DE69520428T2

DE69520428T2 - Verfahren zur verbesserung der wirksamheit eines biologischen aufschluss

Info

Publication number: DE69520428T2
Application number: DE69520428T
Authority: DE
Inventors: Masood Akhtar
Original assignee: Wisconsin Alumni Research Foundation
Current assignee: Wisconsin Alumni Research Foundation
Priority date: 1994-08-11
Filing date: 1995-07-21
Publication date: 2001-06-28
Anticipated expiration: 2015-07-22
Also published as: EP0754257A1; WO1996005362A1; EP0754257B1; AU3234195A; DE69520428D1; US5620564A; ZA956584B; EP0754257A4; US5750005A; ATE199951T1

Description

Gebiet der Erfindung

Allgemein ist das Gebiet der vorliegenden Erfindung der biologische Aufschluß von Holz. Insbesondere ist das Gebiet der vorliegenden Erfindung der biologische Aufschluß von Holz mit Ceriporiopsis subvermispora und einem Nährstoffhilfsmittel.

Hintergrund

Bei der Herstellung von Papier aus Holz wird das Holz zunächst auf einen Übergangszustand reduziert, indem Holzfasern von ihrer natürlichen Umgebung getrennt und in eine Pulpe überführt werden, eine viskose flüssige Suspension. Verschiedene Verfahren werden zur Erzeugung von Pulpe aus verschiedenen Holzarten verwendet. Das einfachste dieser Verfahren ist das Ganzstoff- Mahlverfahren (refiner mechanical pulping method), bei dem das eingesetzte Holz einfach in Wasser durch ein mechanisches Mahlverfahren gemahlen oder verrieben wird, bis die Fasern in einem definierten Zustand voneinander gelöst sind. Andere Aufschlußverfahren schließen einen thermo-mechanischen Aufschluß (thermo-mechanical pulping), eine chemische Behandlung in Kombination mit einem thermo-mechanischen Aufschluß, einen chemischmechanischen Aufschluß und einen chemischen Aufschluß ein, Sulfat- (Kraft-) oder Sulfidverfahren zum Aufschluß von Holz. Das allgemeine Konzept sämtlicher dieser Verfahren zur Erzeugung von Pulpe aus Holz ist es, die Holzfasern in einem gewünschten Ausmaß der Freiheit von der komplexen Matrix, in die sie in dem natürlichen Holz eingebettet sind, herauszulösen.
Von den verschiedenen Bestandteilen von Holz sind Zellulosepolymere die am weitesten verbreiteten und das vorherrschend zur Beibehaltung in Pulpe für die Papiererzeugung gewünschte Molekül. Das am zweithäufigsten verbreitete Polymer in Holz, welches der am wenigsten wünschenswerte Bestandteil in der Pulpe ist, ist Lignin. Lignin ist ein komplexes Makromolekül aromatischer Einheiten mit mehreren unterschiedlichen Arten von Verknüpfungen zwischen einzelnen Einheiten. Bei natürlichem Holz schützt Lignin physikalisch die Zellulosepolysaccharide in Komplexen, die als Lignozellulosen bekannt sind. Beim chemischen Aufschlußverfahren wird Lignin entfernt. Im chemischmechanischen Verfahren wird Lignin zum Freisetzen der Zellulose oder zur Erleichterung der mechanischen Freisetzung der Zellulose zerstört.
Biologische Systeme können zur Unterstützung des Holzaufschlusses verwendet werden. Ein wünschenswertes biologisches System würde Zellulosefasern aus der Ligninmatrix durch Ausnutzen des Vorteils der natürlichen Fähigkeiten eines Organismus freisetzen. Die Forschung auf diesem Gebiet hat sich auf Weißfäulepilze konzentriert, die so genannt sind, weil die charakteristische Erscheinung von infiziertem Holz eine blasse Farbe ist. Diese Farbe ist das Ergebnis der Verarmung an Lignin in dem Holz, wobei das Lignin durch die Pilze zersetzt oder modifiziert wurde. Weil Weißfäulepilze bevorzugt Lignin zu zersetzen oder modifizieren scheinen, sind diese eine logische Wahl zur biologischen Behandlung zum Aufschluß von Holz. Ein Aufschluß mit diesem Verfahren wird als "Bioaufschluß" bezeichnet.
Verschiedene Versuche zur Erzeugung von Bioaufschlußsystemen unter Verwendung von Weißfäulepilzen auf einer Vielzahl von Holzfasern sind berichtet worden. Der am häufigsten verwendete Pilz ist der Weißfäulepilz Phanerochaete chrysosporium, auch als Sporotrichum pulverulentum bezeichnet. Andere Pilze, die zuvor in derartigen Verfahren verwendet wurden, schließen Pilze der Gattung Polyporus und Phlebia ein. Im Stand der Technik ist die Tatsache allgemein bekannt, daß Versuche zur Verwendung von Mikroorganismen, wie Weißfäulepilze, als Teil eines Verfahrens zur Behandlung von Holz in Kombination mit einem Schritt eines entweder mechanischen oder thermomechanischen Aufschlusses von Zellulosefasern unternommen worden sind.
Ein weiteres Beispiel ist US-Patent Nr. 3,962,033, das auf den Bioaufschluß von Zellulose unter Verwendung von Weißfäulepilzen gerichtet ist. Die verwendeten Pilze schlossen beides ein, natürlich vorkommende Kulturen eines Wildtypusstammes und hergestellte potente Stämme, welchen Zellulase fehlte, um so die Menge der durch den Organismus abgebauten Zellulose herabzusetzen. Verschiedene Arten von Holz wurden mit den Pilzen zersetzt. Dieses Holz wurde dann als Aufgabematerial für ein thermo-chemisches oder thermomechanisches Aufschlußverfahren verwendet. Dieses Patent offenbart verschiedene Verfahren zur Herstellung einer Zellulosepulpe durch Verringerung von Lignin, während die Zellulose zersetzende Wirkung der von diesen Organismen erzeugten Enzyme herabgesetzt wurden, um die Zelluloseausbeute zu erhalten. Mit dem Erfinder dieses Patents arbeitende Gruppen besitzen mehrere Publikationen, die die Verwendung von Pilzen für einen biomechanischen Aufschluß betreffen, zum Beispiel Anders und Erikkson, Svensk Papperstidning, 18: 641-2 (1975), Erikkson und Vallander, Svensk Papperstidning, 6:85:33- 38 (1982).
US-Patent Nr. 5,055,159 offenbart einen Bioaufschluß mit Ceriporiopsis subvermispora. Ein biomechanischer Aufschluß von beidem, Hartholz- und Weichholzschnitzeln, wurde mit diesem Weißfäulepilz demonstriert. Während dieses Verfahrens in einem Labormaßstab spart eine Pilzvorbehandlung von beiden, Hartholz- und Weichholzarten, wesentliche Mengen der elektrischen Energie während der Aufarbeitung, verbessert die Papierfestigkeit und reduziert die Umweltbelastung des Aufschlusses (Akhtar, et al., "Biomechanical pulping of loblolly pine with different strains of the white-rot fungus Ceriporiopsis subvermispora", Tappi J. 75: 105-109, 1992; Akhtar, et al., "Biomechanical pulping of loblolly pine chips with selcted white-rot fungi", Holzforschung 47: 36-40, 1993; Akhtar, et al., "Biomechanical pulping of aspen wood chips with three strains of Ceriporiopsis subvermispora", Holzforschung 48: 199-202, 1994; Kirk et al., "Biopulping: A Glimpse of the Future?", Res. Re. FPL-RP-523, Madison, Wisconsin, S. 74 ff., 1993). Diese Ergebnisse zeigen die technische Durchführbarkeit eines Bioaufschlusses.
Einer der Schlüsselfaktoren, der die kommerzielle und wirtschaftliche Durchführbarkeit eines Bioaufschlusses bestimmt, sind die Kosten der Pilzimpfung und der damit im Zusammenhang stehenden Frage der Kulturzeit des Organismus in dem Holz. Wirtschaftliche Überlegungen legen einen bestimmten Zeitrahmen auf die Zeitdauer auf, der als Quellzeit bezeichnet wird, der für die Verbreitung des Pilzes für den Bioaufschluß in dem Holz angesetzt werden kann. Eine Lösung des Problems des Erreichens einer ausreichenden Pilzwirkung vor dem Aufschluß ist einfach die Zugabe von mehr Pilzimpfkultur. Das Verfahren wird jedoch schnell von den Kosten untragbar, wenn eine exzessive Menge an Pilzbiomasse erforderlich ist. Daher wird auf dem Fachgebiet ein Verfahren zur Herabsetzung der erforderlichen Menge an Pilzimpfmaterial für einen erfolgreichen Bioaufschluß in einem zur kommerziellen Anwendung geeigneten Zeitrahmen benötigt.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer Holzpulpe. Das Verfahren umfaßt das Impfen von Holzschnitzeln mit einem Zellmaterial von Ceriporiopsis subvermispora und Getreideaufgußflüssigkeit. Die Holzschnitzel werden entweder vor oder nach dem Impfen in einen Bioreaktor eingeführt und unter Bedingungen inkubiert, die eine Verbreitung des Pilzes begünstigen. Nach einer ausreichenden Zeitdauer modifiziert der Pilz eine bedeutende Menge von natürlicherweise in den Holzschnitzeln vorliegendem Lignin. Die Holzschnitzel werden dann aufgeschlossen.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird Papier aus den aufgeschlossenen Holzschnitzeln hergestellt.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden zwischen 0,5% und 3% Getreideaufgußflüssigkeit (auf einer Gewichtsbasis als Anteil der Holzschnitzelmischung) verwendet.
Es ist ein Vorteil der vorliegenden Erfindung, daß Holz unter Verwendung einer geringeren Menge eines Pilzzellmaterials einem Bioaufschluß unterworfen wird. Bevorzugt ist die Menge an Zellmaterial weniger als 0,3% auf einer Trockengewichtsbasis der gesamten, geimpften Holzschnitzelmischung. Stärker bevorzugt ist die Menge des Zellmaterials weniger als 0,1% auf einer Trockengewichtsbasis. Am stärksten bevorzugt ist die Menge des Zellmaterials weniger als 0,0005% auf einer Trockengewichtsbasis.
Es ist ein Vorteil der vorliegenden Erfindung, daß Getreideaufgußflüssigkeit als Nährmittelhilfsstoff in einem Bioaufschlußverfahren verwendet werden kann.
Es ist ein Merkmal der vorliegenden Erfindung, daß eine dramatische Herabsetzung in der Menge des zum erfolgreichen Bioaufschlusses von Holz erforderlichen Impfguts ermöglicht wird.
Andere Merkmale, Vorteile und Aufgaben werden auf Durchsicht der Beschreibung, Ansprüche und Figur offensichtlich.

Beschreibung der Figur

Fig. 1 erläutert den Bioreaktor im Labormaßstab, der bei den erläuternden Beispielen der vorliegenden Erfindung verwendet wurde.

Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung ist ein Verfahren des Bioaufschlusses unter Verwendung einer Kombination von Ceriporiopsis subvermispora und Getreideaufgußflüssigkeit, um Holzschnitzel zu beimpfen. Die Verwendung von Getreideaufgußflüssigkeit, wie unten beschrieben, ermöglicht es einem, die Menge an Pilzimpfgut (berechnet auf einer Trockengewichtsbasis als Anteil der Menge der Holzschnitzel) von 0,3% bis 0,0005% dramatisch herabzusetzen, während eine vergleichbare Effizienz erzielt wird. Diese 600-fache Verringerung in der Menge an Impfgut ist wichtig, damit die Bioaufschlußtechnologie ökonomisch durchführbar gemacht wird.

1. Holzvorbereitung

Das Verfahren beginnt mit Holzschnitzeln. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung wurde mit und ist besonders nützlich für den Bioaufschluß von Weichhölzern, wie amerikanischen Southern Pine Spezies. Eine bevorzugte Spezies zur Verwendung in dem Bioaufschlußverfahren der vorliegenden Erfindung ist Loblolly pine, Pinus faeda, welches eine verbreitete Faserholzspezies ist. Die folgenden Beispiele richten sich auf die Verwendung von Loblolly pine. Die folgenden Beispiele offenbaren jedoch den Erfolg der vorliegenden Erfindung mit beidem, Nadelholz- und Pappelschnitzeln. Beispiel 5, unten, offenbart den Erfolg von Pappelschnitzeln in der vorliegenden Erfindung. Die vorliegende Erfindung besitzt Anwendbarkeit für andere Weichholzspezies und auch für Hartholzspezies. Die Wirksamkeit eines Bioaufschlusses mit beidem, Weichholz und Hartholz, ist auf dem Fachgebiet demonstriert worden.
Das Holz wird mittels herkömmlicher Technologie in Schnitzel von bevorzugter Schnitzelgröße von irgendwo zwischen 1/8 und 3/4 Zoll umgewandelt.
Weil Bedingungen hoher Feuchtigkeit während des Fermentationsprozesses erwünscht sind, ist ein relativ hoher Feuchtigkeitsgehalt der Schnitzel vor der Fermentation mit dem Bioaufschlußpilz am wünschenswertesten. Der Schnitzelfeuchtigkeitsgehalt ist daher vor dem Beimpfen bevorzugt bei dem Fasersättigungspunkt oder größer. Ein bevorzugter Feuchtigkeitsgehalt wäre ungefähr 55-65% des gesamten Holzes. Diese Messung bedeutet, daß von dem Gesamtgewicht des feuchten Holzes ungefähr 55-65% Feuchtigkeit ist.

2. Pilzapplikation

Getrennt von den Schnitzeln muß eine Saatzellmasse der Pilzkultur zur Verwendung während des Bioaufschlußverfahrens bereitgehalten werden. Die bevorzugte Kultur ist jeder verwendbare Stamm der Pilzspezies Ceriporiopsis subvermispora, wobei ein bevorzugter Stamm CZ-3 ist, der erhältlich ist vom Center for Forest Mycology Research of the Forest Products Laboratory, U.S. Department of Agriculture. Fast sämtliche anderen Stämme von Ceriporiopsis subvermispora sind jedoch auch für die vorliegende Erfindung geeignet. Andere bevorzugte Stämme sind die haploiden Ceriporiopsis subvermispora-Stämme FP-105752 SS-4, L-14807 SS-1, L-14807 SS-3, L-14807 SS-S und L-14807 SS-10, die auch erhältlich sind vom Center for Forest Mycology Research, SUDA Forest Products Laboratory, Madison, Wisconsin. (Unsere nachfolgenden Experimente zeigen, daß zwei der haploiden Stämme eine größere Energieeinsparung und Festigkeitsverbesserungen ergaben, als der diploide CZ-3 Stamm.) Ceriporiopsis subvermispora-Stämme sind verbreitet in der Umgebung und können leicht aus der Natur isoliert werden.
Stämme von Ceriporiopsis subvermispora können durch herkömmliche Pilzkulturverfahren kultiviert werden, am bequemsten durch Zucht auf Kartoffeldextrose Agarplatten. Lagerschrägflächen können routinemäßig von einer Originalkultur zur Routineverwendung hergestellt und bis zur Verwendung tiefgefroren werden.
Die Pilzkultur kann auf verschiedenen Wegen auf das Holz aufgebracht werden. Zum Beispiel kann zum Beimpfen bedeutender Volumina an Holzschnitzeln ein Startzellmaterial hergestellt werden. Das Startzellmaterial kann einfach ein geringeres Volumen an Schnitzeln sein, das von dem Pilzmycelium durchdrungen ist, so daß das Startzellmaterial bequem in ein größeres Volumen von Schnitzeln zur Beimpfung der größeren Menge an Schnitzeln gemischt werden kann. Bei der Starterzellmaterialkultur wird ein relativ hoher Feuchtigkeitsgehalt in dem Holz, wenigstens 55% - 65%, beibehalten, um eine bessere Kolonisierung der Schnitzel mit den Pilzmycelien sicherzustellen.
Bei dem nachfolgend beschriebenen Verfahren im Labormaßstab wird ein flüssiges Impfmaterial durch Kombination von Kartoffeldextroselösung und Hefeextrakt mit destilliertem Wasser und sterilisieren der kombinierten Mischung hergestellt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur werden die Gefäße mit Stücken beimpft, die von einer zehn Tage alten Kartoffeldextrose-Agarplatte geschnitten wurden, welche aus einer Arbeitskultur des Pilzes hergestellt worden war. Diese Kartoffeldextrose-Agarplatten waren bei 27ºC und 65% relativer Feuchtigkeit zehn Tage inkubiert worden. Die beimpften Gefäße wurden dann bei 27ºC bei 65% relativer Feuchtigkeit für zehn weitere Tage inkubiert.
Die Flaschen wurden dekantiert und es wurde mit sterilem, destilliertem Wasser gewaschen, um überschüssiges Medium von der Pilzbiomasse zu entfernen. Die Pilzbiomasse wurde dann in destilliertes Wasser gegeben und in einer elektrischen Mischvorrichtung zweimal für fünf Sekunden bei hoher Geschwindigkeit vermischt. Mehr destilliertes Wasser wird zu der Suspension zugegeben. Ein Anteil der Suspension wird zur Bestimmung des Trockengewichts pro ml getrocknet. Unterschiedliche Verdünnungen des Pilzimpfmaterials können dann von dieser Pilzlagerkultur hergestellt werden, um Impfmaterialien unterschiedlicher Stärken zu erhalten.
Die Schnitzel werden mit dem flüssigen Impfmaterial vermischt und die Mischung wird für einen Zeitraum von bevorzugt zwischen 2 und 4 Wochen inkubiert. Natürlich kann es erforderlich sein, daß die Inkubationsdauer zum Erfüllen kommerzieller Bedingungen verändert werden muß, wenn eine Beimpfung im kommerziellen Maßstab geplant wird.
Alternativ kann das Pilzimpfmaterial auf anderen Wegen auf die Holzschnitzel aufgebracht werden, wie als flüssiges Spray oder als fester Impfstoff.
Wenn die Applikationsrate des Pilzimpfmaterials hier diskutiert wird, wird das Impfmaterial auf einer Trockengewichtsbasis gemessen. Diese Messung bezeichnet den Prozentsatz der Gesamttrockenmasse der geimpften Holzschnitzel, die von dem Pilzimpfmaterial gebildet ist. Zum Beispiel bedeutet ein 0,3% Impfmaterial auf Trockengewichtsbasis, daß in 100 g Trockengewicht der Holzschnitzel plus Impfmaterial 0,3% (0,3 g) der Trockenmasse Pilz ist.
Das Pilzimpfmaterial der vorliegenden Erfindung ist bevorzugt weniger als 0,3% auf einer Trockengewichtsbasis. Stärker bevorzugt ist das Impfmaterial weniger als 0,1% auf einer Trockengewichtsbasis. Es ist ebenfalls gefunden worden, daß das Pilzimpfmaterial der vorliegenden Erfindung gleich oder sogar weniger als 0,0005% auf einer Trockengewichtsbasis sein kann.

3. Zugabe von Getreideaufgußflüssiakeit

Die vorliegende Erfindung erfordert die Zugabe von Getreideaufgußflüssigkeit zu dem oben beschriebenen Bioaufschlußverfahren. Bevorzugt wird eine Menge der Getreideaufgußflüssigkeit zu dem Pilzimpfmaterial gegeben, bevor das Impfmaterial den Holzschnitzeln zugesetzt wird. In den nachfolgenden Beispielen wird Getreideaufgußflüssigkeit zu der Impfkultur gegeben und beides, Impfmaterial und Getreideaufgußflüssigkeit, wird unmittelbar den Holzschnitzeln zugesetzt. Die Getreideaufgußflüssigkeit kann jedoch den Holzschnitzeln getrennt zugesetzt werden, wobei dies vor oder nach der Pilzimpfung erfolgen kann. Außerdem ist berücksichtigt, daß es von Vorteil sein kann, die Getreideaufgußflüssigkeit und die Pilzimpfkultur für einen Zeitraum vor dem Aufbringen auf die Holzschnitzel zu inkubieren.
Die Getreideaufgußflüssigkeit der vorliegenden Erfindung besitzt Fähigkeiten der Förderung des Wachstums der Pilzbiomasse auf eine Weise, die einen erfolgreichen Bioaufschluß mit einer beschränkten Menge an Pilzimpfmaterial erlaubt. Besonders die Getreideaufgußflüssigkeit der vorliegenden Erfindung erlaubt, daß wenigstens 100-fach weniger Pilzimpfmaterial für äquivalente Verweildauern zum Erreichen äquivalenter Ergebnisse verwendet werden können. Dieses Erfordernis bedeutet, daß eine Getreideaufgußflüssigkeit die geeignete Zusammensetzung besitzen muß, um der Pilzbiomasse eine signifikante und dramatische Zunahme seiner Masse relativ zu einer ohne Getreideaufgußflüssigkeit wachsenden Kultur zu erlauben.
Bevorzugt erlaubt die Getreideaufgußflüssigkeit der vorliegenden Erfindung die Verwendung einer Pilzimpfkultur von weniger als 0,1% auf einer Trockengewichtsbasis. Am stärksten bevorzugt erlaubt die Getreideaufgußflüssigkeit der vorliegenden Erfindung die Verwendung einer Pilzimpfkultur von weniger oder gleich 0,0005%.
Als Vergleich werden die nachfolgenden Beispiele 1 und 2 demonstrieren, daß eine 0,3% Pilzimpfkultur (auf einer Trockengewichtsbasis) ohne Getreideaufgußflüssigkeit für Energieeinsparungen von 19% nach einer zweiwöchigen Inkubation oder Verweildauer erforderlich ist. Wenn eine 0,001% Impfkultur (auf einer Trockengewichtsbasis) mit 1% Getreideaufgußflüssigkeit kombiniert wird (gemessen als Gewicht einer halbfesten Flüssigkeit als Prozentsatz des Trockengewichts der Holzschnitzel) wird eine identische Energieeinsparung von 19% nach einer zweiwöchigen Inkubation realisiert. Die zum Erzielen äquivalenter Energieeinsparungen benötigte Menge an Pilzimpfkulturen wird daher durch die Verwendung der Getreideaufgußflüssigkeit um wenigstens das 300- fache verringert. Tabelle 2, nachfolgend bei Beispiel 2, zeigt, daß Impfkulturlevel von 0,0005% (auf einer Trockengewichtsbasis) verwendet werden können und somit signifikante wirtschaftliche Einsparungen ermöglichen.
Die Getreideaufgußflüssigkeit wird als Prozent auf einer Flüssig- zu Trockengewichtsbasis ausgedrückt. Eine 1% Getreideaufgußflüssigkeitslösung repräsentiert daher die Zugabe von 1 g einer viskosen Flüssigkeit von Getreideaufgußflüssigkeit zu 100 g Trockengewicht des Holzes. Die Messung von alternativen Hilfsstoffen, wie Hefeextrakt und Molasse-Additive, sind als Prozent Trokkengewicht von Trockengewicht ausgedrückt. Da die Getreideaufgußflüssigkeit zu ungefähr 50% aus Feststoffen besteht, können die Zugabelevel um ungefähr 50% verringert werden, um die Trockengewichtslevel für dieses Additiv zu erhalten.
Es ist gefunden worden, daß Getreideaufgußflüssigkeit die notwendige Kombination von Nährstoffen enthält, um der Pilzbiomasse in einer Bioaufschlußanwendung eine dramatische Zunahme zu erlauben. Die Getreideaufgußflüssigkeit kann sterilisierte oder im Autoclaven behandelte Getreideaufgußflüssigkeit sein, wobei aber eine Sterilisierung nicht erforderlich ist.
Getreideaufgußflüssigkeit ist ein Nebenprodukt der Produktion von Getreidestärke und, als Nebenprodukt, ist es relativ ökonomisch. Getreideaufgußflüssigkeit ist ausgewählt worden, weil es relativ billig ist ($ 55/t halbfester Flüssigkeit im Jahr 1994) und ist kommerziell erhältlich von Corn Products, einer Tochter von CPC International Inc., Sammit-Argo, Illinois.
Getreideaufgußflüssigkeit ist ein kondensiertes, fermentiertes Getreideextrakt, welches beim Getreidenaßmahlverfahren produziert wird, wenn das trockene Getreide in einer warmen Schwefelsäurelösung eingeweicht (aufgegossen) wird. Getreideaufgußflüssigkeit wird kommerziell von verschiedenen Firmen als viskose, hellbraune Flüssigkeit verkauft. Während des Verfahrens werden die löslichen Kornbestandteile freigesetzt und unterlaufen eine milde Milchsäurefermentierung durch natürlich vorkommende Mikroorganismen. Derzeit wird Getreideaufgußflüssigkeit als Nahrungsergänzung für Wiederkäuer verwendet, unidentifizierte Nährstoffquelle für Geflügel und Proteinquelle und Bidingmittel für Rinderweidenblöcke.
Die Zusammensetzung von Getreideaufgußflüssigkeit variiert leicht. Eine typische Zusammensetzung ist UNGEFÄHR wie folgt:
Trockensubstanz (%) 50,7
pH 3,9
Protein (% Trockenbasis) 40,8
Milchsäure (% Trockenbasis) 16,0
Reduzierender Zucker (% Trockenbasis) 12,8
Die nachfolgenden Beispiele demonstrieren die Verwendung einer von der Corn Products Abteilung von CPC International bezogenen Getreideaufgußflüssigkeit mit der oben genannten Zusammensetzung. In anderen Experimenten haben wir jedoch Getreideaufgußflüssigkeiten verwendet, die aus anderen Chargen stammen und unsere Ergebnisse waren ähnlich zu denen, die mit der oben bezeichneten Charge erzielt wurden. Allgemein wird in einer bevorzugten Getreideaufgußflüssigkeit die Trockensubstanz von ungefähr 50% - 55% variieren, der pH wird von ungefähr 3,9-4,2 variieren, der Proteingehalt wird von ungefähr 20% - 50% variieren, der Milchsäureprozentsatz wird von ungefähr 15% - 20% variieren und die reduzierenden Zucker werden von ungefähr 5% - 15% variieren.
Hefeextrakt und Molassen sind alternative Pilznährstoffe, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren verglichen werden. Hefeextrakt ist kommerziell aus mehreren kommerziellen Quellen erhältlich, eine davon ist Universal Foods. Hefeextrakt wird als Pulver geliefert, das aus einem wasserlöslichen Brauereihefeextrakt sprühgetrocknet wird, wobei der Brauereihefeextrakt durch die autolytische Wirkung von Hefeproteasen erzeugt wird. Allgemein wird Hefeextrakt in pulvriger, trockener Form verkauft. Er enthält gewöhnlich über 40% Protein sowie freie Aminosäuren, Vitamine und Mineralien.
Geeignete Molassen sind jegliche kommerziell oder privat erhältliche Molassen. Molassen werden als rückständige Zuckersirupe verstanden, von denen kein kristalliner Zucker auf einfachen Wegen erhalten werden kann. Bevorzugt werden zwischen 0,5% und 3,0% (auf einer Gewicht zu Gewicht Basis) als Nährstoffshilfsmittel verwendet. Auf einer Kostenbasis ist es vorteilhaft, so wenig Nährstoff wie möglich zu verwenden. Diese Einsparungen sind jedoch gegen eine Zunahme an Pilzbiomasse abzuwiegen, wenn eine erhöhte Menge an Nährstoffhilfsmittel verwendet wird. Wir nehmen an, daß ein Nährstoffhilfsmittel zwischen 0,25% und 6%, auf einer Gewicht zu Gewicht Basis, erfolgreich ist.

4. Inkubieren von Holzschnitzeln

Die tatsächliche Inkubation der Holzschnitzel für den Pilzabbau kann nun beginnen. Holzschnitzel, die mit beidem kombiniert sind, dem Pilzimpfmaterial und der Getreideaufgußflüssigkeit, werden in den Fermentationsreaktor gegeben (Bioreaktor). Der Bioreaktor kann ein beliebiger von einer Anzahl unterschiedlicher Arten sein, der ein festes Medium und Fermentationskulturen enthalten kann. Obwohl gefunden wurde, daß rotierende Trommelbioreaktoren die Fermentationsreaktion zu einem ausreichenden Grad beherbergen, ist ebenso vorteilhafterweise gefunden worden, daß stationäre oder statische Reaktoren im Rahmen der vorliegenden Erfindung ausreichend gut arbeiten, um bevorzugt zu sein. Es ist ausschließlich gefordert, daß der stationäre oder Festphasenreaktor eine ausreichende Belüftung besitzt, um so einen angemessenen Sauerstofffluß zum Pilz und eine signifikante Entfernung von Kohlendioxid von demselben sicherzustellen. Tatsächlich ist es ein Vorteil des hierin beschriebenen Verfahrens, daß ein stationärer und sogar rudimentärer Reaktor ausreicht. Da die Erfordernisse einfach ein gewisser Belüftungsgrad, Feuchtigkeit und Temperatursteuerung sind, ist in Betracht gezogen, daß einfache Gruben oder Anhäufungen von Schnitzeln auf dem Boden verwendet werden können, wenn eine Belüftung vorgesehen wird, wie durch eingeführte Rohre, und die Feuchtigkeit kontrolliert wird, falls notwendig, entweder durch Einschluß oder durch Einbringen von Feuchtigkeit.
Ein besonders geeigneter Reaktor für den Labormaßstab ist in Fig. 1 beschrieben. Dieser Bioreaktor, bezeichnet als der Air-Lift Bioreaktor, wurde unter Verwendung eines Polypropyleneimers 20 als Fermentations- oder Reaktorgefäß hergestellt. Das obere Ende des Gefäßes 20 wurde mit einem Deckel 22 verschlossen, der in die Atmosphäre mittels eines Luftauslaßrohres 24 belüftet war. Oberhalb des Bodens des Reaktors 20 ist ein perforiertes Polypropylenbrett angeordnet, welches eine massive Scheibe eines Polypropylenmaterials ist, die mit Luftlöchern versehen war. Das perforierte Brett 26 wurde mittels eines Ständers 28 in einer bestimmten Höhe gehalten.
Ein Luftfilter 30 ist vorgesehen, der mittels Luftröhre 32 mit der Basis des Bioreaktors 20 verbunden ist. Der Luftfilter 30 erhält seine Luftzufuhr von einem Verteilerrohr 35, das wiederum über eine Luftleitung 36 versorgt wird, welche mit dem Auslaß eines Rotameters 38 verbunden ist. Das Rotameter 38 erhält Luft von einer Luftleitung 40, die mit einem Befeuchter 42 verbunden ist, welcher hereinkommende Luft durch deionisiertes Wasser in ein Gefäß leitet, um die relevante Feuchtigkeit einzustellen. Die eingeführte Luft wurde über eine Rohrleitung 44 von einer regulierten Luftversorgung zugeführt.
Der Air-Lift Reaktor 20 stellt somit einen Konstant-Temperaturreaktor bereit, durch den eine konstante Belüftung in einer sterilen Umgebung vorgesehen werden konnte. Die sterile, befeuchtete Luft passierte konstant die Schnitzelmasse. Zur Beibehaltung einer konstanten Temperatur konnte Wasser zur Erhöhung der Feuchtigkeit erwärmt werden und weitere Befeuchtungsstufen konnten wie erforderlich zugefügt werden. Luft wurde von dem Verteilerrohr einzelnen Reaktoren zugeleitet und durch einen 0,20 um Filter geleitet, bevor sie in den Reaktor eintrat, um eine Kontamination durch andere mikrobielle Agenzien zu vermeiden.
Nach dem Mischen der Impfkultur mit den Holzschnitzeln wurden die Schnitzel nachfolgend in den Bioreaktoren bei 27ºC plus oder minus 1ºC und bei 65 plus oder minus 5% relative Feuchtigkeit für 2 Wochen fermentiert. Parallele Ansätze wurden mit beiden, dem Festphasen- und dem Flüssigphasenstartimpfmaterial behandelt, gleichzeitig mit einer unbehandelten Kontrolle. Nach den Ernten wurden beide Ansätze von Schnitzeln in einem mechanischen Einscheibenrefiner mit 300 mm Durchmesser aufgearbeitet und Papier wurde aus der so erzeugten Pulpe gemacht.
Vor dem Herstellen der Pulpe wurde der Gewichtsverlust der Holzschnitzel gemessen, um ein Anzeichen des relativen Aufschlusses der Holzschnitzel durch die Pilzmycelien aus jeder der experimentellen Zubereitungen bereitzustellen.
Das Beimpfen mit der Startimpfkultur und der Getreideaufgußflüssigkeit erfolgte an den zu behandelnden Holzschnitzeln. Wie oben diskutiert, kann die Menge der zu den Schnitzeln gegeben Impfzellenstarterkultur variieren. Die Impfpilzkultur kann in flüssiger oder trockener Form vorliegen. Die Impfkultur und die Schnitzel werden dann in dem wie in Fig. 1 hergerichteten Bioreaktor gemischt. Die Bioreaktoren werden bevorzugt für 4 Wochen bei 27 ± 1ºC bei 65 ± 5% Feuchtigkeitsgehalt mit konstanter Belüftung mit feuchtigkeitsgesättigter Luft inkubiert.
Die beimpften Schnitzel werden dann während eines Zeitraums inkubiert, in dem die Pilzmycelien sämtliche Holzschnitzel durchdringen. Der am stärksten angestrebte Temperaturbereich hängt von den Pilzstämmen ab. Es ist gefunden worden, daß ein im Bereich von 22-32ºC gehaltener Bioreaktor mit einem Feuchtigkeitsgehalt im Holz von 55% - 65% plus oder minus 5% einen Grad der Myceliendurchdringung der Holzschnitzel erreicht, der in einem signifikanten und nützlichen Abbau der Schnitzel für Papierausschlußzwecke resultiert. Die Holzschnitzel werden bevorzugt kontinuierlich während der Inkubationszeit mit feuchtigkeitsgesättigter Luft belüftet, so daß das Holz einen konstanten Feuchtigkeitsgehalt von ungefähr 55% - 65% beibehält. Es ist am stärksten erwünscht, daß der pH der Schnitzelinkubationskultur besonders überwacht wird, so daß der pH innerhalb des Breitenbereiches von zwischen 3,0 und 6,0 verbleibt. Somit ist es nicht gefordert, daß der pH besonders gesteuert wird, sondern nur gelegentlich überwacht, so daß er innerhalb der für das Wachstum der Pilzkultur notwendigen physiologischen Grenzen verbleibt.

5. Verarbeitung der beimpften Schnitzel

Das biologisch abgebaute Holz wird dann aufgeschlossen. Viele Aufschlußmethoden sind für die vorliegende Erfindung geeignet, obwohl ein mechanischer Aufschluß bevorzugt ist.
In seiner einfachsten Form wird ein mechanisches Zerkleinerungsverfahren verwendet. Wasser wird zum Verdünnen zu den Schnitzeln gegeben und die Schnitzel werden durch einen mechanischen Refiner (Feinstzerkleinerer) in einer Anzahl von sequentiellen Durchläufen geleitet. Die Anzahl der Durchläufe der Schnitzel/Pulpemischung hängt von der gewünschten Freiheit der Fasern ab, die für die besondere Papieranwendung herzustellen ist. Die Freiheit ist ein willkürliches Maß der Entwässerung. Die Schnitzel-/Pulpemischung wird wiederholt durch den Refiner geführt, bis der gewünschte Grad der Freiheit erreicht ist. Die Freiheit kann somit periodisch überwacht werden, um die fortschreitende Veränderung der Pulpe in Richtung auf den für das Papier gewünschten Freiheitsgrad zu bestimmen. Die Holzpulpe kann zwischen den Durchläufen wie erforderlich entwässert werden. Loblolly pine, die für einen Zeitraum von 4 Wochen mit den oben beschriebenen Verfahren inkubiert wurde, erfordert zwischen 10 und 15 Durchläufe, um den Wert von 100 ml Canadian standard freeness in einem mechanischen Einscheibenrefiner mit einer Anfangseinstellung von 18 mils zu erreichen.
Die Gesamtenergieeffizienz des Verfahrens kann mit der eines ausschließlich mechanischen Verfahrens durch Aufschluß in derselben Vorrichtung von entweder unbehandelten Schnitzeln oder behandelten Schnitzeln bei gleichzeitiger Überwachung des Energieverbrauchs der Zerkleinerungsmühle selbst verglichen werden. Die behandelten Schnitzel erfordern signifikant weniger Energieeinleitung über den Refiner, um denselben Mahlgrad in den resultierenden Pulpen zu erzielen.
Die über dieses Verfahren hergestellten biomechanischen Pulpen können dann unter Verwendung von Standard Papierherstellungsverfahren zu Papier verarbeitet werden. Standardverfahren (wie von der Technical Association of the Pulp and Paper Industry, TAPPI, beschrieben), von denen bekannt ist, daß sie mit mechanisch zerkleinerten Pulpen arbeiten, arbeiten genau so gut mit biomechanisch zerkleinerten Pulpen der Art, wie sie durch das hierin beschriebene Verfahren erzeugt werden. Dementsprechend kann das Papier durch herkömmliche Verfahren gebildet werden.
Papier aus der biomechanisch erzeugten Pulpe kann in Qualität, Festigkeit und Textur mit dem durch einfachen mechanischen Aufschluß erzeugtes vergleichen werden. Die biomechanisch erzeugte Pulpe besitzt eine Eigenschaft einer signifikant erhöhten Festigkeit. Somit ist offensichtlich, daß das erfindungsgemäße Verfahren nicht die Qualität oder Festigkeit des Papiers opfert, um hocherwünschte Energieeinsparungen zu realisieren, sondern, tatsächlich, in einer einzigartigen Kombination von beidem resultiert, einer signifikanten Reduktion beim Energieverbrauch beim Verfahren und einer Erhöhung der Festigkeitseigenschaften des resultierenden Papiers.
Die Einzelheiten des erfindungsgemäßen Verfahrens werden aus den folgenden Beispielen offensichtlicher, die den Einsatz des erfindungsgemäßen Verfahrens im Labormaßstab und die damit erzielten Ergebnisse beschreiben. Es ist zu verstehen, daß die Maßstabsvergrößerung von einem Labormaßstab auf einen technischen Betriebsmaßstab des unten beschriebenen Aufschlußverfahrens gewisse Veränderungen der Parameter oder Einzelheiten der hierin beschriebenen Verfahrensschritte beinhalten kann. Es ist zu verstehen, daß die unten beschriebenen Beispiele, während sie die Wirksamkeit und Praktikabilität des erfindungsgemäßen Verfahrens demonstrieren, nicht für einen kommerziellen Maßstab optimiert worden sind.
Dennoch machen die vorgestellten experimentellen Nachweise klar, daß das Verfahren wirksam und leistungsfähig ist und die Erzeugung von Verfahren im kommerziellen Maßstab zur Implementierung des hierin allgemein beschriebenen Verfahrens ermöglicht.

Beispiele

Beispiel 1

Aufgabe: Die Bestimmung des optimalen Pilzimpfkulturlevels zum Einsparen elektrischer Energie und zur Verbesserung der Papierfestigkeitseigenschaften.
Holzschnitzel: Frisch geschnittene Stämme von Faserholzgröße von Loblolly pine (Pinus taeda L.) wurden von Talladega National Forest in Talladega, Alabama, bezogen. Die Stämme wurden entrindet und auf eine durchschnittliche Größe von 16 mm zerkleinert. Die Schnitzel wurden in Plastiksäcke eingetütet und bis zur Verwendung eingefroren, um das Wachstum kontaminierender Mikroorganismen zu verhindern.
Pilze: Der Bioaufschluß-Pilz Ceriporiopsis subvermispora, Stamm CZ-3, wurde verwendet. Diese Kultur wurde vom Center for Forest Mycology Research of the USDA Forest Products Laboratory, Madison, Wisconsin, bezogen. Die Kultur wurde kontinuierlich in Cerealienkultur und Kartoffeldextrose- Agarschrägplatten gehalten. Arbeitskulturen wurden wie benötigt aus den Lagerkulturen hergestellt und bis zur Verwendung gekühlt. Kartoffeldextrose- Agarplattenkulturen wurden von einer Arbeitskultur beimpft und bei 27ºC und 65% relativer Feuchtigkeit für 10 Tage inkubiert.
Bei der Herstellung eines flüssigen Impfmediums wurde eine Kartoffeldextrose- Nährlösung (50,4 g) und Hefeextrakt (15,28 g) zu 2100 ml destilliertem Wasser gegeben und gut gemischt. 300 ml dieses Mediums wurde in sieben 2800 ml Kolben gegossen. Jeder Kolben wurde für 20 Minuten bei 121ºC im Autoclaven behandelt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde jeder Kolben mit 30 Stücken beimpft, die mit einem Korkbohrer der Größe Nr. 9 aus einer 10 Tage alten Kartoffeldextrose-Agarplatte der Pilzkultur geschnitten worden waren. Die Kolben wurden dann bei 27ºC bei 65% relativer Feuchtigkeit für 10 Tage inkubiert. Vor der Verwendung wurden die Kolben dekantiert, die die Pilzbiomasse enthielten, und mit sterilem destilliertem Wasser gewaschen, um überschüssiges Medium von der Pilzbiomasse zu entfernen. Die Pilzbiomasse wurde dann in destilliertes Wasser gegeben und mit einem Waringmischer (VWR scientific) zweimal für 15 Sekunden, jedesmal bei hoher Geschwindigkeit, gemischt, wonach destilliertes Wasser zur Suspension gegeben wurde, um ein Gesamtvolumen von 700 ml herzustellen.
Ungefähr 100 g dieser Suspension lieferten 1,50 g Trockengewicht des Pilzes. Verschiedene Verdünnungen der Pilzimpfkultur wurden von der Pilzlagerlösung hergestellt, um 0,01%, 0,05%, 0,10%, 0,15% und 0,30% Impfkultur auf einer Trockengewichtsbasis zu erhalten, wobei die entsprechende Menge an Pilzimpfkultur mit sterilisiertem Wasser auf eine 100 ml Suspension verdünnt wurde.
Schnitzelzubereitung und Bioreaktorbeimpfung: Gefrorene Loblolly pine Schnitzel wurden aufgetaut und gründlich vermischt, um einheitliche Proben zu erhalten. Sechs Bioreaktoren mit stationärem Bett (Fig. 1), von denen jeder 1500 g Schnitzel enthielt (auf einer Trockengewichtsbasis), wurden für 90 Minuten bei 121ºC im Autoclaven behandelt und dann auf Raumtemperatur abgekühlt.
Diese Bioreaktoren wurden mit unterschiedlichen Mengen an Impfkultur wie oben erwähnt beimpft. Die gesamten 100 ml der Pilzkultur wurden als die Impfkultur verwendet. Ein nicht beimpfter Bioreaktor diente als Kontrolle. Ungefähr 55% Feuchtigkeit (Naßgewichtsbasis) wurde während der Fermentation in den Holzschnitzeln beibehalten. Nach Erhalt der Impfkulturen wurden die Bioreaktoren zum einheitlichen Vermischen kräftig geschüttelt.
Jeder Bioreaktor wurde verschlossen und bei 27ºC für 2 Wochen in einen Inkubator gegeben und mit einer spezifischen Belüftungsrate von 0,0227 liter/liter/min. belüftet. Bei der Ernte wurden die pilzbehandelten Schnitzel und die Kontrollschnitzel in einem mechanischen Atmosphärenscheibenrefiner von 300 mm Durchmesser zur Messung des Energieverbrauchs während des Zerkleinerns zerkleinert und die resultierende Pulpe wurde zu Papier verarbeitet und auf Festigkeitseigenschaften untersucht.
Resultate: Tabelle 1 beschreibt die Resultate. Die niedrigste Menge an Impfkultur (0,01% auf einer Trockengewichtsbasis) sparte nur 4% an elektrischer Energie während des Zerkleinerns und verbesserte nicht die Papierfestigkeit im Vergleich zu der Kontrolle. Die größte Menge an Impfkultur (0,30% auf einer Trockengewichtsbasis) sparte 19% an elektrischer Energie und verbesserte nur den Zugindex signifikant (28%) im Vergleich zu der Kontrolle.
Tabelle 1. Energieeinsparung und Festigkeitseigenschaften während des biomechanischen Aufschlusses von Loblolly pine Schnitzeln mit Ceriporiopsis subvermispora CZ-3 (2-wöchige Inkubation).
a Die Energieeinsparungen sind auf der Basis der unbehandelten Kontrollwerte berechnet
b Standardabweichung

Beispiel 2

Die obigen Resultate sind akzeptabel, aber die Menge an Impfkultur (0,3% auf einer Trockengewichtsbasis), die zum Erreichen der Resultate erforderlich ist, ist relativ hoch. Daher haben wir versucht, die Menge der Pilzimpfkultur auf ein Niveau der kommerziellen Anwendung (0,0005% auf einer Trockengewichtsbasis) mit der Verwendung von speziellen Nährstoffhilfsmitteln zu reduzieren, ohne Energieeinsparungen oder Festigkeitsverbesserungen zu opfern.

Aufgabe: Reduktion der Menge an Pilzimpfkultur

Holz: Wie in Beispiel 1.

Pilz: Die Impfkultur wurde wie in Beispiel 1 hergestellt. Drei unterschiedliche Gehalte der Impfkultur wurden verwendet (0,002%, 0,001% und 0,0005% auf einer Trockengewichtsbasis). 210 g einer halbfesten Getreideaufgußflüssigkeit wurden in einem Becher für 20 Minuten bei 121ºC in einem Autoclaven behandelt. 15 oder 45 g halbfester Getreideaufgußflüssigkeit wurde zu verschiedenen Leveln der Impfkultur gegeben. Diese Getreideaufgußflüssigkeit enthaltenden Impfkulturen wurden zum Beimpfen von in den Bioreaktoren befindlichen Holzschnitzeln verwendet. Deshalb wurden 1% oder 3% Getreideaufgußflüssigkeit auf einer Trockenholzbasis zu jedem Bioreaktor zugegeben.
Schnitzelzubereitung und Bioreaktorbeimpfung: Auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1. Bei diesem Experiment wurden Bioreaktoren, die jeweils 1500 g Schnitzel (Trockengewichtsbasis) enthielten, für ungefähr 10 Minuten anstelle der Behandlung im Autoclaven dampfsterilisiert, weil dieses Sterilisierungsverfahren unter Verwendung von Atmosphärendampf praktisch erscheint und ökonomisch durchführbar ist. Zwei Bioreaktoren ohne den Bioaufschlußpilz, einer ohne die Getreideaufgußflüssigkeit und der andere mit 1% Getreideaufgußflüssigkeit dienten als Kontrollen, um zu sehen, ob Getreideaufgußflüssigkeit allein einen vorteilhaften oder nachteiligen Effekt besitzt. Ähnlicherweise wurde einem anderen Bioreaktor bei dem Experiment die herabgesetzte Menge an Impfkultur (0,0005% auf einer Trockengewichtsbasis) zugegeben, aber ohne die Getreideaufgußflüssigkeit, um zu sehen, ob verringerte Level an Impfkultur selbst einen Bioaufschluß herbeiführen können.
Resultate: Tabelle 2 berichtet über die Resultate. Die Zugabe von 1% Getreideaufgußflüssigkeit zu dem Kontrollbioreaktor sparte keine Energie ein und verbesserte die Papierfestigkeit im Vergleich zu dem Kontrollbioreaktor ohne die Getreideaufgußflüssigkeit nicht. Eine Zugabe von 1% oder 3% Getreideaufgußflüssigkeit zu sämtlichen der Impfkulturen sparte jeweils 1-19% oder 25-30% an elektrischer Energie im Vergleich zu der Kontrolle. Jedoch waren die insgesamten Festigkeitseigenschaften aufgrund dieser Behandlungen nicht signifikant verbessert. Die verminderte Menge an Impfkultur (0,0005% auf einer Trockengewichtsbasis) ohne 1% Getreideaufguß zeigte keine Kolonisierung von Holzschnitzeln. Die folgenden Schlüsse können aus diesem Experiment gezogen werden:
1. Getreideaufgußflüssigkeit selbst ist inert.
2. Eine verringerte Menge an Impfkultur (0,0005% auf einer Trockengewichtsbasis) ohne die Getreideaufgußflüssigkeit war nicht erfolgreich.
3. Zugabe von 1% Getreideaufgußflüssigkeit zu 0,0005% Impfkultur ergab ungefähr dieselbe Menge an Energieeinsparungen wie die 0,3% Impfkultur ohne Nährstoffshilfsmittel (Tabelle 1). Die reduzierte Impfkultur plus Hilfsmittel verbesserte jedoch nicht den Zugindex, wie es die 0,3% Impfkultur in dem vorangegangenen Experiment tat (Beispiel 1).
4. 3% Getreideaufgußflüssigkeit ergab größere Energieeinsparungen als 1% Getreideaufgußflüssigkeit.
Daher wurde ein weiteres Experiment (Beispiel 3) durchgeführt, um zu bestimmen, ob eine hohe Konzentration von Getreideaufgußflüssigkeit (3%) während der Fermentation mehr Pilzbiomasse erzeugt und in einer besseren Bioaufschlußleistung des Pilzes resultiert.
Tabelle 2. Energieeinsparungen und Festigkeitseigenschaften während des biomechanischen Aufschlusses von Loblolly pine Schnitzeln mit 3 Leveln an Impfkultur von Ceriporiopsis subvermispora CZ-3 in der Gegenwart von 2 Leveln Getreideaufgußflüssigkeit von Corn Products (Charge E802) (2-wöchige Inkubation).
a Energieeinsparungen sind auf der Basis der unbehandelten Kontrollwerte berechnet
b Standardabweichung
c Kein Pilzwachstum

Beispiel 3

Aufgabe: Untersuchung des Effekts von 2 Leveln von Getreideaufgußflüssigkeit auf die Pilzbiomasse in flüssigem Medium.
Trockengewichtsbestimmung: Wir behielten 55% Feuchtigkeit in Holz auf einer Naßgewichtsbasis während der Fermentation bei. Zum Beispiel wurde den 1500 g Holzschnitzeln (Trockengewichtsbasis) in einem Bioreaktor 1833 g Wasser zugegeben. Zur Verdoppelung des Feuchtigkeitsgehalts des Bioreaktors in einem Kolben wurden daher 1833 g Wasser zu jedem 2800 ml Kolben gegeben (insgesamt sechs Kolben). 15 oder 45 g halbfeste Getreideaufgußflüssigkeit wurde zu jedem Kolben gegeben. Daher gab es drei Replikate pro Behandlung.
Jeder Kolben wurde mit Aluminiumfolie bedeckt. Diese Kolben wurden für 20 Minuten bei 121ºC im Autoclaven behandelt. Impfkultur, wurde wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt. Die 0,0005% Impfkultur wie in dem Bioreaktor verwendet, wurde zu jedem Kolben gegeben. Diese Kolben wurden für 14 Tage bei 27ºC inkubiert. Bei der Ernte wurden die Kolben, die die Pilzbiomassen enthielten, dekantiert und mit sterilem destilliertem Wasser gewaschen, um überschüssiges Medium von der Pilzbiomasse zu entfernen. Replikate wurden gemischt und die Pilzbiomasse wurde über Nacht in einem auf 105ºC eingestellten Ofen getrocknet. 15 g Getreideaufgußflüssigkeit (1%) erzeugten 410 mg Trockengewicht an Pilz pro Kolben bei der Ernte, wohingegen 45 g Getreideaufgußflüssigkeit (3%) bei der Ernte 1060 mg Trockengewicht Pilz/Kolben erzeugten (Tabelle 3). Diese Ergebnisse legen nahe, daß eine große Menge an Getreideaufgußflüssigkeit die Pilzbiomasse während der Fermentation erhöhte und daher in einer erhöhten Bioaufschlußleistung des Pilzes resultierte.
Tabelle 3. Trockengewicht des CZ-3 Stamms von Ceriporiopsis subvermispora auf sterilisierter Getreideaufgußflüssigkeit (2-wöchige Inkubation).

Behandlungen Trockengewicht des Pilzes (mg/Kolben)

1% Getreideaufgußflüssigkeit (Trockengewichtsbasis) 410
3% Getreideaufgußflüssigkeit (Trockengewichtsbasis) 1060
Da 1% sterilisierte Getreideaufgußflüssigkeit und eine verringerte Menge an Pilzimpfkultur (0,0005% auf einer Trockengewichtsbasis) gute Resultate ergab, entschieden wir, diese Kombination für die folgenden Untersuchungen zu verwenden. Da die Zugabe von Getreideaufgußflüssigkeit zu Kontrollholzschnitzeln unseres Resultate nicht beeinflußte, wurde keine Getreideaufgußflüssigkeit zu der Kontrolle in den nachfolgenden Untersuchungen gegeben.

Beispiel 4

Aufgabe: Vergleich von haploiden Stämmen mit dem besten diploiden Stamm von Ceriporiopsis subvermispora (CZ-3).

Holz: Wie in Beispiel 1.

Pilz: Stamm CZ-3 von Ceriporiopsis subvermispora ergab uns gute Energieeinsparungen, aber keine Festigkeitsverbesserungen bei der Verwendung von 1% Getreideaufgußflüssigkeit und 0,0005% Impfkultur. Dieser Stamm war ein diploider. Zum Einsparen von Energie und zur Verbesserung von Papierfestigkeit begannen wir ein Screening von haploiden Stämmen (einzelne Basidiospore isolaten) von Ceriporiopsis subvermispora. Fünf unterschiedliche haploide Stämme (FP-105752 SS-4, L-14807 SS-1, L-14807 SS-3, L-14807 SS-S, L- 14807 SS-10) wurden vom Center for Forest Mycology Research, USDA Forest Products Laboratory, Madison, Wisconsin, bezogen. Eine Impfkultur wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt. Die Bioaufschlußleistung dieser haploiden Stämme wurde mit der des diploiden des CZ-3 Stammes verglichen.
Schnitzelzubereitung und Bioreaktorbeimpfung: Auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1, außer daß die Holzschnitzel enthaltenden Bioreaktoren mit atmosphärischen Dampf für 10 Minuten oder so sterilisiert wurden.
Resultate: Tabelle 4 berichtet über die Resultate. Ein diploider Stamm von Ceriporiopsis subvermispora (CZ-3) sparte 15% an elektrischer Energie und verbesserte den Zugindex um 14% im Vergleich mit der Kontrolle. Sämtliche haploiden Stämme zeigten eine bessere Leistung als der diploide Stamm. Zwei haploide Stämme, L-14807 SS-3 und L-14807 SS-5, sparten 28 - 28% an elektrischer Energie und erhöhten den Zugindex um 21-22% im Vergleich zu der Kontrolle.
Tabelle 4. Energieeinsparungen und Festigkeitseigenschaften während des biomechanischen Aufschlusses von Loblolly pine Schnitzeln unter Verwendung von 0,0005% Impfkultur (Trockengewichtsbasis) eines diploiden (CZ-3) und von haploiden Stämmen von Ceriporiopsis subvermispora in der Gegenwart von 1% Getreideaufgußflüssigkeit von Corn Products (Charge E802) (2- wöchige Inkubation).
a Energieeinsparungen sind auf der Basis der unbehandelten Kontrollwerte berechnet
b Standardabweichung
Diese Resultate demonstrieren folgendes:
1. Bei der Verwendung von Getreideaufgußflüssigkeit und einer verringerten Menge an Pilzimpfkultur sparten beide, diploide und haploide Stämme, Energie und verbesserten die Papierfestigkeit.
2. Zwei haploide Stämme ergaben größere Energieeinsparungen und Festigkeitsverbesserungen als der diploide Stamm.

Beispiel 5

Aufgabe: Bewertung der Bioaufschlußleistung des haploiden Stammes von Ceriporiopsis subvermispora (L-14907 SS3) auf Pappelholzschnitzeln in Gegenwart von sterilisierter und nicht sterilisierter Getreideaufgußflüssigkeit.
Holzschnitzel: Die Pappelholzschnitzel wurden von Pappelstämmen erhalten, die im Nicolet National Forest of Wisconsin geerntet worden waren. Andere Einzelheiten sind dieselben wie in Beispiel 1 beschrieben.
Pilz: Die Einzelheiten der Impfkulturzubereitung wurden in Beispiel 1 beschrieben. Eine 0,0005% Impfkultur (Trockengewichtsbasis) mit 1% (Trockenholzbasis) sterilisierter oder nicht sterilisierter Getreideaufgußflüssigkeit wurde verwendet.
Schnitzelzubereitung und Bioreaktorbeimpfung: Bei diesem Experiment wurden Holzschnitzel für 10 Minuten oder so zum Sterilisieren bedampft. Ein Satz Bioreaktoren wurde für 2 Wochen inkubiert, während der andere für 4 Wochen bei 27ºC inkubiert wurde. Andere Einzelheiten sind in Beispiel 1 beschrieben worden.
Resultate: Tabelle 5 berichtet über die Resultate. In der Abwesenheit von Getreideaufgußflüssigkeit wuchs der Pilz nicht gut genug während dieser Verweilzeit, um signifikante Energieeinsparungen zu erzielen, was als Resultat in Übereinstimmung mit dem vorherigen Experiment (Beispiel 2) ist. Der Unterschied zwischen der Zugabe von sterilisierter oder nicht sterilisierter Getreideaufgußflüssigkeit, im Vergleich zu den Kontrollschnitzeln, beeinflußte die Werte für Energie und Festigkeitseigenschaften nicht. Eine Pilzvorbehandlung in der Gegenwart von sterilisierter oder nicht sterilisierter Getreideaufgußflüssigkeit sparte dieselbe Menge an Energie in 2 Wochen (13-15%) und in 4 Wochen (35-37%) im Vergleich zu der Kontrolle. Innerhalb von 2 Wochen waren die Festigkeitseigenschaften nicht verbessert, unabhängig von der Art der verwendeten Getreideaufgußflüssigkeit. Bei 4 Wochen jedoch verbesserten sterilisierte und nicht sterilisierte Getreideaufgußflüssigkeit den Bruchindex um 21-23% und den Zugindex um 46-48% im Vergleich zu der Kontrolle. Diese Resultate zeigen klar, daß nicht sterilisierte Getreideaufgußflüssigkeit während der kommerziellen Anwendung verwendet werden kann und das Bioaufschlußverfahren wird daher kosteneffizienter, da eine Sterilisierung nicht erforderlich ist.
Tabelle 5. Energieeinsparungen und Festigkeitseigenschaften während des biomechanischen Aufschlusses von Pappelholzschnitzeln unter Verwendung von 0,0005% Impfkultur (Trockengewichtsbasis) des L-14803 SS-3 haploiden Stammes von Ceriporiopsis subvermispora (Behandlung) in der Gegenwart von sterilisierter und nicht sterilisierter 1% Getreideaufgußflüssigkeit von Corn Products (Charge E802) (2-wöchige und 4-wöchige Inkubation).
a Die Energieeinsparungen sind auf der Basis der unbehandelten Kontrollwerte berechnet
b Standardabweichung

Beispiel 6

Aufgabe: Bewertung der Bioaufschlußleistung des haploiden Stamms von Ceriporiopsis subvermispora (L-14807 SS-3) auf Loblolly pine Schnitzel in Gegenwart von nicht sterilisierter Getreideaufgußflüssigkeit.
Holzschnitzel: Einzelheiten sind dieselben wie in Beispiel 1.
Pilz: Die Einzelheiten der Impfkulturzubereitung sind in Beispiel 1 beschrieben worden. Eine 0,0005% Impfkultur (Trockengewichtsbasis) mit 1% (Trockenholzbasis) nicht sterilisierter Getreideaufgußflüssigkeit wurde verwendet.
Schnitzelzubereitung und Bioreaktorbeimpfung: Bei diesem Experiment wurden Holzschnitzel zum Sterilisieren für 10 Minuten oder so mit Dampf behandelt. Eine Kontrolle und die beimpften Bioreaktoren wurden für 2 Wochen bei 27ºC inkubiert. Andere Einzelheiten sind in Beispiel 1 beschrieben worden.
Resultate: Tabelle 6 berichtet über die Resultate. Eine Pilzvorbehandlung ersparte eine bedeutende Menge an Energie (38%) und verbesserte den Zugindex um 51% im Vergleich mit der Kontrolle. Eine Zugabe von sterilisierter 1% Getreideaufgußflüssigkeit sparte 29% an elektrischer Energie und verbesserte den Zugindex um 21% im Vergleich mit der Kontrolle (Tabelle 4). Diese Ergebnisse zeigen, daß die Verwendung von nicht sterilisierter Getreideaufgußflüssigkeit im Vergleich zur sterilisierten Getreideaufgußflüssigkeit (Beispiel 4) die Bioaufschlußleistung des haploiden Stamms des Pilzes verbesserte. In einem vorherigen Experiment (Beispiel 3) wurde eine verbesserte Bioaufschlußleistung einer erhöhten Pilzbiomasse in dem flüssigen Medium aufgrund einer erhöhten Menge an Getreideaufgußflüssigkeit (3% auf einer Trockenholzbasis) zugeschrieben. Zur Bestätigung derselben Beziehung zwischen der Pilzbiomasse in dem flüssigen Medium und der Bioaufschlußleistung des Pilzes in einem Bioreaktor bestimmten wir den Effekt von nicht sterilisierter und sterilisierter Getreideaufgußflüssigkeit auf die Pilzbiomasse im flüssigen Medium.
Tabelle 6. Energieeinsparungen und Festigkeitseigenschaften während des biomechanischen Aufschlusses von Loblolly pine Schnitzeln unter Verwendung von 0,0005% Impfkultur (Trockengewichtsbasis) von L-14803 SS-3 haploider Stamm von Ceriporiopsis subvermispora (Behandlung) in der Gegenwart nicht sterilisierter 1% Getreideaufgußflüssigkeit von Corn Products (Charge E802) (2-wöchige Inkubation)
a Energieeinsparungen wurden auf der Basis der nicht behandelten Kontrollwerte berechnet
b Standardabweichung

Beispiel 7

Aufgabe: Vergleich der Wirksamkeit von sterilisierter Getreideaufgußflüssigkeit mit der von nicht sterilisierter Getreideaufgußflüssigkeit auf Pilzbiomasse in einem flüssigen Medium.
Trockengewichtsbestimmung: 1833 g Wasser wurden zu jedem 2800 ml Kolben (insgesamt vier Kolben) gegeben. 30 g Getreideaufgußflüssigkeit wurde zu zwei dieser Kolben gegeben, die jeweils 15 g Getreideaufgußflüssigkeit enthielten. Jeder Kolben wurde mit Aluminiumfolie bedeckt. Sämtliche dieser Kolben wurden für 20 Minuten bei 121ºC im Autoclaven behandelt. 30 g nicht sterilisierte Getreideaufgußflüssigkeit wurde zu den verbleibenden beiden Kolben gegeben, die jeweils 1833 g sterilisiertes Wasser enthielten. Eine Impfkultur wurde wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt. Eine 0,0005% Impfkultur, wie sie im Bioreaktor verwendet wurde, wurde zu jedem Kolben gegeben.
Diese Kolben wurde für 14 Tage bei 27ºC inkubiert. Bei der Ernte wurden die Kolben, die die Pilzbiomasse enthielten, dekantiert und mit sterilem destilliertem Wasser gewaschen, um überschüssiges Medium von der Pilzbiomasse zu entfernen. Replikate wurden gemischt und die Pilzbiomasse wurde über Nacht in einen auf 105ºC eingestellten Ofen getrocknet.
Resultate: Tabelle 7 berichtet über die Resultate. Sterilisierte Getreideaufgußflüssigkeit erzeugte bei der Ernte 425 mg Trockengewicht Pilz/Kolben wohingegen nicht sterilisierte Getreideaufgußflüssigkeit bei der Ernte nur 150 mg Trockengewicht Pilz/Kolben erzeugte. Diese Ergebnisse deuten darauf, daß eine Kombination von nicht sterilisierter Getreideaufgußflüssigkeit und gedämpftem Holz für die verbesserte Bioaufschlußleistung des haploiden Stamms des Pilzes verantwortlich sein könnte. Da in dem obigen Experiment nicht sterilisierte Getreideaufgußflüssigkeit wesentlich weniger Pilzbiomasse erzeugte, als die sterilisierte Getreideaufgußflüssigkeit in dem flüssigen Medium, entschieden wir die Wirkung anderer Chemikalien (sterilisiert und nicht sterilisiert) auf Pilzbiomasse in Flüssigkultur zunächst zu untersuchen und nachfolgend die Wirkung auf die Bioaufschlußleistung des haploiden Stamms (L-14807 SS-3) des Pilzes unter Verwendung nicht sterilisierter Chemikalien.
Tabelle 7. Trockengewicht von L-14807 SS-3 haploider Stamm von Ceriporiopsis subvermispora auf sterilisierter und nicht sterilisierter Getreideaufgußflüssigkeit (2-wöchige Inkubation).

Behandlungen Trockengewicht des Pilzes (mg/Kolben)

sterilisierte Getreideaufgußflüssigkeit 425
nicht sterilisierte Getreideaufgußflüssigkeit 190

Vergleichsbeispiel 1

Aufgabe: Untersuchung der Wirkung von sterilisiertem und nicht sterilisiertem Hefeextrakt und Molassen auf Pilzbiomasse in flüssigem Medium.
Trockengewichtsbestimmung: Auf dieselbe Weise wie in Beispiel 7. 15 g jedes Nährstoffshilfsmittels wurde verwendet.
Resultate: Tabelle 8 berichtet über die Resultate. Sterilisierter Hefeextrakt erzeugte bei der Ernte 305 mg Trockengewicht an Pilz/Kolben, wohingegen nicht sterilisierter Hefeextrakt dem Pilz kein Wachstum erlaubte. Andererseits erzeugten sterilisierte Molassen bei der Ernte 365 mg Trockengewicht Pilz/Kolben und nicht sterilisierte Molassen erzeugten 230 mg Trockengewicht Pilz/Kolben bei der Ernte.
Tabelle 8. Trockengewicht von L-14807 SS-3 haploider Stamm von Ceriporiopsis subvermispora auf sterilisiertem und nicht sterilisiertem Hefeextrakt und Molassen (2-wöchige Inkubation).

Behandlungen Trockengewicht des Pilzes (mg/Kolben)

Hefeextrakt
sterilisiert 305
nicht sterilisiert 0
Molassen
sterilisiert 365
nicht sterilisiert 230

Vergleichsbeispiel 2

Aufgabe: Bestimmung der Bioaufschlußwirksamkeit des haploiden Isolats von Ceriporiopsis subvermispora (L-14807 SS-3) unter Verwendung von nicht sterilisiertem Hefeextrakt und Molassen.

Holz: Dasselbe wie in Beispiel 1.

Pilz: Eine 0,0005% Pilzimpfkultur von L-14807 SS-3 haploider Stamm wurde verwendet. Die in den vorherigen Untersuchungen verwendete Getreideaufgußflüssigkeit ist eine halbfeste Flüssigkeit (ungefähr 50% Feststoffe). Eine Zugabe von 15 g Getreideaufgußflüssigkeit zu jedem Bioreaktor, der 1500 g Trockengewicht an Schnitzeln enthält, ergibt 1% Getreideaufgußflüssigkeit (halbfeste Getreideaufgußflüssigkeit/Trockengewicht von Holz). Weil Getreideaufgußflüssigkeit einen Feststoffgehalt von ungefähr 50% besitzt, verwendeten wir 0,5% Getreideaufgußflüssigkeit (Trockengewicht von Getreideaufgußflüssigkeit/Trockengewicht von Holz) in vorhergehenden Experimenten. Hefeextrakt und Molassen wurde ebenfalls bei derselben Rate von 0,5% (Trockengewicht der Chemikalie/Trockengewicht von Holz) in diesem Experiment verwendet. Hefeextrakt ist ein getrocknetes Pulver, wohingegen Molassen einen Feststoffgehalt von ungefähr 62% besitzen. Daher wurden 7,5 g Hefeextrakt und 12 g Molassen zu der Impfkultur gegeben, um dasselbe Trockengewicht jeder Chemikalie pro Bioreaktor wie im Fall der Getreideaufgußflüssigkeit zu haben. Andere Einzelheiten sind dieselben wie in Beispiel 1.
Schnitzelzubereitung und Bioreaktorbeimpfung: Bei diesem Experiment wurden Holzschnitzel für 10 Minuten oder so zum Sterilisieren bedampft. Die Kontrolle und die beimpften Bioreaktoren wurden für 2 Wochen bei 27ºC inkubiert. Andere Einzelheiten sind in Beispiel 1 beschrieben worden.
Resultate: Tabelle 9 berichtet über die Resultate. Nicht sterilisierter Hefeextrakt und Molassen sparten jeweils 14 und 20% elektrischer Energie und erhöhten den Zugindex jeweils um 21 und 33% im Vergleich mit der Kontrolle. Diese Ergebnisse zeigen, daß nicht sterilisierter Hefeextrakt und Molassen auch beim Bioaufschluß verwendet werden können, wobei aber diese nicht chemisch definierten Medien nicht so wirksam wie Getreideaufgußflüssigkeit sind.
Tabelle 9. Energieeinsparungen und Festigkeitseigenschaften während des biomechanischen Aufschlusses von Loblolly pine Schnitzeln unter Verwendung von 0,0005% Impfkultur (Trockengewichtsbasis) eines haploiden Stamms (L- 14807 SS-3) von Ceriporiopsis subvermispora in der Gegenwart von nicht sterilisiertem 0,5% Hefeextrakt und Molassen auf einer Trockengewichtsbasis (2- wöchige Inkubation).
a Energieeinsparungen wurden auf der Basis der nicht behandelten Kontrollwerte berechnet
b Standardabweichung

Claims

Wir beanspruchen:

1. Ein Verfahren zur Herstellung von Holzpulpe, umfassend die Schritte:

(a) Zerspanen von Holz in Holzschnitzel;

(b) Impfen der Holzschnitzel mit Zellmaterial von Ceriporiopsis subvermispora und Getreideaufgußflüssigkeit;

(c) Einführen der behandelten Holzschnitzel in einen Bioreaktor, wobei Schritt (c) vor oder nach Schritt (b) stattfinden kann;

(d) Inkubieren der Holzschnitzel unter Bedingungen, die die Verbreitung des Pilzes durch die Holzschnitzel begünstigen, für eine ausreichende Zeit, damit der Pilz eine signifikante Menge des natürlicherweise in den Holzschnitzel vorliegenden Lignins modifizieren kann; und

(e) mechanisches Einstampfen der durch den Pilz abgebauten Holzschnitzel in eine Papierpulpe.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Holzschnitzel aus Southern Yellow Pine erhalten werden.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Holzschnitzel von Pappeln stammen.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Menge der Getreideaufgußflüssigkeit zwischen 0,5% und 3% auf Trockengewichtsbasis beträgt.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Menge der Getreideaufgußflüssigkeit 1% auf der Basis Gewicht zu Gewicht (flüssig zu trocken) beträgt.

6. Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei die Getreideaufgußflüssigkeit Eigenschaften mit ungefähr den folgenden Werten besitzt:

Trockensubstanz (in %) 50,7

pH 3,9

Protein (% Trockenbasis) 40,8

Milchsäure (% Trockenbasis) 16,0 und

reduzierende Zucker (%(Trockenbasis) 12, 8.

7. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Zellmaterial weniger als 0,3 % auf Trockengewichtsbasis ist.

8. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Zellmaterial weniger als 0,1 % auf Trockengewichtsbasis ist.

9. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Zellmaterial weniger als 0,01% auf Trockengewichtsbasis ist.

10. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Zellmaterial gleich oder weniger als 0,0005% auf Trockengewichtsbasis ist.

11. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei Schritt (d) für 2 Wochen durchgeführt wird.

12. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei Schritt (e) durch mechanisches Zerstampfen durchgeführt wird.

13. Verfahren zur Vorbehandlung von Holz, so daß das Holz leichter in Pulpe umgewandelt werden kann, umfassend die Schritte:

(a) Zerspanen des Holzes in Holzschnitzel, und

(b) Impfen der Holzschnitzel mit einem Zellmaterial von Ceriporiopsis subvermispora und Getreideaufgußflüssigkeit.

14. Verfahren zur Papierherstellung, umfassend die Schritte:

(a) Impfen der Holzschnitzel mit Zellmaterial von Ceriporiopsis subvermispora und Getreideaufgußflüssigkeit;

(b) Einführen der Holzschnitzel in einen Bioreaktor, wobei Schritt (b) vor oder nach Schritt (a) stattfinden kann;

(c) Inkubieren der Holzschnitzel unter Bedingungen, die die Verbreitung des Pilzes durch die Holzschnitzel fördern;

(d) Zerstampfen der inkubierten Holzschnitzel bis zu einem gewählten Grad an Faserfreiheit in der Pulpe; und

(e) Herstellung von Papier mit der so erzeugten Pulpe.