronische HBV-Infektion zu entwickeln.
Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung und nicht der Einschränkung.
BEISPIEL 1
Identifizierung CTL-spezifischer HBenv-Epitope
Dieses Beispiel beschreibt die Identifizierung von HBenv-Peptiden, die für HGV-Hüllenantigene spezifische HLA-restringierte CTL-Reaktionen stimulieren.
Alle Patienten der Studie waren HLA-A2-positiv. Dreizehn Patienten (A-1 bis A-13; Tabelle II) wurden während einer Episode von akuter Hepatitis untersucht, wobei 6 (C-1 bis C-6) chronische HBV-Infektion litten und 6 nicht infizierte, gesunde Freiwillige (N-1 bis N-6) waren, die als nicht infizierte Kontrollpersonen dienten. Die Patienten und ihre HLA-Haplotypen, die unter Einsatz von PBMC in Mikrozytotoxizitätsprüfungen mit HLA-Typisierungsplatten (One Lambda, Canoga Park, CA, USA) bestimmt wurden, sind in Tabelle II angeführt.
Die Diagnose von akuter Hepatitis basierte auf herkömmlichen Diagnosekriterien. Diagnostische Parameter umfassten klinische (Ikterus) und biochemische Beweise für Leberschäden (ALT-Aktivität zumindest 20 Mal höher als die normale Obergrenze), sowie serologische Beweise für eine akute HBV-Infektion (Vorhandensein von HBV-Oberflächenantigenen (HBsAg) und IgG-Anti-HBc-Antikörpern), in Ermangelung von serologischen Beweisen für Hepatitis-Delta- und Hepatitis-C-Virusinfektionen (Abbott Laboratories, North Chicago, IL, USA). Alle Patienten wurden während der ersten 4 Wochen nach Beginn des Ikterus untersucht, und zu diesem Zeitpunkt waren ihr Serum HBsAG-positiv und ihre ALT-Werte deutlich anomal. Elf der 13 Patienten erholten sich anschließend von der Krankheit, wobei vier Monate nach der Erstdiagnose eine Normalisierung der Serumtransaminase und Clearance von HBsAg beobachtet wurde. Ein Patient (A-11, Tabelle II) entwickelte chronische aktive Hepatitis und blieb bis zu 13 Monaten nach der Erstdiagnose HBsAg-positiv. Patienten mit chronischer Hepatitis B waren über sechs Monate lang wiederholt serologisch HBsAg-positiv und wiesen leicht bis mittelmäßig erhöhte Serum-ALT-Aktivität auf. Nicht infizierte Kontrollpersonen hatten keine klinische Vorgeschichte in Bezug auf HBV-Infektionen und waren serologisch negativ für HBV-Marken. Alle Patienten und Kontrollpersonen waren serologisch negativ für Antikörper gegen HIV. Tabelle II Merkmale der untersuchten Personen
PBMC von Patienten und normalen Spendern wurden mithilfe von Ficoll-Hypaque-Dichtegradienten (Sigma, St. Louis, MO, USA) getrennt, drei Mal in Hanks ausgeglichener Salzlösung (HBSS) (Gibco, Grand Island, NY, USA) gewaschen, im Medium RPMI 1640 (Gibco, Grand Island, NY, USA) mit L-Glutamin (2 mM), Gentamicin (10 μg/ml, Penicillin (50 Einheiten/ml), Streptomycin (50 μg/ml) und HEPES (5 mM), das 10 Hitze-inaktiviertes Human-AB-Serum (Vollkultur) enthielt, ergänzt und mit 4 × 10⁶ Zellen/Napf in 24-Napf-Platten plattiert. Die synthetischen Peptide wurden, falls nicht anders angegeben, mit einer Endkonzentration von 10 μg/ml zu den Zellkulturen zugesetzt. Während der ersten Stimulierungswoche wurde 1 μg/ml rHBcAg zugesetzt. Am Tag 3 wurde zu jedem Napf 1 ml Vollkultur, die mit einer Endkonzentration von 10 Einheiten/ml mit rIL2 (Hoffman-La Roche, Nutley, NY, USA) ergänzt war, zugesetzt. Am Tag 7 wurden die Kulturen mit dem Peptid rIL2 restimuliert und autolog bestrahlt (300 Rad) oder mit HLA-A2-identischen Nährzellen restimuliert, und am Tag 14 wurden die kultivierten PBMC auf ihre CTL-Aktivität getestet. Ausgewählte Kulturen, die Peptid-spezifische zytolytische Aktivität aufwiesen, wurden durch wöchentliche Restimulation mit 1 × 10⁶ bestrahlten (6.000 Rad) allogenischen PBMC und 1 × 10⁵ bestrahlten (18.000 Rad) JY-Zellen (allogenische EBV-B-transformierte Zelllinie, HLA-A2.1, B7, Cw7) (14) in 1 ml Vollkultur, die 1 μg/ml Peptid, 20 Einheiten/ml IL2 und 1 μg/ml Phytohämagglutinin (PHA) (Sigma, St. Louis, MO, USA) enthielt, expandiert.
Zielzellen für Zytotoxizitätstests bestanden entweder aus a) autologen PHA-stimulierten Blasten oder allogenischen HLA-identischen und -nichtidentische EBV-transformierten B-Lymphoblastoidzelllinien (B-LCL), die über Nacht mit 10 μg/ml synthetischen Peptiden inkubiert wurden; b) oben beschriebenen stabilen B-LCL-Transfektanten; oder c) mit rekombinanten Vaccinia-Viren infizierten B-LCL (Beschreibung folgt). B-LCL wurden entweder von der American Society for Histocompatibility and Immunogenetics (Boston, MA, USA) bezogen oder wie in der Parallelanmeldung 07/935.898 beschrieben aus dem Pool aus Patienten und normalen Spendern der Erfinder gewonnen. Die Zellen wurden in mit L-Glutamin (2 mM), Gentamicin (10 μg/ml), Penicillin (50 Einheiten/ml), Streptomycin (50 μg/ml), HEPES (5 mM) und 10 Vol.-% durch Hitze inaktivierte FCS (Gibco, Grand Island, NY, USA) ergänztem RPMI 1640 gehalten. Kurzfristige Linien von autologen PBMC-Blasten wurden hergestellt, indem PBMC mit 1 μg/ml PHA im RPMI 1640, das mit L-Glutamin (2 mM), Gentamicin (10 μg/ml, Penicillin (50 Einheiten/ml), Streptomycin (50 μg/ml), HEPES (5 mM) und 10 Vol.-% durch Hitze inaktivierte FCS (Gibco, Grand Island, NY, USA) ergänzt war, und 10 Einheiten/ml rIL2 7 Tage lang stimuliert wurden, bevor sie als Zielzellen eingesetzt wurden. Vaccinia-infizierte Zielzellen wurde hergestellt, indem 1 × 10⁶ Zellen auf 50 plaquebildenden Einheiten/Zelle auf einer Schüttelplatte eine Stunde lang bei Raumtemperatur infiziert wurden, gefolgt von einem einmaligen Waschen und einer Inkubation bei 37°C über Nacht.
Zielzellen wurden eine Stunde lang mit 100 μCi ⁵¹Cr (Amersham, AirlingtonHeights, IL, USA) markiert und drei Mal mit HBSS gewaschen. Die zytolytische Aktivität wurde in einem herkömmlichen 4-stündigen ⁵¹Cr-Freisetzungstest unter Einsatz von U-förmigen 96-Napf-Platten mit 5.000 Zielzellen pro Napf bestimmt. Alle Tests wurden doppelt durchgeführt. Die prozentuelle Zytotoxizität wurde mithilfe der folgenden Formel bestimmt: 100 × [(experimentelle Freisetzung – spontane Freisetzung)/(maximale Freisetzung – spontane Freisetzung)]. Die maximale Freisetzung wurde durch Lyse von Zielzellen durch ein Detergens (1% Triton X-100, Sigma) bestimmt. Die spontane Freisetzung betrug in allen Tests weniger als 25% der maximalen Freisetzung.
Zwei HLA-A2-positive Patienten mit akuter Hepatitis (A-1 und A-3) wurden zuerst für eine Analyse der CTL-Reaktion auf HBsAg329-348 (ASARFSWLSLLVPFVQWFVG (Seq.-ID Nr. 22)) ausgewählt, das 2 überlappende HLA-A2.1-Allel-spezifische Bindungsmotive (WLSLLVPFV und LLVPFVQWFV) enthält. Von einem dieser Patienten (A-3-) war aus vorherigen Versuchen bekannt, dass er eine HLA-A2-restringierte CTL-Reaktion auf ein 10 Reste umfassendes HBV-Nukleokapsid-Epitop (HBcAg18-27) aufweist, das ebenfalls ein HLA-A2.1-Allal-spezifisches Bindungsmotiv (FLPSDFFPSV) darstellt. Dieser Patie_nt wurde als potentieller Reagent auf ein oder beide Motive) in HBsAg329-348 betrachtet. Ein anderer Patient (A-1 ), von dem bekannt war, dass er nicht auf HBcAg18-27 reagiert, wurde zum Vergleich untersucht.
Aus PBMC beider Patienten wurden HBsAg329-348-spezifische CTL-Linien erzeugt, indem sie mit dem oben beschriebenen Peptid stimuliert wurden. Nach 2 bis 3 Stimulierungsvorgängen wiesen beide Patienten eine starke zytotoxische Reaktion gegen eine homozygote HLA-A2.1-positive EBV-Zelllinie JY) auf, die mit dem HBsAg329-348-Peptid vorgepulst worden war. die HBsAg329-348-spezifische Zelllinie von Patient A-1 wurde zum Klonieren ausgewählt.
CTL-Linien wurden in 96-Napf-Mikrotiterplatten ursprünglich bei 1, 10 und 100 Zellen pro Napf kloniert und dann bei 0,3 oder 1 Zellen pro Napf subkloniert. Die Zellen wurden in Gegenwart eines Peptids (1 μg/ml), von PHA (1 μg/ml), rIL-2 (20 Einheiten/ml), bestrahlten (6.000 Rad) allogenischen PBMC (10⁵ Zellen/Napf) und bestrahlten (18.000 Rad) JY-Zellen (10⁴ Zellen/Napf) plattiert. Ein HBV-spezifische Klone wurde in einer 24-Napf-Platte wie oben beschrieben kloniert, mit der Ausnahme, dass das Peptide ausgelassen und 10⁵ Zellen pro Napf bestrahlte JY-Zellen, die mit einem Plasmid transfiziert waren, das eine stabile Expression des großen HBV-Hüllenantigens (EBO-preS1, Referenz 10), zugesetzt wurden.
Unter Verwendung der HBsAg329-348-spezifischen Zelllinie von Patient A-1 wurden vier Klone von Zellen abgeleitet, die bei 1 Zelle pro Napf (Klon B13, B16, B17) oder 0,3 Zellen pro Napf (Klon B3) plattiert wurden. Der Klon B3 wurde gegen eine Reihe von allogenischen Zielzellen getestet, die teilweise mit den Effektoren auf der Ebene von HLA-Klasse-I-Allelen identisch waren. Unter Verwendung allogenischen Zielzellen, die in Bezug auf HLA-Klase I teilweise mit jenen von Patient A-1 identisch waren, zeigte sich, dass die zytolytische Aktivität des Klons B3 HLA-A2-restringiert war, weil 2-HLA-A2.1-Bindungsmotive im Peptid vorhanden waren. Auch eine HBsAg329-348-spezifische polyklonale CTL-Linie, die vom Patienten A-2 stammte, wurde auf dieselbe Weise als HLA-A2-restringiert ausgewiesen. Da die HLA-A2-Subtypen der Patienten nicht bestimmt wurden, ist nicht bekannt, ob die CTL-Reaktion auf die Peptide nur durch das HLA-A2.1-Allel restringiert ist oder sich auch auf andere HLA-A2-Subtypen erstreckt.
Um ein minimales, optimales HLA-A2-restringiertes CTL-Epitop in HBsAg329-348 zu bestimmen, wurde eine Reihe von aminoterminalen Verkürzungen und überlappenden 9-Meren und 10-Meren, die von der HBsAg329-348-Sequenz stammten, hergestellt, um das/die in diesem 20 Reste umfassenden Peptid, das 2 überlappende ideale HLA-A2.1-Bindungsmotive enthielt, vorhandenen HLA-A2-restringierten CTL-Epitop(e) zu kartieren. Der HLA-A2-restringierte CTL-Klon B17 vom Patienten A-1 und eine polyklonale CTL-Linie 1B9 vom Patienten B-3, die durch wiederholte Stimulierung von der oben beschriebenen anfänglichen Zelllinie und von HBsAg329-348 abgeleitet waren, wurden als Effektorzellen verwendet, um die Feinspezifität der CTL-Reaktion auf BHsAg329-348 herzustellen. Zielzellen wurden hergestellt, indem eine HLA-A2.1-positive B-Zelllinie (JY) entweder mit dem ursprünglichen 20-Mer oder mit den verkürzten Peptiden inkubiert wurden.
Die Ergebnisse, die in 1 angeführt sind, zeigen, dass nur das erste der beiden 2-HLA-A2.1-Bindungsmotive (HBsAg335-343) vom CTL erkannt wird. Außerdem zeigen die Daten, dass dieses Peptid (WLSLLVPFV) das minimale, optimale HLA-A2-restringierte Epitop ist, das vom durch HBsAg329-348 stimulierten CTL erkannt wird, da die Auslassung des äußersten aminoterminalen oder des äußersten carboxyterminalen Rests von HBsAg335-343 die Erkennung durch das CTL aufhebt.
Die Überlegenheit von HBsAg335-343 auf der Effektor-Ebene wurde erneut belegt, als Peptide verwendet wurden, um eine CTL-Reaktion in PBMC vom Patienten A-1 zu stimulieren. 10 μM synthetische Peptide, die ausgewählte HBsAg329-348-Untereinheiten darstellten, wurden verwendet, um PBMC vom Patienten A-1 zu stimulieren. Nach zweiwöchiger Stimulierung wurde die Zytotoxizität dieser Linien bei E : T 60 : 1 gegen JY-Zielzellen, die mit 10 μM desselben Peptids vorgepulst waren, und gegen JY-Zielzellen, die mit 10 μM HBsAg335-343 vorgepulst waren, getestet. Die in 2 angeführten Ergebnisse zeigen die prozentuelle Lyse in einem 4-stündigen ⁵¹CR-Freisetzungsassay. Wie aus 2 ersichtlich ist, führt die Auslassung der äußersten amino- und carboxyterminalen Aminosäuren, obwohl die Fähigkeit von HBsAg335-343 und ihre verlängerten Varianten, eine CTL-Reaktion auszulösen bestätigt wurde, zur vollkommenen Aufhebung der Fähigkeit der Peptide, eine CTL-Reaktion zu stimulieren, wodurch die Schlussfolgerung nahe gelegt wird, dass HBsAg335-343 das minimale, optimale HLA-A2-restringierte Epitop zwischen den Resten 329-348 von HBsAg ist.
BEISPIEL II
CTL-Reaktion auf sieben HLA-A2.1-Bindungsmotive in HBVenv
Sieben ideale HLA-A2.1-Allel-spezifische Bindungsmotive, die als Peptide mit einer Länge von 9 bis 10 Resten definiert sind, die an der zweiten Position ein Leucin und als carboxyterminalen Rest ein Valin enthalten, sind in der HBsAg-Region des HBV-Hüllenproteins vorhanden (Tabelle III). Basierend auf den in Beispiel 1 erhaltenen Ergebnissen, wurde die Fähigkeit dieser sieben Hüllenpeptide sowie des bekannten HLA-A2-restringierten HBV-Nukleokapsid-Epitops (HBcAg18-27) untersucht, in 12 HLA-A2-positiven Patienten mit akuter Hepatitis B eine CTL-Reaktion zu stimulieren. Zum Vergleich wurden sechs HLA-A2-positive Patienten mit chronischer Hepatitis und sechs nicht infizierte, normale Personen auf ihr Ansprechvermögen auf dieselben Peptide getestet. Tabelle III Von HBV stammende HLA-A2.1-Bindungsmotive und Peptide
PBMC von akuten Patienten (A-1 bis A-12), chronischen Patienten (C-1 bis C-6) und normalen Personen (N-1 bis N-6) wurden mit den folgenden synthetischen Peptiden stimuliert: 1 = HBcAg18-27, 2 = HBsAg201-210, 3 = HBsAg251-259, 4 = HBsAg260-269, 5 = HBsAg335-343, 6 = HBsAg338-347,7 = HBsAg348-357, 8 = HBsAg378-387, und zwar zwei Wochen lang, wie in Beispiel 1 beschrieben, und in einem vierstündigen ⁵¹Cr-Freisetzungassay gegen JY-Zielzellen getestet, die über Nacht mit demselben Peptid vorgepulst waren. Die peptidspezifische Zytotoxizität wurde gemessen, indem die ⁵¹Cr-Freisetzung durch JY-Zielzellen, die nicht mit einem Peptid vorgepulst waren, von der ⁵¹Cr-Freisetzung durch JY-Zielzellen, die mit dem Peptid vorgepulst waren, abgezogen wurde. Die Ergebnisse (3) zeigen die prozentuelle spezifische Lyse in einem 4-stündigen ⁵¹Cr-Freisetzungsassay.
Wie aus 3 ersichtlich ist, reagierten neun der zwölf HLA-A2-positiven Patienten mit akuter Hepatitis auf zumindest eines der Peptide. Im Gegensatz dazu reagierte unter Einsatz derselben In-vitro-Stimulierungsstrategie keine der sechs HLA-A2-positiven, nicht infizierten normalen Kontrollpersonen auf ein Peptide, was zu der Schlussfolgerung führt, dass das Ansprechvermögen der Patienten auf diese Peptide das In-vivo-Priming durch die entsprechenden von HBV stammenden Epitope widerspiegelt.
Wichtig ist, dass acht der neun reagierenden Personen multiple Epitope aus der Reihe erkannten, was darauf hinweist, dass die CTL-Reaktion auf HBV während einer akuten Hepatitis sowohl polyklonal als auch multispezifisch ist. Außerdem gab es eine wesentliche Variation im Epitop-Spektrum, das von den neun reagierenden Personen erkannt wurde, so dass bestimmte Epitope häufiger erkannt wurden als andere. HBcAg18-27 und HBsAg335-343 wurden beispielsweise von sieben bzw. acht der reagierenden Personen erkannt, und in Kombination wurden sie von allen neun reagierenden Personen erkannt. Im Gegensatz dazu wurden HBsAg348-357, HBsAg251-259 und HBsAg260-269 von nur 3/9, 2/5 und 3/6 der reagierenden Personen, in denen sie getestet wurden, erkannt.
Eine Nukleotidsequenzanalyse der zirkulierenden Virion-DNA von Patienten mit akuter Infektion zeigte, dass alle Patienten, einschließlich jener ohne CTL-Reaktion, durch Viren infiziert wurden, welche die exakte Aminosäuresequenz, die im Prototyp HBsAg-335-343-Peptid, das zur Stimulierung einer Expansion von CTL in vitro verwendet wird, vorhanden ist, exprimierte. Da bekannt ist, dass Reste 335-343 in allen veröffentlichten HBV-Sequenzen von allen 4 HBV-Subtypen erhalten bleiben, wie in der GenBank-72-Datenbank veröffentlicht ist, und auch in den hierin untersuchten 10 Patienten erhalten bleiben, kann die Schlussfolgerung folgen, dass HBsAg335-343 ein HBV-Gruppen-spezifisches CTL-Epitop ist. Das gilt jedoch nicht für HBsAg348-357, da nur sieben der zehn Patienten durch Viren infiziert waren, die für die Prototyp-Sequenz kodieren, die zur In-vitro-Stimulierung eingesetzt wird (GLSPTVWLSV). Die restlichen drei Patienten (A-9, A-10, A-13) wiesen eine variierte Sequenz auf, in der das carboxyterminale Valin an Position 357 mit einem Alanin substituiert war. Unter den Patienten, die durch den Prototyp-Virus infiziert waren, gab es solche, die CTL-Reaktion auf HBsAg348-357 aufwiesen, und solche, die keine Reaktion aufwiesen, wie auch in Bezug auf die Reaktion auf HBsAg335-343. Auf der anderen Seite wies keiner der 3 Patienten, die durch den variierten Virus infiziert waren, eine CTL-Reaktion auf das Prototyp-Peptid auf.
Beachtenswert ist, dass alle neun reagierenden Personen danach HBsAg-negativ wurden und ihre Lebererkrankung völlig heilte. Im Gegensatz dazu waren alle sechs Patienten mit chronischer Hepatitis, die zu keiner Clearance des Virus fähig waren, auch zu keiner CTL-Reaktion im peripheren Blut auf eines dieser Epitope fähig. Drei der Patienten mit akuter Infektion (A-10, A-11, A-12) waren außerdem zu keiner Reaktion auf eines dieser Peptide fähig. Darüber hinaus entwickelte eine der Personen, die keine Reaktion aufwies (A-10), chronische aktive Hepatitis und war 13 Monate nach seiner akuten Erkrankung immer noch HBsAg-positiv. Diese zusammengefassten Daten lassen vermuten, dass eine Verbindung zwischen der CTL-Reaktion und der viralen Clearance besteht. Patient A-12, der keine Reaktion zeigte, serokonvertierte jedoch zwischen 1 bis 4 Monaten nach Beginn der Krankheit zu HBsAg-Negativität.
Wie aus Tabelle II und 3 ersichtlich, hatten vier der neun reagierenden Personen nur das HLA-A2-Allel mit der JY-Zelllinie, die in dieser Untersuchung verwendet wurde (HLA-A2, B7, Cw7), gemein, was darauf hinweist, dass die Reaktion auf all diese Peptide bei dieser Personen HLA-A2-restringiert war. Da die restlichen reagierenden Personen neben A2 auch das HLA-B7- und/oder Cw7-Allel in den JY-Zelllinien gemein hatten, ist es möglich – wenn auch unwahrscheinlich -, dass in diesen Patienten all diese Allele als Restriktionselemente für diese Epitope dienen können.
Die molekulare Basis für die unterschiedliche Immunogenität der sieben HBV-Hüllenpeptide war aus einem Vergleich ihrer Sequenzen nicht sofort erkennbar. Mögliche Unterschiede in der relativen Bindungsaffinität der Peptide an HLA-A2.1 würden untersucht, indem die Fähigkeit der sieben Hüllenpeptide, mit der Bindung eines nicht verwandten HLA-A2-restringierten Nukleokapsid-Epitops (HBcAg18-27) an eine homozygote HLA-A2.-positive B-Zelllinie (JY) zu konkurrieren, bestimmt wurde.
Beim kompetitiven Bindungshemmungstest wurde ein HBcAg18-27-spezifischer CTL-Klon vom Patienten A-4 als Effektorzellen-Quelle verwendet. Blockerpeptide (1, 10, 100 μM) wurden über einen Zeitraum von 40 Minuten zu einem Gemisch von ⁵¹Cr-markierten, HLA-A2.1-positiven JY-Zielzellen und Effektorzellen (E : T = 40 : 1, 3.000 Zielzellen/Napf) zugesetzt, bevor eine Untersättigungskonzentration (0,03 μM) des Zielpeptids, HBcAg^18-27, zugesetzt wurde. Die Bindungsfähigkeit der einzelnen Peptide wurde bewertet, indem der Grad, in dem sie die Lyse von Zielzellen in einem 4-stündigen ⁵¹Cr-Freisetzungsassay blockierten, berechnet wurde.
Wie in 4 dargestellt, banden sich alle vier immunogenen Peptide und zwei der drei nicht immunogenen Peptide an das HLA-A2.1-Molekül, jedoch mit äußerst (mehr als 100fach) variablen Wirkungsgraden, die nicht mit ihrer relativen Immunogenität korrelierten. Wichtig ist, dass nur ein Peptid, das sich in diesem Assay nicht an HLA-A2.1 band (HBsAg337-348), nicht immunogen war. Bei den anderen beiden nicht immunogenen Peptiden war jedoch die HLA-A2.1-Bindungsaffinität genauso stark oder stärker als bei einigen der immunogenen Peptide. Somit ist, obwohl die Fähigkeit eines Peptids, an dieses Klasse-I-Molekül zu binden, für die Immunogenität erforderlich, jedoch nicht garantiert. Das führt zu der Annahme, dass die zusätzlichen Faktoren auf der Ebene des Antigen-Processing und des T-Zellen-Repertoirs eine Rolle bei der Bestimmung der HLA-A2.1-Bindungspeptide in einem viralen Protein spielen könnten, die zur Induktion einer CTL-Reaktion fähig sind.
BEISPIEL III
Peptid-spezifische CTL erkennen endogenes HBenv-Antigen
Die Fähigkeit von HBsAg_335-343- und HBsAg_348-357-spezifischen CTL, ein endogen synthetisiertes Antigen zu erkennen, wurde untersucht, indem ihre Fähigkeit gemessen wurde, Zielzellen zu lysieren, die mit zwei Gruppen von rekombinanten Vaccinia-Viren infiziert waren, die für große, mittlere und Haupt-Hüllenpolypeptide von klonierten HBV-Genomen des ayw- oder des adw-Subtyps von HBV kodierten.
Rekombinante Vaccinia-Viren, welche die großen, mittleren und Haupt-Hüllenpolypeptide exprimieren (adw-Subtyp), und eine entsprechende Vaccinia der Wildform zur Kontrolle wurden erhalten (Smith, et al., Nature 302, 490 (1983); Cheng et al., J. Virol. 60, 337 (1986); und Cheng und Moss, ). Virol. 61, 1286 (1987)). Eine unabhängige Reihe von rekombinanten Vaccinia-Viren, die dieselben drei HBV-Hüllenpolypeptide von HBV-Subtyp ayw exprimieren, wurde wie folgt erhalten. Zur Expression des HBsAg wurde ein Xhol/Sphl-Restriktionsfragment, das die Nukleotide 1409–2514 der HBV-Sequenz enthielt, stromab vom frühen/späten 7,5-K-Promotor in einen Vaccinia-Virus-Expressionsvektor kloniert. Für den preS1-exprimierenden Vaccinia-Virus wurde ein Bgl-II/Sph-I-Fragment, das die Nukleotide 937-2514 enthielt, verwendet. Um die preS2-Kodierungssequenz zu klonieren, wurde zuerst ein kurzes Adapter-Oligonukleotid, das am Nukleotid 1267 begann (z.B. sechs Basenpaare stromauf vom preS2-Startcodon) synthetisiert und dieEco-RI-Stelle an Position 1280 umfasste. Nach Klonierung dieses Oligo nukleotids in den Vaccinia-Virus-Expressionsvektor wurde die Kodierungssequenz durch erneutes Klonieren des Eco-RI/Sphl-HBV-Fragments in dieses Zwischenkonstrukt vervollständigt (Nukleotide 1280-2514). Die Bildung von rekombinanten Vaccinia-Viren basierte auf Standardverfahren, wie sie in Smith et al., w.o. beschrieben sind. Stabile Transfektanten, welche die HBV-Hüllenproteine (ayw-Subtyp) exprimierten, wurden durch Transfektion von B-LCL mit einer Reihe von auf EBV basierenden Expressionsvektoren, welche die entsprechenden HBV-Kodierungssregionen (ayw-Subtyp) enthielten, hergestellt, was durch Verweis hierin aufgenommen ist.
Eine HBsAg_335-343-spezifische CTL-Linie (Patient A-1) und eine HBsAg_348-357-spezifische CTL-Linie (Patient A-4) wurden durch Stimulierung mit den Peptidsequenzen WLSLLVPFV bzw. GLSPTVWLSV gebildet. CTL wurden mit ⁵¹Cr-markierten JY-Zielzellen inkubiert, die vorher entweder mit einem Medium, mit dem induzierenden Peptid oder (im Falle von HBsAg_348-357) mit einem Variationspeptid (GLSPTVWLSA) inkubiert worden waren. CTL wurden auch mit ⁵¹Cr-markierten JY-Zielzellen inkubiert, die mit einer Reihe von 6 rekombinanten Vaccinia-Viren infiziert worden waren, welche die Haupt- (V-HBs), mittleren (V-preS2) und großen (V-preS2) HBV-Hüllenpolypeptide, die von ayw- und adw-HBV-Genomen, stammen, exprimierten. Vaccinia-Viren der Wildform (V-wt) wurden als Kontrolle verwendet. Die HBsAg_335-343-spezifische CTL-Linie (rechte Reihe) wurde in einem Verhältnis von E : T = 40 : 1 verwendet. Die HBsAg_348-3573-spezifische CTL-Linie (linke Reihe) wurde in einem Verhältnis von E : T = 3 : 1 verwendet. Die Ergebnisse zeigen die prozentuelle Lyse in einem 4-stündigen ⁵¹Cr-Freisetzungsassay.
Sowohl die HBsAg_335-343-spezifische als auch die HBsAg_348-357-spezifische CTL-Linie von den Patienten A-1 und A-4 waren zur Lyse von mit rekombinanten Vaccinia-Viren infizierten Zielzellen fähig, die alle drei der HBV-Hüllenproteine synthetisieren (5). Das zeigt, dass beide synthetischen Peptide Epitope darstellen, die durch endogene Prozessierung der großen, mittleren und Haupt-HBV-Hüllenpolypeptide in infizierten Zellen gebildet werden.
Wichtig ist, dass HBsAg_335-343-spezifische CTL Ziele, die durch beide Reihen von rekombinanten Vaccinia-Viren gleich wirksam infiziert waren, lysieren konnten, wobei mit ayw-infizierten Zielzellen lysierte HBsAg_348-357-spezifische CTL viel wirksamer sind als die adw-Ziele.
Die in den oben angeführten Beispielen beschriebenen Ergebnisse zeigen, dass die CTL-Reaktion auf HBV beim Menschen sehr polyvalent zu sein scheint, wahrscheinlich um einen effizienteren Schutz gegen diese ernste Virusinfektion bereitzustellen. Darüber hinaus weisen die Daten darauf hin, dass die hierin eingesetzte Peptid-Stimulierungsstrategie, so wie sie durch den polymorphen HLA-Klasse-I-Locus beschränkt ist, sowohl effizient als auch wirksam zur Identifizierung und Analyse der polyvalenten Reaktion verwendet werden kann. Da zusätzliche HLA-Allel-spezifischen Bindungsmotive identifiziert werden, können von HBV stammende Peptide, die diese Motive enthalten, zur In-vitro-Stimulierung von CTL-Vorläufern eingesetzt werden.
Alle in dieser Beschreibung erwähnten Veröffentlichungen, Patente und Patentanmeldung sind durch Verweis in die Beschreibung aufgenommen, und zwar so, als ob jede einzelne Publikation, jedes Patent oder jede Patentanmeldung speziell und einzeln durch Verweis hierin aufgenommen wäre.
Aus den oben gegebenen Erläuterungen ist ersichtlich, dass, obwohl hierin zum Zwecke der Veranschaulichung spezifische Ausführungsformen der Erfindung beschrieben wurden, verschiedenen Modifikationen vorgenommen werden können, ohne vom Geist und Schutzumfang der Erfindung abzuweichen. Demgemäß ist die Erfindung nur durch die beiliegenden Ansprüche eingeschränkt. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Peptid HBenv183-191 (Seq.-ID Nr. 1) Phe-Leu-Leu-Thr-Arg-Ile-Leu-Thr-Ile oder ein Fragment davon, worin sich das Peptid oder Fragment an ein HLA-A2-Molekül bindet, um einen Komplex zu bilden, der von zytotoxischen T-Zellen erkannt wird, wobei die T-Zellen ein natives HBV-Antigen erkennen.
Immunogene Zusammensetzung, die das Peptid oder Fragment nach Anspruch 1 und einen immunogenen Lipidträger umfasst.
Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 2, worin das Peptid an den Lipidträger konjugiert ist.
Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 2, worin der Lipidträger eine Human-T-Lymphozyten-Reaktion verstärkt.
Immunogene Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 2 bis 4, die weiters ein zweites immunogenes Peptid umfasst.
Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 5, worin das erste Peptid oder Fragment mit dem zweiten immunogenen Peptid verbunden ist, um ein Heteropolymer zu bilden.
Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 5 oder 6, worin das zweite Immunogene Peptid eine Immunreaktion hervorruft, die für Hepatitis-B-Virus spezifisch ist.
Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 5 oder 6, worin das zweite Immunogene Peptid eine T-Helferzellen-vermittelte Reaktion hervorruft.
Peptid oder Fragment nach Anspruch 1 zur Verwendung in einem medizinischen Behandlungsverfahren.
Verwendung des Peptids oder Fragments nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von oder Vorbeugung gegen Hepatitis-B-Infektion in einem Wirt, der einen HLA-A2-Haplotyp aufweist.
Verwendung nach Anspruch 10, worin der Wirt an akuter Hepatitis-B-Infektion leidet.
Verwendung nach Anspruch 10 oder 11, worin das CTL induzierende Peptid prophylaktisch verabreicht wird.
Verwendung nach Anspruch 10, worin der Wirt an chronischer Hepatitis-B-Infektion leidet oder ein Hepatatis-B-Träger ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 10 bis 13, worin das CTL induzierende Peptid zusammen mit einem zweiten Peptid an den Wirt verabreicht wird, das eine T-Helfer-Reaktion auf HBV herbeiführt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 10 bis 14, worin das CTL induzierende Peptid und T-Helfer induzierende Peptid verbunden sind.