DE69433285T2

DE69433285T2 - Hepatitis-b-virusmutanten, und verbindungen und verfahren für ihre bestimmung

Info

Publication number: DE69433285T2
Application number: DE69433285T
Authority: DE
Inventors: William Carman; Richard H. Decker; Lesley Thornwood WALLACE; Larry T. Mimms; Larry R. Solomon
Original assignee: University of Glasgow; Abbott Laboratories
Current assignee: University of Glasgow; Abbott Laboratories
Priority date: 1993-05-07
Filing date: 1994-05-09
Publication date: 2004-06-24
Anticipated expiration: 2014-05-10
Also published as: CA2162132A1; US5595739A; US5593825A; ES2212796T3; EP0745128A4; EP0745128B8; CA2162132C; US5925512A; EP0745128A1; WO1994026904A1; US5591440A; EP0745128B1; DE69433285D1; AU6908294A; JP3813168B2; JPH08510129A

Description

Hintergrund der Erfindung
Diese Erfindung bezieht sich im allgemeinen auf Mutanten des Hepatitis B Virus (HBV), und genauer bezieht sie sich auf neue Mutanten von HBV, ihre Wichtigkeit in klinischen Anwendungen, ihre Verwendung als Reagenzien bei der Detektion einer HBV-Infektion und -Immunität und ihre Verwendung in Impfstoffen.
HBV ist dafür bekannt, eine Vielzahl von Krankheitsstadien hervorzurufen, von milder subklinischer Infektion bis hin zu chronischer aktiver und fulminanter Hepatitis. Das Hepatitis B Genom ist eine kreisförmige, teilweise doppelsträngige DNA von ungefähr 3200 Basenpaaren, die für sieben virale Proteine kodiert. P. Tiollais et al., Nature 317: 489–495 (1985). Das Polymerasegen überlappt die viralen Hüllgene PreS1, PreS2 und S vollständig, und überlappt die X und Kerngene teilweise. Die Hülle des Hepatitis B Virions besteht aus drei Proteinen und deren glykosylierten Derivaten. Diese Proteine, kleine (S), mittlere (M) und große (L) Hepatitis B Oberflächen-(HBs) Proteine genannt, enthalten die S Gensequenz. W. H. Gerlich et al., in Viral Hepatitis and Liver Disease, F. B. Hollinger et al., Ausgaben Williams-Wilkens, Baltimore, MD, Seiten 121–134 (1991). Die MHBs enthalten die PreS2 Sequenz (55 Aminosäuren [a. a].) und das L Protein enthält die PreS1 Sequenz (108 oder 119 a. a., abhängig von dem Subtyp) plus die PreS2 Sequenz. Nur ein sehr kleiner Teil des gesamten Hepatitis B Oberflächenantigens existiert als komplette Virionen oder Dane Partikel. Zwei andere morphologische Formen, 22nm kugelförmige Partikel und Filamente von 22nm Durchmesser und variabler Länge, haben kein Kapsid oder DNA und werden in großem Überschuß über HBV-Virionen produziert.
Das Kerngene kodiert das Nukleokapsidprotein (183 oder 185 a. a.), das Hepatitis B Kernantigen (HBcAg). Unmittelbar stromaufwärts des Kerngens ist die Vorkernregion, welche aus 87 Nucleotiden besteht, die 29 a. a. in der Phase mit dem Kerngen kodieren. Die ersten 19 a. a. der Vorkernregion dienen als ein Signal für die Membrantranslokation und die mögliche Sekretion des Vorkerngenprodukts, bezeichnet als HBeAg. Die Funktion des HBe ist rätselhaft, kann aber dem Virus durch Einführen einer Immuntoleranz helfen, der Immunüberwachung zu entkommen.
Wegen der genomischen Kompaktheit und den extensiven funktionalen Überlappungen wird erwartet, daß signifikante Beschränkungen auf der DNA Sequenz-Divergenz vorkommen werden, um ein Genom in der Lage zur effizienten Replikation und Transmission zu halten. Das Hepatitis B Virus jedoch zeigt eine größere Mutabilität als zuvor angenommen. Ähnlich wie das humane Immunschwächevirus (HIV), verwendet HBV die reverse Transkriptase (RT) als einen essenziellen Schritt in dem Replikationszyklus. RT hat eine geringe Fähigkeit genau zu lesen, was zu einer hohen Rate an Nucleotid-Fehlinkorporation führt. Berechnungen weisen darauf hin, daß diese mit Fehlern beladene Replikation zu Ein-Punkt-Ersatz, Deletion oder Insertion pro 1000 bis 100,000 kopierten Nucleotiden führt. W. Carman et al., Lancet 341: 349–353 (1993). Die Veränderlichkeit in dem Virus wurde zunächst durch klassische Subtyping-Studien von HBsAg entdeckt. A. M. Courouce et al., Bibliotheca Haematologica 42: 1 (1976).
Die Mutationen können nicht zufällig auf dem Genom lokalisiert werden. Berichte in jüngerer Zeit haben das Auftreten von anderen Mutationen in den Vorkern, Kern und Hüllproteingenen, PreS und S, dokumentiert, welche dienen Mutanten anscheinend einen selektiven Vorteil beim Ausweichen des Immunsystems über den Wildtyp (WT) geben.
Ein Beweis schlägt vor, daß die virale Clearance und die Leberzellverletzung bei einer HBV-Infektion durch eine zytotoxische T Lymphozyten (CTL) Antwort auf ein oder mehrere HBV-kodierte Antigene vermittelt werden, die auf der Hepatozytenoberfläche exprimiert werden. M. Peters et al., Hepatology 13: 977–994 (1991). Eine starke T-Zellantwort auf HBcAg- und HbeAg-Antigene, aber nicht auf Hüllantigene, wurde in akuter Hepatitis B gefunden. Das Fortbestehen der viralen Replikation korrelierte mit einer abgestumpften T-Zellantwort auf HbcAg. Obwohl die T-Zellantwort auf virales Antigen bei der chronischen HBV außer Kraft gesetzt sein kann, kann die CTL Antwort bei chronischen Trägern fortbestehen.
Auch gibt es einen Nachweis für andauernde homorale Antwort in sowohl symptomatischen als auch asymptomatischen Hepatitis B Trägern. Hohe Spiegel an anti-HBc wurden in fast allen HBV-Trägern beobachtet. Zwanzig Prozent von zufällig HbsAg-positiven-Spezies haben detektierbare HBeAg und anti-HBe, und 10–20% haben detektierbare, aber niedrige Spiegel an anti-HBs. Ein jüngerer Bericht, der sehr sensible Detektionsverfahren benutzte, zeigt an, daß nahezu alle HBV-Patienten mit Leberkrankheiten und ungefähr 50% von chronischen Hepatitis B Patienten ohne Lebererkrankungen vorzeigbare humorale Immunantworten haben, die spezifisch sind für HBeAg und anti-HBsAg und PreS Ag. Viele der anti-HBs-Antworten können jedoch existieren, wegen den unterschiedlich feinen Spezifitäten von HBsAg und anti-HBs, und sind wahrscheinlich nicht neutralisierend. Diese Daten stützen die Theorie, daß es eine andauernde Immunüberwachung von Vorkern, Kern und Hüllgenprodukten in chronischen HBV-Trägern gibt, welche einen selektiven Druck für das Auftreten von HBV-Varianten bereitstellen könnten.
Die HBV-Hüllregionen, die PreS und PreS2 umfassen, und die Region 120–160 a. a. von S werden auf der Oberfläche der viralen Partikel gezeigt, und es würde daher vermutet werden, daß sie Ziele der Immunüberwachung sind. W. H. Gerlich et al., supra. Einige S Mutanten, die bisher beschrieben wurden, haben die Antigenität des "a" Epitops ("a" Epitope) signifikant beeinflußt, welche allgemeine oder Gruppen-spezifische Determinanten von SHBs sind. W. Carman et al., Gastroenterology 102: 711–719 (1992). Die "a" Determinanten sind komplexe, konformere und abhängig von der Disulfidbindung unter den hoch konservierten Cysteinresten. Die "a" Immunoreaktivität kann teilweise durch zyklische synthetische Peptide nachgearmt werden. Obwohl die "a" Epitope traditionell definiert wurden durch die Reaktivität gegenüber polyklonalen Antisera hat die Verwendung von monoklonanen Antikörpern gezeigt, daß die "a" Reagion aus mindestens fünf nicht überlappenden Epitopen besteht. D. Peterson et al., J. Immunol. 132: 920–927 (1984). Eine genetische Abänderung in der "a" Determinante, was zu einem Immunentweichen führt, wurde in Impfstoffen beschrieben in Italien und Japan und in Lebertransplantationspatienten mit monoklonaler anti-a Antikörpertherapie. Siehe beispielsweise W. F. Carman et al., Lancet 336: 325–329 (1990); H. Okamoto et al., Pediatric Research 32: 264–268 (1992); G. McMahon et al., Hepatology 15: 757–766 (1992); H. Fujii et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 184: 1152–1157 (1992); und T. J. Harrison et al., J. of Hepatology 13: 5105–5107 (1991). Die üblichste bisher beschriebene Mutante ist eine einzelne Nucleotidsubstitution die zum Ersatz eines Glycins durch ein Arginin führt (G-R 145). Diese Mutation zerstört einige, aber nicht alle "a" Epitope. Die Detektion von anti-HBs mit monoklonalen Antikörpern war nicht problematisch.
Andere Mutationen in der "a" Region führen zu dem Verlust von spezifischen subtypischen oder typischen Determinanten, und w/r. Einige jüngere Schriften haben das Auftreten von großen Deletionen und Punktmutationen in der PreS1/PreS2 Region dokumentiert, wobei vorgeschlagen wurde, das die Produktion dieser Umhüllungsgenprodukte auch unter der Immunselektion in chronisch infizierten Individuen ist. Es wurde von HBV-Mutanten im Plasma von HBV-Trägern berichtet, welche nicht replizieren können, wegen der Deletionen in den env, C oder P Genen. Alle coexisteren mit den HBV-Formen, welche replikationskompetent sind. Okamoto et al. (supra) zeigte, daß Mutantengenome mit großen Deletionen in den PreS/S, C und P Genen, abgeleitet aus Plasma oder asymptomatischen Trägern, vervollständigt werden können in vorübergehenden Expressions-Systemen mit Hepatomzellen. Die Vervollständigung wurde gemessen, als die Fähigkeit, virale Partikel mit Mutantengenomen in das Kulturmedium zu sezernieren. Interessanterweise hatten alle Mutanten ein intaktes Einkapselungssignal. Die Vervollständigung mit Vorgänger WT Viren, anderen Mutanten und sogar mit HBV-DNA-Sequenzen, die in Wirtschromosomen integriert wurden, wurde in diesem in vitro System gezeigt. Somit wurde der Vorschlag gemacht, daß HBV-Mutanten, die als defekte störende Partikel wirken, die WT Virusreplikation schwächen können und dabei helfen können, die Persistenz einer Infektion zu erhalten.
Die Detektion von Mutanten des Hepatitis B Oberflächenantigens ist daher wichtig. Mutanten können sich aufgrund solcher Faktoren über die Zeit als Impfstoffverabreichung oder Infektion entwickeln. Die Identifikation und Detektion von Mutanten Hepatitis B Viren kann zur Impfstoffentwicklung und Detektionssystemen führen, um die Anwesenheit dieser Mutanten in Testproben zu bestimmen. Es besteht daher nicht nur ein Bedarf, diese Mutantenstämme zu identifizieren, sondern auch Detektionssysteme bereitzustellen, die in der Lage sind, die Anwesenheit des Mutanten in einer Testprobe zu bestimmen. Ein weiterer Bedarf existiert ebenfalls für die Entwicklung eines Impfstoffs für solche Mutantenstämme.
Zusammenfassung der Erfindung
Diese Erfindung beschreibt einen Mutanten Hepatitis B Virus, der eine modifizierte "a" Determinante besitzt, worin es eine Insertion von zwei Aminosäuren an der 122 Position der HBsAg-Sequenzen gibt, wobei die Insertion einer sechs-Nucleotidinsertion an der 366 Position des HBsAg-Genoms entspricht. Die zwei Aminosäuren, die an Position 122 eingefügt wurden, sind N und T, während die entsprechende Nucleotidsequenz, die an Position 366 auftritt, die Nucleotidsequenz -A-A-C-A-C-A- ist.
Die Erfindung stellt ein gereinigtes Polynucleotid von mutantem HBV bereit, das eine modifizierte "a" Determinante umfaßt, in welcher es eine Insertion von sechs Nucleotiden an Position 366 des HBsAg-Genoms gibt, ein rekombinantes Polynucleotid von mutantem HBV, das eine modifizierte "a" Determinante umfaßt, in welcher es eine Insertion von zwei Aminosäuren an Position 122 der HBsAg-Sequenz gibt, Wirtszellen und rekombinante Vektoren, die diese Insertion rezitieren. Die zwei eingefügten Aminosäuren an Position 122 sind N und T, während die entsprechende Nucleotidsequenz, die an Position 366 der Nucleotidsequenz auftritt -A-A-C-A-C-A- ist. Das rekombinante Polynucleotid von mutantem HBV umfaßt eine Sequenz, die aus einem mutantem HBV-Genom abgeleitet ist. Auch das rekombinante Polynucleotid von mutantem HBV umfaßt ein Epitop von mutantem HBV. Die Erfindung stellt ebenfalls ein rekombinantes Expressions-Systemen bereit, das einen Open Reading Frame von DNA umfaßt, abgeleitet aus dem Genom von mutantem HBV, worin der Open Reading Frame operativ an eine Kontrollsequenz geknüpft ist, die kompatibel ist mit einem gewünschten Wirt, Zellen, die mit dem rekombinanten Expressions-Systemen transformiert wurden und Polypeptide, die durch diese Zellen produziert wurden. Die Erfindung stellt weiterhin gereinigten Mutanten-HBV bereit, welcher eine Zubereitung von mutantem HBV-Polypeptid umfassen kann. Alle Ausführungsformen rezitieren die Modifikation der "a" Determinante, die entweder eine zwei-Aminoinsertion bei Aminosäure 122 oder eine sechs Nucleotidinsertion bei 366 hat.
Zusätzlich stellt die vorliegende Erfindung ein rekombinantes Polypeptid bereit, das eine Sequenz umfaßt, die aus einem mutantem HBV-Genom abgeleitet ist und ein rekombinantes Polypeptid, das ein mutantes HBV-Epitop umfaßt: Ebenfalls bereitgestellt wird ein Antikörper, der gegen mindestens ein Epitop von mutantem HBV gerichtet ist. Der Antikörper ist polyklonal oder monoklonal. Die Erfindung stellt weiterhin ein Fusionspolypeptid bereit, das ein Polypeptid von mutantem HBV umfaßt.
Die Erfindung stellt ebenfalls einen Partikel bereit, der immunogen ist gegen mutante HBV-Infektion, der ein nicht mutantes HBV-Polypeptid umfaßt, das eine Aminosäuresequenz hat, die in der Lage ist, einen Partikel zu bilden, wenn die Sequenz in einem eukarytoischem oder prokarytoschen Wirt produziert wird und ein Epitop von mutantem HBV eine Polynucleotid-Sonde für mutantes HBV, und verschiedene Testkits zur Durchführung von verschiedenen Verfahren, um entweder mutantes HBV-Antigen oder Mutanten-HBV-Antikörper zu detektieren.
Darüberhinaus stellt die Erfindung ein Verfahren bereit zur Herstellung eines Polypeptids, das ein Epitop von mutantem HBV enthält, das das Inkubieren von Wirtszellen umfaßt, die mit einem Expressionsvektor transformiert wurden, die eine Sequenz enthalten, die ein Polypeptid kodiert, das ein Epitop von HBV enthält, unter Bedingungen und für einen Zeitraum, der die Expression dieses Polypeptids erlaubt.
Desweiteren wird ein Verfahren zur Detektion von Mutanten-HBV-Nukleinsäuren in einer Testprobe bereitgestellt, von der erwartet wird, dass sie Mutanten-HBV enthält, worin das Verfahren die Reaktion der Testprobe mit einer Sonde für ein Polynucleotid von mutantem HBV umfaßt, unter Bedingungen und für einen Zeitraum, der die Bildung eines Komplexes zwischen der Sonde und der Nukleinsäure von mutanter HBV in der Testprobe erlaubt; und Detektieren des Komplexes der die Sonde enthält. Ein zusätzliches Verfahren zur Detektion von mutantem HBV-Antigen in einer Testprobe, von der erwartet wird, daß sie mutantes HBV enthält, umfaßt das in Kontakt bringen einer Testprobe mit einem Antikörper, der gegen mutantes HBV-Antigen gerichtet ist, das detektiert werden soll, für einen Zeitraum und unter Bedingungen, die ausreichend sind, um die Bildung von Antikörper/Antigen-Komplexen zu erlauben; und Detektieren des Komplexes, der den Antikörper enthält. Wiederum ein anderes Verfahren zur Detektion von Mutanten-HBV-Antikörpern in einer Testprobe, von der erwartet wird, daß diese Antikörper enthält, umfaßt das in Kontakt bringen der Testprobe mit einem Sonden-Polypeptid, worin das Polypeptid ein mutantes HBV-Epitop enthält, für einen Zeitraum und unter Bedingungen, die ausreichend sind, um die Bildung von Antigen/Antikörper-Komplexen zu erlauben; und Detektieren dieser Komplexe, welche das Sonden-Polypeptid enthalten.
Ein Impfstoff zur Behandlung von einer Mutanten-HBV-Infektion wird ebenfalls bereitgestellt, welcher eine pharmakologisch wirksame Dosis eines immunogenen Mutanten-HBV-Polypeptids hat, welches ein Epitop von mutantem HBV in einem pharmazeutisch verträglichen Bindemittel enthält. Der Impfstoff für die Behandlung von einer Mutanten-HBV-Infektion kann ebenfalls ein inaktiviertes oder abgeschwächtes mutantes HBV in einer pharmakologisch wirksamen Dosis in einem pharmazeutisch verträglichen Bindemittel umfassen.
Weiterhin stellt die Erfindung auf Gewebekultur gewachsene Zellen bereit, die mit mutantem HBV infiziert wurden und ein Verfahren zur Herstellung von Antikörpern gegen Mutanten-HBV, das die Verabreichung eines isolierten immunogenen Polypeptids an ein Individuum umfaßt, welches ein Epitop von mutantem HBV in einer Menge enthält, die ausreichend ist, um eine Immunantwort hervorzurufen.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung liefert eine Charakterisierung eines neu ermittelten Mutanten von HBV, der eine zwei-Aminosäure (N-T) Insertion an Position 122 der HBV-Hüllregion hat. Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren bereit zur Bestimmung der Anwesenheit des Mutanten-HBV in einer Testprobe und Reagenzien, die in diesen Verfahren nützlich sind. Alle Aspekte stellen eine Modifikation der "a" Determinante bereit, in welcher es eine Insertion von zwei Aminosäuren an Position 122 der HBsAg-Sequenz gibt, welche einer sechs Nucleotidinsertion an Position 366 des HBsAg-Genoms entspricht.
Die Nukleinsäuresequenz, die von mutantem HBV abgeleitet ist, oder ein Teil davon, sind nützlich als Sonden, um die Anwesenheit von mutantem HBV in Testproben zu bestimmen. Die Sequenz macht ebenfalls Polypeptidsequenzen von Mutanten-HBV-Antigenen verfügbar, die innerhalb des Genoms von solchem Mutanten-HBV kodiert werden, und erlaubt die Produktion von Polypeptiden, welche als Standards oder Reagenzien in diagnostischen Tests und/oder als Komponenten von Impfstoffen nützlich sind. Monoklonale und polyklonale Antikörper, die gegen ein Epitop gerichtet sind, das innerhalb dieser Polypeptidsequenzen enthalten ist, sind ebenfalls für diagnostische Tests nützlich, ebenso wie als therapeutische-Wirkstoffe, zum Screening von antiviralen Wirkstoffen, und für die Isolation des Mutanten-HBV, von welchem diese Nukleinsäuresequenzen abgeleitet sind.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird ein gereinigtes Polynucleotid von mutantem HBV bereitgestellt werden, ein rekombinantes Polynucleotid von mutantem HBV, ein rekombinantes Polynucleotid, das eine Sequenz umfaßt, die von einem Genom von mutantem HBV abgeleitet ist; ein rekombinantes Polypeptid, das ein Epitop von mutantem HBV kodiert; ein rekombinanter Vektor der irgendeines der oben beschriebenen rekombinanten Polypeptide enthält, und eine Wirtszelle, die mit irgendeinem dieser Vektoren transformiert wurde. Alle Aspekte stellen eine Modifikation der "a" Determinante bereit, in welcher es eine Insertion von zwei Aminosäuren an Position 122 der HBsAg-Sequenz gibt, welche einer sechs Nucleotidinsertion an Position 366 des HBsAg-Genoms entspricht.
In einem anderen Aspekt der Erfindung wird ein gereinigtes Antigen von mutantem HBV bereitgestellt werden; eine Zubereitung von Polypeptiden aus dem gereinigten Mutanten-HBV; ein gereinigtes Polypeptid von mutantem HBV; ein gereinigtes Polypeptid, das ein Epitop umfaßt, welches immunologisch identifizierbar ist, mit einem Epitop, das in mutantem HBV enthalten ist.
In wiederum einem anderen Aspekt der Erfindung wird ein rekombinantes Expressions-System bereitgestellt werden, das einen Open Reading Frame (ORF) von DNA umfaßt, der aus einem mutanten HBV-Genom abgeleitet ist, worin der ORF operativ an eine Kontrollsequenz gebunden ist, die mit einem gewünschten Wirt kompatibel ist, eine Zelle, die mit dem rekombinanten Expressions-System transformiert wurde und ein Polypeptid, das durch die transformierte Zelle produziert wurde.
Zusätzliche Aspekte der vorliegenden Erfindung schließen ein rekombinantes Polypeptid von mutantem HBV ein, ein rekombinantes Polypeptid, das aus einer Sequenz zusammen gesetzt ist, die abgeleitet ist von einem Genom von mutantem HBV; ein rekombinantes Polypeptid, das aus einem Epitop von mutantem HBV und einem Fusionspolypeptid zusammengesetzt ist, das aus einem Polypeptid von mutantem HBV zusammengesetzt ist.
Die vorliegende Erfindung liefert ebenfalls Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers, welcher spezifisch an mindestens ein Epitop von mutantem HBV bindet; eine gereinigte Zubereitung von monoklonalen Antikörpern, die spezifisch an mindestens ein mutantes HBV-Epitop binden; und Verfahren zur Verwendung dieser Antikörper, welche diagnostische, prognostische und therapeutische Verwendungen einschließen.
In wiederum einem anderen Aspekt der Erfindung wird ein Partikel bereitgestellt werden, welcher immunogen ist gegen eine mutanten HBV-Infektion, der ein nicht mutantes HBV-Polypeptid umfaßt, das eine Aminosäuresequenz hat, die in der Lage ist einen Partikel zu bilden, wenn diese Sequenz in einem eukaryotischen Wirt produziert wird, und ein Epitop von mutantem HBV.
Eine Polynucleotid-Sonde für Mutanten-HBV wird ebenfalls bereitgestellt werden.
Die vorliegende Erfindung stellt Kits bereit, die Reagenzien enthalten, welche für die Detektion der Anwesenheit und/oder Menge von Polynucleotiden verwendet werden können; die aus mutantem HBV abgeleitet sind, wobei solche Reagenzien eine Polynucleotid-Sonde umfassen, die eine Nucleotidsequenz aus mutantem HBV von ungefähr 8 oder mehr Nucleotiden enthält, in einem geeigneten Behälter, und wobei die Nucleotide für die Insertion von zwei Aminosäuren an Position 122 kodieren; ein Reagenz zur Detektion der Anwesenheit und/oder Menge eines Mutanten-HBV-Antigens, das einen Antikörper umfaßt, der gegen das mutante HBV-Antigen gerichtet ist, das detektiert werden soll, in einem geeigneten Behälter; ein Reagenz zur Detektion der Anwesenheit und/oder Menge von Antikörpern, die gegen ein mutantes HBV-Antigen gerichtet sind, das ein Polypeptid umfaßt, das ein Epitop von mutantem HBV enthält, das in dem Mutanten-HBV-Antigen anwesend ist, bereitgestellt in einem geeigneten Behälter. Andere Kits für verschiedene Assayformate werden ebenfalls durch die vorliegende Erfindung, wie hierin beschrieben, bereitgestellt.
Andere Aspekte der vorliegenden Erfindung schließen ein Polypeptid ein, das ein Epitop von Mutanten-HBV umfaßt, angeheftet an eine feste Phase, und einen Antikörper gegen ein Epitop von mutantem HBV, angeheftet an eine feste Phase. Ebenfalls eingeschlossen sind Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, das ein Epitop gegen mutantes HBV enthält, die das Inkubieren von Wirtszellen umfassen, die mit einem Expressionsvektor transformiert wurden, der eine Sequenz enthält, die ein Polypeptid kodiert, das ein Epitop von mutantem HBV enthält, unter Bedingungen, welche die Expression des Polypeptids erlauben und ein Polypeptid, das ein Epitop von mutantem HBV enthält, hergestellt durch dieses Verfahren.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls Assays bereit, welche die rekombinanten oder synthetischen Polypeptide verwenden, die durch die Erfindung bereitgestellt werden, ebenso wie die Antikörper, die hierin in verschiedenen Formaten beschrieben sind, wobei jeder eine signalerzeugende Verbindung in dem Assay verwenden kann. Assays, die keine signalerzeugenden Verbindungen verwenden, um ein Mittel zur Detektion bereitzustellen, werden ebenfalls bereitgestellt. Alle der beschriebenen Assays detektieren im allgemeinen entweder Antigen oder Antikörper, oder beide und schließen das in Kontakt bringen einer Testprobe mit mindestens einem Reagenz ein, das hierin bereitgestellt wird, um mindestens einen Antigen/Antikörper-Komplex zu bilden, und Detektieren der Anwesenheit des Komplexes. Diese Assays sind hierin im Detail beschrieben.
Impfstoffe zur Behandlung einer Mutanten-HBV-Infektion, die ein immunogenes Peptid umfassen, das ein mutantes HBV-Epitop enthält oder eine inaktivierte Zubereitung von mutantem HBV oder eine abgeschwächte Zubereitung von mutantem HBV, sind in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Ebenfalls in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen ist ein Verfahren zur Herstellung von Antikörpern gegen mutantes HBV, das das Verabreichen eines isolierten immunogenen Polypeptids an ein Individuum umfaßt, das ein Epitop von mutantem HBV enthält, in einer Menge, die ausreichend ist, um eine Immunantwort in dem inokulierten Individuum zu erzeugen.
Ebenfalls wird durch die vorliegende Erfindung eine in Gewebekultur gewachsene Zelle bereitgestellt, die mit mutantem HBV infiziert ist.
Definitionen
Merke: Alle Definitionen schließen die Modifikation der "a" Determinante ein, in welcher es eine Insertion von zwei Aminosäuren. an Position 122 der HBsAg-Sequenz gibt, welche einer sechs Nucleotidinsertion an Position 366 des HBsAg-Genoms entspricht. Der Ausdruck "Mutanten-HBV" bedeutet ein virales Isolat, das diese Modifikation der "a" Determinante hat.
Ein Polypeptid "abgeleitet von" einer bezeichneten Sequenz, von dem Mutanten-HBV-Genom, bezieht sich auf eine Polynucleotidsequenz, welche aus einer Sequenz von ungefähr mindestens 6 Nucleotiden besteht, welche vorzugsweise mindestens ungefähr 8 Nucleotide hat, welche noch bevorzugter mindestens ungefähr 10–12 Nucleotide hat, und noch bevorzugter mindestens ungefähr 15–20 Nucleotide hat, entsprechend, d. h. homolog oder komplementär zu einer Region der bezeichneten Nucleotidsequenz. Vorzugsweise ist die Sequenz der Region, aus der das Polynucleotid abgeleitet ist, homolog oder komplementär zu einer Sequenz, die einzigartig für das Mutanten-HBV-Genom ist. Ob eine Sequenz komplementär oder homolog zu einer Sequenz ist oder nicht, welche einzigartig für ein Mutanten-HBV-Genom ist, kann bestimmt werden durch Techniken, die denjenigen, die im Fachgebiet bewandert sind, bekannt sind. Vergleiche zu Sequenzen in Datenbanken, beispielsweise können verwendet werden als ein Verfahren, um die Einzigartigkeit einer bestimmten Sequenz zu bestimmen.
Das abgeleitete Polypeptid wird nicht notwendigerweise physikalisch von der Nucleotidsequenz von Mutanten-HBV abgeleitet sein, aber kann in jeder Art und Weise erzeugt werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf chemische Synthese, Replikation oder reverse Transkription oder Transkription, welche auf der Information- basieren, die durch die Sequenz von Basen in der Region (den Regionen) bereitgestellt werden, aus denen das Polynucleotid abgeleitet ist. Zusätzlich können Kombination von Regionen, die der bestimmten Sequenz entsprechen, in Arten modifiziert werden, die im Fachgebiet bekannt sind, um mit einer beabsichtigten Verwendung übereinstimmend zu sein.
Ein Polypeptid oder eine Aminosäuresequenz, die von einer bestimmten Nukleinsäuresequenz oder von dem Mutanten-HBV-Genom abgeleitet ist, bezieht sich auf ein Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz hat, die identisch ist mit der eines Polypeptids, das in der Sequenz kodiert wird, oder einem Teil davon, worin der Teil aus mindestens 2 bis 5 Aminosäuren besteht, und bevorzugter aus mindestens 8 bis 10 Aminosäuren und noch bevorzugter aus 15 bis 20 Aminosäuren oder welches immunologisch identifizierbar ist mit einem Polypeptid, das in der Sequenz kodiert wird.
Ein "rekombinantes Protein" ("rekombinantes Polynucleotid"), wie hierin verwendet, bedeutet zumindest ein Polypeptid von genomischem semisynthetischem oder synthetischem Ursprung, welche aufgrund seines Ursprungs oder von Manipulation nicht mit allen oder einem Teil dse Polynucleotids assoziiert ist, mit dem es in der Natur assoziiert ist, oder in der Form einer Bücherei und/oder an ein Polynucleotid geknüpft ist, das anders ist als das, an welches es in Natur geknüpft ist. Ein rekombinantes oder abgeleitetes Polypeptid wird nicht notwendigerweise von einer bestimmten Nukleinsäuresequenz von Mutanten-HBV oder von einem Muntanten-HBV-Genom translatiert. Es kann auch in einer Art und Weise erzeugt werden, einschließlich chemischer Synthese oder Expression eines rekombinanten Expressionssystems oder Isolation von mutiertem HBV.
Der Ausdruck "Polynucleotid", wie hierin verwendet, bedeutet eine polymere Form von Nucleotiden jeder Länge, entweder Ribonucleotiden oder Desoxyribonucleotiden. Dieser Ausdruck bezieht sich nur auf die Primärstruktur des Moleküls. Daher schließt der Ausdruck doppelt- und einzelsträngige DNA ein, ebenso wie doppelt- und einzelsträngige RNAs. Er schließt ebenfalls Modifikationen ein, entweder durch Methylierung und/oder durch Überdecken, und unmodifizierte Formen des Polynucleotids.
"Gereinigtes virales Polynucleotid" bezieht sich auf ein Genom von Mutanten-HBV oder ein Fragment davon, welches im wesentlichen frei ist von Polypeptiden, d. h. weniger als ungefähr 50% vorzugsweise weniger als ungefähr 70% und noch bevorzugter weniger als ungefähr 90% an Polypeptiden enthält, mit welchen das virale Polynucleotid natürlicherweise assoziiert ist. Techniken zur Reinigung von viralen Polynucleotiden sind im Fachgebiet wohl bekannt und schließen beispielsweise die Zerstörung des Partikels mit einem chaotropen Wirkstoff ein, und das Abtrennen des Polynucleotids (der Polynucleotide) und Polypeptide durch Ionen-Austauschchromatographie, Affinitätschromatographie und Sedimentation nach der Dichte. Daher bedeutet "gereinigtes virales Polypeptid" ein Polypeptid von Mutanten-HBV oder einem Fragment davon, welches im wesentlichen frei ist von zellulären Komponenten, d. h. weniger als ungefähr 50%, vorzugsweise weniger als ungefähr 70% und noch bevorzugter weniger als ungefähr 90% an zellulären Komponenten enthält, mit welchen das virale Polypeptid natürlicherweise assoziiert ist. Verfahren zur Reinigung sind dem Fachmann bekannt.
"Polypeptid" wie hierin verwendet, bezeichnet eine molekulare Kette von Aminosäuren, und bezieht sich nicht auf eine spezifische Länge des Produktes. Daher sind Peptide, Oligopeptide und Proteine eingeschlossen innerhalb der Definition von Polypeptid. Dieser Ausdruck soll sich jedoch nicht auf post-Expressionsmodifikationen des Polypeptids beziehen, beispielsweise Glycosylierungen, Acetylierungen, Phosphorylierungen und dergleichen.
"Rekombinante Wirtszellen", "Wirtszellen", "Zellen", "Zellinien", "Zellkulturen" und andere solcher Ausdrücke, die Mikroorganismen oder höhere eucaryotische Zellinien bezeichnen, die als unizelluläre Einheiten kultiviert wurden, beziehen sich auf Zellen, welche verwendet werden können oder verwendet worden sind als Empfänger für einen rekombinanten Vektor oder andere Transfer-DNA, und schließen die originale Nachkommenschaft der originalen Zelle ein, welche transfiziert wurde.
Wie hierin verwendet, bedeutet "Replikon" irgendein genetisches Element, wie zum Beispiel ein Plasmid, ein Chromosom, einen Virus, der sich wie eine autonome Einheit von Polynucleotidreplikation innerhalb einer Zelle verhält. Das bedeutet, es ist in der Lage zur Replikation unter seiner eigenen Kontrolle.
Ein "Vektor" ist ein Replikon, in welchem ein anderes Polynucleotidsegment angeheftet ist, wie zum Beispiel um die Replikation und/oder Expression des angeheftet Segments zu bewirken.
Der Ausdruck "Kontrollsequenz" bezieht sich auf Polynucleotidsequenzen, welche notwendig sind, um die Expression von kodierenden Sequenzen zu bewirken, an welche sie ligiert sind. Die Natur solcher Kontrollsequenzen unterscheidet sich abhängig von dem Wirtsorganismus. In Prokaryoten schließen solche Kontrollsequenzen üblicherweise Promoter, ribosomale Bindungsstelle und Terminatoren ein; in Eukaryoten schließen solche Kontrollsequenzen üblicherweise Promoter, Terminatoren und in einigen Fällen, Verstärker ein. Der Ausdruck "Kontrollsequenz" soll daher zumindest alle Komponenten einschließen, deren Anwesenheit notwendig ist für die Expression, und kann ebenfalls zusätzliche Komponenten einschließen, deren Anwesenheit vorteilhaft ist, zum Beispiel Leadersequenzen.
"Operativ verbunden" bezieht sich auf eine Situation, worin die beschriebenen Komponenten in Beziehung zueinander stehen, was ihnen erlaubt in ihrer beabsichtigten Weise zu funktionieren. Daher ist zum Beispiel eine Kontrollsequenz "operativ verbunden" mit einer kodierenden Sequenz in einer solchen Art und Weise, das die Expression der kodierenden Sequenz erreicht wird, unter Bedingungen, die kompatibel sind mit den Kontrollsequenzen.
Der Ausdruck "Open Reading Frame" oder "ORF" bezieht sich auf eine Region einer Polynucleotidsequenz, welche ein Polypeptid kodiert; diese Region kann einen Teil einer kodierenden Sequenz oder eine gesamte kodierende Sequenz darstellen.
Eine "kodierende Sequenz" ist eine Polynucleotidsequenz, welche in mRNA transkribiert wird und/oder in ein Polypeptid translatiert wird, wenn sie unter die Kontrolle von geeigneten regulatorischen Sequenzen gesetzt wird. Die Grenzen der kodierenden Sequenz werden bestimmt durch ein Translationsstartcodon an dem 5'-Terminus und ein Translationsstopcodon an dem 3'-Terminus. Eine kodierende Sequenz kann einschließen, ist aber nicht begrenzt auf mRNA und rekombinante Polypeptidsequenzen.
Der Ausdruck "immunologisch identifizierbar mit/als" bezieht sich auf die Anwesenheit von Epitopen und Polypeptiden, welche ebenfalls anwesend sein können und einzigartig sind für das bestimmte Polypeptid (die bestimmten Polypeptide) üblicherweise Mutanten-HBV-Proteine. Die immunologische Identität kann bestimmt werden durch Antikörperbindung und/oder Konkurrenz in der Bindung. Diese Techniken sind dem Fachmann bekannt und sind ebenfalls hierin beschrieben. Die Einzigartigkeit eines Epitops kann auch bestimmt werden durch Computeruntersuchungen von bekannten Datenbanken, wie zum Beispiel der Genbank, für die Polynucleotidsequenzen, welche das Epitop kodieren, und durch Aminosäuresequenzvergleiche mit anderen bekannten Proteinen.
Wie hierin verwendet bedeutet "Epitop" eine antigene Determinante eines Polypeptids. Vorstellbarerweise kann ein Epitop drei Aminosäuren in einer räumlichen Konformation umfassen, welche einzigartig ist für das Epitop. Üblicherweise besteht ein Epitop aus mindestens fünf solcher Aminosäuren, und üblicher besteht es aus mindestens 8 bis 10 Aminosäuren. Verfahren zur Überprüfung der räumlichen Konformation sind im Fachgebiet bekannt und schließen beispielsweise die Röntgenkristallographie und zwei-dimensionale nukleare magnetische Resonanz ein.
Ein Polypeptid ist "immunologisch reaktiv" mit einem Antikörper, wenn es an den Antikörper bindet aufgrund von Antikörpererkennung eines spezifischen Epitops, das in dem Polypeptid enthalten ist. Die immunologische Reaktivität kann bestimmt werden durch Antikörperbindung, genauer durch die Kinetiken der Antikörperbindung, und/oder durch Konkurrenz der Bindung unter Verwendung eines bekannten Polypeptids (bekannten Polypeptiden), die ein Epitop enthalten, gegen welches der Antikörper gerichtet ist, als Kompetitoren. Die Verfahren zum Bestimmen, ob ein Polypeptid immunologisch reaktiv ist mit einem Antikörper sind im Fachgebiet bekannt.
Wie hierin verwendet bedeutet der Ausdruck "immunogenes Polypeptid, das ein Mutanten-HBV-Epitop enthält" natürlich vorkommende Polypeptide von Mutanten-HBV oder Fragmenten davon, ebenso wie Polypeptide, die durch andere Mittel hergestellt wurden, beispielsweise chemischer Synthese oder der Expression des Polypeptids in einem rekombinanten Organismus.
Der Ausdruck "Transformation" bezieht sich auf die Insertion eines exogenen Polynucleotids in eine Wirtszelle, ungeachtet dem Verfahren, das für die Insertion verwendet wurde. Zum Beispiel sind die direkte Aufnahme, die Transduktion oder die f-Paarung eingeschlossen. Das exogene Polynucleotid kann als ein nicht integrierter Vektor gehalten werden, zum Beispiel als ein Plasmid oder alternativ kann es in das Wirtsgenom integriert werden.
"Behandlung" bezieht sich auf Prophylaxe und/oder Therapie. Der Ausdruck "Individuum", wie hierin verwendet, bezieht sich auf Wirbeltiere, insbesondere Mitglieder der Säugetierspezies und schließt ein, ist aber nicht beschränkt auf Haustiere, Sporttiere, Primaten und Menschen; genauer bezieht sich der Ausdruck auf Schimpansen und Menschen.
Der Ausdruck "plus-Strang", wie hierin verwendet, bezeichnet eine Nukleinsäure, die die Sequenz enthält, die das Polypeptid kodiert. Der Ausdruck "minus-Strang" bezeichnet eine Nukleinsäure, die eine Sequenz enthält, die komplementär ist zu der des "plus" Strangs.
"Positiv strängiges Genom" eines Virus bedeutet, daß das Genom einzelsträngig ist und ein virales Polypeptid (virale Polypeptide) kodiert.
Der Ausdruck "Antikörper enthaltende Körperkomponente" (oder Testprobe) bezieht sich auf eine Komponente eines Körpers von einem Individuum, welche die Quelle ist für Antikörper von Interesse. Diese Komponenten sind im Fachgebiet wohl bekannt. Diese Proben schließen biologische Proben ein, welche durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung, die hierin beschriebn sind, getestet werden können, und schließen menschliche und tierische Körperflüssigkeiten ein, wie zum Beispiel Vollblut, Serum, Plasma, cerebrospinal Flüssigkeit, Urin, Lymphflüssigkeiten und verschiedene externe Sekretionen des Respirations-, Intestinal- und Urogenitaltrakts, Tränen, Speichel, Milch, weiße Blutkörperchen, Melome und dergleichen, biologische Flüssigkeiten, wie zum Beispiel Zellkulturüberstände, feste Gewebeproben und feste Zellproben.
"Gereinigtes Mutanten-HBV" bezieht sich auf eine Zubereitung von Mutanten-HBV, welche isoliert wurde aus den zellulären Bestandteilen, mit welchen der Virus normalerweise assoziiert ist, und aus anderen Typen von Viren, welche in dem infizierten Gewebe anwesend sein können. Die Techniken zur Isolierung von Viren sind denjenigen, die im Fachgebiet bewandert sind bekannt und schließen beispielsweise die Zentrifugation und die Affinitätschromatographie ein. Ein Verfahren für die Zubereitung von gereinigtem HBV ist hierin beschrieben.
Allgemeine Verwendungen
Nach der Herstellung von rekombinanten Proteinen, synthetischen Peptiden oder gereinigten viralen Polypeptiden nach Wahl, wie durch die vorliegende Erfindung beschrieben, können die rekombinanten oder synthetischen Peptide verwendet werden, um einzigartige Assays zu entwickeln, wie hierin beschrieben, um entweder in Anwesenheit eines Antigens oder Antikörpers gegen Mutanten-HBV zu detektieren. Diese Zusammensetzungen können auch verwendet werden, um monoklonale und/oder polyklonale Antikörper mit einem spezifischen rekombinanten Protein oder synthetischen Peptid zu entwickeln, welches spezifisch an das immunologische Epitop des Mutanten-HBV bindet, welches durch den Fachmann gewünscht wird. Ebenfalls wird in Erwägung gezogen, daß mindestens ein Polynucleotid der Erfindung verwendet werden kann um Impfstoffe zu entwickeln durch Befolgen der Verfahren, die im Fachgebiet bekannt sind.
Es wird in Erwägung gezogen, daß das verwendete Reagenz für den Assay in der Form eines Kits bereitgestellt werden kann mit einem oder mehreren Behältern, wie zum Beispiel Röhrchen oder Flaschen, wobei jeder Behälter ein separates Reagenz enthält, wie zum Beispiel einen monoklonalen Antikörper oder einen Cocktail von monoklonalen Antikörpern oder ein Polypeptid (entweder rekombinant oder synthetisch), das in dem Assay verwendet wird.
"Feste Phasen" ("feste Träger") sind denen im Fachgebiet bekannt und schließen ein die Wände von Behältern eines Reaktionsgefäßes, Teströhrchen, Polystyrenkügelchen, magnetischen Kügelchen, Nitrozellulosestreifen, Membranen, Mikropartikeln, wie zum Beispiel Latexpartikeln und andere. Die "feste Phase" ist nicht entscheidend und kann gewählt werden durch einen, der im Fachgebiet bewandert ist. Daher sind Latexpartikel, Mikropartikel, magnetische oder nicht magnetische Kügelchen, Membranen, Plastikröhrchen, Wände von Mikrotiterauskerbungen, Glas oder Silikonchips und rote Blutkörperchen vom Schaf alle geeignete Beispiele. Geeignete Verfahren zur Immobilisierung von Peptiden auf festen Phasen schließen ionische, hydrophobe, kovalente Wechselwirkungen und dergleichen ein. Eine "feste Phase", wie hierin verwendet, bezieht sich auf jedes Material, welches unlöslich ist, oder welches durch eine nachfolgende Reaktion unlöslich gemacht werden kann. Die feste Phase kann gewählt werden wegen ihrer intrinsischen Fähigkeit, das Einfangreagenz anzuziehen und zu immobilisieren. Alternativ kann die feste Phase einen zusätzlichen Rezeptor zurückbehalten, der die Fähigkeit hat, das Einfangreagenz anzuziehen und zu immobilisieren. Der zusätzliche Rezeptor kann eine geladene Substanz einschließen, die gegenteilig geladen ist in Bezug auf das Einfangreagenz selbst oder in Bezug auf eine geladene Substanz, die mit dem Einfangreagenz konjugiert ist. Als wiederum eine andere Alternative kann das Rezeptormolekül irgendein spezifisches Bindeglied sein, welches auf der festen Phase immobilisiert ist (an die feste Phase angeheftet ist) und welches die Fähigkeit besitzt, das Einfangreagenz durch eine spezifische Bindungsreaktion zu immobilisieren. Das Rezeptormolekül erlaubt die indirekte Bindung des Einfangreagenzes an ein festes Phasenmaterial vor der Durchführung des Assays oder während der Durchführung des Assays. Die feste Phase kann daher ein Plastik sein, ein derivatisiertes Plastik, ein magnetisches oder nicht magnetisches Metall, Glas oder eine Silikonoberfläche eines Teströhrchens, einer Mikrotiterauskerbung, ein Blatt, ein Kugel, ein Mikropartikel, ein Chip und andere Konfigurationen, die denjenigen, die im Fachgebiet durchschnittlich bewandert sind, bekannt sind.
Es wird in Erwägung gezogen und es ist innerhalb des Schutzumfangs der Erfindung, dass die feste Phase auch irgendein geeignetes poröses Material umfaßt mit ausreichend Porösität, um einen Zugang durch die Detektion von Antikörpern und eine geeignete Oberflächenaffinität zu erlauben, um Antigene zu binden. Mikroporöse Strukturen werden allgemein bevorzugt, aber Materialien mit Gelstruktur im hydrierten Stadium können ebenfalls verwendet werden. Solche nützlichen festen Träger schließen folgende ein:
neutrale polymere Kohlenhydrate und deren synthetisch modifizierte, quervernetzte oder substituierte Derivate, wie zum Beispiel Agar, Agarose, quervernetzte Alginsäure, substituierte und quervernetzte Guargummis, Zelluloseester, insbesondere mit Salpetersäure und Carbonsäuren, gemischte Zelluloseester, und Zellulether; natürliche Polymere, die Stickstoff enthalten, wie zum Beispiel Proteine und Derivate, einschließlich quervernetzter oder modifizierter Gelatine; natürlichen Kohlenwasserstoffpolymere, wie zum Beispiel Latex und Gummi; synthetische Polymere, welche mit geeigneten porösen Strukturen hergestellt werden, wie zum Beispiel Vinylpolymere, einschließlich Polyethylen, Polypropylen, Polystyren, Polyvinylchlorid, Polyvinylacetat und deren partiell hydrolysierte Derivate, Polyacrylamide, Polymethacrylate, Copolymere und Terpolymere der oben genannten Polykondensate, wie zum Beispiel Polyester, Polyamide und andere Polymere, wie zum Beispiel Polyurethane oder Polyepoxide; poröse anorganische Materialien, wie zum Beispiel Sulfate oder Carbonate von Erdalkalimetallen und Magnesium, einschließlich Bariumsulfat, Kalziumsulfat, Kalziumcarbonat, Silikaten von Alkali- und Erdalkalimetallen, Aluminium und Magnesium; und Aluminium oder Silikonoxide oder Hydrate, wie zum Beispiel Lehm, Aluminium, Talk, Kaolin, Zeolith, Silikagel oder Glas (diese Materialien können als Filter verwendet werden mit den oben genannten polymeren Materialien); und Mischung oder Copolymere von den oben genannten Klassen, wie zum Beispiel Pfropfcopolymere, erhalten durch Initialisierung der Polymerisation von synthetischen Polymeren auf einem vorbestehenden natürlichen Polymer. Alle dieser Materialien können in geeigneten Formen verwendet werden, wie zum Beispiel Filmen, Blättern oder Platten, oder sie können auf geeignete inerte Träger beschichtet werden oder daran gebunden werden oder laminiert werden, wie zum Beispiel Papier, Glas, Plastikfilmen oder Geweben.
Die poröse Struktur von Nitrozellulose hat exzellente Absorptions- und Adsorptionsqualitäten für eine große Vielzahl an Reagenzien, einschließlich monoklonalen Antikörpern. Nylon besitzt ebenfalls ähnliche Charakteristika und ist ebenfalls geeignet. Es wird in Erwägung gezogen, daß solche porösen festen Träger, die hierin oben beschrieben wurden, vorzugsweise in der Form von Blättern mit einer Dicke von ungefähr 0,01 bis 0,5 mm, vorzugsweise ungefähr 0,1 mm vorliegen. Die Porengröße kann innerhalb großen Grenzen variieren, und ist vorzugsweise von ungefähr 0,025 bis 15 Mikrons, insbesondere von ungefähr 0,15 bis 15 Mikrons. Die Oberflächen solcher Träger können aktiviert sein durch chemische Verfahren, welche eine kovalente Bindung des Antigens oder Antikörpers an den Träger bewirken. Die irreversible Bindung des Antigens oder Antikörpers wird jedoch im allgemeinen durch Absorption an das poröse Material durch wenig verstandene hydrophobe Kräfte erhalten. Geeignete feste Träger sind ebenfalls beschrieben in U.S. Patentanmeldung Serien Nr. 227, 272, welche hierin durch die Bezugnahem aufgenommen ist.
Das "Indikatorreagenz" umfaßt eine "signalerzeugende Verbindung" (Marker) welche in der Lage ist ein meßbares Signal zu erzeugen, daß durch externe Mittel detektierbar ist, die an ein spezifisches Bindeglied für Mutanten-HBV konjugiert (angeheftet) ist. "Spezifisches Bindeglied", wie hierin verwendet, bedeutet ein Glied eines spezifischen Bindungspaars. D. h., zwei unterschiedliche Moleküle, wobei eines der Moleküle durch chemische oder physikalische Mittel spezifisch an das zweite Molekül bindet. Zusätzlich dazu, daß das Indikatorreagenz ein Antikörperglied eines spezifischen Bindungspaars für Mutanten-HBV ist, kann es auch ein Glied von irgendeinem spezifischen Bindungspaars sein, einschließlich jeweils Hapten-Antihaptensystemen, wie zum Beispiel Biotin oder anti-Biotin, Avidin odr Biotin, einem Kohlenhydrat oder einem Lectin, eine komplementäre Nucleotidsequenz, ein Effektor- oder ein Rezeptormolekül, ein Enzymcovaktor und ein Enzym, ein Enzyminhibitor oder ein Enzym, und dergleichen. Ein immunoreaktives spezifisches Bindungsglied kann ein Antikörper sein, ein Antigen, oder ein Antikörper/Antigenkomplex, der in der Lage ist, entweder an Mutanten-HBV wie in einem Sandwichassay zu binden, an das Einfangreagenz wie in einem kompetitiven Assay, oder an das untergeordnete spezifische Bindungsglied, wie in einem indirekten Assay.
Die verschiedenen "signalerzeugenden Verbindungen" (Marker), die in Erwägung gezogen werden, schließen Chromogene, Katalysatoren, wie zum Beispiel Enzyme, lumineszente Verbindungen, wie zum Beispiel Fluorescein und Rhodamin, chemilumineszente Verbindungen, radioaktive Elemente, und direkte visuelle Marker ein. Beispiele von Enzymen, schließen alkalische Phosphatase, Meerrettich-Peroxidase, beta-Galactosidase und dergleichen ein. Die Auswahl eines speziellen Markers ist nicht entscheidend aber wird in der Lage sein, ein Signal zu erzeugen, entweder durch den Marker selbst oder in Verbindung mit einer oder mehreren zusätzlichen Substanzen.
Andere Ausführungsformen, welche verschiedene andere feste Phasen verwenden, werden ebenfalls in Erwägung gezogen und liegen innerhalb des Schutzumfangs dieser Erfindung. Zum Beispiel können Ioneneinfangverfahren zur Immobilisierung eines immobilisierbaren Reaktionskomplexes mit einem negativ geladenen Polymer, beschrieben in der mit-anhängigen U.S. Patentanmeldung mit der laufenden Nr. 150,278, entsprechend der EP Veröffentlichung 0326100 und U.S. Patentanmeldung mit der Serien Nr. 375,029, (EP Veröffentlichungsnr. 0406473), wovon jede hierin durch die Bezugnahme eingeschlossen ist, verwendet werden gemäß der vorliegenden Erfindung, um immunochemische Reaktion mit einer schnellen Lösungsphase zu bewirken. Ein immunobilisierbarer Immunkomplex wird vom Rest der Reaktionsmischung durch ionische Wechselwirkungen zwischen dem negativ geladenen Polyanion/Immun-Komplex und der zuvor behandelten positiv geladenen porösen Matrix abgetrennt, und detektiert durch Verwendung von verschiedenen signalerzeugenden Systemen, die zuvor beschrieben wurden, einschließlich derer die in chemilumineszenten Signalmessungen beschrieben wurden, wie beschrieben in der mitanhängigen U.S. Patentanmeldung Serien Nr. 921,979 entsprechend der EPO Veröffentlichung Nr. 0 273 115, welche hierin durch die Bezugnahme eingeschlossen ist.
Ebenfalls können die Verfahren der vorliegenden Erfindung angepaßt werden zur Verwendung in Systemen, welche die Mikropartikeltechnologie verwenden, einschließlich in automatisierten und semiautomatisierten Systemen, worin die feste Phase einen Mikropartikel umfaßt. Solche Systeme schließen diejenigen ein, die in den anhängigen U.S. Patentanmeldungen 425,651 und 425,643 beschrieben sind, welche den veröffentlichten EPO Anmeldungen mit den Nrn. EP 0 425 633 und EP 0 424 634 entsprechen, welche hierin durch die Bezugnahme aufgenommen sind.
Die Verwendung von Abtastsondenmikroskopie (scanning probe microscopy, SPM) für Immunoassays ist ebenfalls eine Technologie, an welche die monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung leicht angepaßt werden können. In der Abtastsondenmikroskopie, insbesondere in der Atomkraftmikroskopie, wird die Einfangphase, zum Beispiel mindestens einer der monoklonalen Antikörper der Erfindung, an eine feste Phase angeheftet und ein Abtastsondenmikroskop wird verwendet, um Antigen/Antikörper-Komplexe zu detektieren, welche auf der Oberfläche der festen Phase anwesend sein können. Die Verwendung von Abtasttunnelungsmikroskopie eliminiert das Bedürfnis nach Markern, welche normalerweise in vielen Immunoassaysystemen verwendet werden müssen, um Antigen/Antikörper-Komplexe zu detektieren. Solch ein System ist beschrieben in der anhängigen U.S. Patentanmeldung Nr. 662,147, welches hierin durch die Bezugnahme aufgenommen ist.
Die Verwendung von SPM, um spezifische Bindungsreaktionen zu überwachen, kann in vielen Arten auftreten. In einer Ausführungsform wird ein Glied eines spezifischen Bindungspartners (eine Analyt-spezifische Substanz, welche der monoklonale Antikörper der Erfindung ist) an eine Oberfläche angeheftet, die geeignet ist für das Abtasten. Das Anheften der Analyt-spezifischen Substanz kann durch Absorption an ein Teststück sein, welches eine feste Phase einer Plastik- oder Metalloberfläche umfaßt, gemäß den Verfahren, die denjenigen von gewöhnlicher Kenntnis im Fachgebiet bekannt sind. Oder das kovalente Anheften eines spezifischen Bindungspartners (einer Analyt spezifischen Substanz) an ein Teststück, wobei das Teststück eine feste Phase von derivatisiertem Plastik, Metall, Silizium oder Glas umfaßt, kann verwendet werden. Kovalente Anheftungsverfahren sind denjenigen, die im Fachgebiet bewandert sind, bekannt, und schließen eine Vielzahl von Mitteln ein, um spezifische Bindungspartner irreversibel an das Teststück zu binden. Wenn das Teststück Silizium oder Glas ist, muß die Oberfläche vor dem Anheften des spezifischen Bindungspartners aktiviert werden. Aktivierte Silanverbindungen, wie zum Beispiel Triethoxyaminopropylsilan (erhältlich von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), Triethoxyvinylsilan (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) und (3-Mercapto-propyl)-trimethoxysilan (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) können, verwendet werden, um reaktive Gruppen, wie zum Beispiel Amino-, Vinyl bzw. Thiol einzuführen. Solche aktivierten Oberflächen können verwendet werden, um den Bindungspartner direkt (in den Fällen von Amino oder Thiol) zu verknüpfen oder die aktivierte Oberfläche kann weiter reagiert werden mit Linkern, wie zum Beispiel Glutaraldehyd, bis(Succinimidyl)suberat, SPPD 9 Succinimidyl 3-[2-Pyridyldithio]propionat), SMCC (Succinimidyl-4-[N-maleimidomethyl]cyclohexan-1-carboxylat), SIAB (Succinimidyl[4-jodacetyl]aminobenzoat) und SMPB (Succinimidyl 4-[1-maleimidophenyl]butyrat), um den Bindungspartner von der Oberfläche abzutrennen. Die Vinylgruppe kann oxidiert werden, um ein Mittel für die kovalente Anheftung bereitzustellen. Sie kann auch verwendet werden als ein Anker für die Polymerisation von verschiedenen Polymeren, wie zum Beispiel Polyacrylsäure, welche vielfache Anheftungspunkte für spezifische Bindungspartner bereitstellen kann. Die Aminooberfläche kann mit oxidierten Extranen von unterschiedlichen Molekulargewichten reagiert werden, um hydrophile Linker von unterschiedlicher Größe und Kapazität bereitzustellen. Beispiele von oxidierbaren Dextranen schließen Dextran T-40 (Molekulargewicht 40,000 Dalton), Detran T-110 (Molekulargewicht 110,000 Dalton), Dextran T-500 (Molekulargewicht 500,000 Dalton), Dextran T-2M (Molekulargewicht 2,000,000 Dalton), (wobei alle erhältlich sind von Pharmacia) oder Ficoll (Molekulargewicht 70,000 Dalton (erhältlich von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) ein. Auch können Polyelektrolytwechselwirkungen verwendet werden, um einen spezifischen Bindungspartner auf einer Oberfläche eines Teststücks zu immobilisieren unter Verwendung von Techniken und von Chemie, die beschrieben sind durch anhängige U.S. Patentanmeldungen Seriennr. 150,278, angemeldet 29. Januar 1988, und Seriennr. 375,029, angemeldet 7. July 1989. Das bevorzugte Anheftungsverfahren ist durch kovalente Mittel. Gemäß der Anheftung eines spezifischen Bindungsglieds, kann die Oberfläche weiter behandelt werden mit Materialien, wie zum Beispiel Serum, Proteinen oder anderen blockierenden Mitteln, um die nicht spezifische Bindung zu minimieren. Die Oberfläche kann auch entweder an der Herstellungsstelle oder am Punkt, der Verwendung abgetastet werden, um ihre Geeignetheit für Assayzwecke zu verifizieren. Es wird nicht erwartet, daß das Abtastverfahren die spezifischen Bindungseigenschaften des Teststücks abändern.
Verschiedene andere Assayformate können verwendet werden, einschließlich "Sandwich" Immunoassays und kompetitiven Sondenassays. Beispielsweise können die monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung in verschiedenen Assaysystemen verwendet werden, um die Anwesenheit von Mutanten-HBV-Proteinen, wenn es welche gibt, in einer Testprobe zu bestimmen. Fragmente dieser bereitgestellten monoklonalen Antikörper können auch verwendet werden. Beispielsweise werden in einem ersten Assayformat ein polyklonaler oder monoklonaler anti-Mutanten- HBV-Antikörper oder ein Fragment davon oder eine Kombination dieser Antikörper, welche auf eine feste Phase geschichtet wurden, mit einer Testprobe in Kontakt gebracht, welche Mutanten-HBV-Proteine enthalten kann, um eine Mischung zu bilden. Diese Mischung wird für einen Zeitraum und unter Bedingungen inkubiert, die ausreichend sind, um Antigen/Antikörper-Komplexe zu bilden. Dann wird ein Indikatorreagenz, das einen monoklonalen oder einen polyklonalen Antikörper oder ein Fragment davon umfaßt, welches spezifisch an eine Mutanten-HBV-Region bindet, oder eine Kombination dieser Antikörper, an welche eine signalerzeugende Verbindung angeheftet wurde, mit den Antigen/Antikörper-Komplexen in Kontakt gebracht, um eine zweite Mischung zu bilden. Diese zweite Mischung wird dann für einen Zeitraum und unter Bedingungen inkubiert, die ausreichend sind, um Antikörper/Antigen/Antikörper-Komplexe zu bilden. Die Anwesenheit von Mutanten-HBV-Antigen, das in der Testprobe anwesend ist und auf der festen Phase eingefangen wurde, wird, wenn es welches gibt, durch die Detektion des meßbaren Signals, das durch die signalerzeugende Verbindung erzeugt wurde, bestimmt. Die Menge an Mutanten-HBV-Antigen, die in der Testprobe vorhanden ist, ist proportional zu dem erzeugten Signal.
Alternativ werden ein polyklonaler oder monoklonaler anti-Mutanten-HBV-Antikörper oder ein Fragment davon, oder eine Kombination dieser Antikörper, welche an einen festen Träger gebunden sind, die Testprobe und ein Indikatorreagenz, das einen monoklonalen oder polyklonalen Antikörper oder Fragmente davon umfaßt, welches spezifisch an Mutanten-HBV-Antigen bindet, oder eine Kombination dieser Antikörper, an welche eine signalerzeugende Verbindung angeheftet ist, in Kontakt gebracht, um eine Mischung zu bilden. Diese Mischung wird für einen Zeitraum und unter Bedingungen inkubiert, die ausreichend sind, um Antikörper/Antigen/Antikörper-Komplexe zu bilden. Die Anwesenheit von Mutanten-HBV-Proteinen, falls es welche gibt, die in der Testprobe anwesend sind und auf der festen Phase eingefangen wurden, wird durch die Detektion des meßbaren Signals bestimmt, das durch die signalerzeugende Verbindung erzeugt wurde. Die Menge an Mutanten-HBV-Proteinen, die in der Testprobe vorhanden sind, ist proportional zu dem erzeugten Signal
In einem anderen alternativen Assayformat kann einer oder eine Kombination von einem oder mehreren monoklonalen Antikörpern der Erfindung verwendet werden als eine kompetitive Sonde für die Detektion von Antikörpern gegen Mutanten-HBV-Protein. Beispielsweise können Mutanten-HBV-Proteine, entweder alleine oder in Kombination mit anderen Mutanten-HBV-Proteinen oder nicht Mutanten-HBV-Proteinen auf eine feste Phase geschichtet werden. Eine Testprobe, von der vermutet wird, dass sie Antikörper gegen Mutanten und/oder nicht-Mutanten-HBV-Antigen enthält, wird dann mit einem Indikatorreagenz, das eine signalerzeugende Verbindung umfaßt, und mindestens einem monoklonalen Antikörper der Erfindung für einen Zeitraum und unter Bedingungen inkubiert, die ausreichend sind, um Antigen/Antikörper-Komplexe aus entweder der Testprobe und dem Indikatorreagenz gegenüber der festen Phase oder dem Indikatorreagenz gegenüber der festen Phase zu bilden. Die Reduktion in der Bindung des monoklonalen Antikörpers an die feste Phase kann quantitativ gemessen werden. Eine meßbare Reduktion in dem Signal, verglichen mit dem Signal, das aus einer bestätigten negativen HBV-Testprobe erzeugt wird, zeigt die Anwesenheit von anti-HBV-Antikörper in der Testprobe an.
In wiederum einem anderen Detektionsverfahren kann jeder der monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung verwendet werden in der Detektion von Mutanten-HBV-Antigenen in festen Gewebeabschnitten, ebenso wie in festen Zellen durch immunohistochemische Analyse.
Zusätzlich können diese monoklonalen Antikörper an Matrixen gebunden sein, ähnlich der CNBr-aktivierten Sepharose und verwendet werden für die Affinitätsreinigung von spezifischen Mutanten-HBV-Proteinen aus Zellkulturen oder biologischen Geweben, wie zum Beispiel Blut und Leber.
Die monoklonalen Antikörper der Erfindung können auch verwendet werden für die Erzeugung von chimären Antikörpern zur therapeutischen Verwendung, oder für andere ähnliche Anwendungen.
Die monoklonalen Antikörper oder Fragmente davon können individuell bereitgestellt werden, um Mutanten-HBV-Antigene zu detektieren. Kombinationen der monoklonalen Antikörper (und Fragmente davon), die hierin bereitgestellt werden, können auch zusammen als Komponenten in einer Mischung oder einem "Cocktail" von mindestens einem anti-Mutanten-HBV-Antikörper der Erfindung mit Antikörpern gegen andere HBV-Regionen (entweder Mutanten oder nicht Mutanten, jeweils mit unterschiedlichen Bindungsspezifitäten) verwendet werden. Somit kann dieser Cocktail die monoklonalen Antikörper der Erfindung einschließen, welche gegen Mutanten-HBV-Proteine gerichtet sind und andere monoklonale Antikörper gegen andere Antigene Determinanten des HBV-Genoms einschließen.
Der polyklonale Antikörper oder das Fragment davon, welches in den Assayformaten verwendet werden kann, sollte spezifisch an eine spezifische Region des Mutanten-HBV oder anderen Mutanten-HBV-Proteinen, die in dem Assay verwendet werden, binden. Der verwendete polyklonale Antikörper ist vorzugsweise von Säugetierursprung. Ein polyklonaler anti-HCV-Antikörper vom Menschen, von der Ziege, vom Hasen oder Schaf kann verwendet werden. Vorzugsweise ist der polyklonale Antikörper ein polyklonaler anti-Mutanten-HBV-Antikörper vom Hasen. Die polyklonalen, Antikörper die in den Assays verwendet werden können entweder alleine oder als ein Cocktail von polyklonalen Antikörpern verwendet werden. Da die Cocktails, die in den Assayformaten verwendet werden, aus entweder monoklonalen Antikörpern oder polyklonalen Antikörpern mit unterschiedlichen HBV-Spezifitäten zusammengesetzt sind, wären sie nützlich für die Diagnose, Bewertung und Prognose einer HBV-Infektion, ebenso wie für die Untersuchung der HBV-Proteindifferenzierung und Spezifität.
In einem anderen Assayformat kann die Anwesenheit von Antikörper und/oder Antigen gegen Mutanten-HBV in einem simultanen Assay detektiert werden, wie folgt. Eine Testprobe wird gleichzeitig mit einem Einfangreagenz eines ersten Analyten, worin das Einfangreagenz ein erstes Bindungsglied umfaßt, das spezifisch ist für einen ersten analyten, der an eine feste Phase angeheftet ist, und mit einem Einfangreagenz für einen zweiten Analyt, worin das Einfangreagenz ein erstes Bindungsglied für einen zweiten Analyten umfaßt, angeheftet an eine zweite feste Phase, um dabei eine Mischung zu bilden. Diese Mischung wird für einen Zeitraum und unter Bedingungen inkubiert, die ausreichend sind, um Einfangreagenz/erster Analyt und Einfangreagenz/zweiter Analyt Komplexe zu bilden. Diese so gebildeten Komplexe werden dann mit einem Indikatorreagenz in Kontakt gebracht, das ein Glied eines Bindungspaars umfaßt, das spezifisch ist für den ersten Analyten, der mit einer signalerzeugende Verbindung markiert ist, und mit einem Indikatorreagenz, das ein Glied eines Bindungspaars umfaßt, das spezifisch ist für den zweiten Analyten, der mit einer signalerzeugenden Verbindung markiert ist, um eine zweite Mischung zu bilden. Diese zweite Mischung wird für einen Zeitraum und unter Bedingungen inkubiert, die ausreichend sind, um Einfangreagenz/erster Analyt/Indikatorreagenz-Komplexe und Einfangreagenz/zweiter Analyt/Indikatorreagenz-Komplexe zu bilden. Die Anwesenheit von einem oder mehreren Analyten wird durch das Detektieren eines Signals bestimmt, das in Zusammenhang mit den gebildeten Komplexen entweder auf einer oder beiden festen Phasen erzeugt wird als ein Hinweis auf die Anwesenheit von einem oder mehreren Analyten in der Testprobe. In diesem Assayformat können Proteine, die aus menschlichen Expressionssystemen abgeleitet sind, ebenso verwendet werden, wie monoklonale Antikörper, die aus den Proteinen produziert wurden, die aus den Säugetierexpressionssystemen wie hierin offenbart abgeleitet sind. Solche Assaysysteme werden in größerer Ausführlichkeit in der anhängigen U.S. Patentanmeldung Seriennr. 07/574,821 beschrieben, mit dem Titel Simultaner Assay zur Detektion von einem oder mehreren Analyten, welche der EP Veröffentlichungsnr. 0473065 entspricht, welche hierin durch die Bezugnahme aufgenommen ist.
In wiederum anderen Assayformaten können rekombinante Proteine verwendet werden, um die Anwesenheit von anti-Mutanten- HBV in Testproben zu detektieren. Beispielsweise wird eine Testprobe mit einer festen Phase inkubiert, an welche mindestens ein rekombinantes Protein angeheftet wurde. Diese werden für einen Zeitraum und unter Bedingungen reagiert, die ausreichend sind, um Antigene/Antikörper-Komplexe zu bilden. Nach der Inkubation wird der Antigen/Antikörper-Komplex detektiert. Indikatorreagenzien können verwendet werden, um die Detektion zu erleichtern, abhängig von dem gewählten Assaysystem. IN einem anderen Assayformat wird eine Testprobe mit einer festen Phase in Kontakt gebracht, an welche ein rekombinantes Protein, das hergestellt wurde, wie hierin beschrieben, angeheftet ist, und wird ebenfalls in Kontakt gebracht mit einem monoklonalen oder polyklonalen Antikörper, der spezifisch ist für das Protein, welches vorzugsweise mit einem Indikatorreagenz markiert wurde. Nach der Inkubation für einen Zeitraum und unter Bedingungen, die ausreichend sind für die Bildung von Antikörper/Antigen-Komplexe wird die feste Phase von der freien Phase abgetrennt und der Marker wird entweder in der festen oder freien Phase detektiert als ein Hinweis auf die Anwesenheit von HBV-Antikörper. Andere Assayformate, die die Proteine der vorliegenden Erfindung verwenden, werden in Erwägung gezogen. Diese schließen das in Kontakt bringen einer Testprobe mit einer festen Phase ein, an welche mindestens ein rekombinantes Protein, das in dem Säugetierexpressionssystem produziert wurde angeheftet wurde, das Inkubieren der festen Phase und der Testprobe für einen Zeitraum und unter Bedingungen, die ausreichend sind, um Antigen/Antikörper-Komplexe zu bilden, und dann das in Kontakt bringen der festen Phase mit einem markierten rekombinanten Antigen. Assays wie dieser und andere sind beschrieben in der anhängigen U.S. Patentanmeldung Seriennr. 07/787,710, welche hierin durch die Bezugnahme eingeschlossen ist.
Während die vorliegende Erfindung vorzugsweise die Verwendung von festen Phasen offenbart, wird in Erwägung gezogen, daß die Proteine der vorliegenden Erfindung in Assaysystemen ohne feste Phase verwendet werden können. Diese Assaysysteme sind denjenigen, die im Fachgebiet bewandert sind, bekannt und sollen innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung liegen. Während die vorliegenden Erfindung vorzugsweise die Verwendung von festen Phasen offenbart, wird in Erwägung gezogen, daß die Peptide der vorliegenden Erfindung in Assaysystemen ohne feste Phase verwendet werden können. Diese Assaysysteme sind denjenigen, die im Fachgebiet bewandert sind bekannt, und sollen innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung liegen.
Materialien und Verfahren
Allgemeine Techniken
Konventionelle und wohl bekannte Techniken und Verfahren in den Gebieten der Molekularbiologie, Mikrobiologie, rekombinanter DNA und Immunologie werden in der Praxis der Erfindung verwendet, solange nichts anderes angegeben ist. Solche Techniken werden in der Literatur erklärt und ausführlich angegeben. Siehe zum Beispiel T. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2te Ausgabe, Cold Spring Harbor Press, N.Y. (1989); D. N. Glover, Ausg., DNA Cloning, Band I und II (1985); M. J. Gait Ausg., Oligonucleotide Synthesis, (1984); B. D. Hames et al., Ausg., Nucleic Acid Hybridization, (1984); B. D. Hames et al., Ausg., Transcription and Translation, (1984); R. I. Freshney Ausg., Animal Cell Culture, (1986); Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press (1986); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, (1984); die Serien, Methods in Enzymology, Academic Press, Inc., Orlando, Florida; J. H. Miller et al., Ausg., Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1987); Wu et al., Ausg., Methods in Enzymology, Band 154 und 155; Mayer et al., Ausg., Immunological Methods In Cell and Molecular Biology, Academic Press, London (1987); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, 2te Ausg., Springer-Verlag. N.Y.; und D. Weir et al., Ausg., Handbook Of Experimental Immunology, Band I–IV (1986).
Die Reagenzien und Verfahren der vorliegenden Erfindung werden möglich gemacht durch die Bereitstellung einer Familie von nahe homologen Nucleotidsequenzen, die aus einer Genombücherei isoliert wurden, abgeleitet von Nucleinsäuresequenzen, die im Plasma, dem Serum oder dem Leberhomogenisat eines Individuums, das mit Mutanten-HBV infiziert ist, anwesend sind. Deren Plasma oder Leberhomogenisate von Menschen, die mit Mutanten-HBV infiziert sind, enthalten Antikörper, welche an dieses Polypeptid binden, wobei Seren, Plasma oder Leberhomogenisate von nicht infizierten Menschen keine Antikörper gegen dieses Polypeptid enthalten. Letztendlich werden, da die Seren von uninfizierten Individuen keine Antikörper gegen dieses Polypeptid enthalten, die Antikörper in Individuen nach einer akuten HBV-Infektion eingeführt.
Die Verfügbarkeit von Nucleinsäurensequenzen erlaubt die Konstruktion von DNA Sonden und Polypeptiden, die nützlich sind bei der Diagnose von Hepatitis aufgrund von Mutanten-HBV-Infektionen, und beim Screening von Blutspendern, gespendetem Blut, Blutprodukten und Individuen auf Infektion. Beispielsweise ist es aus der Sequenz möglich, DNA-Oligomere von ungefähr acht bis zehn Nucleotiden oder größer zu synthetisieren, welche nützlich sind als Hybridisationssonden, um die Anwesenheit des viralen Genoms in beispielsweise Seren von Subjekten zu detektieren, von denen vermutet wird, daß sie den Virus beherbergen oder für das Screening von Blutspenden auf die Anwesenheit des Virus. Die Familie der Nucleinsäurensequenzen erlaubt ebenfalls das Design und die Produktion von Mutanten-HBV spezifischen Polypeptiden, welche nützlich sind als diagnostische Reagenzien für die Anwesenheit von Antikörpern, die während der Infektion mit Mutanten-HBV entstanden sind. Antikörper gegen gereinigte Polypeptide, die aus den Nucleinsäurensequenzen abgeleitet sind, können ebenfalls verwendet werden, um virale Antigene in infizierten Individuen und in Blut zu detektieren. Diese Nucleinsäurensequenzen erlauben ebenfalls das Design und die Produktion von Polypeptiden, welche verwendet werden können als Impfstoffe gegen Mutanten-HBV und ebenfalls für die Herstellung von Antikörpern, welche dann für den Schutz vor der Krankheit verwendet werden können und/oder für die Therapie von Individuen, die mit Mutanten-HBV infiziert sind.
Die Sequenzen und die Polypeptide, die von diesen Sequenzen abgeleitet sind, ebenso wie Antikörper, die gegen diese Polypeptide gerichtet sind, sind ebenfalls nützlich bei der Isolierung und Identifikation von Mutanten-HVB ätiologischen Wirkstoffen. Zum Beispiel können Antikörper, die gegen das Mutanten-HBV-Epitop gerichtet sind, das in Polypeptiden enthalten ist, die aus den Nucleinsäurensequenzen abgeleitet sind, in Verfahren verwendet werden, die auf der Affinitätschromatographie basieren, um den Virus zu isolieren. Alternativ können die Antikörper verwendet werden, um virale Partikel zu identifizieren, die durch andere Techniken isoliert wurden. Die viralen Antigene und das genomische Material innerhalb der isolierten viralen Partikel kann dann weiter charakterisiert werden.
Die Information, die aus der weiteren Sequenzierung des Mutanten-HBV-Genoms (der HVB Genome) erhalten wird, ebenso wie aus der weiteren Charakterisierung des Mutanten-HBV-Antigens und der Charakterisierung des Genoms, erlaubt das die Design und die synthese von zusätzlichen Sonden und Polypeptiden und Antikörpern, welche verwendet werden können für die Diagnose, die Prävention und die Therapie von Mutanten-HBV-induzierter Hepatitis, und für das Screening auf infizierte Blut- und Blut-verwandte Produkte.
Die Verfügbarkeit von Sonden für Mutanten-HBV, einschließlich Antigenen, Antikörpern und Polynukleotiden, die aus dem Genom abgeleitet sind aus welchem die Nucleinsäurensequenzen abgeleitet sind, erlaubt ebenfalls die Entwicklung von Gewebekultursystemen, welche große Verwendung finden bei der Aufklärung der Biologie des Mutanten-HBV. Wenn dies einmal bekannt ist, wird in Erwägung gezogen, daß neue Behandlungsregimes entwickelt werden können, basierend auf den anti-viralen Verbindungen, welche vorzugsweise die Replikation oder die Infektion durch Mutanten-HBV hemmen.
In dem Verfahren, das verwendet wird, um den ätiologischen Wirkstoff von HBV zu identifizieren und zu isolieren, wird eine genomische Bibliothek entwickelt aus den Nucleinsäuren, die in infiziertem Serum, Plasma oder Leberhomogenisaten aus einem infiziertem Individuum anwesend sind, vorzugsweise einem Schimpansen oder einen Menschen. Die Bibliothek wird in einem Vektor entwickelt, welcher die Expression von Polypeptiden erlaubt, die in den Nucleinsäuresequenzen kodiert werden. Klone von Wirtszellen, die den Vektor enthalten, welcher ein immunologisch reaktives Fragment eines Polypeptids des ätiologischen Wirkstoffs (Mutanten-HBV) exprimiert hat, werden ausgewählt durch immunologisches Screening der Produktionsprodukte der Bibliothek, mit einer einen Antikörper enthaltenden Körperkomponente aus einem anderen Individuum, das zuvor mit dem vermeintlichen Wirkstoff infiziert wurde. Die Schritte in der immunologischen Screeningtechnik schließen die Wechselwirkung der Expressionsprodukte der klonierten Nucleinsäuresequenzen, die Vektoren enthalten, mit der den Antikörper enthaltenden Körperkomponente eines zweiten infizierten Individuums ein, und das Detektieren der Bildung von Antigen/Antikörperkomplexen zwischen dem Expressionsprodukt(en) und den Antikörpern des zweiten infizierten Individuums. Die isolierten Klone werden weiter immunologisch gescreent durch die Wechselwirkung ihrer Expressionsprodukte mit der den Antikörper enthaltenden Körperkomponente von anderen Individuen, die mit dem vermeintlichen Wirkstoff infiziert sind, und detektieren der Bildung von Antigen/Antikörper-Komplexen mit Antikörpern aus den infizierten Individuen, und die Nucleinsäurensequenzen, die Vektoren enthalten, welche Polypeptide kodieren, welche immunologisch mit Antikörpern von infizierten Individuen und Individuen von denen vermutet wird, daß sie infiziert sind, mit dem Wirkstoff, aber nicht mit Kontrollindividuen werden isoliert. Die infizierten Individuen, die für die Konstruktion der Nucleinsäuresequenzbücherei verwendet werden und für das immunologische Screening müssen nicht von derselben Spezies sein. Die Nucleinsäuresequenzen, die als ein Ergebnis dieses Verfahrens isoliert werden und ihre Expressionprodukte und Antikörper die gegen die Expressionsprodukte gerichtet sind, sind nützlich bei der Charakterisierung und/oder beim Einfangen des etiologischen Wirkstoffs. Dieses Verfahren wird in der EP Patentanmeldung Veröffentlichungsnr. 0 318 216 gelehrt, welche hierin durch die Bezugnahme eingeschlossen ist.
Herstellung der Nucleinsäuresequenzen
Gepooltes oder individuelles Serum, Plasma oder Leberhomogenisate aus einem Individuum, das die Kriterien erfüllt und innerhalb der Parameter liegt, die unten bekannt gemacht sind, mit akuter oder chronischer Mutanten-HBV-Infektion, werden verwendet, um virale Partikel zu isolieren. Die Nukleinsäuren, die aus diesen Partikeln isoliert werden, verwenden verwendet als die Matrixe in der Konstruktion einer genomischen Bücherei für das virale Genom. Die Verfahren, die zur Isolation von Mutanten-HBV-Partikeln verwendet werden und für die Konstruktion der genomischen Bücherei in Lambda-gt11 oder ähnlichen Systemen, die im Fachgebiet bekannt sind, werden hierin diskutiert. Lambda-gt11 ist ein Vektor der spezifisch entwickelt wurde, um eingefügte cDNAs als Fusionspolypeptide mit beta-Galactosidase zu expremieren und um große Zahlen an rekombinanten Phagen mit spezifischen Antiseren zu screenen, welche gegen ein definiertes Antigen gezüchtet wurden. die Lambda-gt11 cDNA Bücherei die aus einem cDNA Pool erzeugt wurde, der cDNA enthält, wird für kodierte Epitope gescreent, welche spezifisch mit Seren binden können, die aus Individuen abgeleitet sind, die zuvor eine Hepatitis durchgemacht haben aufgrund von Mutanten-HBV. Siehe V. Hunyh et al., in D. Glover, Ausg., DNA Cloning Techniques; A Practical Approach, IRL Press, Oxford, England, Seiten 49–78 (1985). Ungefähr 10⁶–10⁷ Phagen werden gescreent, aus welchen die positiven Phagen identifiziert werden, gereinigt werden, und dann auf ihre Bindungsspezifität an Sera getestet werden aus unterschiedlichen Individuen, die zuvor mit dem Mutanten-HBV-Wirkstoff infiziert wurde. Phagen, die selektiv Seren, Plasma aus Patienten, die die Kriterien erfüllen, die hierin beschrieben sind und nicht in Patienten, welche nicht diese beschriebenen Kriterien erfüllen, binden, werden zur weiteren Untersuchung bevorzugt.
Durch Verwenden der Technik der Isolierung überlappender Nucleinsäuresequenzen werden Klone erhalten, die zusätzliche stromaufwärts und stromabwärts Mutanten-HBV-Sequenzen enthalten. Die Isolation dieser Klone wird hierin unten beschrieben.
Die Analyse der Nucleotidsequenzen der Mutanten-HBV-Nucleinsäuresequenzen, welche innerhalb der isolierten Klone kodiert werden, wird durchgeführt, um zu bestimmen, ob die zusammengesetzte Sequenz einen langen kontinuierlichen ORF enthält. Die Sequenzen (und ihre Komplemente), die aus der Mutanten-HBV-Bücherei von Sequenzen gewonnen wurden, werden hierin bereitgestellt und die Sequenzen oder jeder Teil davon kann hergestellt werden unter Verwendung von synthetischen Verfahren oder durch eine Kombination von synthetischen Verfahren mit der Wiedergewinnung von Teilsequenzen unter Verwendung von Verfahren, die ähnlich sind zu derjenigen, die hierin beschrieben sind. Diese Beschreibung stellt somit ein Verfahren bereit, durch welches genomische Sequenzen, die dem gesamten Mutanten-HBV-Genom entsprechen, isoliert werden können. Andere Verfahren zur Isolierung dieser Sequenzen werden jedoch denjenigen, die im Fachgebiet bewandert sind, offensichtlich sein, und sollen innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung liegen.
Stämme, die aus der Mutanten-HBV-Nucleinsäuresequenzbücherei repliziert wurden, werden bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 unter den Bestimmungen des Budapest Vertrags hinterlegt werden, und werden für einen Zeitraum von dreißig (30) Jahren vom Datum der Hinterlegung an, oder für fünf (5) Jahre nach der letzten Nachfrage für die Hinterlegung, oder für einen dursetzbaren Zeitraum des U.S. Patents, was auch immer länger ist, gehalten werden. Die Hinterlegungen und jegliches andere hinterlegte Material, das hierin beschrieben ist, werden nur zur Bequemlichkeit bereitgestellt, und sind nicht erforderlich, um die vorliegende Erfindung im Bezug auf die Lehren, die hierin bereitgestellt werden, durchzuführen.
Herstellung von viralen Polypeptiden und Fragmenten
Die Verfügbarkeit von Nucleinsäuresequenzen erlaubt die Konstruktion von Expressionsvektoren, die die Antigen-wirksame Region des Polypeptids kodieren, die in jedem Strang kodiert wird. Die Antigen-wirksame Region ist abgeleitet aus dem Envelope (Hüll) Antigen. Fragmente, die die gewünschten Polypeptide kodieren, sind abgeleitet aus den genomischen Klonen unter Verwendung von konventioneller Restriktionsverdauung oder durch synthetische Verfahren, und werden in Vektoren ligiert, welche beispielsweise Teile von Fusionssequenzen enthalten, wie zum Beispiel beta-Galactosidase (B-ga1) oder Superoxiddismutase (SOD) oder CMP-KDO Synthetase (CKS). Verfahren und Vektoren, welche nützlich sind für die Produktion von Polypeptiden, welche Fusionssequenzen von SOD enthalten, sind beschrieben in EPO 0196056, veröffentlicht am 01. Oktober 1986, und diejenigen von CKS sind beschrieben in EPO Veröffentlichungsnr. 0331961, veröffentlicht am 13. September 1989, welche hierin durch die Bezugnahme eingeschlossen sind. Jeder gewünschte Abschnitt der Nucleinsäuresequenz, die einen Open Reading Frame enthält, in jedem Sensstrang, kann erhalten werden als ein rekombinantes Protein, wie zum Beispiel ein reifes oder ein Fusionsprotein; alternativ kann ein Polypeptid, das in dem Mutanten-HBV-Genom kodiert wird, bereitgestellt werden durch chemische Synthese.
Die Nucleinsäuresequenz, die das gewünschte Polypeptid kodiert, entweder in fusionierter oder in reifer Form, und entweder eine Signalsequenz enthaltend oder nicht, um die Sekretion zu erlauben, kann in Expressionsvektoren ligiert werden, die geeignet sind für jeden passenden Wirt. Sowohl eukaryotische als auch prokaryotische Wirtssysteme werden im Fachgebiet, verwendet, um rekombinante Proteine zu bilden, und einige von diesen sind hierin aufgezählt. Das Polypeptid wird dann aus lysierten Zellen oder aus dem Kulturmedium isoliert und soweit gereinigt, wie es für die beabsichtigte Verwendung erforderlich ist. Die Reinigung kann durchgeführt werden durch Techniken, die im Fachgebiet bekannt sind, und schließt die Salzfraktionierung, die Chromatographie auf Ionenaustauscherharzen, die Affinitätschromatographie, die Zentrifugation und andere ein. Solche Polypeptide können als diagnostische Reagenzien oder für die passive Immunotherapie verwendet werden. Zusätzlich sind Antikörper für diese Polypeptide nützlich zur Isolierung und Identifizierung von Mutanten-HBV-Partikeln. Die Mutanten-HBV-Antigene können auch isoliert werden aus Mutanten-HBV-Virionen. Diese Virionen können gezüchtet werden in Mutanten-HBV infizierten Zellen in Gewebekultur oder in einem infizierten Individuum.
Herstellung von antigenen Polypeptiden und Konjugation mit einer festen Phase
Ein antigener Abschnitt oder ein Fragment eines Polypeptids ist im allgemeinen relativ klein, üblicherweise ungefähr 8 bis 10 Aminosäuren oder weniger in der Länge. Fragmente von so wenig wie 2–5 Aminosäuren können einen antigenen Abschnitt charakterisieren. Diese Segemente können Regionen des Mutanten-HBV-Antigens entsprechen. Unter Verwendung der Mutanten-HBV genomischen Sequenzen als eine genomische Basis, können Nucleinsäuresequenzen, die kurze Segmente von Mutanten-HBV-Polypeptiden kodieren, rekombinant exprimiert werden, entweder als Fusionsproteine oder als isolierte Polypeptide. Diese kurzen Aminosäuresequenzen können auch durch chemische Synthese erhalten werden. Die. kleinen chemisch synthetisierten Polypeptide können an ein geeignetes Trägermolekül geknüpft werden, wenn das erhaltene synthetisierte Polypeptid richtig konfiguriert ist, um das richtige Epitop bereitzustellen, aber zu klein ist, um Antigen zu sein. Verknüpfungsverfahren sind im Fachgebiet bekannt und schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf die Verwendung von N-Succinimidyl-3-(2-pyridylthio)propionat (SPDP) und Succinimidyl 4-(N-Maleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat (SMCC). Polypeptide, denen Sulfhydrylgruppen fehlen, können modifiziert werden durch Hinzufügen eine Cysteinrests. Diese Reagenzien erzeugen eine Disulfidbindung zwischen ihnen und den Peptidcysteinresten auf einem Protein und eine Amidbindung durch das Epsilon-Amino auf einem Lysin, oder einer anderen freien Aminogruppe in dem anderen. Eine Vielzahl solcher-Disulfid/Amid-bildenden Wirkstoffe ist bekannt. Andere bifunktionale Kopplungswirkstoffe bilden einen Thioester eher als eine Disulfidbindung. Viele dieser Thioether bildenden Wirstoffe sind kommerziell erhältlich und sind denjenigen, die im Fachgebiet durchschnittlich bewandert sind, bekannt. Die Carboxylgruppen können aktiviert werden, in dem sie mit Succinimid oder 1-Hydroxyl-2-nitro-4-sulfonsäure, Natriumsalz kombiniert werden. Jeder Träger, der nicht selbst die Produktion von Antikörpern induziert, die für den Wirt schädlich sind, kann verwendet werden. Geeignete Träger schließen Proteine, Polysaccharide, wie zum Beispiel Latex funktionalisierte Sepharose, Agarose, Zellulose, Zellulosekügelchen, polymere Aminosäuren, wie zum Beispiel Polyglutaminsäure, Polylysin, Amionsäurecopolymere und inaktive Viruspartikel, unter anderem ein. Beispiele von Proteinsubstraten schließen Serumalbumine, Nampfschneckenhemocyanin, Immunglobulinmoleküle, Thyroglobulin, Ovalbumin, Tetanustoxoid und noch andere Proteine ein, die denjenigen, die im Fachgebiet bewandert sind, bekannt sind.
Herstellung von Hybridpartikelimmunogenen die HBV-Epitope enthalten
Die Immunogenität von Mutanten-HBV-Epitopen kann auch verstärkt werden, indem sie in Säugetier- oder Hefesystemen hergestellt werden, die mit Partikel-bildenden Proteinen, wie zum Beispiel denjenigen, die mit dem HBV-Oberflächenantigen assoziiert sind, fusioniert sind oder in Zusammenhang stehen. Konstrukte, worin das Mutanten-HBV-Epitop direkt an die Sequenzen geknüpft ist, die das Partikel bildende Protein kodieren, produzierten Hybride, welche in Bezug auf das Mutanten-HBV-Epitop immunogen sind. Zusätzlich schließen alle der hergestellten Vektoren Epitope ein, die spezifisch sind für Mutanten-HBV, wobei sie variierende Grade an Immunogenität haben. Partikel, die aus dem Partikel bildenden Protein konstruriert wurden, welche Mutanten-HBV-Sequenzen einschließen, sind in Bezug auf Mutanten-HBV immunogen.
Das Hepatitis B Oberflächenantigen wurde bestimmt, um in Partikeln in S. cerevisiae und Säugetierzellen gebildet und zusammengebaut zu werden; von der Bildung dieser Partikel wurde berichtet, daß sie die Immunogenität der Monomer-Untereinheit verstärkt. P. Valenzuela et al., Nature 298: 334 (1982); P. Valenzuela et al., in I. Millman et al., Ausg., Hepatitis B, Plenum Press, Seiten 225–236 (1984). Die Konstrukte können immunodominante Epitope von HBsAg einschließen. Von solchen Konstrukten wurde berichtet, daß sie in Hefe exprimierbar sind und Hybride, die heterologe virale Sequenzen für die Hefeexpression einschließen, wurden offenbart. Siehe zum Beispiel EPO 174,444 und EPO 174,261. Von diesen Konstrukten wurde ebenfalls berichtet, daß sie in der Lage sind in Säugetierzellen wie zum Beispiel chinesischen Hamsterovarialzellen (CHO) exprimiert werden können. Michelle et al., International Symposium on Viral Hepatitis, 1984. In HBV können Teile der Sequenz, die das Partikel bildende Protein kodiert, ersetzt werden, durch Kodons, die ein HBV-Epitop kodieren. Bei diesem Ersatz können Regionen, welche nicht erforderlich sind, um die Aggregation der Einheiten zu vermitteln, um immunogene Partikel in Hefe oder Säugetieren zu bilden, zerstört werden, wodurch zusätzliche HBV antigene Stellen aus dem Wettbewerb, um das HBV-Epitop eliminiert werden.
Impfstoffherstellung
Impfstoffe können aus einem oder mehreren immunogenen Polypeptiden hergestellt werden, die aus Mutanten-HBV-Nucleinsäuresequenzen oder aus dem Mutanten-HBV-Genom abgleitet sind, welchem sie entsprechen. Impfstoffe können rekombinante Polypeptide umfassen, die Epitope. von Mutanten-HBV enthalten. Diese Polypeptide können in Bakterien, Hefe oder Säugetierzellen exprimiert werden oder können alternativ aus viralen Zubereitungen isoliert werden. Es ist ebenfalls vorweg genommen, daß verschiedene Strukturproteine Epitope von Mutanten-HBV enthalten können, welche protektive anti-Mutanten-HBV-Antikörper hervorrufen. So können Polypeptide, die mindestens ein Epitop von Mutanten-HBV enthalten, verwendet werden, entweder allein oder in Kombinationen in Mutanten-HBV-Impfstoffen. Es wird ebenfalls in Erwägung gezogen, das nicht Strukturproteine ebenso wie Strukturproteine einen Schutz gegen virale Pathogenität bereitstellen können auch wenn sie nicht die Herstellung von neutralisierenden Antikörpern bewirken.
Unter Berücksichtigung des oben genannten, können multivalente Impfstoffe gegen Mutanten-HBV Proteine umfassen, welche die zwei Aminosäureinsertion (N-T) an Position 122 einschließen. Diese Impfstoffe können beispielsweise aus rekombinanten Mutanten-HBV-Polypeptiden und/oder Polypeptiden, die aus den Virionen isoliert wurden, zusammengesetzt sein.
Zusätzlich kann es möglich sein inaktivierte Mutanten-HBV in Impfstoffen zu verwenden. Eine solche Inaktivierung kann durch die Herstellung von viralen Lysaten erfolgen, oder durch andere Mittel, die im Fachgebiet bekannt sind, um die Inaktivierung von Hepatitis ähnlichen Viren zu bewirken, zum Beispiel die Behandlung mit organischen Lösungsmitteln oder Waschsubstanzen oder die Behandlung mit Formalin. Eine abgeschwächte Mutanten-HBV-Strang-Zubereitung ist ebenfalls in der vorliegenden Erfindung offenbart. Es wird in Erwägung gezogen, daß einige der Proteine in Mutanten-HBV mit anderen bekannten Viren kreuzreagieren können und somit, daß geteilte Epitope zwischen Mutanten-HBV und anderen Viren existieren können, welche dann protektive Antikörper gegen eine oder mehrere der Störungen hervorrufen, die durch diese pathogenen Wirkstoffe ausgelöst werden. Es wird in Erwägung gezogen, daß es möglich sein kann, Impfstoffe für vielerlei Zwecke zu designen, nach diesem Wissen.
Die Zubereitung von Impfstoffen, welche mindestens ein immunogenes Peptid als einen aktiven Inhaltsstoff enthalten, ist einem der im Fachgebiet bewandert ist bekannt. Typischerweise werden solche Impfstoffe als Injektabilia hergestellt, entweder als flüssige Lösungen oder Suspensionen; feste Formen, die für die Lösung in oder die Suspension in Flüssigkeit geeignet sind, vor der Injektion können auch hergestellt werden. Die Zubereitung kann emulgiert sein, oder das Protein kann in Liposomen eingekapselt werden. Die aktiven immunogenen Inhaltsstoffe, werden oft mit pharmazeutisch verträglichen Bindemitteln vermischt, die mit dem aktiven Inhaltsstoff kompatibel sind. Geeignete Bindemittel schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Wasser, Salzlösung, Dextose, Glycerol, Ethanol und dergleichen; Kombinationen dieser Bindemittel in unterschiedlichen Mengen können ebenfalls verwendet werden. Der Impfstoff kann auch kleine Mengen an Hilfssubstanzen enthalten, wie zum Beispiel befeuchtende oder emulgierende Reagenzien, pH Pufferwirkstoffe, und/oder Hilfsstoffe, welche die Wirksamkeit des Hilfsstoffs verstärken. Beispielsweise können solche Hilfsstoffe Aluminiumhydroxid, N-Acetyl-muramyl-L-threonyl-D-isoglutamin (thr-DMP), N-Acetyl-nomuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin (CGP 11687, also referred to as nor-MDP), N-Acetylmuramyul-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanin-2-(1'2'-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy)-ethylamin (CGP 19835A, also referred to as MTP-PE) und RIBI (MPL + TDM + CWS) in einer 2%igen Squalen/Tween-80° Emulsion einschließen. Die Wirksamkeit eines Hilfsstoffs kann bestimmt werden, durch Messen der Menge an Antikörpern, die gegen ein immunogenes Polypeptid gerichtet sind, das eine HBV antigene Sequenz enthält, die aus der Verabreichung dieses Polypeptids in Impfstoffen resultiert, welche ebenfalls aus unterschiedlichen Hilfsstoffen zusammengesetzt sind.
Die Impfstoffe werden üblicherweise durch intravenöse oder intramuskuläre Injektion verabreicht. Zusätzliche Formulierungen, welche geeignet sind für andere Arten der Verabreichung, schließen Suppositorien und in einigen Fällen, orale Formulierungen ein. Für Suppositorien können traditionelle Bindemittel und Träger einschließen, sind aber nicht beschränkt auf Polyalkylenglycole oder Triglyceride. Solche Suppositorien können aus Mischungen gebildet werden, die den aktiven Inhaltsstoff im Bereich von ungefähr 0,5% bis ungefähr 10% enthalten, vorzugsweise ungefähr 1% bis ungefähr 2%. Orale Formulierungen schließen solche normalerweise verwendete Bindemittel ein, die zum Beispiel pharmazeutische Grade von Mannitol, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Zellulose, Magnesiumcarbonat und dergleichen. Diese Zusammensetzungen können die Form von Lösungen, Suspensionen, Tabletten, Pillen, Kapseln, Formulierungen mit verzögerter Freisetzung oder Pulver annehmen, und enthalten ungefähr 10% bis ungefähr 95% des aktiven Inhaltsstoffs, vorzugsweise ungefähr 25% bis ungefähr 70%.
Die Proteine, die in dem Impfstoff verwendet werden, können in dem Impfstoff als neutrale oder als Salzformen formuliert sein. Pharmazeutisch verträgliche Salze, wie zum Beispiel Säureadditionssalze, (gebildet mit freien Aminogruppen des Peptids), und die mit anorganischen Säuren wie zum Beispiel Chlorwasserstoff oder Phosphorsäuren oder solchen organischen Säuren, wie zum Beispiel Essig-, Oxal-, Wein-, Malein-, und anderen, die denjenigen, die im Fachgebiet bewandert sind, bekannt sind, gebildet werden. Salze, die mit den freien Carboxylgruppen gebildet werden, können auch von anorganischen Basen, wie zum Beispiel Natrium, Kalium, Ammonium, Kalzium oder Eisenhydroxiden und dergleichen abgeleitet sein, und von solchen organischen Basen wie zum Beispiel Isopropylamin, Trimethylamin, 2-Ethylaminothanol, Histidinprocain, und anderen, die denjenigen, die im Fachgebiet bewandert sind, gut bekannt sind.
Impfstoffe werden in einem Weg verabreicht, der kompatibel ist mit der Dosierungsformulierung und in solchen Mengen, wie sie prophylaktisch und/oder therapeutisch wirksam sind. Die zu verabreichende Menge ist im allgemeinen im Bereich von ungefähr 5 Mikrogramm bis ungefähr 250 Mikrogramm des Antigens pro Dosierung und hängt von dem Subjekt ab, das dosiert werden soll, von der Kapazität des Immunsystems des Objekts Antikörper zu synthetisieren, und von dem erwünschten Schutzgrad. Präzise Menge an wirksamen Inhaltsstoff, der erforderlich ist zur Verabreichung, können auch von der Beurteilung des Arztes abhängen und können für jedes Subjekt einzigartig sein. Der Impfstoff kann in einem Einzel- oder Mehrfach-Dosenschema gegeben werden. Eine mehrfache Dosis ist eine, in welcher ein primärer Impfweg mit einer bis zehn getrennten Dosierungen sein kann, gefolgt von anderen Dosierungen, die in nachfolgenden Zeitintervallen gegeben werden, was erforderlich ist, um die Immunantwort aufrecht zu erhalten oder wiederzubeleben, beispielsweise bei einem bis vier Monaten für eine zweite Dosierung, und wenn es durch das Individuum erforderlich ist, eine nachfolgende Dosierung(en) nach mehreren Monaten. Das Dosierungsregime wird auch bestimmt, zumindest teilweise, durch das Bedürfnis des Individuums und hängt von der Beurteilung des Arztes ab. Es wird in Erwägung gezogen, daß der Impfstoff, der das immunogene Mutanten-HBV-Antigen e) enthält, in Zusammenhang mit anderen immunoregulatorischen Wirkstoffen verabreicht werden kann, beispielsweise mit Immunglobulinen.
Herstellung von Antikörpern gegen Mutanten-HBV-Epitope
Die immunogenen Peptide, die wie hierin beschrieben hergestellt wurden, werden verwendet, um entweder polyklonale oder monoklonale Antikörper zu produzieren. Wenn polyklonale Antikörper hergestellt werden, wird ein ausgewähltes Säugetier (zum Beispiel eine Maus, ein Hase, eine Ziege, ein Pferd und dergleichen) mit einem immunogenen Polypeptid immunisiert, das mindestens ein Mutanten-HBV-Epitop trägt. Das Serum von dem immunisiertem Tier wird gesammelt nach einem angemessenen Inkubationszeitraum und gemäß bekannten Verfahren behandelt. Wenn Serum, welches polyklonale Antikörper gegen ein Epitop von Mutanten-HBV enthält, Antikörper gegen andere Antigene enthält, können die polyklonalen Antikörper beispielsweise durch Immunoaffinitätschromatographie gereinigt werden. Techniken zum Herstellung und Verarbeiten von polyklonalen Antikörpern sind im Fachgebiet bekannt und werden unter anderem beschrieben in Mayer und Walker, Ausg., Immunochemical Methods In Cell and Molecular Biology, Academic Press, London (1987). Polyklonale Antikörper können auch isoliert werden. Polyklonale Antikörper können erhalten werden aus einem Säugetier, das zuvor mit HBV infiziert wurde. Ein Beispiel eines Verfahrens zum Reinigen von Antikörpern gegen Mutanten-HBV-Epitopen aus dem Serum eines Individuums, das mit Mutanten-HBV infiziert ist, unter Verwendung von Affinitätschromatographie, wird hierin bereitgestellt.
Monoklonale Antikörper, die gegen Mutanten-HBV Epitope gerichtet sind, können ebenfalls durch jemanden, der im Fachgebiet bewandert ist, hergestellt werden. Die allgemeine Methodik zur Herstellung solcher Antikörper ist wohl bekannt und wurde beispielsweise beschrieben in Kohler und Milstein, Nature 256: 494 (1975) und überarbeitet in J. G. R. Hurrel, Ausg.; Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press Inc., Boco Ratan, FL (1982), so wie die Methodik, die durch L. T. Mimms et al., Virology 176: 604–619 (1990) gelehrt wird. Unsterbliche Antikörper produzierende Zellinien, können entwickelt werden durch Zellfusion und ebenfalls durch andere Techniken, wie zum Beispiel die direkte Umwandlung von B Lymphozyten mit onkogener DNA oder der Transfektion mit Epstein-Barr-Virus. Siehe ebenfalls, M. Schreier et al., Hybridoma Techniques, Scopes (1980) Protein Purification, Principles and Practice, 2te Ausgabe, Springer-Verlag, New York (1984); Hammerling et al., Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas (1981); Kennet et al., Monoclonal Antibodies (1980). Beispiele für Verwendungen und Techniken von monoklonalen Antikörpern für HCV sind in den U.S. Patentanmeldungen Seriennrn. 748,292; 748,563; 610,175; 648,473; 648,477 und 648,475 offenbart.
Monoklonale und polyklonale Antikörper die so entwickelt wurden, die gegen Mutanten-HBV-Epitope gerichtet sind, sind nützlich in diagnostischen und prognostischen Anwendungen, und ebenfalls sind diejenigen, welche neutralisierend sind, nützlich sind in der passiven Immunotherapie. Monoklonale Antikörper können insbesondere verwendet werden, um anti-Idiotyp Antikörper zu produzieren. Diese anti-Idiotyp Antikörper sind Immunglobuline, welche ein "internes Bild" des Antigens des infektiösen Wirkstoffs tragen, gegen welchen ein Schutz erwünscht ist. Siehe beispielsweise, A. Nisonoff et al., Clin. Immunol. Immunopath, 21: 397–406 (1981) und Dreesman et al., J. Infect. Dis. 151: 761 (1985). Techniken zur Züchtung solcher Idiotyp-antikörper sind im Fachgebiet bekannt und beispielhaft dargestellt, beispielsweise in Grych et al., Nature 316: 74 (1985); MacNamara et al., Science 226; 1325 (1984); und Uytdehaag et al., J. Immunol. 134: 1225 (1985). Diese anti-Idiotypen-Antikörper können auch nützlich sein für die Behandlung von einer HBV-Infektion, ebenso wie für die Aufklärung der immunogenen Regionen von HBV-Antigenen.
Diagnostische Oligonukleotidsonden und Kits
Unter Verwendung von bestimmten Abschnitten von den isolierten Mutanten-HBV-Nucleinsäuresequenzen als eine Basis; können Oligomere von ungefähr 8 Nucleotiden oder mehr hergestellt werden, entweder durch Exzision oder synthetisch, welche mit dem Mutanten-HBV-Genom hybridisieren und nützlich sind bei der Identifikation des viralen Wirkstoffs (der viralen Wirkstoffe), zur weiteren Charakterisierung des viralen Genoms, ebenso wie in der Detektion des Virus (der Viren) in erkrankten Individuen. Die natürlichen oder abgeleiteten Sonden für Mutanten-HBV-Polynucleotide sind in einer Länge, welche die Detektion von einzigartigen viralen Sequenzen durch Hybridisation erlaubt. Während 6 bis 8 Nucleotide eine verarbeitbare Länge sein kann, sind Sequenzen von 10 bis 12 Nucleotiden bevorzugt, und diejenigen von ungefähr 20 Nucleotiden können am meisten bevorzugt werden. Diese Sequenzen leiten sich vorzugsweise aus Regionen ab, welchen die Heterogenität fehlt. Diese Sonden können unter Verwendung von Routine-, Standardverfahren hergestellt werden, einschließlich automatisierten Oligonucleotid synthetischen Verfahren. Ein Komplement jeglichen einzigartigen Abschnitts des Mutanten-HBV-Genoms wird zufriedenstellend sein. Eine vollständige Komplementarität ist wünschenswert für die Verwendung als Sonden, obwohl sie nicht notwendig sein kann, wenn die Länge des Fragments erhöht wird.
Wenn sie als diagnostische Reagenzien verwendet werden, kann die biologische Testprobe, die analysiert werden soll, wie zum Beispiel Blut oder Serum, behandelt werden, beispielsweise um die Nucleinsäuren, die darin enthalten sind, zu extrahieren. Die resultierende Nucleinsäure aus der Probe kann einer Gelelektrophorese oder anderen Größentrennungstechniken unterworfen werden; oder die Nucleinsäureprobe kann Punkt abgetupft werden ohne Größentrennung. Die Sonden werden dann markiert. Geeignete Marker und Verfahren zum Anheften von Markern an Sonden sind im Fachgebiet bekannt, und schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf radioaktive Marker, die durch Bruchstellentranslation oder durch Chinase inkorporiert sind, Biotin, fluoreszente und chemilumineszente Sonden. Beispiele für viele dieser Marker sind hierin offenbart. Die Nucleinsäuren die aus der Probe extrahiert wurden, werden dann mit der markierten Sonde unter Hybridisationsbedingungen von geeigneter Stärke behandelt.
Die Sonden können vollständig komplementär zu dem Mutanten-HBV-Genom gemacht werden. Daher sind üblicherweise sehr strenge Bedingungen wünschenswert, um falsche Positive zu vermeiden. Jedoch sollten Bedingungen von großer Strenge nur verwendet werden, wenn die Sonden komplementär sind zu den Regionen des Mutanten-HBV-Genoms, denen die Heterogenität fehlt. Die Strenge der Hybridisierung wird bestimmt durch eine Vielzahl von Faktoren, während des Waschverfahrens, einschließlich der Temperatur, der Ionenstärke, der Länge der Zeit und der Konzentration an Formamid. Siehe zum Beispiel T. Maniatis (supra). Die Hybridisierung kann durch eine Vielzahl von verschiedenen Techniken ausgeführt werden, einschließlich beispielsweise durch die Ligasekettenreaktion (LCR), die Polymerasekettenreaktion (PCR). Diese Techniken sind hierin beschrieben.
Es wird in Erwägung gezogen, daß die Mutanten-HBV-Genomsequenzen in Serum von infizierten Individuen mit relativ niedrigen Spiegeln anwesend sein können, beispielsweise ungefähr 10²–10³ Sequenzen pro ml. Dieser Spiegel kann es erforderlich machen, daß Amplifikationstechniken in Hybridisierungsassays verwendet werden, wie zum Beispiel die Ligasekettenreaktion oder die Polymerasekettenreaktion. Solche Techniken sind im Fachgebiet bekannt. Beispielsweise verwendet das "Bio-Bridge" System eine therminale Deoxynucleotidtransferase, um modifizierte 3'-Poly-dT-Schwänze zu einer Nucleinsäuresonde (Enzo Biochem. Corp.). Die Poly dt-geschänzte Sonde wird an die Zielnucleinsequenz hybridisiert und dann an ein Biotin-modifiziertes Poly-A. Ebenfalls ist in EP 124221 ein DNA-Hybridisierungsassay, worin der Analyt an eine einzelsträngige DNA-Sonde angeschmolzen, die komplementär ist zu einem Enzym-markierten Oligonucleotid und der resultierende geschwänzte Doppelstrang an Enzym-markiertes Oligonucleotid. EP 204510 beschreibt ein DNA-Hybridisierungsassay, in dem eine Analyt-DNA mit einer Sonde in Kontakt gebracht wird, welche einen Schwanz hat, wie zum Beispiel einen Poly-dt-Schwanz, einem Verstärkerstrang, der eine Sequenz hat, die an den Schwanz der Sonde hybridisiert, wie zum Beispiel eine Poly-A-Sequenz, und der in der Lage ist, eine Vielzahl von markierten Strängen zu binden. Die Technik kann zuerst die Amplifikation der Ziel-HBV-Sequenzen in Seren auf ungefähr 10⁶ Sequenzen/ml einschließen. Dies kann bewerkstelligt werden durch Befolgen der Verfahren, die durch Saiki et al., Nature 324: 163 (1986) beschrieben sind. Die amplifizierten Sequenzen können dann detektiert werden unter Verwendung eines Hybridisierungsassays, wie zum Beispiel diejenigen, die im Fachgebiet bekannt sind. Die Sonden können in diagnostischen Kits verpackt werden, welche die Sondennucleinsäuresequenz einschließen, wobei die Sequenz markiert sein kann; alternativ kann die Sonde unmarkiert sein und die Inhaltsstoffe zum Markieren könnten mit dem Kit eingeschlossen sein. Der Kit kann ebenfalls andere geeignet verpackte Reagenzien und Materialien enthalten, die benötigt werden oder wünschenswert sind für das spezielle Hybridisierungsprotokoll, beispielsweise Standards ebenso wie Vorschriften zum Durchführen des Assays.
Immunoassay und diagnostische Kits
Sowohl die Polypeptide, welche immunologisch mit Serum reagieren, das Mutanten-HBV-Antikörper und Zusammensetzungen davon enthält, als auch die Antikörper, die gegen die Mutanten-HBV spezifischen Epitope in diesen Polypeptiden gezüchtet wurden, sind nützlich in Immunoassays, um die Anwesenheit von Mutanten-HBV-Antikörpern oder die Anwesenheit von dem Virus und/oder viralen Antigenen in biologischen Testproben zu detektieren. Das Design dieser Immunoassays unterliegt der Abänderung und eine Vielzahl von disen sind im Fachgebiet bekannt; eine Vielzahl von diesen wurden hierin beschrieben. Der Immunoassay kann ein virales Antigen verwenden, wie zum Beispiel ein Polypeptid, das aus irgendeiner Klon enthaltenden Mutanten-HBV-Nucleinsäuresequenz abgeleitet ist, oder aus den zusammengesetzten Nucleinsäuresequenzen, die aus den Mutanten-HBV-Nucleinsäuresequenzen in diesen Klonen abgeleitet sind, oder aus dem Mutanten-HBV-Genom, aus welchem die Nucleinsäuresequenzen in diesen Klonen abgeleitet sind. Oder der Immunoassay kann die Kombination von viralen Antigenen, die aus diesen Quellen abgeleitet sind, verwenden. Er kann beispielsweise einen monoklonalen Antikörper verwenden, der gegen dasselbe virale Antigen gerichtet ist, oder polyklonale Antikörper die gegen unterschiedliche virale Antigene gerichtet sind. Assays können einschließen, sind aber nicht beschränkt auf diejenigen die auf Konkurrenz direkter Reaktion oder Sandwichartigen Assays basiert sind. Assays können feste Phasen verwenden, oder können durch Immunopräzipitation durchgeführt werden oder irgendwelche anderen Verfahren, welche keinen festen Phasen verwenden. Beispiele für Assays, welche Marker verwenden, wie die signalerzeugende Verbindung und solche Marker sind hierin beschrieben. Die Signale können auch amplifiziert werden durch die Verwendung von Biotin und Avidin, Enzymmarker oder Biotin anti-Biotinsysteme, wie zum Beispiel das das in den anhängigen U.S. Patentanmeldungen Seriennrn. 608,849; 070,647; 418,981 und 687,785 beschrieben ist. Rekombinante Polypeptide, welche Epitope aus immunodominanten Regionen von Mutanten-HBV einschließen, können nützlich sein für die Detektion von viralen Antikörpern in biologischen Testproben von infizierten Individuen. Es wird auch in Erwägung gezogen, daß Antikörper nützlich sein können bei der Unterscheidung akuter Infektionen von nicht akuten Infektionen. Kits, die geeignet sind für die Immunodiagnose und die geeigneten Reagenzien enthalten, werden zusammengestellt, in dem die geeigneten Materialien verpackt werden, einschließlich der Polypeptide der Erfindung, die Mutanten-HBV-Epitope oder Antikörper, die gegen Mutanten-HBV-Epitope gerichtet sind, enthalten, in geeigneten Behältern, mit den restlichen Reagenzien und Materialien, die erforderlich sind für die Durchführung des Assays, ebenso wie geeignete Assayvorschriften.
Weitere Charakterisierung des HBV-Genoms, der Virionen, und der viralen Antigene unter Verwendung von Sonden
Die Mutanten-HBV-Nucleinsäuresequenzen können verwendet werden, um weitere Information über die Sequenz des Mutanten-HBV-Genoms zu gewinnen und für die Identifikation und die Isolation von Mutanten-HBV. Diese Information kann dann wieder zu zusätzlichen Polynucleotidsonden, Polypeptiden, die aus dem HBV-Genom abgeleitet sind und Antikörpern führen, die gegen-Mutanten-HBV-Epitopbe gerichtet sind, welche nützlich wären für die Diagnose und/oder die Behandlung von Mutanten-HBV-Hepatitis.
Die Nucleinsäuresequenzinformation ist nützlich für das Design von Sonden für die Isolation von zusätzlichen Nucleinsäuresequenzen, welche aus der Hüllregion des Mutanten-HBV-Genoms abgeleitet sind. Beispielsweise können markierte Sonden, die eine Sequenz von 8 oder mehr Nucleotiden, und vorzugsweise 20 oder mehr Nucleotiden enthalten, welche abgeleitet sind von Regionen in der Nähe der 5'-Termini oder 3'-Termini der Mutanten-HBV-Nucleinsäuresequenzen, verwendet werden, um überlappende Nucleinsäuresequenzen aus Mutanten-HBV genomischen Büchereien zu isolieren. Diese Sequenzen, welche die Mutanten-HBV-Nucleinsäuresequenzen überlappen, welche aber ebenfalls Sequenzen enthalten, die aus Regionen des Genoms abgeleitet sind, von dem die oben erwähnten Mutanten-HBV-Nucleinsäuresequenzen nicht abgeleitet sind, können dann verwendet werden, um Sonden für die Identifikation von anderen überlappenden Fragmenten zu synthetisieren, welche nicht notwendigerweise die Nucleinsäuresequenzen in den Klonen überlappen. Sofern das Mutanten-HBV-Genom nicht segmentiert wird und den Segmenten übliche Sequenzen fehlen, ist es möglich, das gesamte virale Genom (virale Genome) zu sequenzieren unter Verwendung der Isolationstechnik von überlappenden Nucleinsäuresequenzen, abgeleitet aus dem viralen Genom (viralen Genomen). Obwohl es unwahrscheinlich ist, kann die Sequenz des Genoms, wenn das Genom ein segmentiertes Genom ist, dem übliche Sequenzen fehlen, seriologisch bestimmt werden durch Screening von Lambda-gt11 Mutanten-HBV genomischen Büchereien, der Sequenzierung von Mutanten-HBV genomischen Isolaten und der Verwendung der isolierten Mutanten-HBV Nucleinsäuresequenzen, um überlappende Fragmente zu isolieren, unter Verwendung der Techniken, die für die Isolierung und Sequenzierung von Klonen beschrieben wurde. Die Charakterisierung der genomischen Segmente könnte alternativ aus dem viralen Genom (den viralen Genomen) erfolgen, die aus gereinigten Mutanten-HBV-Partikeln isoliert wurden. Verfahren zur Reinigung von Mutanten-HBV-Partikeln und für deren Detektion während der Reinigungsprozedur sind hierin beschrieben. Verfahren zur Isolierung von Polynucleotidgenomen aus viralen Partikeln sind im Fachgebiet wohl bekannt. Die isolierten genomischen Segmente könnten dann kloniert und sequenziert werden. Daher ist es möglich, das Mutanten-HBV-Genom (die Mutanten-HBV-Genome), zu klonieren und zu sequenzieren, ungeachtet ihrer Natur.
Verfahren zur Konstruktion von Mutanten-HBV genomischen Büchereien sind im Fachgebiet bekannt, und Vektoren, die für diesen Zweck nützlich sind, sind im Fachgebiet bekannt. Diese Vektoren schließen Lambda-gt11, Lambda-gt10 und andere ein. Die Mutanten-HBV abgeleitet Nucleinsäuresequenz, die durch die Sonden detektiert wird, die aus den Mutanten-HBV genomischen Bücherein abgeleitet sind, kann aus dem Klon isoliert werden durch Verdauung des isolierten Polynucleotids mit einem geeigneten Restriktionsenzym (mit geeigneten Restriktionsenzymen), und kann sequenziert werden.
Die Sequenzinformation, die aus diesen überlappenden Mutanten-HBV-Nucleinsäuresequenzen abgeleitet wird, ist nützlich zur Bestimmung von Homologie- und Heterogenitätsbereichen innerhalb des viralen Genoms (der viralen Genome), die die Anwesenheit von verschiedenen Strängen des Genoms und/oder von Populationen von defekten Partikeln anzuzeigen. Es ist ebenfalls nützlich für das Design von Hybridisierungssonden, Mutanten-HBV oder Mutanten-HBV-Antigene oder Mutanten-HBV-Nucleinsäuren in biologischen Proben zu detektieren und während der Isolation von Mutanten-HBV unter Verwendung der hierin beschriebenen Techniken. Die überlappenden Nucleinsäuresequenzen können verwendet werden, um Expressionsvektoren für Polypeptide zu entwickeln, die aus dem Mutanten-HBV-Genom (den Mutanten-HBV-Genomen) abgeleitet sind. Innerhalb der Familie von Nucleinsäuresequenzen werden Antigene kodiert, die Epitope enthalten, von denen vermutet wird, daß sie einzigartig sind für Mutanten-HBV, daß heißt Antikörper, die gegen diese Antigene gerichtet sind, fehlen in den Individuen, die mit HAV, HCV und HEV infiziert sind, und wobei die genomischen Sequenzen in der Genbank anzeigen sollen, daß eine minimale Homologie zwischen diesen Nucleinsäuresequenz und den Polynucleotidsequenzen dieser Quellen existiert. Somit können Antikörper, die gegen die Antigene gerichtet sind, die mit den Mutanten-HBV-Nucleinsäuresequenzen kodiert wurden, verwendet werden, um den Mutanten-HBV-Partikel zu identifizieren, der aus infizierten Individuen isoliert wurde. Zusätzlich sind sie ebenfalls nützlich für die Isolierung des Mutanten-HBV-Wirkstoffs (der Mutanten-HBV-Wirkstoffe).
Mutanten-HBV-Partikel können isoliert werden aus den Seren von infizierten Individuen oder aus Zellkulturen durch irgendeines der Verfahren, die im Fachgebiet bekannt sind, einschließlich beispielsweise Techniken, die auf der Größenunterscheidung basieren, wie zum Beispiel der Sedimentation oder Exklusionsverfahren, oder Techniken, die auf der Dichte basieren, wie zum Beispiel die Ultrazentrifugation in dichte Gradienten oder die Präzipitation mit Wirkstoffen, wie zum Beispiel Polyethylenglykol (PEG), oder Chromatographie auf einer Vielzahl von Materialien, wie zum Beispiel anionischen oder kationischen Austauschermaterialien, und Materialien, welche aufgrund hydrophober Wechselwirkungen binden, ebenso wie Affinitätssäulen. Während des Isolationsverfahrens kann die Anwesenheit von Mutanten-HBV durch Hybridisationsanalyse des extrahierten Genoms detektiert werden, unter Verwendung von Sonden, die aus Mutanten-HBV-Nucleinsäuresequenzen abgeleitet sind, oder durch Immunoassay, welcher als Sondenantikörper verwendet, die gegen Mutanten-HBV-Antigene gerichtet sind, kodiert innerhalb der Familie von Mutanten-HBV-Nucleinsäuresequenzen. Die Antikörper- können polyklonal oder monoklonal sein und es kann wünschenswert sein, die Antikörper vor ihrer Verwendung in dem Immunoassay zu reinigen. Solche Antikörper, die gegen Mutanten-HBV-Antigene gerichtet sind, welche an feste Phasen angeheftet sind, sind nützlich für die Isolation von Mutanten-HBV durch Immunoaffinitätschromatographie. Verfahren für die Immunoaffinitätschromatographie sind im Fachgebiet bekannt und schließen Verfahren ein zum Anheften von Antikörpern an feste Phasen, so daß sie ihre immunoselektive Wirksamkeit zurückhalten. Diese Verfahren schließen die Absorption und das kovalente Binden eine. Spacergruppen können in die bifunktionellen Kopplungsstoffe eingeschlossen werden, so daß die Antigen bindende Stelle des Antikörpers zugänglich bleibt.
Während des Reinigungsverfahrens kann die Anwesenheit von Mutanten-HBV detektiert und/oder verifiziert werden durch Nucleinsäurehybridisation, wobei Polynucleotide als Sonden verwendet werden, die abgeleitet sind von einer Familie von HBV- genomischen Sequenzen, ebenso wie von überlappenden Mutanten-HBV-Nucleinsäuresequenzen. Die Fraktionen werden unter Bedingungen behandelt, welche die Zerstörung von viralen Partikeln bewirken würden, wie zum Beispiel durch die Verwendung von Waschsubstanzen in der Anwesenheit von Gelat-bildenden Wirkstoffen, und die Anwesenheit von viraler Nucleinsäure, die durch Hybridisationstechniken bestimmt wurde. Eine weitere Bestätigung, daß die isolierten Partikel die Wirkstoffe sind, welche eine Mutanten-HBV-Infektion induzieren, kann erhalten werden durch infizieren eines Individuums, welches vorzugsweise ein Schimpanse ist, mit den isolierten Viruspartikeln, gefolgt von einer Bestimmung, ob die Symptome der Mutanten-HBV-Hepatitis, wie hierin beschrieben, von der Infektion herrühren.
Die Bestimmung von Polypeptiden, die konservierte Sequenzen enthalten, kann nützlich sein zur Selektion von Sonden, welche das Mutanten-HBV-Genom binden, und somit seine Isolation erlauben. Zusätzlich können konservierte Sequenzen zusammen mit denjenigen, die aus den Mutanten-HBV-Nucleinsäuresequenzen abgeleitet sind, verwendet werden, um Primer zu entwickeln, zur Verwendung in Systemen, welche genomische Sequenzen amplifizieren. Weiter kann die Struktur von Mutanten-HBV auch bestimmt werden und seine Komponenten können isoliert werden. Die Morphologie und die Größe kann beispielsweise durch Elektronenmikroskopie bestimmt werden. Die Identifikation und Lokalisierung von spezifischen viralen Polypeptidantigenen, wie zum Beispiel envelope (Hüll)antigenen, oder internen Antigenen, wie zum Beispiel Nucleinsäure-bindenden Proteinen oder Kernantigenen, und Polynucleotidpolymerase(n) können auch bestimmt werden durch versichern, ob die Antigene in viralen Haupt- oder Nebenkomponenten enthalten sind, ebenso wie durch die Verwendung von Antikörpern, die gegen die spezifischen Antigene gerichtet sind, die innerhalb der isolierten Nucleinsäuresequenzen als Sonden kodiert wurden. Diese Information kann nützlich sein für diagnostische und therapeutische Anwendungen. Beispielsweise kann es bevorzugt sein, ein äußeres Antigen in eine Impfzubereitung einzuschließen, oder vielleicht können multivalente Impfstoffe zusammengesetzt sein aus einem Polypeptid, das aus dem Genom abgeleitet ist, das ein Strukturprotein kodiert, ebenso wie ein Polypeptid aus einem anderen Teil des Genoms, wie zum Beispiel ein nicht Strukturpolypeptid.
Zellkultursysteme und Tiermodellsysteme für die Mutanten-HBV-Replikation
Im allgemeinen können geeignete Zellen oder Zellinien für die Kultivierung von Mutanten-HBV folgendes einschließen: Zellen von der Affenniere, wie zum Beispiel MK2 und VERO, Zellinien von der Schweineniere, wie zum Beispiel PS, Zellinien von der Babyhamsterniere, wie zum Beispiel BHK, Zellinien von Rattenmacrophagen, wie zum Beispiel P388D1, MK1 und Mm1, Zellinien von menschlichen Macrophagen, wie zum Beispiel U-937, menschliche periphere Blutleukozyten, menschliche anhaftende Monozyten, Hepatozyten oder hepatozytische Zellinien, wie zum Beispiel HUH7 und HepG2, Embryos oder Embryonenzellen, wie zum Beispiel Kückenembryofibroblasten oder Zellinien, die von wirbellosen Tieren abgeleitet sind, vorzugsweise von Insekten, wie zum Beispiel Drosophia Zellinien oder noch bevorzugter von Anthropoden, wie zum Beispiel Mosquitozellinien oder Zeckenzellinien. Es ist ebenfalls möglich, das primäre Hepatozyten kultiviert und dann mit Mutanten-HBV infiziert werden können. Alternativ könnten die Hepatozytenkulturen abgeleitet werden aus den Lebern von infizierten Individuen (Menschen oder Schimpansen). Der letzt genannte Fall ist ein Beispiel einer Zellinien, welche in vivo infiziert wurde und dann in vitro überführt wurde. Zusätzlich können verschiedene Immortalisierungsverfahren verwendet werden, um Zellinien zu erhalten, die aus Hepatozytenkulturen abgeleitet sind. Beispielsweise können primäre Leberkulturen (vor und nach der Anreicherung der Hepatozytenpopulation) mit einer Vielzahl von Zellen fusioniert werden, um die Stabilität aufrecht zu erhalten. Ebenfalls können Kulturen mit transformierenden Viren infiziert werden, oder mit transformierenden Genen transfiziert werden, um permanente oder semipermanente Zellinien zu entwickeln. Zusätzlich können Zellen in Leberkulturen in hergestellten Zellinien fusioniert werden, wie zum Beispiel PehG2. Verfahren für die Zellfusion sind einem routinierten Fachmann wohl bekannt und schließen die Verwendung von Fusionsmittel, wie zum Beispiel PEG, Sendai Virus und Epstein-Barr Virus unter anderem ein.
Es wird in Erwägung gezogen, daß die Mutanten-HBV-Infektion von Zellinien erreicht werden kann durch Techniken, wie zum Beispiel dem Inkubieren der Zellen mit viralen Zubereitungen unter Bedingungen, welche den viralen Zugang in die Zelle erlauben. Es kann auch möglich sein, die virale Produktion zu erhalten durch transfizieren der Zellen mit isolierten viralen Polynucleotiden. Verfahren zum transfizieren von Gewebekulturzellen sind im Fachgebiet bekannt und schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Techniken, welche die Elektroporation und die Präzipitation mit DEAE-Dextran oder Kalziumphosphat verwenden. Die Transfektion mit klonierter Mutanten-HBV-genomischer DNA sollte in der viralen Replikation und der in vitro Vermehrung des Virus resultieren. Zusätzlich zu den kultivierten Zellen können Tiermodellsysteme für die virale Replikation verwendet werden.
Screening für antivirale Wirkstoffe für Mutanten-HBV
Die Verfügbarkeit von Zellkultur- und Tiermodellsystemen für Mutanten-HBV macht ebenfalls das Screening für antivirale Wirkstoffe möglich, welche die Mutanten-HBV-Replikation verhindern und insbesondere für diejenigen Wirkstoffe, welche vorzugsweise das Zellwachstum und die Multiplikation verlauben, während sie die virale Replikation verhindern. Diese Screeningverfahren sind im Fachgebiet bekannt. Im allgemeinen werden die antiviralen Wirkstoffe bei einer Vielzahl von Konzentrationen getestet, auf ihre Wirksamkeit zur Verhinderung der viralen Replikation in Zellkultursystemen, welche die virale-Replikation unterstützen, und dann auf die Hemmung der Infektiosität oder der viralen Pathogenität, und einen niedrigen Spiegel an Toxizität in einem Tiermodellsystem. Die Verfahren und die Zusammensetzung, die hierin bereitgestellt werden für die Detektion von Mutanten-HBV-Antigenen und Mutanten-HBV-Polynucleotiden, sind nützlich für das Screening von antiviralen Wirkstoffen, weil sie eine alternative bereitstellen und vielleicht ein genaueres Mittel zum detektieren der Wirksamkeit des Mittels auf die virale Replikation als der Zellplaqueassay oder der ID₅₀ Assay. Beispielsweise können die Mutanten-HBV-Polynucleotidsonden, die hierin beschrieben sind, verwendet werden, um die Menge an viraler produzierter Nucleinsäure in einer Zellkultur quantitativ zu bestimmen. Dies könnte erreicht werden durch die Hybridisierung oder die Wettbewerbshybridisierung der Nucleinsäuren der infizierten Zelle mit einer markierten Mutanten-HBV-Nucleotidsonde. Auch anti-Mutanten-HBV-Antikörper können verwendet werden, um die Mutanten-HBV-Antigene in der Zellkultur zu identifizieren und quantitativ zu bestimmen unter Verwendung der Immunoassays, die hierin beschrieben sind. Ebenfalls sind, da es wünschenswert sein kann, Mutanten-HBV-Antigene in der infizierten Zellkultur durch einen Wettbewerbsassay quantitativ zu bestimmen, die Polypeptide, die innerhalb der Mutanten-HBV-Nucleinsäuresequenzen kodiert werden, die hierin beschrieben sind, nützlich für diese Assays. Im allgemeinen würde ein rekombinantes Mutanten-HBV-Polypeptid, das von der Mutanten-HBV genomischen DNA abgeleitet ist, markiert werden, und die Hemmung der Bindung dieses markierten Polypeptids an ein Mutanten-HBV-Polypeptid aufgrund des Antigens, das in dem Zellkultursystem produziert wurde, würde überwacht werden. Diese Verfahren sind insbesondere nützlich in Fällen, wo das Mutanten-HBV in der Lage sein kann, sich in einer Zellinien zu replizieren, ohne den Zelltod zu bewirken.
Herstellung von abgeschwächten Stämmen von Mutanten-HBV
Es kann möglich sein, abgeschwächte Stämme von Mutanten-HBV zu isolieren durch Verwendung der Gewebekultursysteme und/oder Tiermodellsysteme, die hierin bereitgestellt sind. Diese abgeschwächten Stämme würden nützlich sein für Impfstoffe oder für die Isolation von viralen Antigenen. Abgeschwächte Stämme sind isolierbar nach vielfachen Passagen in Zellkultur und/oder einem Tiermodell. Die Detektion eines abgeschwächten Stamm einer infizierten Zelle oder infiziertem Individuum kann erreicht werden durch befolgen der Verfahren, die im Fachgebiet bekannt sind und könnte die Verwendung von Antikörpern gegen ein oder mehrere Epitope einschließen, die in Mutanten-HBV kodiert werden, als eine Sonde, oder die Verwendung eines Polynucleotids, das eine Mutanten-HBV-Sequenz von mindestens ungefähr 8 Nucleotiden in der Länge enthält, als eine Sonde. Ebenfalls oder alternativ kann ein abgeschwächter Stamm konstruiert werden unter Verwendung der genomischen Information von Mutanten-HBV, die hierin bereitgestellt ist und unter Verwendung von rekombinanten Techniken. Üblicherweise wird ein Versuch gemacht, um eine Region des Genoms zu zerstören, die ein Polypeptid kodiert, das mit der Pathogenität in Zusammenhang steht, aber nicht mit der viralen Replikation. Die genomische Konstruktion würde die Expression eines Epitops erlauben, welches Anlaß geben würde für neutralisierende Antikörper für Mutanten-HBV. Das veränderte Genom könnte dann verwendet werden, um Zellen zu tranformieren, welche die Mutanten-HBV-Replikation erlauben, und das die Zellen, die unter den Bedingungen gewachsen sind, die virale Replikation erlauben. Abgeschwächte Mutanten-HBV-Stämme sind nützlich nicht nur für Impfzwecke, aber ebenso als Quellen für die kommerzielle Produktion von viralen Antigenen, da das Verarbeiten dieser Viren weniger strenge Schutzmaßnahmen für die Beschäftigten, die in die virale Produktion und/oder die Produktion von viralen Produkten involviert sind, erfordern würde.
Wirte und Expressionskontrollsequenzen
Obwohl das Folgende im Fachgebiet bekannt ist, sind hierin allgemeine Techniken eingeschlossen, die bei der Extraktion des Genoms aus einem Virus, bei der Herstellung und dem Sondieren einer genomischen Bibliothek, dem Sequenzieren von Klonen, der Konstruktion von Expressionsvektoren, Transformation von Zellen, dem Durchführen von immunologischen Assays und für das Züchten von Zellen in Kultur verwendet werden.
Sowohl prokaryotische als auch eukaryotische Wirtszellen können für die Expression von gewünschten kodierenden Sequenzen verwendet werden, wenn geeignete Kontrollsequenzen, die kompatibel sind mit dem bezeichneten Wirt, verwendet werden. Unter den prokariotischen Wirten wird E. coli am häufigsten verwendet. Die Expressionskontrollsequenzen für prokariotische Wirte schließen Promoter, die wahlweise Operatorabschnitte enthalten und Ribosombindungsstellen enthalten. Transfervektoren, die mit prokariotischen Wirten kompatibel sind, sind üblicherweise abgeleitet aus dem Plsmid pBR322, welches Operon enthält, die eine Ampizillin- und Tetrazylinresistenz übertragen, und die verschiedenen pUC Vektoren, welche ebenfalls Sequenzen enthalten, die antibiotische Resistanzmarker übertragen. Diese Marker können verwendet werden, um erfolgreiche Tranformanten durch Selektion zu erhalten. Üblicherweise verwendete prokariotische Kontrollsequenzen schließen die beta-Lactamase (Penizillinase), Lactosepromotersystem (Chang et al., Nature 198: 1056 [1977]) das Tryptophanpromotersystem (berichtet von Goeddel et al., Nucleic Acid Res 8: 4057 [1980]) und dem Lambda-abgeleiteten P1 Promoter und N-Gen-Ribosombindungsstelle (Shimatake et al., Nature 292: 128 [1981]) und den Hybrid Tac Promoter (De Boer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 292: 128 [1983]) abgeleitet von Sequenzen der trp und lac UV5 Promoter. Die vorhergehenden Systeme sind insbesondere kompatibel mit E. Coli; jedoch können andere prokariotische Wirte, wie zum Beispiel Stämme von Bacillus oder Pseudomonas wenn gewünscht, mit entsprechenden Kontrollsequenzen.
Eukaryotische Wirte schließen Hefe- und Säugetierzellen in Kultursystemen ein. Saccharomvces cerevisiae und Saccharomvces carlsberaensis sind die am üblichsten verwendeten Hefewirte, und sind geeignete Pilzwirte. Hefe kompatible Vektoren tragen Marker, welche die Selektion von erfolgreichen Transformanten erlauben, durch übertragen von Protrophie auf Auxotrophe Mutanten oder eine Resistenz gegenüber Schwermetallen auf Wildtypstämmen. Hefe kompatible Vektoren können den 2 Mikron-Replikationsursprung verwenden (wie beschrieben durch Broach et al., Meth. Enz. 101: 307 [1983]), die Kombination von CEN3 und ARS1 oder andere Mittel, um die Replikation sicher zustellen, wie zum Beispiel Sequenzen, welche in der Inkorporation eines geeigneten Fragments in das Wirtszellgenom resultieren werden. Kontrollsequenzen für Hefevektoren sind im Fachgebiet bekannt und schließen Promoter ein für die Synthese von glycolytischen Enzymen, einschließlich dem Promoter für die 3 Phosphophyceratkinase. Siehe beispielsweise Hess et al., J. Adv. Enzyme Req. 7: 149 (1968), Holland et al., Biochemistry 17: 4900 (1978) und Hitzeman J. Biol. Chem. 255: 2073 (1980). Terminatoren können auch eingeschlossen sein, wie zum Beispiel diejenigen, die aus dem Enolasegen abgeleitet sind, wie berichtet durch Holland, J. Biol. Chem. 256: 1385 (1981). Es wird in Erwägung gezogen, das speziell nützliche Kontrollsysteme diejenigen sind, welche den Glyceraldehyd-3 Phosphatdehydrogenase (GAPDH) Promoter oder den Alkoholdehydrogenase (ADH) regulierbaren Promoter, Terminatoren, die ebenfalls von GAPDH abgeleitet sind und wenn die Sekretion erwünscht ist, Leadersequenzen vom Hefealphafaktor fassen. Außerdem können die transkriptionsregulatorische Region und die Ttranskriptionsiniziationsregion, welche operativ verknüpft sind, derart sein, daß sie nicht natürlichlicherweise in dem Wildtyporganismus assoziiert sind.
Säugetierzellinien, die als Wirte für die Expression verfügbar sind, sind im Fachgebiet bekannt und schließen viele immortalisierte Zellinien ein, welche erhältlich sind von der American Type Culture Collection. Diese schließen folgendes ein: HeLa Zelle, Ovarialzellen vom chinesischen Hamster (CHO), Zellen der Babyhamsterniere (BHK) und andere. Geeignete Promoter für Säugetierzellen sind ebenfalls im Fachgebiet bekannt und schließen virale Promoter ein, wie zum Beispiel aus dem Simian Virus 40 (SV40), Rous Sarcomavirus (RSV), Adenovirus (ADV), Rinderpapillomavirus (BPV), Cytomegalovirus (CMV). Säugetierzellen können auch Terminatorsequenzen und poly A Additionssequenzen erfordern; Verstärkersequenzen, welche die Expression erhöhen, können auch eingeschlossen werden, und Sequenzen, welche die Amplifikation des Gens bewirken, können auch wünschenswert sein. Diese Sequenzen sind im Fachgebiet bekannt. Vektoren, die geeignet sind für die Replikation in Säugetierzellen können virale Replikons einschließen, oder Sequenzen, welche die Integration der geeigneten Sequenzen, die non-A, non-B, non-C, non-E Epitope kodieren, in das Wirtsgenom sicherstellen. Ein Beispiel eines Säugetierexpressionssystems für HCV ist beschrieben in U.S. Patent Anmeldung Seriennr. 07/830,024, angemeldet am 31. Januar 1992.
Transformationen
Eine Transformation kann durch jedes bekannte Verfahren erfolgen, zum Einführen von Polynucleotiden in eine Wirtszelle, einschließlich dem Verpacken des Polynucleotids in einen Virus und das Umwandeln einer Wirtszelle mit dem Virus und durch direkte Aufnahme des Polynucleotids. Die ausgewählten Transformationsverfahren hängen vom Wirt ab, der transformiert werden soll. Eine bakterielle Transformation durch direkte Aufnahme verwendet im allgemeinen die Behandlung mit Kalzium oder Rubidiumchlorid. Cohen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 2110 (1972). Die Hefetransformation durch direkte Aufnahme kann durchgeführt werden unter Verwendung des Kalziumphosphatpräzipitationsverfahrens von Graham et al., Virology 52: 526 (1978), oder Modifikationen davon.
Vektorkonstruktion
Die Vektorkonstruktion verwendet Verfahren, die im Fachgebiet bekannt sind. Im allgemeinen wird eine ortsspezifische DNA-Abspaltung durchgeführt durch Behandeln mit geeigneten Restriktionsenzymen unter Bedingungen, welche im allgemeinen durch den Hersteller dieser kommerziell erhältlichen Enzyme angegeben sind. Üblicherweise wird ungefähr 1 Mikrogramm (μg) an Plsmid oder DNA Sequenz durch eine Einheit von Enzym in ungefähr 20 μl Pufferlösung durch Inkubation bei 37°C für 1 bis 2 Stunden gespalten. Nach der Inkubation mit dem Restriktionsenzym, wird das Protein durch Phenol/Chloroform-Extraktion entfernt und die DNA wird durch Präzipitation mit Ethanol wiedergewonnen. Die abgespaltenen Fragmente können unter Verwendung von Polyacrylamid oder Agarosegelelektrophoreseverfahren getrennt werden, gemäß den Verfahren, die einem Fachmann bekannt sind.
Sticky end -Abspaltungsfragmente können zu einem Blunt end gemacht werden unter Verwendung von E. coli DNA Polymerase 1 (Klenow) in der Anwesenheit der geeigneten Desoxynucleotidtriphosphate (dNTPs), die in der Mischung anwesend sind. Die Behandlung mit S1 Nuclease kann auch verwendet werden, was in der Hydrolyse von irgendwelchen einzelsträngigen DNA Abschnitten resultiert.
Die Ligationen werden durchgeführt unter Verwendung von Standardpuffer und -Temperaturbedingungen unter Verwendung von T4 DNA Ligase und ATP. Sticky end -Ligationen erfordern weniger ATP und weniger Ligase als Blunt end -Ligationen. Wenn Vektorfragmente verwendet werden als ein Teil einer Ligationsmischung, wird das Vektorfragment oft mit bakterieller alkalischer Phosphatase (BAP) oder intestinaler alkalischer Phosphatase vom Kalb behandelt, um das 5'-Phosphat zu entfernen und somit die Wiederligation des Vektors zu verhindern. Oder die Restirktionsenzymverdauung von ungewollten Fragmenten kann verwendet werden, um die Ligation zu verhindern. Ligationsmischungen werden in geeigneten Klonierungswirten, wie zum Beispiel E. coli transformiert und erfolgreiche Transformanten werden durch Verfahren einschließlich der Antibiotikaresistenz ausgewählt, und dann für die korrekte Konstruktion gescreent.
Konstruktion von gewünschten DNA Sequenzen
Synthetische Oligonukleotide können hergestellt werden unter Verwendung eines automatisierten Oligonukleotidsynthesizer, wie zum Beispiel den der durch Warner beschrieben ist, DNA 3: 401 (1984). Wenn gewünscht, können die synthetischen Stränge markiert werden mit ³²P durch Behandlung mit Polynucleotidkinase in der Anwesenheit von ³²P-ATP, unter Verwendung von Standardbedingungen für die Reaktion. DNA Sequenzen, einschließlich derer, die aus genomischen oder cDNA Büchereinen isoliert wurden, können durch bekannte Verfahren modifiziert werden, welche die ortsgerichtete Mutagenese einschließen, wie beschrieben durch Zoller, Nucleic Acids Res. 10: 6487 (1982). Kurz gesagt, wird die DNA, die modifiziert werden soll, in einen Phagen verpackt als eine einzelsträngige Sequenz, und in eine doppelsträngige DNA umgewandelt mit DNA Polymerase, unter Verwendung eines synthetischen Oligonukleotids als einen Primer, das komplementär ist zu dem Abschnitt der DNA, die modifiziert werden soll, und das die gewünschte Modifikation in seiner eigenen Sequenz eingeschlossen hat. Kulturen der umgewandelten Bakterien, welche Replikationen von jedem Strang des Phagens enthalten, werden in Agar platziert, um Plaque zu erhalten. Theoretisch enthalten 50% der neuen Plaque einen Phagen, der die mutierte Sequenz hat, und die restlichen 50% haben die ursprüngliche Sequenz. Die Replikate der Plaques werden hybridisiert an markierte synthetische Sonden bei Temperaturen und Bedingungen, die geeignet sind für die Hybridisierung mit dem korrekten Strang, aber nicht mit der unmodifizierten Sequenz. Die Sequenzen, die identifiziert wurden durch Hybridisierung, werden wiedergewonnen und kloniert.
Hybridisierung mit Sonden
HBV genomische oder DNA Büchereien können zu Sonden gemacht werden unter Verwendung des Verfahrens das durch Grunstein und Hogness, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73: 3961 (1975). Kurz gesagt wird die DNA, die zur Sonde gemacht werden soll, auf Ntrozellulosefiltern immobilisiert, denaturiert und prehybridisiert mit einem Puffer, der 0–50% Formamid, 0,75 M NaCl, 75 mM Natriumcitrat, 0,02% (w/v) jeweils von Rinderserimalbumin (BSA), Polyvinylpyrollidon und ficoll, 50 mM Natriumphosphat (pH 6,5), 0,1% SDS und 100 μg/ml Träger denaturierte DNA. Der Prozentsatz an Formamid in dem Puffer, ebenso wie die Zeit- und Temperaturbedingungen der Prehybridisierung und nachfolgenden Hybridisierungsschritten hängt ab von der erforderlichen Stränge. Oligonmere Sonden, welche weniger strenge Bedingungen erfordern, werden üblicherweise, verwendet mit geringen Prozentsätzen an Formamid, niedrigeren Temperaturen, und längeren Hybridisierungszeiten. Sonden, die mehr als 30 oder 40 Nucleotide enthalten, wie zum Beispiel diejenigen, die aus genomischen Sequenzen abgeleitet sind, verwendet üblicherweise höhere Temperaturen, beispielsweise ungefähr 40 bis 42°C, und eine hohen Prozentsatz, beispielsweise 54% an Formamid. Nach der Prehybridisierung wird eine ³²P-markierte Oligonucleotidsonde zu dem Puffer hinzugefügt, und die Filter werden in dieser Mischung unter Hybridisierungsbedingungen inkubiert. Nach dem Waschen werden die behandelten Filter einer Autoradiographie unterworfen, um den Ort der hybridisierten Sonde zu zeigen. Die DNA in den entsprechenden Orten auf den original Agarplatten wird verwendet als die Quelle der gewünschten DNA.
Verifizierung von Konstruktion und Sequenzierung
Für Standardvektorkonstruktionen werden die Ligationsmischungen in E. coli Strang HB 101 oder einen anderen geeigneten Wirt transformiert und die erfolgreichen Transformanten werden ausgewählt durch antibiotische Resistenz oder andere Marker. Plasmide aus den Transformanten werden dann hergestellt gemäß dem Verfahren von Clewell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 62: 1159 (1969) üblicherweise nach einer Chloramphenicolamplifizierung wie berichtet durch Clewell et al., J. Bacteriol. 110: 667 (1972). Die DNA wird isoliert und analysiert üblicherweise durch Restirktionsenzymanalyse und/oder Sequenzierung. Die Sequenzierung kann durch das wohl bekannte Dideoxyverfahren durch Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463 (1977), wie weiter beschrieben durch Messing et al., Nucleic Acid Res. 9: 309 (1981) oder durch das Verfahren, das durch Maxam et al., beschrieben ist Methods in Enzymology 65: 499 (1980). Probleme mit der Bandkompression, welche manchmal in GC reichen Regionen beobachtet werden, können durch die Verwendung von Titelverbindung-Deazoguanosin überwunden werden gemäß dem Verfahren, das durch Barr et al., Biotechniaues 4: 428 (1986) berichtet wird.
Heterologer Enzymimmunoassay
Ein heterologer Enzymimmunoassay (ELISA) kann verwendet werden, um entweder Antigen oder Antikörperkonzentrationen zu messen. Dieses Verfahren hängt ab von der Konjugation eines Enzymmarkers an entweder ein Antigen oder einen Antikörper, und verwendet die Aktivität des gebundenen Enzyms (Signal erzeugt) als einen quantitativen Marker (meßbares erzeugtes Signal). Verfahren, welche Enzyme als Marker verwenden, sind hierin beschrieben, ebenso wie Beispiele solcher Enzymmarker.
Herstellung von Mutanten-HBV-Nucleinsäureseguenzen
Die Quelle des Mutanten-HBV-Wirkstoffes ist ein Individuum oder gepooltes Plasma, Serum oder Leberhomogenisat von einem Menschen oder Schimpansen, der mit dem Mutanten-HBV-Virus infiziert wurde, der die klinischen und Laborkriterien, die hierin beschrieben sind erfüllt. Ein Schimpanse kann alternativ experimentell infiziert werden mit Blut von einem anderen Individuum mit Mutanten-HBV-Hepatitis, das die Kriterien, die hierin unten beschrieben sind erfüllt. Ein Pool kann hergestellt werden durch Kombinieren von vielen individuellen Plasma-, Serum- oder Leberhomogenisatproben, die hohe Spiegel an Alanintranseraseaktivität enthalten; diese Aktivität resultiert aus der hepatischen Verletzung aufgrund von Mutanten-HBV-Infektion.
Beispielsweise wird eine Nucleinsäurebibliothek aus Plasma-, Serum- oder Leberhomogenisat, vorzugsweise aber nicht notwendigerweise mit hohem Titer, wie folgt erzeugt. Zuerst werden virale Partikel aus dem Plasma-, Serum- oder Leberhomogenisat isoliert; dann wird ein Aliquot in einer gepufferten Lösung verdünnt, wie zum Beispiel eine, die 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl enthält. Die Debris wird durch Zentrifugation entfernt, beispielsweise für 20 Minuten bei 15,000 × g bei 20°C. Dann werden virale Partikel in dem resultierenden Überstand pelletiert durch Zentrifugation durch geeigneten Bedingungen welche routinemäßig durch jemanden der im Fachgebiet bewandert ist, bestimmt werden kann. Um das virale Genom freizusetzen, werden die Partikel zerstört durch Suspendieren der Pellets in einem Aliquot einer SDS Suspension, beispielsweise einer, die 1% SDS, 120 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 enthält, welche ebenfalls 2 mg/ml Proteinase K enthält, gefolgt von Inkubation bei geeigneten Bedingungen, beispielsweise 45°C für 90 Minuten. Die Nucleinsäuren werden isoliert durch Hinzufügen von beispielsweise 0,8 μg MS2 Bakteriophagen RNA als Träger, und Extrahieren der Mischung vier mal mit einer 1 : 1 Mischung von Phenol : Chloroform (Phenol gesättigt mit 0,5 M Tris-HCl, pH 7,5, 0,1% (v/v) Beta-Mercaptoethanol, 0,1% (w/v) Hydroxychinolon, gefolgt von zweimaliger Extraktion mit Chloroform. Die wässerige Phase wird konzentriert mit beispielsweise 1-Butanol vor der Präzipitation mit 2,5 Volumen absolutem Ethanol über Nacht bei –20°C. Die Nucleinsäuren werden durch Zentrifugation wiedergewonnen in beispielsweise einem Beckman SW41 Rotor bei 40,000 rpm für 90 Min. bei 4°C, und aufgelöst in Wasser, welches mit 0,05% (v/v) Diethylpyrocarbonat behandelt ist, und autoclaviert.
Die Nucleinsäure, die durch das obige Verfahren erhalten wird, wird denaturiert mit beispielsweise 17,5 mM CH₃HgOH; die cDNA wird dann unter Verwendung dieser denaturierten Nucleinsäure als Matrize synthetisiert, und wird in die EcoRI Stelle von Phase Lambda-gt11 kloniert, beispielsweise unter Verwendung von Verfahren, die durch Huynh (1985) oben beschrieben sind, außer daß zufällige Primer Oligo(dT) 12–18 ersetzten, während der Synthese des ersten Nucleinsäurestrangs durch reverse Transkriptase (siehe Taylor et al., [1976]).
Die Lambda-gt11 genomische Bibliothek, die somit erzeugt wurde, wird auf Epitope gescreent, welche spezifisch mit Serum-, Plasma- oder einem Leberhomogenisat auf einem Individuum binden können, welches zuvor eine Hepatitis erfahren hat, aufgrund von Mutanten-Hepatitis B Virus (jemand, der die Kriterien, wie hierin aufgeführt, erfüllt). Ungefähr 10⁴–10⁷ Phagen werden mit Serum-, Plasma- oder Leberhomogenisaten gescreent, unter Verwendung der Verfahren von Huyng et al. (supra). Gebundener menschlicher Antikörper kann mit Schaf anti-humanen Ig Antiserum detektiert werden, welches mit ¹²⁵I oder anderen geeigneten Reportermolekülen einschließlich HRPO, alkalischer Phosphatase und anderen radiomarkiert ist. Positive Phagen werden identifiziert und gereinigt. Diese Phagen werden dann auf ihre Spezifität getestet, an Seren aus einer vorher bestimmten Anzahl von unterschiedlichen Menschen zu binden, welche zuvor mit dem Mutanten-HBV-Wirkstoff infiziert wurden, unter Verwendung desselben Verfahrens. Idealerweise wird die Phase ein Polypeptid kodieren, das mit allen oder einem Großteil der Seren-, Plasma- oder Leberhomogenisaten, die getestet werden, reagiert, und nicht mit Seren-, Plasma- oder Leberhomogenisaten aus Individuen reagiert, die als "negativ" bezeichnet werden, gemäß den Kriterien die hierin für den Mutanten-HBV-Wirkstoff ebenso wie Hepatitis A, non-Mutant B, C und E aufgeführt sind. Gemäß diesem Verfahren, ein Klon, der ein Polypeptid kodiert, welches spezifisch immunologisch durch Seren-, Plasma- oder Leberhomogenisate aus non-A, non-Mutant B, non-C, non-E- identifizierten Patienten erkannt wird.
Die vorliegende Erfindung wird nun durch Beispiele beschrieben werden.
BEISPIELE
Beispiel 1, Identifikation von Serumproben
Anfängliche Laborbestimmungen
Kommerziell erhältliche Immunoassays (AUSZYME^® UND AUSRIA^®II, Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) wurden für die Bestimmung von Antikörpern gegen HBsAg verwendet. Gemäß den Anweisungen des Herstellers wurde eine Patiententestprobe von Serum drei mal mit dem AUSZYME^® Assay auf Antikörper gegen HBsAg getestet. Der AUSZYME^® Kit enthält eine feste Phase (Kügelchen) auf welche monoklonale Antikörper gegen HBsAg geschichtet wurden. Die Patiententestprobe wurde negativ getestet bei jedem mal der drei Male für den Antikörper gegen HBsAg unter Verwendung dieses Testkits. Die Patiententestprobe wurde wiederum getestet unter Verwendung des AUSRIA^®II Testkit, welcher einen polyklonalen Antikörper gegen ein Hepatitis B Oberflächenantigen enthält. Die Ergebnisse des AUSRIA^®II Tests zeigten an, daß der Patient für Antikörper gegen HBsAg positiv war.
Weitere Labortests
Eine Serumtestprobe von dem Patienten, der in dem AUSZYME^® monoklonalen Antikörpertest für Antikörper gegen HBsAg negativ getestet wurde, und der in dem AUSRIA^®II polyklonalen Antikörpertest für Antikörper gegen HBsAg positiv getestet wurde, wurde 1 : 20 verdünnt. Ein Kreuz-Austausch von AUSRIA^®II Reagenzien und AUSZYME® monoklonalen Reagenzien wurde durchgeführt (d. h., AUSRIA^®II Kügelchen mit AUSZYME^® monoklonalem Antikörpermarker und umgekehrt). Die bevorzugten Testbedingungen für die Bewertung waren die über Nacht Inkubation der Testprobe bei Raumtemperatur für die erste Inkubation und vier Stunden bei Raumtemperatur für die zweite Inkubation. Die Testprobe wurde auch seriell verdünnt, und die Verdünnungen wurden getestet und verglichen mit ähnlichen Verdünnungen (5-fach) der positiven Kontrolle. Die Daten aus diesen Tests werden unten in Tabelle 1 gezeigt.
TABELLE 1
Die Daten zeigten zunächst, daß die Testprobe mit AUSRIA^®II reaktiv war, aber nicht mit AUSZYME^® monoklonal. Die Daten aus Tabelle 1 zeigen, daß wenn der Kreuz-Austausch von Reagenzien verwendet wurde für das Testen der Testprobe, dann war die Testprobe schwach reaktiv mit beiden Kombinationen, aber war irgendwie mehr reaktiv mit AUSZYME^® Kügelchen und ¹²⁵I-Antikörper, als mit AUSRIA^®II Kügelchen und AUSZYME^®-HRP Antikörper. Die weitere Untersuchung der Unterschiede zwischen den Antikörpern aus jedem Testsystem zeigte an, daß der Hauptreaktant in dem AUSZYME^® ein anti-a Antikörper ist, wie es der HRB-Antikörper ist. In AUSRIA^®II wird das Kügelchen mit einem polyklonalen Antikörper anti-HBs beschichtet, der einen starken anti-a hat, aber mit anti-d und anti-y Fähigkeiten. Weiterhin ist der ¹²⁵I-Antikörper in AUSRIA^®II ein polyklonaler, welcher vorwiegend anti-a ist, aber sowohl Kügelchen als auch Sondenantikörper werden als Breitspektrum Antikörper angesehen. Der monoklonale Antikörper mit seiner fokussierten Spezifität auf anti-a war nicht reaktiv mit der Testprobe. Obwohl die Testprobe mit den polyklonalen Antiseren reagierte, wurde gedacht, daß die Reaktivität des polyklonalen Antikörpers verändert werden würde, da er auch vorwiegend anti-a detektierte. Eine Verdünnungskurve mit AUSRIA^®II Antikörper (nicht gezeigt) zeigte, daß er tatsächlich verändert war, obwohl das breite Spektrum des polyklonalen Reagens angemessen war, um die anti-HBs zu detektieren, die in der Testprobe anwesend sind.
Beispiel 2. Bestimmung der Sequenz
Da geglaubt wurde, daß die Probe eine Form eines Mutanten-HBV war, wurde die Sequenzierung durchgeführt, um zu bestimmen, ob irgendwelche Variablen in dem Nucleotid und der Aminosäuresequenz von HBV Oberflächenantigen anwesend sind. Die Sanger Dideoxysequenzierungsreaktion, wie beschrieben in Titelverbindung. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2te Ausgabe, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., Buch 2: Kapitel 13, 13.1–13.77 (1989) wurde durchgeführt. Die Resultate der Sequenzbestimmungen zeigten eine zwei Aminosäure-Insertion in der Aminosäuresequenz des HBsAg an Position 122. Das Nucleotid und die Aminosäuresequenz von dem Mutanten-HBV sind gezeigt in Sequenzidentitätsnummer 1 und Sequenzidentitätsnummer 2. Die Wiederholung des Verfahrens deckte leichte Aminosäureänderungen auf, und sie sind gezeigt als Sequenzidentitätsnummer 3 und Sequenzidentitätsnummer 4. Was jede Aminosäuresequenz gemeinsam hat, ist die zwei Aminosäure (N-T) Insertion an Position 122 von HBsAg. Daher ist in der Sequenz von HBsAg eine Modifikation anwesend, in welcher es eine Insertion von zwei Aminosäuren an Position 122 gibt (N-T), wobei die Modifikation einer sechs Nucleotidinsertion an Position 366 des HBsAG Genoms entspricht.
Die vorliegende Erfindung stellt daher Reagenzien und Verfahren zum Bestimmen der Anwesenheit von Mutanten-HBsAg, in einer Testprobe bereit. Es ist ersichtlich, daß das Durchführen eines Assays mit einem monoklonalen Antikörpertest, der vorwiegend anti-a Antikörper verwendet, diesen speziellen Mutanten nicht detektieren wird. Weiterhin ist es vorhersehbar, basierend auf den Daten, die gezeigt wurden, daß gängige Impfstoffe nicht schützend sein werden gegen diesen Mutantenstrang von HBV. Daher sind die Reagenzien von solchem Mutanten-HBV nützlich für die Detektion von HBV in Testproben, und ebenfalls für die Impfstoffproduktion. Es wird in Erwägung gezogen und es ist innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung, dass ein Polynucleotid oder ein Polypeptid, das spezifisch ist für den hierin beschriebenen Mutanten-HBV, oder Antikörper, die aus diesen Polypeptiden und Polynucleotiden hergestellt werden, mit den vorliegenden Assayreagenzien kombiniert werden können und in übliche Assayverfahren eingefügt werden können für die Detektion von Antikörpern gegen HBsAg. Alternativ können diese Polynucleotide oder Polypeptide, die spezifisch sind für den Mutanten-HBV der hierin beschrieben ist, oder Antikörper, die aus diesen Polypeptiden und Polynucleotiden produziert wurden, separat verwendet werden für die Detektion des Mutantenstrangs von HBV, in welchem die "a" Determinante eine zwei Aminosäureinsertion an Position 122 der HBsAg Sequenz hat.
Andere Verwendungen oder Variationen der vorliegenden Erfindung werden denjenigen, die im Fachgebiet durchschnittlich bewandert sind, ersichtlich sein, wenn sie diese Offenbarung betrachten. Daher soll die vorliegende Erfindung nur durch die angehängten Ansprüche begrenzt werden.
SEQUENZLISTE

Claims

Ein gereinigtes Mutanten-HBV-Polynucleotid, das eine modifizierte „a" Determinante umfasst, in welcher es eine Insertion von sechs Nucleotiden an Position 366 des HBsAg-Genoms gibt, worin die sechs Nucleotide -A-A-C-A-C-A- sind.
Ein rekombinantes Mutanten-HBV-Polypeptid, das eine modifizierte „a" Determinante umfasst, in welcher es eine Insertion von zwei Aminosäuren an Position 122 der HBsAg Sequenz gibt, worin die zwei Aminosäuren, die an Position 122 eingefügt sind, N und T sind.
Das Polynucleotid von Anspruch 2, worin das Polynucleotid in einem rekombinanten Vektor enthalten ist, welcher zur Transformierung einer Wirtszelle benutzt wird.
Ein rekombinantes Expressions-System, das einen Open Reading Frame einer DNA, die von dem Mutanten HBV-Genom abgeleitet ist, umfasst, worin das Genom eine modifizierte „a" Determinante umfasst, in welcher es eine Insertion von sechs Nucleotiden an Position 366 des HBsAg Genoms gibt, worin der Open Reading Frame operativ verknüpft ist mit einer Kontroll-Sequenz, die mit einem gewünschten Wirt kompatibel ist und worin die sechs Nucleotide -A-A-C-A-C-A- sind.
Ein rekombinantes Polypeptid, das eine Sequenz umfasst, die abgeleitet ist von einem Mutanten HBV-Genom, das eine modifizierte „a" Determinante umfasst, in welcher es eine Insertion von sechs Nucleotiden an Position 366 des HBsAg Genoms gibt, worin die sechs Nucleotide -A-A-C-A-C-A- sind.
Ein monoklonaler Antikörper, der das Antigen der Mutanten HBC „a" Determinante spezifisch detektiert, und der nicht mit dem Antigen der ursprünglichen HBV „a" Determinante kreuzreagiert, wobei es in der modifizierten „a" Determinante eine Insertion von zwei Aminosäuren an Position 122 der HBsAg Sequenz gibt, worin die beiden Aminosäuren, die an Position 122 eingefügt sind, N und T sind.
Ein Fusions-Polypeptid, das ein Polypeptid des Mutanten HBV umfasst, worin das Fusions-Polypeptid weiterhin eine modifizierte „a" Determinante umfasst, in welcher es eine Insertion von zwei Aminosäuren an Position 122 der HBsAg Sequenz gibt, worin die beiden Aminosäuren, die an Position 122 eingefügt sind, N und T sind.
Ein Partikel, der gegen eine Mutanten-HBV-Infektion immunogen ist, der ein nicht HBV-Polypeptid umfasst, das eine Aminosäuresequenz besitzt, die in der Lage ist, einen Partikel zu bilden, wenn die Sequenz in einem eukariotischen oder prokariotischen Wirt produziert wird und ein Mutanten-HBV-Epitop, worin das Epitop des Mutanten-HBV weiterhin eine modifizierte „a" Determinante umfasst, in welcher es eine Insertion von zwei Aminosäuren an Position 122 der HBsAg Sequenz gibt, worin die beiden Aminosäuren, die an Position 122 eingefügt sind, N und T sind.
Eine Polynucleotid-Sonde für Mutanten-HBV, die eine modifizierte „a" Determinante umfasst, in welcher es eine Insertion von sechs Nucleotiden an Position 366 des HBsAg-Genoms gibt, worin die sechs Nucleotide -A-A-C-A-C-A- sind.
Ein Kit zur Bestimmung der Anwesenheit von Mutanten-HBV-Antigen oder -Antikörper in einer Testprobe, der einen Behälter umfasst, der ein Polypeptid enthält, das ein HBV-Epitop besitzt, das in dem HBV-Antigen anwesend ist, worin das Epitop eine modifizierte „a" Determinante umfasst, in welcher es eine Insertion von zwei Aminosäuren an Position 122 der HBsAg-Sequenz gibt, worin die beiden Aminosäuren N und T sind.
Ein Kit zur Bestimmung der Anwesenheit von Mutanten-HBV- Antigen oder -Antikörper in einer Testprobe, der einen Behälter umfasst, der einen Antikörper enthält, der sich gegen ein zu detektierendes Mutanten-HBV-Antigen richtet und worin das Antigen eine modifizierte „a" Determinante umfasst, in welcher es eine Insertion von zwei Aminosäuren an Position 122 der HBsAg-Sequenz gibt, worin die beiden Aminosäuren N und T sind.
Ein Kit zur Bestimmung der Anwesenheit von Mutanten-HBV-Polynucleotiden in einer Testprobe, von der vermutet wird, dass sie die Polynucleotide enthält, der einen Behälter umfaßt, der eine Polynucleotid-Sonde umfasst, die eine Nucleotid-Sequenz von Mutanten-HBV enthält, worin die Nucleotid-Sequenz eine Insertion von sechs Nucleotiden an Position 366 des HBsAg-Genoms umfasst, worin die sechs Nucleotide -A-A-C-A-C-A- sind.
Ein Verfahren zur Bestimmung von Mutanten-HBV-Nukleinsäuren in einer Testprobe, von der vermutet wird, dass sie HBV enthält, wobei das Verfahren folgendes umfasst: a.) Reagieren der Testprobe mit einer Sonde für ein HBV-Polynucleotid, worin das Polynucleotid eine Nucleotid-Sequenz von Mutanten-HBV mit einer Insertion von sechs Nucleotiden an Position 366 des HBsAg-Genoms umfasst, unter Bedingungen und für einen Zeitraum, die die Bildung eines Komplexes zwischen der Sonde und der Mutanten-HBV-Nukleinsäure in der Testprobe erlauben; und b.) Detektieren des Komplexes, welcher die Sonde enthält; worin die sechs Nucleotide -A-A-C-A-C-A- sind.
Ein Verfahren zur Detektion von Mutanten-HBV-Antigen in einer Testprobe, von der vermutet wird, dass sie HBV enthält, wobei das Verfahren folgendes umfasst: a.) In Kontakt bringen einer Testprobe mit einem Antikörper, der gegen zu detektierendes Mutanten-HBV-Antigen gerichtet ist, worin das Mutanten-HBV-Antigen eine modifizierte „a" Determinante umfasst, in welcher es eine Insertion von zwei Aminosäuren an Position 122 der HBsAg-Sequenz gibt, worin die beiden Aminosäuren N und T sind, für einen Zeitraum und unter Bedingungen, die ausreichend sind, um die Bildung von Antikörper/Antigen-Komplexen zu erlauben; und b.) Detektieren der Komplexe, die den Antikörper enthalten.
Ein Verfahren zur Detektion von HBV-Antikörpern in einer Testprobe, von der vermutet wird, dass sie die Antikörper enthält, wobei das Verfahren folgendes umfasst: a.) In Kontakt bringen der Testprobe mit einem Sonden-Polypeptid, worin das Polypeptid ein Mutanten-HBV-Epitop enthält und worin das HBV-Antigen eine modifizierte „a" Determinante umfasst, in welcher es eine Insertion von zwei Aminosäuren an Position 122 der HBsAg-Sequenz gibt, für einen Zeitraum und unter Bedingungen, die ausreichend sind, um die Bildung von Antigen/Antikörper-Komplexen zu erlauben; und b.) Detektieren der Komplexe, welche das Sonden-Polypeptid enthalten, worin die beiden Aminosäuren an Position 122 N und T sind.
Ein Impfstoff zur Behandlung von Mutanten-HBV-Infektion, der eine pharmakologisch wirksame Dosis eines immunogenen Mutanten-HBV-Polypeptids umfasst, dass ein HBV-Epitop enthält, und worin das Mutanten-HBV-Epitop eine modifizierte „a" Determinante umfasst, in welcher es eine Insertion von zwei Aminosäuren an Position 122 der HBsAg-Sequenz gibt, in einem pharmazeutisch verträglichen Bindemittel und worin die beiden Aminosäuren, die an Position 122 eingefügt sind, N und T sind.
Ein Impfstoff zur Behandlung von Mutanten-HBV-Infektion, der ein inaktiviertes oder abgeschwächtes Mutanten-HBV in einer pharmakologisch wirksamen Dosierung in einem pharmakologisch verträglichen Bindemittel umfasst, und worin das Mutanten-HBV eine modifizierte „a" Determinante umfasst, in welcher es eine Insertion von zwei Aminosäuren an Position 122 der HBsAg-Sequenz gibt, worin die beiden Aminosäuren N und T sind.
Eine auf Gewebekultur gezüchtete Zelle, die mit Mutanten-HBV infiziert ist, worin das Mutanten-HBV eine modifizierte „a" Determinante umfasst, in welcher es eine Insertion von zwei Aminosäuren an Position 122 der HBsAg-Sequenz gibt, worin die beiden Aminosäuren N und T sind.
Die Verwendung eines isolierten immunogenen Polypeptids, das ein Mutanten-HBV-Epitop enthält, das eine modifizierte „a" Determinante umfasst, in welcher es eine Insertion von zwei Aminosäuren an Position 122 der HBsAg-Sequenz gibt, worin die beiden Aminosäuren, die an Position 122 eingefügt sind, N und T sind, zur Herstellung eines Impfstoffes zur Verhütung einer Mutanten-HBV-Infektion.