DE69708143T2

DE69708143T2 - N-acetyl aminoethoxyvinylglycin (avg) und seine verwendung als ethylenbiossythese-inhibitor

Info

Publication number: DE69708143T2
Application number: DE69708143T
Authority: DE
Inventors: F. Heiman
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1996-09-23
Filing date: 1997-09-22
Publication date: 2002-07-11
Anticipated expiration: 2017-09-23
Also published as: EP0938468B1; AU727796B2; NZ334404A; CA2266489A1; AU4429297A; EP0938468A1; ATE208371T1; DE69708143D1; DK0938468T3; JP4080539B2; IL128756A; PT938468E; CA2266489C; KR100562183B1; WO1998012173A1; HK1024460A1; JP2002514182A; ES2168673T3; IL128756A0; BR9711524A

Description

1. Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft die Entdeckung einer neuen chemischen Verbindung, L-trans-2-amino-4-(2-acetamidoethoxy)-3- butensäure (N-acetyl-AVG).
Die Verbindung kann durch chemische Synthese aus L-trans-2- amino-4-(2-aminoethoxy)-3-butensäure (AVG) oder in Pflanzen als ein Produkt biosynthethischer Umwandlung aus dem gleichen Präkutsor hergestellt werden.

2. Hintergrund der Erfindung

Es ist recht lange bekannt, daß Pflanzen Ethylen produzieren, indem sie Methionin/über S-Adenosylmethionin in I- Aminocyclopropan-I-carbonsäure (ACC) konvertieren, die dann zu Ethylen, HCN und Kohlendioxid abgebaut wird. Das Pflanzenenzym, das für die Produktion von ACC verantwortlich ist, heißt ACC- Synthase. Man glaubt, daß Ethylen, ein gasförmiges Phytohormon, bei der Modulation einer Anzahl biochemischer Wege von Pflanzen eine Rolle spielt, die Prozesse wie Abtrennung, Altern, Blüte, Ansetzen von Früchten, Reifen von Früchten, Keimen von Samen, Geschlechtsexpression, Wachstum von Wurzeln, internodale Verlängerung, Epinastie und Geotropismus beeinflussen.
Die Vermarktung von Schnittblumen und Zierblütenpflanzen ist für die Gartenbauindustrie Von erheblicher wirtschaftlicher Bedeutung. Der gesamte Großhandelsumsatz an Schnittblumen, Blütenpflanzen und Blatt- und Beetpflanzen in 1994 betrug circa 1,3 Milliarden Dollar. Der Verkauf von Schnittblumen trug zu diesem Betrag circa 15% bei, und der Verkauf von Topf- Blütenpflanzen trug circa 23% bei. Die Vermarktung dieser Produkte umfaßt im allgemeinen den Versand von dem Ort, wo die Pflanzen gezüchtet werden, zu wirtschaftlich wichtigen Märkten anderswo im Land. Die Handhabung und Verpacken und der Versand von sowohl Schnittblumen als auch Zierpflanzen setzt sie großen Beanspruchungen aus, was in Schäden resultieren kann, so daß ihr kommerzieller Wert für den Einzelhändler reduziert wird. Die Beanspruchungen, denen Pflanzen ausgesetzt werden, resultieren in verfrühter Alterung (Altern und Braun-Werden), die zum Teil auf die Wirkung von Ethylen zurückzuführen sein kann. Ethylen- Gas, das entweder durch die Pflanze selbst als Reaktion auf Beanspruchung produziert wird oder in der Umgebung vorhanden ist, verursacht eine Beschleunigung der Alterung. Pflanzen, die bei der Ernte gut aussehen und austreibende Knospen aufweisen, können nach dem Transport ungesund aussehen und viele ihrer Knospen verlieren.
Eine Anzahl chemische Stoffe, die die durch Ethylen verursachten Schäden an Schnittblumen begrenzen, sind identifiziert worden. Hierzu zählen Silberthiosulfat, 1- Methylcyclopropen (MCP) (vgl. Plant Growth Regulation, Band 18, Seiten 169-174 (1996), Carboxymethoxylamin (auch bekannt als Aminooxyessigsäure (AOAA)), AVG, Rhizobitoxin und L-trans-2- amino-4-methoxy-3-Butensäure (MVG). Man glaubt, daß Silberthiosulfat und MCP die Wirkung von internem und externem Ethylen hemmen, während man von anderen glaubt intern zu wirken, um das Vermögen der Schnittblumen, Pflanzen und Früchte, Ethylen zu produzieren, hemmen. Diese Verbindungen (außer MCP) werden typischerweise in Form einer wässerigen Behandlungslösung auf die Pflanzen bzw. das Pflanzenmaterial aufgebracht. Die Aufbringung der Behandlungslösung auf Topfpflanzen wird durchgeführt, indem die Behandlungslösung auf die oberirdischen Teile der Pflanzen gesprüht oder dem Bewässerungswasser hinzugefügt wird, das den Wurzeln der Pflanzen zugeführt wird. Die Behandlung von Schnittblumen oder grünen Pflanzenteilen wird typischerweise durchgeführt, indem die geschnittenen Enden der Stengel sofort nach der Ernte, während des Transportierens, oder während das Blumengesteck zur Schau steht, in die wässerige Lösung, die das Behandlungsmittel enthält, eingetaucht werden; sie könnten aber auch behandelt werden, indem die ganzen Blumen in eine Lösung eingetaucht oder indem sie besprüht werden. Da MCP ein Gas ist, kann es nicht ohne weiteres in einer wässerigen Lösung aufgebracht werden, und die Pflanzen werden deshalb behandelt, indem sie einer modifizierten, kontrollierten Atmosphäre (die eine definierte Menge MCP enthält) in einem geschlossenen Raum ausgesetzt werden.
Silberthiosulfat ist teuer und kann nicht auf wirtschaftlich sinnvolle Weise auf großflächig angebaute Pflanzungen von niedrigem Wert aufgebracht werden. Es kann außerdem für Tiere, einschließlich Menschen, giftig sein, und aus dem Grund kann es nicht auf Nahrungsmittel oder auf Feldfrüchte, die als Nahrungsmittel genutzt werden, aufgebracht werden. MCP hat auf Grund von Schwierigkeiten bei der Produktion und Aufbringung und wegen seiner mangelnden Stabilität keine breite Verwendung gefunden.
Die Rolle von Ethylen beim Reifen von Früchten ist auf dem Fachgebiet seit über 40 Jahren anerkannt. Es ist bekannt, daß die Geschwindigkeit der Produktion von Ethylen bei reifenden Früchten zunimmt, während sich die Frucht, durch die Bildung einer Schicht von Zellen mit einer niedrigen Adhäsion, die als die Abtrennungsschicht bezeichnet wird, von ihrem Stiel trennt. Wenn die Bildung dieser Schicht abgeschlossen wird, bevor die Frucht gepflückt werden kann, fällt die Frucht zu Boden, wobei sie beschädigt wird, was in einer schlechteren Qualität resultiert. Es ist für den Anbauer somit von wesentlichem wirtschaftlichem Vorteil, zu verhindern, daß die Früchte vor der Ernte zu Boden fallen. Außerdem haben Früchte typischerweise vor und unmittelbar nach der Ernte einen höheren Widerstand gegen Druckstellenbildung oder Penetrationsschäden als nach einer kurzzeitigen Lagerung. Der Widerstand der Frucht gegen Penetration wird mit einer Vorrichtung gemessen, die als Penetrometer bezeichnet wird, und als die Fruchtfestigkeit angegeben. Die Fruchtfestigkeit ist auch ein allgemein anerkanntes Maß der Knackigkeit und der Frische. Früchte haben typischerweise bei der Ernte eine höhere Fruchtfestigkeit als nach Lagerung. Man glaubt, daß die Abnahme der Fruchtfestigkeit mit der Zeit zumindest indirekt mit der Produktion von Ethylen in der Frucht zusammenhängt.
AVG ist ein Pflanzenwachstumsregler, der die Ethylenproduktion hemmt. Es wirkt, indem es das Pflanzenenzym ACC-Synthase hemmt. Wie effektiv AVG bei der Hemmung von Ethylenbiosynthese auch ist, es besteht weiterhin die Notwendigkeit, zusätzliche Inhibitoren der Ethylenbiosynthese zu identifizieren.
US-Patent Nr. 4 115 105 betrifft die Substanz L-2-amino- 4-(2-aminoethoxy)-butensäure als Fruchtreifungswirkstoff und als Abtrennungswirkstoff, der durch die katalytische Reduktion von AVG hergestellt wird.
US-Patent Nr. 5 284 818 offenbart AVG und Salze davon als ACC-Synthase-Inhibitoren in trockenen Konservierungsmittelformulierungen für Schnittblumen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung liefert die neue Verbindung L- trans-2-amino-4-(2-acetamidoethoxy)-3-butensäure (N-acetyl-AVG)
oder ein Ester oder ein Salz davon.
Die vorliegende Erfindung liefert auch Verfahren und Formulierungen zur Hemmung von Ethylenbiosynthese, die N-acetyl- AVG oder ein Ester oder ein Salz davon umfassen.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Ethylen ist ein natürliches Hormon in Pflanzen. AVG ist ein Wirkstoff, der die Ethylenbiosynthese in Pflanzen hemmt, und als solches kann es verwendet werden, um bei Schnittblumen und Feldfrüchten die Alterung zu verzögern und Stress-Antwortprozesse zu verändern. AVG verbessert außerdem die Lagerfähigkeit von Pflanzen, Früchten, Gemüse und Schnittblumen. Ein neues Produkt der vorliegenden Erfindung ist das End- Acetamid von AVG. (N-acetyl-AVG), ein von AVG abgeleitetes synthetisches oder Biotransformationsprodukt. Nach der exogenen Aufbringung von AVG nimmt die Konzentration von N-acetyl-AVG in Pflanzen zu, während die AVG-Konzentrationen auf Grund von AVG- Bioumwandlung abnimmt.
Die vorliegende Erfindung offenbart die neue Verbindung, N- actyl AVG, die als Verbindung (I) gezeigt ist
oder ein Ester oder ein Salz davon.
N-actyl AVG oder ein Ester oder ein Salz davon kann in Formulierungen auf Pflanzen aufgebracht werden, um die Ethylenbiosynthese zu hemmen.
Der Begriff "Formulierungen" im Sinne des vorliegenden Textes schließt folgendes ein:
(1) Formulierungen, die N-actyl AVG oder einen Ester oder ein Salz davon umfassen, oder (ii) AVG/N-actyl-AVG-Gemisch- Formulierungen oder Ester oder Salze davon.
Man glaubt, daß das Acetamid von N-actyl AVG die Ethylenbiosynthese auf Grund der Anwesenheit einer alpha-Amino- und einer beta-Olefin -funktionellen Gruppe des Acetamids hemmt, die zwei Voraussetzungen für, das konkurrierende Hemmen des Enzyms ACC-Sythase darstellen.
Der Begriff "Pflanze(n)" wie hierin verwendet betrifft grüne Landpflanzen. Grüne Landpflanzen schließen folgendes ein, sollen aber nicht darauf beschränkt sein: auf Feldern angebaute Pflanzen einschließlich Faserpflanzen und Nahrungsmittelpflanzen, forstwirtschaftliche Pflanzen, Rasengräser, Blattpflanzen und Zierpflanzen.
Nahrungsmittelpflanzen schließen folgendes ein, sollen aber nicht darauf beschränkt sein: Gemüsepflanzen, Kornpflanzen und Fruchtpflanzen. Gemüsepflanzen können folgendes einschließen, sollen aber nicht darauf beschränkt sein: Bohnen, Mais, Kartoffeln, Tomaten, Brokkoli, Sojabohnen, Kürbisse, Gurken, Kopfsalat und Zwiebeln. Kornpflanzen können folgendes einschließen, sollen aber nicht darauf beschränkt sein: Hafer, Reis, Weizen und Gerste. Faserpflanzen können folgendes einschließen, sollen aber nicht darauf beschränkt sein: Baumwolle und Flachs. Außerdem können die Formulierungen der vorliegenden Erfindung auch verwendet werden, um abgeschnittene grüne Pflanzenteile, die zu Zierzwecken verwendet werden, und Schnitt-Zierblumen zu behandeln.
Die Formulierungen der vorliegenden Erfindung können auf Pflanzen verwendet werden, um die Ethylenbiosynthese zu hemmen. Die Formulierungen der vorliegenden Erfindung können bei Aufbringung vor und/oder nach der Ernte verwendet werden, wenn die Ernte relevant ist.
Die vorliegende Erfindung offenbart auch die neue Verbindung (I) als Alterungs-Inhibitor bei Pflanzen und die Verwendung der Verbindung (I) in Formulierungen zur Aufbringung auf Pflanzen. Zum Beispiel können Formulierungen, die N-acetyl- AVG umfassen, verwendet werden, um die Ethylenbiosynthese in Pflanzen zu hemmen.
Die Verbindung (1) der vorliegenden Erfindung kann in Form von Salzen verwendet werden, die von anorganischen oder organischen Säuren abgeleitet sind. Die Salze können während der abschließenden Isolierung und Reinigung der Verbindung der vorliegenden Erfindung in situ hergestellt werden, oder sie können separat hergestellt werden, indem die freie basische. Funktion mit einer geeigneten organischen Säure zur Reaktion gebracht wird. Diese Salze schließen folgendes ein, sind aber nicht darauf beschränkt: Acetat, Citrat, Aspartat, Benzoat, Benzolsulfonat, Bisulfat, Butyrat, Heptanoat, Hexanoat, Fumarat, Hydrochlorid, Hydrobromid, Hydrojodid, Laktat, Maleat, Methansulfonat, Oxalat, Propionat, Succinat, Tartrat und Thiocyanat.
Bespiele von Säuren, die verwendet werden können, um verträgliche Salze der Verbindung der vorliegenden Verbindung zu bilden, schließen anorganische Säuren wie Salzsäure, Schwefelsäure und Phosphorsäure und organische Säuren wie Essigsäure, Oxalsäure, Maleinsäure, Bernsteinsäure und Zitronensäure ein.
Basische Additionssalze können während der abschließenden Isolierung und Reinigung der Verbindungen der Formel (I) in situ hergestellt werden, oder sie können separat hergestellt werden, indem die Carbonsäurefunktion der Verbindung (I) mit einer geeigneten Base wie Hydroxid, Carbonat oder Bicarbonat eines Metall-Kations oder mit Ammoniak oder einem organischen primären, sekundären oder tertiären Amin zur Reaktion gebracht wird. Salze der vorliegenden Erfindung schließen folgendes ein, sind aber nicht darauf beschränkt: Kationen auf der Grundlage der Alkali- und der Erdalkalimetalle wie Natrium, Lithium, Kalium, Kalzium, Magnesium, Aluminiumsalze und dergleichen. Einem Fachmann wird es gut bekannt sein, wie man Salze der Verbindung (I) herstellt.
Der Begriff "Ester" wie hierin verwendet bezeichnet Ester, die in vivo hydrolysiert werden, und schließt diejenigen ein, die in einer Pflanze zerfallen, um die Stammverbindung oder ein Salz davon zurückzulassen. Geeignete Ester schließen z. B. diejenigen ein, die von verträglichen aliphatischen und aromatischen Alkoholen abgeleitet sind, insbesondere von Alkyl- und Alkenylalkoholen mit geraden oder verzweigten Ketten und von Benzylalkohol, bei denen jeder Alkyl- oder Alkenyl-Teil am vorteilhaftesten nicht mehr als 6 Kohlenstoffatome aufweist. Beispiele von einzelnen Estern schließen die folgenden ein, sind aber nicht darauf beschränkt: Methyl-, Ethyl-, Ethenyl-, Propyl-, Propenyl-, Isopropyl-, Isopropenyl-, Butyl-, Benzyl- und Butenylester.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die Verbindung (I) in Formulierungen zur einfachen oder mehrfachen Aufbringung auf Pflanzen verwendet werden.
Bei einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann eine Kombination aus AVG und N-acetyl-AVG in den Formulierungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Die Formulierungen der vorliegenden Erfindung sind aber nicht auf die Verwendung zum Schutz von Topf-Zierblütenpflanzen vor Versandschäden beschränkt. Die Formulierungen der vorliegenden Erfindung können auf Nahrungsmittelpflanzen aufgebracht werden. Nahrungsmittelpflanzen schließen folgendes ein, sollen aber nicht darauf beschränkt sein: Gemüsepflanzen, Kornpflanzen und Fruchtpflanzen. Die Formulierungen der vorliegenden Erfindung können vor oder nach der Ernte oder sowohl vor als auch nach der Ernte auf Nahrungsmittelpflanzen aufgebracht werden. Die Formulierungen können auf Fruchtpflanzen aufgebracht werden, die folgendes einschließen, aber nicht darauf beschränkt sein sollen: Kernobst, Steinobst, Beeren, Weintrauben und Tomaten: Beispiele von Kernobst, bei dem die Formulierungen der vorliegenden Erfindung nützlich sein können, schließen folgendes ein, sollen aber nicht darauf beschränkt sein: Äpfel und Birnen. Beispiele von Steinobst, bei denen die Formulierungen der vorliegenden Erfindung nützlich sein können, schließen folgendes ein, sollen aber nicht darauf beschränkt sein: Pfirsich, Kirsche, Aprikose, Olive, Pflaume, Nektarine, Backpflaume und Mandel. N-acetyl-AVG-Formulierungen können durch Aufbringung vor und/oder nach der Ernte verwendet werden, um die Qualität von Feldfrüchten zu verbessern. Wenn sie vor der Ernte aufgebracht werden, können sie auch helfen zu verhindern, daß die Früchte vorzeitig vom Baum fallen. Dies kann dem Anbauer einen wirtschaftlichen Vorteil bieten, weil Früchte, die vom Baum fallen, meistens Druckstellen davontragen und nur zu einem Bruchteil des Preises von Früchten ohne Druckstellen verkauft werden können.
Die Formulierungen der vorliegenden Erfindung können auch auf Faserpflanzen aufgebracht werden. Beispiele von Faserpflanzen schließen folgendes ein, sollen aber nicht darauf beschränkt sein: Baumwolle und Flachs.
Die Formulierungen der vorliegenden Erfindung können auch ein früheres Besprühen von Pflanzen erlauben, als mit anderen Produkten gebräuchlich ist. Es kann z. B. möglich sein, Apfelbäume 5 bis 6 Wochen vor der Ernte anstatt 2 bis 4 Wochen vor der Ernte zu besprühen. Dies bietet Vorteile, indem es dem Anbauer eine größere Flexibilität hinsichtlich des Zeitpunkts der Aufbringung bietet und das Kombinieren des Besprühens mit einer anderen zur Versorgung der angebauten Pflanzen erforderlichen Behandlung, z. B. dem Besprühen mit Insektizid, erlauben kann.
Die Formulierungen der vorliegenden Erfindung werden im allgemeinen auf wachsende Pflanzen aufgebracht, indem das Blätter, die Knospen, die Früchte und die Blüten besprüht werden oder indem die Erde durchtränkt wird. Wenn sie durch Sprühen aufgetragen werden, werden die Formulierungen nach Techniken, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, auf die oberirdischen Teile der Pflanze gesprüht, vorzugsweise bis zum Punkt des Abfließens. Bei dieser Methode wird bevorzugt, - obwohl es nicht unbedingt erforderlich ist - daß die Formulierungen einen nichtionischen oberflächenaktiven Stoff enthalten, um die Blätter und die Knospen, Blüten und/oder Früchte mit den Formulierungen gründlich zu benetzen.
Bei der Bodendurchtränkungsmethode kann die Formulierung in die Erde um die Pflanze herum gegossen werden oder von unten auf die Wurzeln aufgebracht werden, wie z. B. bei der als "Ebbe-und- Flut" bekannten Technik, bei der Wasser und Nährstoffe von unten auf wachsende Pflanzen auf einer Treibhausbank aufgebracht werden. Bei diesen Techniken ist typischerweise kein oberflächenaktiver Stoff in der Formulierung enthalten.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die Alterung der Blüten von Topf-Zierpflanzen während des Versands verhindert werden. Die derzeit übliche Praxis in der Industrie besteht darin, für kommerzielle Zwecke bestimmte Topfpflanzen in Hüllen oder Kartons zu verpacken, sie dann in Versandkartons zu packen und die in Hüllen und Kartons verpackten Pflanzen in gekühlten Lastkraftwagen oder Eisenbahnwagen auf dem Landweg zu ihrem Zielort zu versenden. Während Schnittblumen oft auf dem Luftweg versandt werden, ist wegen des zusätzlichen Gewichts des Topfes und der Erde der Versand auf dem Landweg der einzige wirtschaftlich realisierbare Weg, Topfpflanzen zu versenden. Einige für kommerzielle Zwecke bestimmte Blütenpflanzen wie Zwergnelken (Dianthus sp.), die an der Ost- und Westküste der Vereinigten Staaten gezüchtet werden, werden wegen der durch die Versand-bedingten Beanspruchung verursachten Schäden an den Pflanzen, die den kommerziellen Wert der Pflanzen am Zielort vernichten, nicht weit verkauft. Die Formulierungen der vorliegenden Erfindung, die die Verbindung (I) umfassen, bieten einen Weg, solche Pflanzen vor einer vorzeitigen Alterung zu schützen.
Alternativ können die Formulierungen der vorliegenden Erfindung nach der Ernte auf Obst oder Gemüse aufgebracht werden, indem das Obst oder Gemüse mit einer Lösung, die N- acetyl-AVG enthält, besprüht wird oder indem das Obst oder Gemüse eine Zeit lang in die Lösung teilweise oder ganz eingetaucht wird.
Die Formulierungen der vorliegenden Erfindung können Hilfsstoffe wie Konservierungsmittel, Benetzungsmittel, Emulgatoren und Dispersionsmittel enthalten.
Formulierungen der vorliegenden Erfindung, die N-acetyl-AVG oder die Ester oder Salze davon enthalten, können in Konzentrationen zwischen ungefähr 10 parts per million (ppm) und 2000 parts per million (ppm) in einem flüssigen Medium vorhanden sein, wobei Konzentrationen nahe dem unteren Ende dieses Bereichs bevorzugt werden, wenn die Formulierungen der vorliegenden Erfindung nach der Bodendurchtränkungsmethode auf Pflanzen aufgebracht werden. Wenn die Formulierungen nach Sprühtechniken auf Pflanzen aufgebracht werden, werden Konzentrationen zwischen ungefähr 50 und 1000 ppm bevorzugt. Die Formulierungen können auch einen nichtionischen oberflächenaktiven Stoff enthalten, insbesondere wenn die vorgesehene Verwendung eine Aufbringung der Formulierung auf die Pflanzen durch Sprühen einschließt. Das flüssige Medium ist vorzugsweise wässerig, kann aber ein organisches Lösungsmittel, in dem N-acetyl-AVG löslich ist, einschließen oder im wesentlichen daraus bestehen. In dem Fall, daß ein organisches Lösungsmittel verwendet wird, sollte das Lösungsmittel für Pflanzen nicht schädlich sein. Das US-Patent Nr. 5 500 403 und das US-Patent Nr. 5 523 281 beschreiben AVG-Formulierungen und Methoden zur Verwendung solcher Formulierungen.
Die N-acetyl-Formulierungen werden typischerweise hergestellt, indem N-actyl-AVG in einem flüssigen Medium, vorzugsweise Wasser, aufgelöst wird, der oberflächenaktive Stoff (falls erforderlich) hinzugefügt wird und schließlich das Gemisch auf die gewünschte Aufbringungskonzentration verdünnt wird.
Die folgenden Beispiele sind für die vorliegende Erfindung repräsentativ, sie sollen aber nicht den Umfang der Erfindung gänzlich definieren oder eingrenzen.

BEISPIEL 1 Synthese von N-acetyl-AVG

Die Synthese von N-acetyl-AVG wurde unter Anwendung von Kupferchelatbildung durchgeführt, um eine Reaktion an der alpha- Aminogruppe von AVG zu verhindern.
L-trans-2-amino-4-(2-aminoethoxy)-3-butensäure (AVG) (1,97 g, 10 mmol, 1 äquivalente Menge, Abbott Laboratories, North Chicago, IL) wurde in 10 ml entionisiertem Wasser aufgelöst, und 3,35 ml 6 molare (M) wässerige Natriumhydroxid (20 mmol, 2 äquivalente Mengen) wurde hinzugefügt. Dazu wurde tropfenweise unter gründlichem Rühren bei Umgebungstemperatur eine Lösung von Kupfersulfat-Pentahydrat (1,273 g, 5,1 mmol, 0,51 äquivalente Mengen) in 3 ml Wasser hinzugefügt. Das Kupfer wurde anfangs präzipitiert, dann aber schnell wieder aufgelöst, um eine tiefblaue Lösung zu ergeben. Das Gemisch wurde nach dem Hinzufügen der Kupferlösung eine Stunde lang gerührt.
Reines Acetanhydrid (943 ul, 10 mmol, 1 äquivalente Menge) wurde über einen Zeitraum von circa 1 Minute tropfenweise hinzugefügt. Dieses Gemisch wurde 30 Minuten lang gerührt, bevor es über Nacht bei 4ºC gelagert wurde.
Nach dem Wiederaufwärmen auf Zimmertemperatur wurden 0,1 äquivalente Mengen Natrumhydroxidlösung (1,0 ml 1,0 M, 1,0 mmol) hinzugefügt, gefolgt von weiteren 0,1 äquivalenten Mengen Acetanhydrid (94 ul, 1,0 mmol), und das Rühren wurde eine Stunde lang fortgesetzt. Um das Kupfer zu entfernen, wurde der pH-Wert mit einer verdünnten Natriumhydroxidlösung auf 8,0 eingestellt, und Thioacetamid (1,127 g, 15 mmol, 1,5 äquivalente Mengen) wurde hinzugefügt. Das Gemisch ließ man bei Umgebungstemperatur über Nacht rühren. Das reichlich vorhandene fein verteilte schwarze Präzipitat wurde durch Filtration durch ein Bett Kieselgur (Celite®, Aldrich Chemical Company, Inc., Milwaukee, WI) entfernt, der pH-Wert wurde auf 6,5 eingestellt, und die Lösung wurde in einer Säule Dowex 50-X8-400 (Dow Chemical Company, Midland, MI) in der FU-Form (Bettvolumen ungefähr 75 ml) einer Ionenaustauschchromatographie unterzogen. Nachdem das Reaktionsgemisch auf die Säule gegeben wurde, wurde es mit 175 ml Wasser eluiert (bis die ausfließende Flüssigkeit farblos war), gefolgt von 200 ml 2%igem Pyridin in Wasser. Die Fraktionen, die das gewünschte Produkt enthielten, wurden gefriergetrocknet, um 1,266 Gramm eines gelbbraunen bis hellgelben Feststoffs zu ergeben (63% der theoretischen Ausbeute). Das Material ergab die korrekten Molekularionen von 203 für (M + H)&spplus; im positiven FAB-Modus und 201 für (M - H)&supmin; im negativen FAB-Modus. Das C13-NMR-Spektrum zeigte die erwarteten Signale bei 24,67 (Acetatmethyl), 41,49 (terminaler Kohlenstoff von AVG), 56,88 (alpha-Kohlenstoff), 70,96 (Ethermethylen), 100,73 (Vinyl angrenzend dem alpha-Kohlenstoff), 155,78 (Ethervinyl) und 176,65 und 177,14 ppm (Carbonylkohlenstoffe). Die Proton-NMR stimmte mit der vorgeschlagenen Struktur überein. Der Schmelzpunkt von N-actetyl-AVG war 178ºC mit Zersetzung.

BEISPIEL 2 Biosynthese von N-acetyl-AVG in Apfelfrüchten

L-trans-2-amino-4-(2-aminoethoxy)-3-butensäure (AVG), die am alpha-Kohlenstoffatom mit C14 markiert war (Abbott Laboratories, North Chicago, IL), wurde mit einer Konzentration von 144,3 g/l bzw. 532 mCi/l in Wasser aufgelöst. 28 Tage vor dem Tag, von dem man erwartete, daß die Früchte ganz reif sein würden, wurde diese Lösung auf Apfelfrüchte (Malus domestica Borkh., cv. Gordon) aufgebracht. Die Äpfel wurden am Tag 0 (dem Tag der Aufbringung), Tag 7, Tag 14 und Tag 28 zur Analyse von radioaktiven Rückständen geerntet. Die geernteten Äpfel wurden zweimal durch Eintauchen in destilliertes Wasser (100-500 ml/Spülvorgang) gespült, um eventuell auf ihren Oberflächen verbliebenes radioaktives Material zu entfernen. Die Spülflüssigkeiten wurden kombiniert, und die gesamte Radioaktivität der Spülflüssigkeit würde mit einem Flüssigkeitsszintillationszähler (LSC) gemessen.
Jeder Apfel wurde geschält, und die Schale und das Fruchtfleisch wurden getrennt auf Radioaktivität analysiert. Das Gewebe (Fruchtfleisch oder Schale) wurde in kleine Stücke geschnitten und in Flüssigstickstoff eingefroren, in einen Mischer gebracht und zu einem Pulver homogenisiert. Nach der Verbrennung einer homogenisierten Teilmenge wurde die Gesamtradioktivität der Schalen- und Fruchtfleischproben mit einem Flüssigkeitsszintillationszähler gemessen.
Die Spülflüssigkeitsproben wurden außerdem durch phasengewendete Hochdruckflüssigchromatographie auf AVG- und N- actetyl-AVG-Komponenten analysiert. Um einzelne Komponenten in den Schalen- und Fruchtfleischproben zu untersuchen, wurden wässerige Extrakte hergestellt, indem einer gewogenen Teilmenge des pulverisierten Gewebes die fünffache Menge destilliertes Wasser hinzugefügt wurde und das Gemisch 30 Minuten lang heftig geschüttelt und danach zentrifugiert wurde. Der Vorgang der wässerigen Extraktion wurde wiederholt, und die kombinierten Flüssigkeitsüberstände wurden einer Analyse durch phasengewendete Hochdruckflüssigchromatographie unterzogen. An allen Daten nach dem Tag 0 zeigten die chromatographischen Analysen in zwei verschiedenen Systemen für die Schalen- und Fruchfleischproben neben der Spitze, die zusammen mit unveränderter L-trans-2-amino-4-(2-aminoethoxy)-3-butensäure koeluiert wurde, eine radioaktiv markierte Spitze, die zusammen mit einer authentischen Probe von L-trans-2-amino-4-(2- acetamidoethoxy)-3-butensäure koeluiert wurde, die in BEISPIEL 1 hergestellt wurde. Zur Bestätigung der Struktur des Produkts wurde ein Teil eines wässerigen Extrakts des Fruchtfleisches von Äpfeln vom Tag 21 auf pH 3,4 gepuffert und auf SCX-Bond-Elut- SPE-Kartuschen (Varian) gegeben, mit Phosphatpuffer gewaschen und mit 0,5 M wässerigem Ammoniak eluiert. Das eluierte Material wurde auf ein kleines Volumen konzentriert und wiederholt auf ein präparatives Hochdruckflüssigchromatographiesystem (C18- Säule) gespritzt. Die gesammelten Fraktionen, die das markierte Produkt enthielten, wurden auf Mega-Bond-Elut-Silikagel- Kartuschen gegeben (Varian), mit Acetonitril/Wasser gewaschen und eluiert. Das konzentrierte Produkt wurde wieder präparativer Hochdruckflüssigchromatographie in einer Selectosil-SCX-110A- Säule (Phenomenex) mit einem Ammoniumacetat-Puffer-Gradienten unterzogen. Die gesammelten Fraktionen, die das radioaktive Produkt enthielten, ergaben Flüssigchromatographie-/Massenspektroskopie- und Proton-NMR- Spektra, die mit denen identisch waren, die mit eine authentischen Probe von L-trans-2-amino-4-(2-acetamidoethoxy)-3- butensäure, die in Beispiel 1 hergestellt wurde, produziert wurden.
Tabelle 1 zeigt die repräsentativen Konzentrationen von AVG und N-acetyl-AVG, ausgedrückt als ein Prozentsatz der totalen wiedergewonnenen Radioaktivität, gemessen in jeder Apfelfraktion, geerntet an den Tagen 0, 7, 14 und 28. TABELLE 1

BEISPIEL 3 Mungbohnen-Bioassay

Mungbohnensamen (Vigna radiata) wurden in Kunststoffschalen mit einem erdlosen Rindengemisch gepflanzt, dann ließ man sie unter Lichtausschluß bei 25ºC und. einer relativen Luftfeuchtigkeit von über 90% wachsen. Nach vier Tagen wurden 10 Hypokotyl-Segmente (mit einer Länge von 2 cm) aus diesen etiolierten Sämlingen herausgeschnitten und in 25-ml-Flaschen gelegt. Bei jeder Behandlung wurden fünf Wiederholungsversuchsflaschen verwendet. Jede Flasche enthielt 9 ml einer Indolessigsäure (IAA) -Behandlungslösung, einem bekannten Beschleuniger von Ethylenbiosynthese, mit oder ohne Inhibitor. Jede Flasche wurde mit einem Gummiseptum verschlossen und 25 Stunden lang bei 25ºC unter Lichtausschluß inkubiert. Jeder Flasche wurde Headspace-Gas entnommen, und der Ethylengehalt wurde mit einem Gaschromatographen (Hewlett- Packard Model-Nr. 5890) bestimmt, der mit einem FID (Flammenionisationsdetektor) ausgestattet war. Tabelle 2 zeigt die letzten Ethylenkonzentrationsmessungen in parts per million des Ethylens, das pro zehn Segmente und Stunde produziert wurde. Die Ergebnisse zeigen, daß 100 uM N-acetyl-AVG zu einer statistisch signifikanten (p = 0,05) Abnahme der Ethylenbiosynthese führte. TABELLE 2
* Die Daten der Tabellen 2, 3 und 5 wurden unter Anwendung des Duncanschen Mehrbereichstests (Biometrics. 11: 1-42 (1955)) statistisch analysiert. Dieses Verfahren ermöglicht die Durchführung von Vergleichen unter mehreren Mittelwerten oder Durchschnittswerten in einer gegebenen Datenmenge und ist ein weithin angewandte Methode der statischen Analyse von Daten in biologischen Versuchen. Die Ergebnisse werden unter Verwendung einer Buchstabenbezeichnung (d. h. "a" oder "b" usw.) angegeben. Zwei Werte, die mit dem gleichen Buchstaben bezeichnet sind, sind voneinander nicht statistisch signifikant unterschiedlich, während zwei Werte mit unterschiedlichen Buchstabenbezeichnungen statistisch signifikant unterschiedlich sind.

BEISPIEL 4 Baumwollkotyledon-Bioassay

Baumwolle (Gossypium hirsutum) Sorte DP50 wurde in 3-Zoll- Zellen mit einem erdlosen Rindengemisch gepflanzt, dann ließ man sie 10 bis 12 Tage bei 25ºC in einer Wachstumskammer mit abwechselnd 18 Stunden Licht und 6 Stunden Lichtausschluß wachsen. Eine 710-Mikromol-Lösung von 6-Anilinopurin, einem Beschleuniger von Ethylenbiosynthese, mit einem. 0,1%igen siliziumorganischen oberflächenaktiven Stoff wurde auf die achsferne Seite intakter Keimblätter jeder Pflanze gesprüht, dann ließ man die Lösung trocknen. Auf die Kontrollpflanze wurde lediglich 6-Anilinopurin aufgebracht. Bei den behandelten Pflanzen (Keimblätter) wurde auf die achsferne Seite entweder AVG oder N-acetyl-AVG aufgebracht. Die Pflanzen wurden für 48 Stunden in die Wachstumskammer bei 25ºC mit abwechselnd 18 Stunden Licht und 6 Stunden Lichtausschluß zurückgebracht. Paare von Keimblättern wurden herausgeschnitten, gewogen und dann in 50-ml-Zentrifugengläser gelegt, die 1 ml Wasser enthielten. Jedes Glas wurde mit Einem Gummiseptum verschlossen und 4 bis 5 Stunden lang bei 25ºC im Dunkeln inkubiert. Bei jeder Behandlung wurden acht Wiederholungsversuchsgläser verwendet. Jedem Glas wurde Headspace-Gas entnommen, und der Ethylengehalt wurde in einem Gaschromatographen (Hewlett-Packard Model-Nr. 5890) bestimmt, der mit einem FID ausgestattet war. Tabelle 3 zeigt die letzten Ethylenkonzentrationsmessungen in parts per million des Ethylens, das pro Gramm Gewicht der Keimblätter und Stunde produziert wurde. Die Ergebnisse zeigen, daß N-acetyl-AVG die Ethylenproduktion hemmt. TABELLE 3

BEISPIEL 5 Ganzer Pfirsichfrucht-Assay

Frische, ganze Pfirsiche wurden bei einem örtlichen Supermarkt gekauft. Einzelne Früchte wurden jeweils in eines von 24 Ein-Quart-Gefäßen gelegt, die mit Deckeln verschlossen wurden, die Gummisepta enthielten. Nach zwei Stunden wurde jedem Gefäß Headspace-Gas entnommen, und der Ethylengehalt wurde mit einem Gaschromatographen (Hewlett-Packard Model-Nr. 5890) bestimmt, der mit einem FID ausgestattet war. Von den 24 Früchten wurden die 15 Früchte mit den gleichmäßigsten Ethylenproduktionsniveaus gewogen und etikettiert. Fünf der 15 Früchte wurden 15 Minuten lang in jede Behandlungslösung getaucht. Die Behandlungslösungen waren wie folgt:
Lösung Nr. 1 2.5 mM AVG + 0,1%iger nichtionischer oberflächenaktiver Stoff
Lösung Nr. 2 2.5 mM N-acetyl-AVG + 0,1%iger nichtionischer oberflächenaktiver Stoff
Lösung Nr. 3. Kontrolle (lediglich 0,1%iger nichtionischer oberflächenaktiver Stoff)
Bei allen Behandlungen wurde ein siliziumorganischer oberflächenaktiver Stoff in einer Konzentration von 0,1% v/v verwendet. 24 Stunden nach der Behandlung beginnend und mit einer Fortsetzung alle 24 Stunden danach wurden die Früchte zwei bis fünf Stunden lang in Ein-Quart-Gefäße gelegt, und Headspaceproben wurden, wie oben beschrieben, auf Ethylen analysiert. Die Ethylenproduktion wurde auf der Basis von Nanoliter Ethylen pro Gramm Frischgewicht pro Stunde berechnet. Negative Werte für "Tage nach der Behandlung" geben die Anzahl der Tage vor der Behandlung mit der Lösung an. TABELLE 4 Ethylenproduktion aus Pfirsichen
Wie durch die Daten gezeigt, hemmt N-acetyl-AVG die Ethylenproduktion in Pfirsichfrüchten.

BEISPIEL 6 Ganzer ApfelFrucht-Assay

Frische, ganze Äpfel (cv. Granny Smith) wurden bei einem örtlichen Supermarkt gekauft. Vor der Versuchsdurchführung wurde jeder Apfel mit seifigem Wasser gewaschen, um Rückstände auf der Oberfläche zu entfernen. Einzelne Früchte wurden jeweils in eines von 24 Ein-Quart-Gefäßen gelegt, die mit Deckeln verschlossen wurden, die Septa enthielten. Nach zwei Stunden wurde jedem Gefäß Headspace-Gas entnommen, und der Ethylengehalt wurde mit einem Gaschromatogramm (Hewlett-Packard Model-Nr. 5890) bestimmt, das mit einem FID ausgestattet war. Von den 24 ursprünglichen Früchten wurden die 15 Früchte mit den gleichmäßigsten Ethylenproduktionsniveaus gewogen und etikettiert. Fünf der 15 Früchte wurden 15 Minuten lang in jede im Beispiel 5 aufgelistete Behandlungslösung getaucht. 24 Stunden nach der Behandlung beginnend und mit einer Fortsetzung alle 24 Stunden danach wurden die Früchte in Ein-Quart-Gefäße gelegt, die zwei bis fünf Stunden lang verschlossen wurden. Headspaceproben wurden, wie oben beschrieben, auf Ethylen analysiert. Zwischen den Headspaceprobeentnahmeperioden wurden die Gefäße geöffnet und die Früchte den Umgebungsbedingungen ausgesetzt. Die Ethylenproduktion wurde auf der Basis von Nanoliter Ethylen pro Gramm Frischgewicht pro Stunde berechnet. Negative Werte für "Tage nach der Behandlung" geben die. Anzahl der Tage vor der Behandlung mit der Lösung an. TABELLE 5 Ethylenproduktion aus "Granny Smith"-Äpfeln
Die Daten wurden unter Anwendung des Duncanschen Mehrbereichstests statistisch analysiert, wie im Beispiel 3 beschrieben. Wie durch die Daten in der Tabelle 5 gezeigt, hemmen sowohl N-acetyl-AVG als auch AVG die Ethylenproduktion in Äpfeln, wobei die Wirksamkeit von N-acetyl-AVG und die von AVG nach 8 Tagen statistisch nicht unterscheidbar sind.

Claims

1. Die Verbindung L-trans-2-amino-4-(2-acetamidoethoxy)- 3-butensäure mit der Struktur:

oder ein Ester oder Salz davon.

2. Eine Zusammensetzung, die folgendes umfaßt:

a) die Verbindung L-trans-2-amino-4-(2-acetamidoethoxy)- 3-butensäure oder ein Ester oder Salz davon, und

b) einen agronomisch verträglichen Träger.

3. Eine Zusammensetzung, die folgendes umfaßt:

a) die Verbindung L-trans-2-amino-4-(2-acetamidoethoxy)- 3-butensäure oder ein Ester oder Salz davon,

b) einen oder mehrere agronomisch verträgliche Hilfsstoffe, und

c) einen agronomisch verträglichen Träger.

4. Eine Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 2 oder 3, worin der agronomisch verträgliche Träger ein wässeriger Träger ist.

5. Eine Zusammensetzung gemäß Anspruch 4, worin der wässerige Träger Wasser ist.

6. Eine Zusammensetzung gemäß Anspruch 3, worin die agronomisch verträglichen Hilfsstoffe einen oder mehrere Hilfsstoffe umfassen, die gewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Konservierungsmitteln, oberflächenaktiven Stoffen, Benetzungsmitteln, Emulgatoren und Dispersionsmitteln.

7. Eine Zusammensetzung gemäß Anspruch 6, worin die Hilfsstoffe einen nichtionischen oberflächenaktiven Stoff umfassen, und wahlweise einen oder mehrere Hilfsstoffe gewählt aus der Gruppe bestehend aus Konservierungsmitteln, Benetzungsmitteln, Emulgatoren und Dispersionsmitteln.

8. Ein Verfahren zur Hemmung der Ethylenbiosynthese in einer Pflanze, das das Verabreichen einer wirksamen Menge einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 2 an die Pflanze umfaßt.

9. Ein Verfahren zur Hemmung der Ethylenbiosynthese in einer Pflanze, das das Verabreichen einer wirksamen Menge einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 3 an die Pflanze umfaßt.

10. Ein Verfahren gemäß Anspruch 9, worin der agronomisch verträgliche Träger der Zusammensetzung gemäß Anspruch 3 ein wässeriger Träger ist.

11. Ein Verfahren gemäß Anspruch 10, worin der wässerige Träger Wasser ist.

12. Ein Verfahren gemäß Anspruch 11, worin die Zusammensetzung von ungefähr 10 parts per million bis ungefähr 2000 parts per million der L-trans-2-amino-4-(2- acetamidoethoxy)-3-butensäure umfaßt, oder einen Ester oder ein Salz davon.

13. Ein Verfahren gemäß Anspruch 12, worin die Zusammensetzung weiterhin zwischen ungefähr 0,025 Gew.-% bis ungefähr 1 Gew.-% eines nichtionischen oberflächenaktiven Stoffes umfaßt.

14. Ein Verfahren gemäß Anspruch 9, worin die Zusammensetzung auf mindestens eines oder mehrere von Blättern, Knospen, Früchte, Wurzeln, Stengel, Stämme, Zweige oder Blüten dieser Pflanze aufgebracht wird.

15. Ein Verfahren gemäß Anspruch 14, worin die Zusammensetzung auf mindestens eines oder mehrere der Blätter oder Frucht dieser Pflanze aufgebracht wird.

16. Ein Verfahren gemäß Anspruch 14, worin die Zusammensetzung auf mindestens eines oder mehrere der Blätter, Knospen oder Blüten dieser Pflanze aufgebracht wird.