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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Die vorliegende Erfindung betrifft
Verfahren zum Bekämpfen
von pflanzenparasitären
Nematoden durch Anwendung einer rekombinanten DNA-Technologie und
betrifft die Erzeugung von transgenen Pflanzen.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Weltweit sind pflanzenparasitäre Nematoden
die am stärksten
zerstörenden
Pathogene für
die Lebenserhaltung von Feldfrüchten.
Im Jahr 1984 führten
Nematoden zu wirtschaftlichen Verlusten von mehr als 50 Milliarden
Dollar (US). Der Anteil der Vereinigten Staaten an diesem Wert allein
beträgt
fast 6 Milliarden Dollar. Bei einigen Kulturpflanzen gibt es eine
genetische Widerstandsfähigkeit
gegenüber
bestimmten Nematodenarten, jedoch sind diese in der Zahl beschränkt und
die Verfügbarkeit
von Kulturpflanzen sowohl mit erstrebenswerten landwirtschaftlichen
Merkmalen als auch mit der Widerstandsfähigkeit sind begrenzt. Um eine lebensfähige Kulturpflanze
hervorzubringen, erfordern traditionelle Methoden der Pflanzenaufzucht
darüber
hinaus 5 bis 10 Jahre, während
der Bedarf für
neue Mittel zur Nematodenbekämpfung
sofort besteht und entscheidend ist.
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Die wichtigste Methode zur Bekämpfung von
Nematoden ist die Anwendung chemischer Nematozide gewesen. Während 1982
wurden allein in den Vereinigten Staaten mehr als 100 Millionen
Pound Nematozid auf Feldfrüchte
aufgebracht. Chemische Nematozide sind in der Regel hochtoxische
Verbindungen, von denen bekannt ist, dass sie eine erhebliche Umweltbelastung
sind. In den vergangenen Jahren haben Themen wie Grundwasserkontamination,
Toxizität
für Säuger und
Vögel und
Rückstände in Lebensmitteln
zu sehr viel strengeren Restriktionen der Anwendung chemischer Nematozide
geführt.
Leider ist in vielen Fällen
keine Alternative für
die Anbauer verfügbar,
die auf Nematozide zum Schutz ihrer Feldfrüchte gegenüber gallenbildenden Wurzelnematoden
und Wurzelzysten auf Nematozide angewiesen sind. Dementsprechend
gibt es einen ständigen
Bedarf nach neuartigen Wegen zur Bekämpfung von Nematoden in Pflanzen.
In der WO-A-9204453 werden Nematoden widerstandsfähige Pflanzen
beschrieben. Die darin identifizierten Gene unterscheiden sich von
den Nematoden-Kernproteingenen der vorliegenden Erfindung.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Ein erster Aspekt der vorliegenden
Erfindung ist ein DNA-Konstrukt, das eine Transkriptionskassette aufweist.
Das Konstrukt weist in der 5'-
bis 3'-Richtung
auf (a) einen in einer Pflanzenzelle operablen Promotor, (b) eine
mindestens 15 Nucleotide aufweisende DNA, die zu einer DNA-Sequenz
antisense sind, die ein nematodeninduzierbares transmembranöses Porenprotein
codiert, oder zu einer DNA, die ein enzymatisches RNA-Molekül codiert,
das gegen das nematodeninduzierbare transmembranöse Porenprotein gerichtet ist, und
(c) wahlweise und jedoch bevorzugt ein Terminationssignal. Der Promotor
kann ein solcher sein, der in Pflanzenzellen konstitutiv wirksam
ist, der in Zellen von Pflanzenwurzelgewebe selektiv wirksam ist
oder ein auf Nematoden ansprechendes Element, wie beispielsweise
das auf Nematoden ansprechende Element von Tabak-RB7 (TobRB7)-Promotor.
Derartige Konstrukte können
von einem Pflanzen-Transformatiosvektor geführt werden, wie beispielsweise
einem Vektor von Agrobacterium tumefaciens, der wiederum zur Erzeugung rekombinanter
Pflanzen verwendet wird.
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Ein zweiter Aspekt der vorliegenden
Erfindung ist dementsprechend eine nematodenresistente transgene
Pflanze. Die Pflanze weist Zellen auf, die ein DNA-Konstrukt enthalten,
das eine Transkriptionskassette entsprechend der vorstehenden Beschreibung
aufweist.
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In speziellen Ausführungsformen
der Erfindung kann die ein nematodeninduzierbares Transmembran-Porenprotein
codierende DNA ausgewählt
werden aus der Gruppe, bestehend aus: (a) isolierter DNA, die über die
hierin als SEQ ID NO: 1 (die das nematodeninduzierbare Transmembran-Porenprotein codiert,
das hierin als SEQ ID NO: 2 vorgegeben ist) oder SEQ ID NO: 6 verfügt (die
eine genomische DNA ist, die das hierin als SEQ ID NO: 7 angegebene,
nematodeninduzierbare Transmembran-Porenprotein codiert, welches das gleiche
ist wie SEQ ID NO: 2); (b) isolierter DNA, die zu einem Komplement
der isolierten DNA von (a) vorstehend hybridisiert und die ein nematodeninduzierbares,
transmembranöses
Porenprotein codiert (wobei die isolierte DNA bevorzugt zu mindestens
50% homolog mit einer isolierten DNA von (a) vorstehend ist; und wobei
das Porenprotein vorzugsweise zu mindestens 60% mit einem Porenprotein
von (a) vorstehend homolog ist); und (c) isolierter DNA, die sich
von den isolierten DNA's
von (a) und (b) vorstehend in der Nucleotidsequenz aufgrund der
Degeneration des genetischen Codes unterscheidet und die ein nematodeninduzierbares,
transmembranöses
Porenprotein codiert. Ein spezielles Beispiel für eine solche DNA ist eine
Antisense-Konfiguration zum Ausführen
der vorliegenden Erfindung, die hierin als SEQ ID NO: 3 angegeben
ist.
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Darüber hinaus kann in speziellen
Ausführungsformen
der Erfindung eine DNA, die ein auf Nematoden ansprechendes Element
codiert, ausgewählt
werden aus der Gruppe, bestehend aus: (i) isolierter DNA mit der
hierin als SEQ ID NO: 5 angegebenen Sequenz und (ii) isolierter
DNA, die zu isolierter DNA von (i) vorstehend hybridisiert wird
und die ein auf Nematoden ansprechendes Element codiert (das vorzugsweise
zu mindestens 60% homolog zur isolierten DNA von (i) vorstehend
ist und das vorzugsweise mindestens eine Länge von 10 oder 15 Nucleotide
hat) (diese Definition soll die vorstehend genannten Fragmente (i)
einbeziehen, die ihre Wirksamkeit als auf Nematoden ansprechende
Elemente bewahren).
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Die vorgenannten und weitere Aufgaben
und Aspekte der vorliegenden Erfindung werden im Detail in den Zeichnungen
hierin sowie in der nachfolgend ausgeführten Beschreibung erläutert.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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Es zeigen:
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1 eine
Veranschaulichung eines Paars von DNA-Konstrukten, aufweisend Transkriptionskassetten,
von denen eine die TobRB7-cDNA in Sense-Konfigurationen unter transkriptioneller
Kontrolle eines CaMV 35S-Promotors ist und die andere mit einer
TobRB7-cDNA in Antisense-Konfiguration unter transkriptioneller Kontrolle
eines CaMV 35S-Promotors ist. In beiden Fällen wird eine Nummer 3'-Terminationssequenz
und ein Neomycin-Phosphotransferase II (NPT-II)-wählbarer
Marker bereitgestellt, um Canamycin-Resistenz zu vermitteln. Die
Grenzbereiche des Ti-Plasmids, in das die Kassette insertiert wird,
sind als "TiB" bezeichnet.
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2 eine
Veranschaulichung von Transkriptionskassetten, die den vorstehend
in 1 veranschaulichten
sehr ähnlich
sind mit der Ausnahme, dass der konstitutiv aktive CaMV35S-Promotor
entweder durch das Element TobRB7 Δ0.6, das in Wurzel-Gewebezellen
selektiv aktiv ist, ersetzt ist oder durch das auf Nematoden ansprechende
Element TobRB7 Δ0.3.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die vorliegende Erfindung findet
Anwendung für
die Bekämpfung
von Nematoden und speziell auf gallenbildende Wurzelnematoden (Meloidogyne
spp.) und die Wurzelrystennematoden (Globodera spp. und Heterodera
spp.). Diese Nematoden verfügen über ähnliche
Lebenszyklen. Die gallenbildenden Wurzelnematoden sind standorttreue
Endoparasiten mit einer extrem innigen und komplexen Beziehung zur
Wirtspflanze. Das infektive zweite Jugendstadium (J2) ist in dem
Boden frei. Befindet es sich auf einer Wirtswurzel penetriert das
J2 die Wurzel interzellular in dem unmittelbar hinter der Wurzelkappe
gelegenen Bereich und wandert zu dem sich entwickelnden Leitbündelrylinder.
Die Nematode orientiert sich sodann parallel zu dem Zylinder und injiziert
glanduläre
Sekretionen in die Pflanzenzellen, die dessen Kopf umgeben, was
zur Auslösung
von die Nematode fütternden
Zellen führt.
Diese 5-7-Zellen erfahren rasche Kernteilungen, nehmen kolossal
an Größe zu und
werden ausgefüllt
mit Poren und Zellwand-Invaginationen.
Die fütternden
Ortszellen oder "Riesenzellen" fungieren als Super-Transferzellen,
und stellen der sich entwickelnden Nematode die Nahrung bereit. Während dieser
Zeit verliert die Nematode die Fähigkeit
zur Bewegung und schwillt von dem normalen Älchen in der J2-Form zu einem
großen,
birnenförmigen
erwachsenen Weibchen. Mit der Nahrungszunahme auf den Riesenzellen
führt eine
parthenogenetische Reproduktion zum Ablegen von 300 bis 1.000 Eiern.
Dieser gesamte Prozess dauert eine Zeitspanne von 20 bis 30 Tagen,
wobei die gallenbildenden Wurzelnematoden im Verlaufe einer Erntesaison
bis zu 7 Generationen fertigstellen können. Der Lebenszyklus der
Wurzelzysten in der Nematode ist weitgehend der gleiche mit der
Ausnahme, dass ihre Fütterungsstelle
als eine "Synzytia" bezeichnet wird
und sie einer geschlechtlichen Vermehrung unterliegt.
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Nematodeninduzierbare transmembranöse Porenproteine
sind Porenproteine, deren Expression in den Zellen bei Infektion
einer Pflanze erhöht
ist, die die Zellen von einer pflanzenparasitären Nematode an einer Stelle
unmittelbar neben solchen Zellen enthält. Die erhöhte Expression derartiger Porenproteine
wird von der Nematode bei der Herstellung von Fütterungsstellen benötigt, die
die Nährstoffe
von der Pflanze zu der Nematode durchlassen können. Im Allgemeinen und wie
detaillierter nachfolgend erläutert
wird, schließen DNA-codierende,
nematodeninduzierbare Transmembran-Porenproteine DNA ein, die zu
50% oder mehr mit einer DNA homolog ist, welche die hierin als SEQ
ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 6 gegebene Sequenz hat. Im Bezug auf das
Protein codieren die DNA-codierenden nematodeninduzierbaren Transmembran-Porenproteine ein
Protein, das hinsichtlich des Gehaltes an Aminosäure zu etwa 60% oder mehr homolog
oder vorzugsweise etwa 70% oder mehr homolog zu dem Protein ist,
das über
die hierin als SEQ ID NO: 2 bezeichnete Aminosäuresequenz verfügt. Die
Ermittlungen der Homologie werden mit den 2 Sequenzen vorgenommen
(Nucleinsäure
oder Aminosäure),
die auf ein maximales Anpassen ausgerichtet ist. Ein maximales Anpassen
ist den Gaps möglich,
die in beiden Sequenzen angepasst sind. Bevorzugt werden Gap-Längen von
10 oder weniger, wobei Gap-Längen
von 5 oder weniger mehr bevorzugt sind und Gap-Längen von 2 oder weniger noch
mehr bevorzugt sind.
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Es sind Prozeduren der differentiellen
Hybridisierung verfügbar,
die die Isolation der cDNA-Klone ermöglichen, deren mRNA-Werte bis
herab zu etwa 0,05% Poly(A*)RNA beträgt. Siehe hierzu M. Conkling
et al., Plant Physiol. 93, 1203–1211
(1990). Verkürzt
gesagt, werden cDNA-Bänke
unter Verwendung von einsträngigen
cDNA-Sonden von umkehrtranskribierter mRNA aus Pflanzengewebe gescreent
(d. h. Wurzeln und Blätter).
Bei differentiellem Screening wird eine Membran aus Nitrocellulose oder
Nylon in 5 × SSc
eingetaucht, in einen 96-Mulden-Ansaugansatz gegeben , 150 μl stationäre Übernacht-Kultur von einer
Master-Platte zu der jeweiligen Mulde übertragen und Vakuum angelegt,
bis die gesamte Flüssigkeit
das Filter passiert hat. In jede Mulde werden 150 μl denaturierender
Lösung
(0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl) unter Verwendung einer Multipipette gegeben
und etwa 3 min stehen gelassen. Es wird wie vorstehend abgesaugt
und das Filter entfernt und in 0,5 M Tris-HCl (pH 8,0), 1,5 M NaCl
neutralisiert. Dieses wird anschließend für 2 Stunden im Vakuum ausgeheizt und
mit den entsprechenden Sonden inkubier. Unter Verwendung von Nylon-Membranfiltern
und indem die Master-Platten bei –70°C in 7% DMSO aufbewahrt werden,
können
die Filter mehrere Male mit Mehrfachsonden gescreent und nach mehreren
Jahren der Aufbewahrung entsprechende Klone gewonnen werden.
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Um beispielsweise Gene zu isolieren,
deren Expression durch Nematodeninfektion induziert oder verstärkt ist,
wurde eine cDNA-Bank von mRNA, die aus mit Nematoden infizierten
Tabakwurzeln isoliert wurde, aufgebaut. Die Wurzeln wurden so abgestuft,
dass mRNA zum Zeitpunkt der Riesenzellen-Initiierung isoliert wurden. Die Bank
wurde sodann mit Hilfe der vorstehend genannten Prozeduren unter
Verwendung von einsträngigen
cDNA-Sonden von mRNA gescreent, die von mit Nematoden infizierten
sowie von Kontrollwurzeln isoliert wurden. Solche cDNA-Klone, die
unterschiedliche Expressionen zeigten, wurden sodann als Sonden auf
Tabak-Genom-Southern-Blots verwendet (um zu bestätigen, dass die cDNA den Tabak-
und Nematoden-freien Transkripten entsprach) sowie Northern-Blots
von Wurzel-RNA aus
infiziertem und Kontrollgewebe (um die unterschiedliche Expression
zu bestätigen).
Diese Klone, die eine unterschiedliche Expression zeigten, wurden
sodann als Sonden verwendet, um eine bestehende Tabak-Genombank
zu screenen. Es wurde im Wesentlichen die gleiche Prozedur mit anderen
Pflanzen als Tabak und mit anderen Nematoden (oder anderen Pathogenen)
als gallenbildende Wurzelnematoden ausgeführt. Die Prozedur ist zur Identifizierung
von Promotoren anwendbar, die von Wurzelzystennematoden induziert
sind, in welchem Fall die Wurzeln derart gestachelt sind, dass mRNA
zum Zeitpunkt der Synzytia-Initiation isoliert wurden. Beispielsweise
wurde ein induzierbarer Promotor der Kartoffel-Wurzelzystennematode
(Globodera spp.) aus Kartoffelpflanzen (Solanum tuberosum) entsprechend
den vorstehend ausgeführten
Prozeduren isoliert.
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Wir haben im Sondenverfahren eine
große
Vielzahl von dikotylen und monokotylen Pflanzen unter gering stringenten
Bedingungen mit TobRB7-Sonden geprüft und haben festgestellt,
dass die meisten Pflanzen (wenn nicht alle) ein TobRB7 Analog enthalten.
Wir haben bereits unter gering stringenten Bedingungen der Hybridisierung
ein solches wurzelspezifisches cDNA Analog aus Arabidopsis thaliana
(AtRB7) (Yamamoto, Cheng und Conkling, 1990, Nucl. Acids Res. 18:
7449) identifiziert.
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Die bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung
eingesetzten nematodeninduzierbaren Transmembran-Porenproteine schließen Proteine
ein, die zu dem nematodeninduzierbaren Porenprotein Tabak-RB7, das
hierin als SEQ ID NO: 2 (die gleiche wie SEQ ID NO: 7) offenbart
wird, homolog sind und im Wesentlichen die gleichen biologischen
Eigenschaften wie diese besitzen. Diese Definition soll natürliche Allel-Variationen
in dem Porenprotein mit einbeziehen. Die bei der Ausführung der
vorliegenden Erfindung zum Einsatz gelangenden geklonten Gene können ein
nematodeninduzierbares Porenprotein jeder beliebigen Herkunft der
Spezies codieren, einschließlich:
Tabak, Sojabohne, Kartoffel, Erdnüsse, Ananas, Baumwolle und
Gemüsepflanzen, wobei
jedoch bevorzugt nematodeninduzierbares Transmembran-Porenprotein
dikotyler Herkunft codiert wird. So lassen sich zur Ausführung der vorliegenden
Erfindung ebenfalls solche DNA-Sequenzen einsetzen, die DNA der
SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 6 hybridisieren und auf Expression
für ein
nematodeninduzierbares Transmembran-Porenprotein codieren. Die Bedingungen,
mir denen es möglich
ist, dass andere DNA-Sequenzen, die auf Expression für ein Porenprotein
codieren, zu einer DNA hybridisieren, die über die als SEQ ID NO: 1 oder
SEQ ID NO: 6 bezeichnete Sequenz verfügen, lassen sich in üblicher
Weise ermitteln. Beispielsweise kann die Hybridisierung derartiger
Sequenzen unter verringert stringenten Bedingungen oder nur unter stringenten
Bedingungen ausgeführt
werden (z. B. unter Bedingungen, die durch eine Waschbedingung von 0,3
M NaCl, 0,03 M Natriumcitrat, 0,1% SDS bei 60°C oder sogar 70°C zu DNA
repräsentiert
werden, die über die
hierin angegebene SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 6 verfügen, und
zwar in einem Standard-in situ-Hybridisierungsassay.
Siehe hierzu J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory
Manual (2. Ausg., 1989) (Cold Spring Harbor Laboratory). Im Allgemeinen
sind derartige Sequenzen mindestens zu 75% homolog, 80% homolog,
85% homolog, 90% homolog oder sogar 95% homolog oder mehr zu der
hierin als SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 6 gegebenen Sequenz (im
Fall von SEQ ID NO: 6, bei der es sich um eine Genomsequenz handelt,
besteht eine solche Homologie im Bezug auf die Exonen allein, obgleich
die Homologie sowohl im Bezug auf Intronen als auch auf Exonen in
Frage kommen kann). Die Ermittlungen der Homologie werden mit den
zwei auf maximale Anpassung ausgerichteten Sequenzen vorgenommen.
Die Gaps in jeder der zwei Sequenzen, die angepasst werden, werden
im Maximieren der Anpassung gelassen. Bevorzugt werden Gap-Längen von
10 oder weniger, Gap-Längen
von 5 oder weniger sind mehr bevorzugt, während Gap-Längen von 2 oder weniger noch
mehr bevorzugt sind.
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Antisense-DNA's in der vorliegenden Erfindung werden
zur Erzeugung der entsprechenden Antisense-RNA's verwendet. Eine Antisense-RNA ist
eine RNA, die mit den Nucleotidbasen in umgekehrter oder entgegengesetzter
Reihenfolge der Expression erzeugt wird. Derartige Antisense-RNA's sind gut bekannt.
Siehe hierzu z. B. die US-P-4 801 540, erteilt an Calgene Inc. In
der Regel wird die Antisense-RNA eine Länge von mindestens 15 Nucleotiden
haben und noch typischer eine Länge
von mindestens 50 Nucleotiden. In die Antisense-RNA kann ein Intron-Extron-Verbindung
einbezogen sein (d. h. ein, zwei oder drei Nucleotide auf nur einer
oder auf beiden Seiten der Intron-Extron-Verbindung). Antisense-RNA's, in die eine Intron-Extron-Verbindung
einbezogen ist, werden im Bezug auf eine Genom-DNA-Sequenz konstruiert.
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Die bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung
zum Einsatz gelangenden Sense-DNA's haben eine ausreichende Länge, um,
wenn in einer Pflanzenzelle exprimiert, die native Expression eines
nematodeninduzierbaren Transmembran-Porenproteins entsprechend der
Beschreibung hierin in dieser Pflanzenzelle zu unterdrücken. Derartige
Sense-DNA's können im
Wesentlichen ein ganzes Genom sein oder komplementäre DNA,
die ein nematodeninduzierbares Transmembran-Porenprotein codiert,
oder ein Fragment davon, wobei ein solches Fragment im typischen
Fall eine Länge
von mindestens 15 Nucleotiden hat.
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In einer anderen Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird die Sense- oder Antisense-DNA in dem Konstrukt
ersetzt durch eine DNA, die ein enzymatisches RNA-Molekül codiert
(d. h. ein "Ribozym"), bei dem es sich
um ein enzymatisches RNA-Molekül
handelt, das gegen das mRNA-Transkript
einer DNA gerichtet (d. h. es spaltet) ist, die ein nematodeninduzierbares
Transmembran-Porenprotein
entsprechend der vorstehenden Beschreibung codiert. Die DNA, die
enzymatische RNA- Moleküle codiert
kann nach bekannten Methoden erzeugt werden. Siehe hierzu beispielsweise
T. Cech et al., US-P-4 987 071 (deren Offenbarung hierin als Fundstelle
einbezogen ist). Die Erzeugung eines derartigen enzymatischen RNA-Moleküls und die
Zerstörung
der Erzeugung des Porenproteins bekämpft die Pflanzeninfektion
durch Nematoden weitgehend in der gleichen Weise wie die Erzeugung
eines Antisense-RNA-Moleküls:
d. h. durch Zerstörung
der Translation von mRNA in der Zelle, die das Porenprotein erzeugt.
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Promotoren, die bei der Ausführung der
vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, können konstitutiv aktive Promotoren
sein. Es sind zahlreiche konstitutiv aktive Promotoren verfügbar, die
in Pflanzen funktionsfähig
sind. Ein bevorzugtes Beispiel ist der Blumenkohl-Mosaikvirus (CaMV)-35S-Promotor. In der
Alternative kann der Promotor ein wurzelspezifischer Promotor oder
ein auf Nematoden ansprechendes Element sein, wie nachfolgend detaillierter
erklärt
wird.
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Promotoren, die in Gewebezellen von
Pflanzenwurzeln selektiv aktiv sind und in der Ausführung der vorliegenden
Erfindung zum Einsatz gelangen, schließen DNA's ein, die im Bezug auf den hierin als
SEQ ID NO: 4 offenbarten Tabak RB7-wurzelspezifischen-Gen-Promotor
homolog sind oder weitgehend die gleichen biologischen Eigenschaften
wie dieser haben. In diese Definition sollen natürliche Allel-Variationen einbezogen sein.
Derartige Elemente können
von jeder beliebigen Herkunft einer Spezies sein, einschließend Tabak,
Sojabohne, Kartoffel, Erdnüsse,
Ananas, Baumwolle und Gemüsepflanzen,
wobei eine dikotyle Herkunft jedoch bevorzugt ist. Damit lassen
sich diese DNA-Sequenzen, die zu einer DNA der SEQ ID NO: 4 hybridisieren
und einen wurzelspezifischen Gen-Promotor enthalten, und die zur
Ausführung
der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Die Bedingungen, unter
denen es möglich
ist, dass andere DNA-Sequenzen, die ein derartiges Element codieren,
zu einer DNA zu hybridisieren, die die als SEQ ID NO: 4 angegebene
Sequenz hat, lassen sich routinemäßig ermitteln. Beispielsweise
kann die Hybridisierung derartiger Sequenzen unter Bedingungen ausgeführt werden,
wie sie vorstehend in Verbindung mit nematodeninduzierbaren Transmembran-Porenproteinen
ausgeführt
wurden. Derartige Sequenzen sind in der Regel mindestens zu 75%
homolog, zu 80% homolog, zu 85% homolog, zu 90% homolog oder sogar
zu 95% homolog oder mehr im Bezug auf die hierin als SEQ ID NO:
4 angegebene Sequenz. Es können
Gaps eingeführt
werden, um die Homologie auf ein Maximum zu bringen, wenn die Homologie
wie vorstehend diskutiert wurde ermittelt wird. Darüber hinaus
kann die Homologie ermittelt werden im Bezug auf eine 10- bis 15-
oder sogar 25- oder 50-Basensegment einer DNA, die die Sequenz SEQ
ID NO: 5 hat und in der Lage ist eine auf Nematoden ansprechende
Transkription einer Downstream-DNA-Sequenz
(d. h. ein Strukturgen oder eine Antisense-DNA) in einer Pflanzenzelle
zu dirigieren. Unter "Basensegment" wird ein zusammenhängender
Abschnitt davon verstanden, der über
die angegebene Zahl der Nucleotide in der Länge verfügt.
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Auf Nematoden ansprechende Elemente,
die in der Ausführung
der vorliegenden Erfindung zum Einsatz gelangen, schließen DNA's ein, die im Bezug
auf das Tabak RB7 auf Nematoden reagierendes Element, das hierin
als SEQ ID NO: 5 offenbart ist, homolog sind und im Wesentlichen
die gleichen biologischen Eigenschaften wie diese haben. Diese Festlegung
soll natürliche
Allel-Variationen darin einschließen. Derartige Elemente können wiederum
von jeder beliebigen Herkunft der Spezies sein, einschließlich Tabak,
Sojabohne, Kartoffel, Erdnüsse,
Ananas, Baumwolle und Gemüsepflanzen,
wobei jedoch eine dikotyle Herkunft bevorzugt ist. Damit lassen
sich auch DNA-Sequenzen, die zu einer DNA der SEQ ID NO: 5 hybridisiert
werden und ein auf Nematoden ansprechendes Element enthalten, zur
Ausführung
der vorliegenden Erfindung einsetzen. Die Bedingungen, unter denen
es möglich
ist, dass andere DNA-Sequenzen, die ein derartiges Element codieren, zu
einer DNA hybridisiert werden, die über die als SEQ ID NO: 5 angegebene
Sequenz verfügen,
können
wiederum routinemäßig ermittelt
werden. Beispielsweise kann die Hybridisierung derartiger Sequenzen
unter Bedingungen ausgeführt
werden, wie sie vorstehend in Verbindung mit nematodeninduzierbaren
Transmembran-Porenproteinen ausgeführt wurden. Derartige Sequenzen
sind in der Regel mindestens zu 75% homolog, zu 80% homolog, zu
85% homolog, zu 90% homolog oder sogar zu 95% homolog oder mehr
im Bezug auf die hierin als SEQ ID NO: 5 angegebene Sequenz. Wie
vorstehend diskutiert, lassen sich Gaps einführen, um die Homologie auf
ein Maximum zu bringen, wenn die Homologie ermittelt wird. Darüber hinaus
lässt sich
die Homologie im Bezug auf ein 10- bis 15- oder sogar 25- oder 50-Basensegment
einer DNA, die die Sequenz SEQ ID NO: 5 hat und in der Lage ist
eine auf Nematoden ansprechende Transkription einer Downstream-DNA-Sequenz
(d. h. ein Strukturgen oder eine Antisense-DNA) in einer Pflanzenzelle
zu dirigieren.
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DNA-Konstrukte oder "Transkriptionskassetten" der vorliegenden
Erfindung schließen
5' bis 3' in Richtung der
Transkription ein, einen Promotor, wie er vorstehend diskutiert
wurde, eine in Verbindung mit dem Promotor funktionsfähige DNA
und gegebenenfalls eine Terminationssequenz, einschließend ein
Stopsignal für RNA-Polymerase
und ein Polyadenylierungssignal für Polyadenylase. Alle diese
regulatorischen Bereiche sollten in der Lage sein, in den Zellen
des zu transformierenden Gewebes zu funktionieren. Es kann jedes
beliebige geeignete Terminationssignal bei der Ausführung der
vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, wobei Beispiele dafür einschließen, ohne
auf diese beschränkt
zu sein: den nos-Terminator, den CaMV-Terminator oder native Terminationssignale,
die von dem gleichen Gen deriviert sind wie die transkriptionelle
Initiierungsregion oder die von einem anderen Gen deriviert sind.
Der hierin verwendete Begriff "operativ
verbunden" bezieht
sich auf DNA-Sequenzen auf einem einzelnen DNA-Molekül, die zusammenhängen, so
dass die Funktion der Einen durch die der Anderen beeinflusst wird.
Damit ist ein Promotor operativ verbunden mit einer DNA, wenn er
in der Lage ist, die Transkription dieser DNA (d. h. die DNA befindet
sich unter transkriptioneller Kontrolle des Promotors) zu beeinflussen.
Der Promotor wird als "upstream" von der DNA bezeichnet,
die selbst wiederum als "downstream" von dem Promotor
bezeichnet wird.
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Die Transkriptionskassette kann in
einem DNA-Konstrukt bereitgestellt werden, das ebenfalls mindestens über ein
Replikationssystem verfügt.
Aus Gründen
der Einfachheit ist es üblich, über ein
Replikationssystem zu verfügen,
das in Escherichia coli, wie beispielsweise ColEl, pSC101, pACYC184
oder dergleichen, funktionsfähig
ist. Auf diese Weise lässt
sich in jedem Stadium nach der Bearbeitung das resultierende Konstrukt
klonen, sequenzieren und die Richtigkeit der Bearbeitung ermitteln.
Darüber
hinaus, oder anstelle des E. coli-Replikationssystems kann ein Replikationssystem
eines breiten Wirtsbereichs eingesetzt werden, wie beispielsweise
die Replikationssysteme der P-1-Inkompatibilitäts-Plasmide, z. B. pRK290. Zusätzlich zu
dem Replikationssystem wird häufig
mindestens ein Marker vorliegen, der in einem oder mehreren Wirten
verwendbar ist, oder verschiedene Marker für einzelne Wirte. Das bedeutet,
ein Marker kann zur Selektion in einer prokaryotischen Wirtssubstanz
eingesetzt werden, während
ein anderer Marker für
die Selektion in einer eukaryotischen Wirtssubstanz im speziellen
der Pflanzen-Wirtssubstanz eingesetzt werden kann. Die Marker können gegenüber einem
Biozid geschützt sein,
wie beispielsweise Antibiotika, Toxine, Schwermetalle oder dergleichen;
können
eine Komplementation gewähren,
indem einem auxotrophen Wirt Prototrophie vermittelt wird; oder
kann durch die Erzeugung einer neuartigen Verbindung in der Pflanze
einen sichtbaren Phänotyp
schaffen. Beispielhafte Gene, die zum Einsatz gelangen können, schließen ein:
Neomycin-Phosphotransferase (NPTII), Hygromycin-Phosphotransferase
(HPT), Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT), Nitrilase und das Gentamicin-Widerstandsgen.
Bei der Selektion von Pflanzen-Wirtssubstanzen sind nicht einschränkende Beispiele,
die als Marker geeignet sind: NPTII, das Kanamycin Resistenz oder
G418-Resistenz vermittelt;
HPT, das Hygromycin Resistenz vermittelt sowie das mutierte aroA-Gen,
das Glyphosat-Resistenz vermittelt.
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Die verschiedenen Fragmente, die
die verschiedenen Konstrukte, Transkriptionskassetten, Marker und
dergleichen aufweisen, können
nacheinander durch Restriktionsenzymspaltung eines geeigneten Replikationssystems
und Insertion des speziellen Konstrukts oder Fragments in die verfügbare Stelle
eingeführt werden.
Nach der Ligation und dem Klonen kann das DNA-Konstrukt zur weiteren
Bearbeitung isoliert werden. Alle diese Methoden sind umfangreich
in der Literatur exemplifiziert worden, wobei sich eine spezielle
Exemplifizierung bei J. Sambrook et al., Molecular Cloning, ein
Laborhandbuch (2. Ausg., 1989) (Cold Spring Harbor Laboratory) finden.
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Vektoren, die zur Transformierung
von Pflanzengewebe mit DNA-Konstrukten der vorliegenden Erfindung
verwendet werden können,
schließen
sowohl Agrobacterium-Vektoren als auch ballistische Vektoren ein, sowie
Vektoren, die für
die DNA-vermittelte Transformation geeignet sind.
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Methoden zur Erzeugung rekombinanter
und nematodenresistenter Pflanzen gemäß der Erfindung umfassen allgemein
die Bereitstellung einer Pflanzenzelle, die zur Regeneration in
der Lage ist (die Pflanzenzelle, die sich typischerweise in einem
zur Regeneration fähigen
Gewebe befindet}. Die Pflanzenzelle wird sodann mit einem DNA-Konstrukt
transformiert, das eine Transkriptionskassette gemäß der vorliegenden
Erfindung aufweist (wie hierin beschrieben wird) und eine rekombinante
nematodenresistente Pflanze, die aus der transformierten Pflanzenzelle
regeneriert wird. Wie nachfolgend erläutert wird, wird der Transformationsschritt durch
Beschuss der Pflanzenzelle mit Mikropartikeln ausgeführt, die
die Transkriptionskassette führen,
indem die Zelle mit Agrobacterium tumefaClens infiziert wird, das
ein Ti-Plasmid enthält,
das die Transkriptionskassette trägt, oder mit Hilfe irgendeiner
anderen Methode, die zur Erzeugung einer transgenen Pflanze geeignet ist.
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Es sind zahlreiche Agrobacterium-Vektorsysteme
bekannt, die zur Ausführung
der vorliegenden Erfindung verwendbar sind. Beispielsweise offenbart
die US-P-4 459 355 eine Methode zur Transformation empfindlicher
Pflanzen, einschließlich
Dikotylidone, mit einem Agrobacterium-Stamm, der das Ti-Plasmid
enthält. Die
Transformation von Holzgewächsen
mit einem Agrobacterium-Vektor wurde in der US-P-4 795 855 offenbart.
Außerdem
offenbart die US-P-4 940 838, die an Schilperoort et al. erteilt
wurde, einen binären
Agrobacterium-Vektor (d. h. einen solchen, bei dem das Agrobacterium
ein Plasmid enthält,
das die vir-Region eines Ti-Plasmids enthält, nicht jedoch die T-Region,
und ein zweites Plasmid enthält,
das eine T-Region aufweist, nicht jedoch eine vir-Region), die für die Ausführung der
vorliegenden Erfindung verwendbar sind.
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Mikropartikel, die ein DNA-Konstrukt
der vorliegenden Erfindung tragen, wobei das Mikropartikel für die ballistische
Transformation einer Pflanzenzelle geeignet sein muss, sind ebenfalls
zur Erzeugung transformierter Pflanzen der vorliegenden Erfindung
verwendbar.
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Das Mikropartikel wird in eine Pflanzenzelle
zur Erzeugung einer transformierten Pflanzenzelle getrieben und
eine Pflanze aus der transformierten Pflanzenzelle gewonnen. In
der Ausführung
der vorliegenden Erfindung kann jede beliebige geeignete Methode
der ballistischen Zelltransformation sowie Apparate dafür zur Anwendung
gelangen. Ein beispielhafter Apparat sowie Prozeduren wurden offenbart
von Sanford and Wolf in der US-P-4 945 050 und von Christou et al.
in der US-P-S 015 580. Bei Anwendung ballistischer Transformationsprozeduren
kann die Transkriptionskassette in ein Plasmid eingebaut werden,
das zur Replikation in der zu transformierenden Zelle oder zum Einwachsen
darin in der Lage ist. Beispiele für Mikropartikel, die in derartigen
Systemen zur Anwendung geeignet sind, schließen 1 bis 5 μm große Goldkügelchen
ein. Das DNA-Konstrukt kann auf dem Mikropartikel mit Hilfe jeder
geeigneten Methode abgeschieden werden, wie beispielsweise durch
Ausfällung.
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Mit dem DNA-Konstrukt der vorliegenden
Erfindung können
Pflanzenspezies mit Hilfe der DNA-vermittelten Transformation von Pflanzenzellprotoplasten
und nachfolgender Gewinnung der Pflanze aus den transformierten
Protoplasten nach Prozeduren transformiert werden, die auf dem Gebiet
gut bekannt sind.
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Mit einem Vektor der vorliegenden
Erfindung kann jedes beliebige Pflanzengewebe transformiert werden,
das zur anschließenden
klonalen Fortpflanzung ob durch Organogenese oder Embryogenese in
der Lage ist. Der hierin verwendete Begriff "Organogenese" bedeutet einen Prozess, mit Hilfe dessen
Sprösslinge
und Wurzeln sequentiell aus meristematischen Zentren entwickelt
werden; der hierin verwendete Begriff "Embryogenese" bedeutet einen Prozess, mit dessen
Hilfe Sprösslinge
und Wurzeln sich zusammen in einer konzertierten Weise (nicht sequentiell)
ob aus somatischen Zellen oder Gameten entwickeln. Das spezielle
Gewebe, das zur Auswahl kommt, wird von den klonalen Fortpflanzungssystemen
abhängen,
die für
die zu transformierende Spezies verfügbar und am Besten geeignet
ist. Beispielhafte Gewebetargets schließen ein: Laub-Scheibchen, Pollen,
Embryos, Kotyledone, Hypokotyle, Megagametophyten, Kallus-Gewebe,
bestehendes meristematisches Gewebe (z. B. Apikalmeristem, Axillarknospen
und Wurzelmeristeme), sowie induziertes Meristem-Gewebe (z. B. Kotyledonmeristem
und hypokotyles Meristem).
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Die Pflanzen der vorliegenden Erfindung
können
eine Vielzahl von Formen annehmen. Die Pflanzen können Chimären von
transformierten Zellen und nichttransformierten Zellen sein; die
Pflanzen können
klonale Transformanten sein (z. B. alle transformierten Zellen,
die die Transkriptionskassette enthalten); die Pflanzen können verpflanztes
Gewebe von transformierten und nichttransfornerten Geweben aufweisen
(z. B. ein transformiertes Wurzelmaterial, das auf nichttransformiertem
Pfropfreis in Citrus-Spezies gepfropft ist). Die transformierten
Pflanzen können
mit einer Vielzahl von Methoden fortgepflanzt werden, wie beispielsweise
durch klonale Fortpflanzung oder klassische Aufzuchtmethoden. Beispielsweise
kann die erste Generation (oder T1) transformierter Pflanzen durch
Inzucht eine homozygote zweite Generation (oder T2) transformierter
Pflanzen liefern, wobei die T2-Pflanzen weiter fortgepflanzt werden
durch klassische Aufzuchtmethoden. Ein dominanter wählbarer
Marker (wie beispielsweise nptII) kann zur Unterstützung der
Aufzucht mit der Transkriptionskassette zusammengebracht werden.
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Einige pflanzenparasitäre Nematoden,
vor denen Pflanzen mit Hilfe der vorliegenden Erfindung geschützt werden
können,
und die entsprechenden Pflanzen, die in der Ausführung der vorliegenden Erfindung zum
Einsatz gelangen können,
sind folgende: Alfalfa: Ditylenchus dipsaci, Meloidogyne hapla,
Meloidogyne incognita, Meloidogyne javanica, Pratylenchus spp.,
Paratlylenchus spp., und Xiphinema spp.; Banane: Radopholus similis,
Helicotylenchus multicinctus, Meloidogyne incognita, M. arenaria,
M. javanica, Pratylenchus coffeae, und Rotylenchulus reniformis;
Bohnen & Erbsen:
Meloidogyne spp., Heterodera spp., Belonolaimus spp., Helicotylenchus
spp., Rotylenchulus reniformis, Paratrichodorus anemones, und Trichodorus
spp.; Kassava: Rotylenchulus reniformis, Meloidogyne spp.; Getreidesorten:
Anguina tritici (Emmerweizen, Roggen, Spelzenweizen), Bidera avenae
(Hafer, Weizen), Ditylenchus dipsaci (Roggen, Hafer), Subanguina
radicicola (Hafer, Gerste, Weizen, Roggen), Meloidogyne naasi (Gerste,
Weizen, Roggen), Pratylenchus spp. (Hafer, Weizen, Gerste, Roggen),
Paratylenchus spp. (Weizen), Tylenchorhynchus spp. (Weizen, Hafer);
Kichererbse: Heterodera cajani, Rotylenchulus reniformis, Hoplolaimus
seinhorsti, Meloidogyne spp., Pratylenchus spp.; Citrus: Tylenchulus
semipenetrans, Radopholus similis, Radopholus citrophilus (lediglich
in Florida), Hemicycliophora arenaria, Pratylenchus spp., Meloidogyne
spp., Bolonolaimus longicaudatus (lediglich in Florida), Trichodorus,
Paratrichodorus, Xiphinema spp.; Klee: Meloidogyne spp., Heterodera
trifolii; Kokosnuss: Rhadinaphelenchus cocophilus; Kaffee. Meloidogyne
incognita (besonders wichtig in Brasilien), M. exigua (weit verbreitet),
Pratylenchus choffeae, Pratylenchus brachyurus, Radopholus similis,
Rotylenchulus reniformis, Helicotylenchus spp.; Mais: Pratylenchus
spp., Paratrichodorus minor, Longidorus spp., Hoplolaimus columbus; Baumwolle:
Meloidogyne incognita, Belonolaimus longicaudatus, Rotylenchulus
reniformis, Hoplolaimus galeatus, Pratylenchus spp., Tylenchorhynchus
spp., Paratrichodorus minor; Grapefrucht: Xiphinema spp., Pratylenchus
vulnus, Meloidogyne spp., Tylenchulus semipenetrans, Rotylenchulus
reniformis; Gräser:
Pratylenchus spp., Longidorus spp., Paratrichodorus christiei, Xiphinema
spp., Ditylenchus spp.; Erdnuss: Pratylenchus spp., Meloidogyne
hapla.; Meloidogyne arenaria, Criconemella spp., Belonolaimus longicaudatus
(im Osten der Vereinigten Staaten); Straucherbse: Heterodera cajani,
Rotylenchulus reniformis, Hoplolaimus seinhorsti, Meloidogyne spp.,
Pratylenchus spp., Ananas: Paratrichodorus christiei, Criconemella
spp., Meloidogyne spp., Rotylenchulus reniformis, Helicotylenchus
spp., Pratylenchus spp., Paratylenchus spp.; Kartoffel: Globodera
rostochiensis, Globodera pallida, Meloidogyne spp., Pratylenchus
spp., Trichodorus primitivus, Ditylenchus spp., Paratrichodorus
spp., Nacoabbus aberrans; Reis: Aphelenchiodes besseyi, Ditylenchus
angustus, Hirchmanniella spp., Heterodera oryzae, Meloidogyne spp.;
Beerenobst: Meloidogyne spp., Pratylenchus spp., Xiphinema spp.,
Longidorus spp., Paratrichodorus christiei, Aphelenchoides spp.
(Erdbeere); Sojabohne: Heterodera glycines, Meloidogyne incognita,
Meloidogyne javanica, Belonolaimus spp., Hoplolaimus columbus; Zuckerrübe: Heterodera
schachtii, Ditylenchus dipsaci, Meloidogyne spp., Nacobbus aberrans,
Trichodorus spp., Longidorus spp., Paratrichodorus spp.; Zuckenohr:
Meloidogyne spp., Pratylenchus spp., Radopholus spp., Heterodera
spp., Hoplolaimus spp., Helicotylenchus spp., Scutellonema spp.,
Belonolaimus spp., Tylenchorhynchus spp., Xiphinema spp., Longidorus
spp., Paratrichodorus spp.; Tee: Meloidogyne spp., Pratylenchus
spp., Radopholus similis, Hemicriconemoides kanayaensis, Helicotylenchus
spp., Paratylenchus curvitatus; Tabak: Meloidogyne spp., Pratylenchus
spp., Tylenchorhynchus claytoni, Globodera tabacum, Trichodorus spp.,
Xiphinema americanum, Ditylenchus dipsacil (nur in Europa), Paratrichodorus
spp.; Tomate: Pratylenchus spp., Meloidogyne spp.; Baumobst: Pratylenchus
spp. (Apfel, Birne, Steinfrüchte),
Paratylenchus spp. (Apfel, Birne), Xiphinema spp. (Birne , Kirsche,
Pfirsich), Cacopaurus pestis (Walnuss), Meloidogyne spp. (Steinfrüchte, Apfel,
usw.), Longidorus spp. (Kirsche), Criconemella spp. (Pfirsich) und
Tylenchulus spp. (Olive).
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Aus der vorstehenden Ausführung geht
hervor, dass Pflanzen, die zur Ausführung der vorliegenden Erfindung
eingesetzt werden können,
einschließen
(jedoch darauf nicht beschränkt
sind): Tabak (Nicotiana tabacum), Kartoffel (Solanum tuberosum),
Sojabohne (glycine max), Erdnüsse
(Arachis hypogaea), Baumwolle (Gossypium hirsutum), Cassava (Manihot
esculenta), Kaffee (Cofea spp.), Kokosnuss (Cocos nucifera), Ananas
(Ananas comosus), Citrusbäume
(Citrus spp.), Banane (Musa spp.), Mais (Zea mays), Weizen, Hafer, Roggen,
Gerste, Reis und Gemüsepflanzen,
wie beispielsweise grüne
Bohnen (Phaseolus vulgaris), Limabohnen (Phaseolus limensis) und
Erbsen (Lathyrus spp.). Eine anschauliche Kategorie von Pflanzen,
die zur Ausführung
der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind somit die Dikotylidone,
wobei eine speziellere Kategorie von Pflanzen, die zur Ausführung der
vorliegenden Erfindung zur Anwendung gelangen kann, die Vertreter
der Familie der Solanaceae sind.
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In der Praxis wird eine Vielzahl
von erfindungsgemäßen Pflanzen
aufweisende Ertragskultur zusammnen in eine landwirtschaftliche
Nutzfläche
gepflanzt. Unter "landwirtschaftlicher
Nutzfläche" verstehen wir eine übliche Parzelle
Boden oder ein Gewächshaus
mit dem dafür
typischen Merkmal, dass eine übliche
Population von Nematoden den Pflanzenbestand infiziert. Die folgende
Erfindung gewährt
somit ein Verfahren zur Bekämpfung
von pflanzenparasitären
Nematoden in einer landwirtschaftlichen Nutzfläche, indem die Fläche mit einem
Bestand von Pflanzen gemäß der vorliegenden
Erfindung bepflanzt wird.
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Die nachfolgenden Beispiele werden
zur Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung gegeben und sind
nicht zu ihrer Beschränkung
auszulegen.
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BEISPIEL 1
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ISOLATION UND EXPRESSION
VON GENOMISCHEM WURZELSPEZIFISCHEN KLON RB7
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Nicotiana tabacum cv Wisconsin 38
wurde als Quelle für
das Material zum Klonen und zur Gencharakterisierung verwendet.
Die genomische DNA wurde teilweise mit Sau3A digeriert und auf 5
bis 20%igen Kaliumacetat-Gradienten eine Größenfraktionierung vorgenommen.
Die Größenfraktionen
von 17 bis 23 kb wurden gepoolt und in den λ Vektor ligiert, EMBL3b, der
mit BamHI und EcoRI digeriert worden waren. Siehe hierzu A. Frischauf
et al., J. Mol. Biol. 170, 827–842
(1983). Eine erste Bibliothek von näherungsweise 3,5 × 106 Rekombinanten wurde mit Hilfe der Plaque-Hybridisierung
gescreent. Positive Klone wurden von Plaque gereinigt. Die Restriktionskarten
der genomischen Klone wurden unter Anwendung der schnellen Kartierungsprozedur
von Rachwitz et al., Gene 30, 195–200 (1984) aufgebaut.
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Regionen, die die wurzelspezifischen
Klone codieren, wurden mit Hilfe von Southern-Blots identifiziert. Um
die transkribierten Regionen weiter zu definieren haben wir den
Vorteil der Tatsache genutzt, dass die Gene mit hohen Mengen exprimiert
sind. Damit würden
sich Sonden, die aus cDNA von revers transkribierter Poly(A+)RNA
erzeugt wurden, zu Southern-Blots von eingeschränkten genomischen Klonen in
einer Weise hybridisiert werden, die analog den differentiellen
Screeningexperimenten ist. Siehe hierzu Kilchen, Nature 321, 493–499 (1986).
Die Klone wurden mit den entsprechenden Restriktionsenzymen digeriert
und die Fragmente auf Agarosegelen getrennt. Diese Fragmente wurden
Southern-Blots auf Nitrocellulosefiltern unterworfen und mit Sonden
revers transkribierter Wurzel Poly(A+)RNA versehen. Die Sonde wurde
unter Verwendung von stochastischen Hexanucleotiden gestartet (PharmaCla
Biochemicals, Inc.), so dass die 3'-Termini der mRNA-Moleküle unter
der Sonde nicht übenepräsentiert
sein würden.
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Die zu dem jeweiligen wurzelspezifischen
cDNA-Klon hybridisierenden Klone wurden von Plaque gereinigt. Vergleiche
der Restriktionskarten der genomischen Klone mit genomischen Southern-Hybridisierungsversuchen
(nicht gezeigt) ergaben eine gute Korrelation der Sequenzen, die
zu wurzelspezifischen cDNA-Klonen hybitdisieren. Klon λ5A hybridisiert
zu dem cDNA-Klon TobRB7. Hierbei scheint es sich um den genomischen
Klon zu handeln, der dem TobRB7 entspricht und dementsprechend als
TobRB7-5A (SEQ ID NO: 6) bezeichnet wird und zur Erzeugung der Promotorsequenzen
verwendet wird, die in den nachfolgend beschriebenen Versuchen eingesetzt
werden. Das Zellmembran-Kanalprotein wurde als SEQ ID NO: 7 bezeichnet.
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BEISPIEL 2
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IDENTIFIZIERUNG EINES
AUF NEMATODEN REAGIERENDEN ELEMENTS INNERHALB DES TobRB7-PROMOTORS
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Die Fähigkeit der TobRB7-Promotonegion
des λ5A
genomischen Klons zum Regulieren der Expression eines heterologen
Reportergens wurde mit Hilfe des Klonens von näherungsweise 1,4 kb von 5'-flankierender Sequenz zu pBI101.2 getestet.
Die Länge
der TobRB7-flankierenden Region, die zum Einsatz gelangte, wurde
variiert, um festzustellen, wie verschiedene Teilbereiche der flankierenden
Region die Expression von GUS beeinflussten.
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Verkürzt gesagt, wurde eine TobRB7-5'-flankierende Region
aus λ5A
isoliert und mit (3-Glucuronidase in
dem Agrobacterium-binären
Vektor, pBI 101.2 verschmolzen. Dieser Vektor enthält ein β-Glucuronidase (GUS)-Reportergen
und einen nptII-selektierbaren Marker, der von den T-DNA-Grenzsequenzen flankiert
ist (R. Jefferson et al., EMBO J. 6, 3901–3907 (1987)). Das TobRB7-Strukturgen
wurde vollständig
entfernt und die TobRB7-flankierenden Regionen mit dem GUS-initiierenden
Methionen-Codon verschmolzen. Die Konstruktion wurde in einen Agrobacterium-Wirt
eingebaut, der ein entschärftes
Ti-Plasmid (LBA4404) führte,
das in der Lage war, die vir-Funktionen (in trans) bereitzustellen,
die für
den T-DNA-Transfer und den Einbau in das Pflanzengenom erforderlich
sind und weitgehend von An et al., in S. Belvin and R. Schilperoot,
Herausg., Plant Molecular Biology Manual, Martinus Nijhoff Dordrecht,
The Netherlands, S. A3-1-19 (1988) beschrieben wurden. Es wurden
Nicotiana tabacum SRl-Blattscheibchen infiziert und Transformanten
gewählt
und entsprechend der Beschreibung von An et al., Plant Physiol.
81, 301–305
(1986) regeneriert.
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Die gesamten Pflanzen oder exzisierte
Wurzel- und Blattgewebe wurden auf GUS-Expression nach Jefferson
et al., supra, assayiert. Bei der histochemischen Anfärbung wurden
Pflanzen bei 37°C über Nacht
in das 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-glucuronid
(X-GLUC) bei inkubiert. Gewebe, die GUS-Aktivität exprimieren, spalten dieses
Substrat, wodurch sie blau gefärbt
werden. Nach der Inkubation der Gewebe wurden diese in 70%igem Ethanol
gebleicht. Die GUS-Enzymaktivitäten
wurden unter Anwendung des von Jefferson et al. beschriebenen fluorogenen
Assays gemessen.
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Es wurde die Aktivität der verschiedenen
Deletionsmutanten getestet. Die größte, wurzelspezifische Genexpression
wurde mit dem Δ0,6-Deletionsmutanten
(SEQ ID NO: 4) erhalten. Lediglich der Δ0,3-Deletionsmutant (SEQ ID
NO: 5) war als ein Promotor inaktiv, was darauf hinweist, dass der
TobRB7-Promotor in der Region angetroffen wird, die sich über 800
Nucleotide vor dem TobRB7-Strukturgen
erstreckt. Allerdings enthält
der Δ0,3-Deletionsmutant
(SEQ ID NO: 5) das auf Nematoden reagierende RB7-Element, wie nachfolgend
diskutiert wird.
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BEISPIEL 3
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LOKALISIERUNG
DER GENAKTIVIERUNG IN NEMATODENINFIZIERTEN PFLANZEN
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Es wurden transgene Tabakpflanzen,
die entsprechend der Beschreibung in dem vorangegangenen Beispiel
2 hergestellt wurden, mit gallenbildenden Tabakwurzelnematoden infiziert
(Meloidogyne incognita), und zwar entsprechend den bekannten Methoden.
Siehe hierzu z. B. C. Opperman et al., Plant Disease, 869–871 (Oktober
1988). Die Wurzeln wurden auf GUS-Aktivität (blau) und die Nematoden
in drei Stadien rot gefärbt:
(a) 24 bis 48 Stunden nach der Infektion; (b) 7 bis 10 Tage nach
der Infektion; und (c) 20 bis 25 Tage nach der Infektion. Die Nematoden
wurden nach der GUS-Färbung
durch inkubierende Wurzeln in 95% Ethanol/Eisessig (1 : 1) plus
5 Tropfen saures Fuchsin (pro 100 ml) für 4 Stunden inkubiert und anschließend in einer
gesättigten
Chloralhydrat-Lösung
für 12
Stunden über
Nacht entfärbt.
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Es wurde allgemein in der Streckungszone
der Wurzel eine GUS-Aktivität
festgestellt. 24 bis 48 Stunden nach der Infektion hatten Nematoden
des zweiten Jugendstadiums die Tabakwurzeln penetriert und befanden
sich im Rindengewebe und wandern auf der Suche nach einer geeigneten
Futterstelle. Die Jugendstadien in dem vaskularen Gewebe haben in
diesem Stadium bereits begonnen, Futterstellen einzurichten. 7 bis 10
Tage nach der Infektion werden geschwollene späte zweite Jugendstadien mit
ihren Köpfen
in den Futterstellen angetroffen. 20 bis 25 Tage nach der Infektion
ragen erwachsene Nematoden aus dem mit Gallen versehenen Wurzelgewebe
heraus, wobei deren Kopf noch in dem vaskulren Gewebe eingebettet
ist und der Hinterleib exponiert ist, um die Eiablage zu ermöglichen.
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Das mit GUS-Aktivität in Nematoden
infizierte Wurzelgewebe von Pflanzen, die mit den verschiedenen,
in Beispiel 2 beschriebenen Deletionsmutanten transformiert wurden,
zeigten, dass das auf Nematoden reagierende Element des TobRB7-Promotors
sich in dem Δ0,3
(SEQ ID NO: 5)-Deletionsmutanten
befand.
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Ähnliche
Ergebnisse wurden mit gallenbildenden Erdnusswurzelnematoden (Meloidogyne
arenaria) erhalten.
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Im Verlaufe der vorstehend beschriebenen
Versuche wurde beobachtet, dass die Dauer der Genexpression in nematodeninfizierten
Pflanzen sehr viel länger
war als in nicht infizierten Pflanzen und dass die Regionen der
Genaktivität
nicht länger
auf die Streckungszone der Wurzel beschränkt waren. Beispielsweise war
in jeder Stelle, wo es möglich
war, dass sich eine Nematode eine Futterstelle einrichten konnte,
die Genexpression an dieser Stelle bis zu 25 bis 30 Tagen fortgeführt (d.
h. die Dauer des Nematoden-Lebenszyklus).
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BEISPIEL 4
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HEMMUNG VON NEMATODEN-FUTTERSTELLENBILDUNG
DURCH EXPRESSION VON SENSE- ODER ANTISENSE-TobRB7-mRNA
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Dieses Beispiel demonstriert die
Fähigkeit
transgener Pflanzen, die Sense- und Antisense-TobRB7-mRNA unter der Kontrolle eines
konstitutiv wirksamen Promotors exprimieren, beim Aufbau von Futterstellen
von gallenbildenden Wurzelnematoden einzugreifen. Diese eingesetzten
Konstruktionen werden in 1 beschrieben
und die Pflanzen weitgehend in der gleichen Weise hergestellt, wie
vorstehend in Beispiel 2 beschrieben wurde. Die eingesetzte Sense-DNA
hatte die hierin als SEQ ID NO: 1 angegebene Sequenz, während die
eingesetzte Antisense-DNA die hierin als SEQ ID NO: 3 angegebene
Sequenz aufwies. Der eingesetzte Promotor war der Blumenkohl-Mosaikvirus-35S-Promotor
und das eingesetzte Terminationssignal der nos-Terminator. Die Konstrukte
wurden in den Agrobacterium-binären
Vektor pBIN19 übertragen und
transgene Pflanzen weitgehend in der gleichen Weise erzeugt, wie
vorstehend beschrieben wurde: es wurden Tabakblattscheibchen transformiert
und die Transformanten auf Kanamycin selektiert; Regeneranten ließ man sich
selbsten und fremdbefruchten; Sämlinge
(R2) wurden auf Kanamycin gekeimt und die Segregation der Kan-Marker
assayiert; diejenigen Pflanzen, die eine 3 : 1-Segregation zeigten (d. h. einen einzelnen Locus
der Integration enthielten), ließ man sich selbsten; Nachkommen
der R2 wurden auf Kanamycin gekeimt, um solche der R2-Nachkommenschaft
zu determinieren, die für
das Transgen homozygot waren.
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Die Phänotypen einer großen Zahl
von Kontroll-, Sense- und Antisense-Pflanzen wurden untersucht. Die
Kontrollpflanzen sahen ähnlich
aus wie normaler Tabak. Sense- und Antisense-Pflanzen zeigten ähnliche Phänotypen;
(1) lange Internodien, (2) schmale und spitze Blätter und (3) frühzeitige
Blüte.
Diese Phänotypen ähneln "Stress"-Phänotypen,
wie sie bei Pflanzen vorkommen, die unter suboptimalen Bedingungen
aufgezogen werden, beispielsweise kleine Flecken. Es hat den Anschein,
dass der "Stress"-Phänotyp in
Sense-Pflanzen aus dem Phänomen
einer Co-Suppression resultiert: ein Phänomen, bei dem Transgene in
der Sense-Orientierung führende
Pflanzen verringerte anstatt erhöhte
Mengen von Genexpression zeigen. Siehe hierzu z. B. C. Napoli et
al., The Plant Cell 2, 279–289
(1990).
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Transgene Pflanzen von Sense-Transformanten,
Antisense-Transformanten und Kontroll-Transformanten wurden mit M. arenaria
des zweiten Jugendstadiums in weitgehend der gleichen Weise infiziert,
wie vorstehend beschrieben wurde. Es wurden näherungsweise 100.000 Nematoden
in sterilem Wasser suspendiert, zusammen mit Wurzeln von auf Agarplättchen aufgezogenen
Pflanzen auf Pipette gezogen. Die Pflanzen wurden in einer Aufzuchtkammer
bei 25°C
gehalten. 24 Stunden nach der Infektion wurden in verschiedenen Stadien
der Wurzelpenetration auf allen Pflanzen Jugendstadien beobachtet.
Die Gallen waren bei allen Behandlungen nach 3 bis 4 Tagen nach
der Infektion sichtbar.
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Es wurden Wurzeln von den Plättchen 2A,
2B und 7 (Antisense); 13 und 37 (Sense) sowie 22A und 22B (Kontrolle)
21 Tage nach der Infektion geerntet. Die erste Beobachtungen ergaben
ausgeprägte
und umfangreiche Gallenbildung in den Sense- und Kontroll-Pflanzen.
Die Gallen erschienen oftmals in Clustern zusammen mit den Wurzeln.
Es hatte den Anschein, dass eine Zahl von Gallen, erwachsene weibliche
Nematoden, mit der Vermehrung begonnen hatte. Im Gegensatz dazu
waren wenige Gallen auf den Antisense-Pflanzen vorhanden. Diejenigen,
die vorhanden waren, erschienen eher vereinzelt als in Clustern
und waren hinsichtlich der Größe im Vergleich
zu den Sense- und Kontroll-Pflanzen weitgehend verkleinert (< 50% im durchmesser).
Zwei der drei Plättchen
lieferten keine Pflanzen mit sichtbarer Gallenbildung 21 Tage nach
der Infektion.
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Die Wurzeln von jeder Behandlung
wurden mit saurem Fuchsin gefärbt,
um das Stadium der Nematodenentwicklung und den Grad der Wurzelpenetration
zu ermitteln. Die Wurzeln der Sense- und Kontroll-Pflanzen wurden
mit zahlreichen Nematoden in verschiedenen Entwicklungsstadien infiziert.
Es wurden in mehreren Gallen Weibchen beobachtet, wobei es den Anschein
hatte, dass mit der Eiablage begonnen worden war. Die Gallen enthielten
zahlreiche Nematoden. Andere beobachtete Stadien enthielten wurmförmige zweite
Jugendstadien, gequollene zweite Jugendstadien und drittelvierte
Jugendstadien. Im Inneren der Wurzeln oder auf den Plättchen wurden
keine erwachsenen Männchen
beobachtet. Es wurden weitaus weniger Nematoden in Antisense-Pflanzen
beobachtet. Diejenigen, die vorhanden waren, waren überwiegend
wurmförmig
oder befanden sich im gequollenen zweiten Jugendstadium. Es wurden
keine erwachsene weibliche Nematoden angetroffen. Es wurden innerhalb
der Wurzeln erwachsene männliche
Nematoden beobachtet, jedoch keine auf der Plättchenoberfläche. Die
Gallen, die vorhanden waren, enthielten in der Regel eine einzelne
Nematode und neigten zum Auftreten an den Wurzelknoten.
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BEISPIEL 5
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EINFLUSS AUF DIE NEMATODEN-EIMASSEBEWERTUNG
DER EXPRESSION VON SENSE- ODER
ANTISENSE-TobRB7-mRNA UNTER DER KONTROLLE EINES KONSTITUTIVEN PROMOTORS
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Es wurden transgene Tabakpflanzen,
die Sense- oder Antisense-TobRB7-mRNA exprimieren, hergestellt,
wie vorstehend beschrieben wurde, und wurden nach bekannten Methoden
mit gallenbildenden Tabakwurzelnematoden (Meloidogyne incognita)
infiziert. Siehe hierzu beispielsweise C. Opperman et al., Plant
Disease, 869–871
(Oktober 1988). 63 Tage nach der Infektion wurden Wurzeln geerntet,
Eimassen mit Phloxin B zum leichteren Zählen entsprechend den bekannten
Methoden gefärbt
und die Eimassen gezählt.
Es wurde festgestellt, dass sowohl Sense- als auch Antisense-Pflanzen
gegenüber
Nematoden resistent waren. Diese Daten sind in der nachfolgenden
Tabelle 1 zusammengestellt.
TABELLE
1: Eimassebewertungen 63 Tage nach der Infektion
- Eimassebewertung
- 0: keine Eimasse;
1 : weniger als 10 Eimassen; 2 : 10 bis 50 Eimassen; 3 : 50 bis
150 Eimassen; 4 : 150 bis 300 Eimassen; 5 : mehr als 300 Eimassen.
-
NA: nicht verfügbar
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BEISPIEL 6
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HEMMUNG DER NEMATODEN-FUTTERSTELLENBILDUNG
DURCH EXPRESSION VON SENSE- ODER ANTISENSE-TobRB7-mRNA
UNTER DER KONTROLLE EINES AUF NEMATODEN REAGIERENDEN ELEMENTS ODER
EINES WURZELSPEZIFISCHEN GENPROMOTORS
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Transgene Pflanzen, die Sense-Antisense-TobRB7-mRNA
unter der Kontrolle eines Promotors exprimieren und einen wurzelspezifischen
Genpromotor oder ein auf Nematoden reagierendes Element enthalten, greifen
in die Erzeugung von Futterstellen für gallenbildende Wurzelnematoden
ein. Die Konstruktionen, die zum Einsatz gelangten, werden in 2 beschrieben. Sense-, Antisense-
und Kontroll-Pflanzen
wurden weitgehend in der gleichen Weise erzeugt, wie vorstehend
in Beispiel 4 beschrieben wurde, jedoch mit der Ausnahme, dass der
vorstehend beschriebene, wurzelspezifische Promotor, der die gleiche
Sequenz hatte, die mit SEQ ID NO: 4 bezeichnet wird, anstelle des
CaMV 35S-Promotors eingesetzt wurde. Zusätzlich wurden Sense-, Antisense-
und Kontroll-Pflanzen weitgehend in der gleichen Weise erzeugt,
wie in Beispiel 4 vorstehend beschrieben wurde, und zwar mit der
Ausnahme, dass das vorstehend beschriebene, auf Nematoden reagierende
Element, das die Sequenz hatte, die hierin mit SEQ ID NO: 5 angegeben
wird, anstelle des CaMV 35S-Promotors eingesetzt wurde. Die Resistenz
gegenüber
Nematoden wurde in der gleichen Weise gezeigt, wie vorstehend beschrieben
wurde.
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Die vorgenannten Beispiele sind für die vorliegenden
Erfindung veranschaulichend und sind nicht zu ihrer Beschränkung auszulegen.
Die Erfindung ist anhand der folgenden Ansprüche festgelegt, wobei Äquivalente
für die
Ansprüche
hierin einbezogen sind.
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