DE69710077T2

DE69710077T2 - Verfahren zur erkennung von verbindungen, die die interaktion von rna und rna-bindeproteinen beeinflussen

Info

Publication number: DE69710077T2
Application number: DE69710077T
Authority: DE
Inventors: L. Beach; Tony Giordani
Original assignee: Bearsden Bio Inc
Current assignee: Message Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1996-07-31
Filing date: 1997-07-31
Publication date: 2003-01-16
Anticipated expiration: 2017-08-01
Also published as: US6107029A; WO1998004923A1; CA2262920A1; DE69710077D1; EP0920631B1; DK0920631T3; EP0920631A1; CA2262920C

Description

Hintergrund der Erfindung

Die Erfindung betrifft den Bereich der Screening-Assays zur Identifizierung von Verbindungen, die Interaktionen zwischen RNA und RNA-Bindeproteinen beeinflussen.
Die Regulation der Proteinfunktion kann auf einer Vielzahl von Ebenen stattfinden: transkriptional, post-transkriptional oder post-translational. Die Modulation der Proteinfunktion ist häufig zur Behandlung von Krankheiten kritisch. Neuere Arbeiten zur Modulierung von Proteinspiegeln durch Veränderung der transkriptionellen Aktivität haben dazu geführt, dass präklinische Forschungsprogramme etabliert und dass Lizensierungsvereinbarungen eingegangen wurden. Ligand Pharmaceuticals, Inc. (San Diego, CA) hat mit großen pharmazeutischen Unternehmen multiple Arzneistoff-Erkennungsprogramxne begonnen, basierend auf deren Technologie, Signalüberträger und Transduktionsaktivatoren als anti-entzündliche, anti- Krebs- und Hormonersatztherapien zu verwenden. Zusätzlich verwendet Oncogene Science, Inc. (Uniondale, NY) seine eigenen Gentranskriptionstechnologien, um biopharmazeutische Produkte zur Behandlung von Krebs herzustellen. Andere Unternehmen wie Signal Pharmaceuticals, Inc. (San Diego, CA) und Tularik, Inc. (San Francisco, CA) entwickeln kleine Moleküle, die Transkriptionsfaktoren regulieren. Während diese Ansätze zwar vielversprechend sind, hat es bisher noch keine Verbindung zu klinischen Studien geschafft. Der Mangel an Spezifität der Transkriptionsfaktoren und das Erfordernis der Lokalisation im Kern stellen zwei Bedenken bei dieser Technologie dar. Im ersten Fall kann ein Arzneistoff, der die Bindung eines Transkriptionsfaktors beeinträchtigt, die Transkription von vielen anderen Genen neben dem Ziel-Gen beeinflussen. Im zweiten Fall ist es schwierig, einen Arzneistoff zu entwickeln, der sowohl mit einem gewünschten Transkriptionsfaktor eine geeignete Interaktion aufweist als auch in den Kern transportiert wird, wo er seinen Effekt ausübt. Die Hemmung der Proteinexpression, bei der man sich die RNA als Ziel setzt, stellt einen alternativen Ansatz dar, an dem Antisense-Technologie beteiligt ist. Die Antisense-Technologie hat auch sehr viel Interesse durch einige Produkte in klinischen Studien hervorgerufen (ISIS2105, ISIS2922 und 1SIS2302). Die größten Nachteile bei diesem Ansatz bestehen jedoch in den Kosten der Oligonukleotide, der Fähigkeit, die Oligonukleotide in Zellen zu transportieren und deren Unfähigkeit, Proteinspiegel zu erhöhen.
An einem großen Teil der post-transkriptionalen Regulation in eukaryotischen Zellen ist die spezifische Interaktion von Proteinen mit RNA beteiligt. Diese RNA-Bindeproteine (RBP) scheinen die Prozessierung von prä-mRNAs, den Transport von mRNA aus dem Kern ins Cytoplasma, die Stabilisierung von mRNA, die translationale Effizienz von mRNA und die Sequestration einiger mRNAs zu vermitteln. In neueren Studien wurden einige RNA-Bindemotive in einer Vielzahl von RBPs identifiziert. Die häufigsten RNA-Bindeprotein-Motive sind das RNP-Motiv, das ARG-reiche Motiv, die RGG-Box, das KH-Motiv und ein doppelsträngiges RNA-Bindemotiv (zur Übersicht vgl. Burd und Dreyfuss, Science 265: 615-621 (1994)). Diese Motive erkennen sowohl Sequenz- als auch Struktur-abhängige RNA-Elemente. Im Fall des doppelsträngigen RNA-Bindemotivs ist die Sequenzerkennung unwichtig. Zusätzlich zur doppelsträngigen Struktur kann jedoch ein positioneller Effekt für die doppelsträngige RNA eine Rolle bei der Erkennung spielen (Bass, Nucleic Acids Symposium 33: 13- 15 (1995)) und einige dieser Proteine können vor ihrer Aktivität auf die doppelsträngige RNA auch die Bindung von Z-DNA erfordern (Herbert et al., PYOC. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7550- 7554 (1995)). Weiterhin ist auch wahrscheinlich, dass andere RNA-Bindeproteine wie AUBF (Malter, Science 246: 664-666 (1989)) in einer Struktur-unabhängigen Weise binden.
Aufgrund der deutlichen Wichtigkeit von RNA/RBP-Interaktionen bei der Regulierung der Gen-Expression würden diese Interaktionen ein attraktives Ziel für Arzneistoffe darstellen, die diese zur Modulierung von Proteinspiegeln in Krankheitszuständen beeinträchtigen würden. Um diese Interaktionen als therapeutische Ziele voll auszunützen, ist jedoch ein klares Verständnis davon nötig, auf welche Weise diese Interaktionen die Expression beeinträchtigen, welche RBPs an der Regulation der interessierenden RNAs beteiligt sind und die Fähigkeit, die modulierenden Effekte der möglichen Arzneistoffe auf die RNA/RBP-Interaktionen zu untersuchen.
Viele Forscher haben zum Nachweis von RNA/Protein-Interaktionen Mobilitäts-Shift-Assays verwendet. Dieses Verfahren wurde z. B. dazu verwendet, Interaktionen zwischen RNA-Bindeproteinen und des 3-untranslatierten Bereichs der Amyloid-Vorläuferprotein-mRNA nachzuweisen (Zaidi et al., J. Biol. Chem. 270: 17292-17298 (1995); Zaidi et al., J. Biol. Chem. 269: 24000-24006 (1994)). Die in einem Labor etablierten Bedingungen versagen jedoch oft dabei, lnteraktionen verschiedener Moleküle nachzuweisen. Weiterhin hat die Vielzahl von RNA-Strukturen und Bindemotiven im Protein zahlreiche Forscher zu der Schlussfolgerung geführt, dass es unmöglich ist, einen einzigen Satz von Bedingungen zum Nachweis multipler verschiedener Interaktionen zu definieren. Während mehr Gene identifiziert werden, die posttranskriptional reguliert werden, würde ein universaler Satz von Bindebedingungen den Nachweis und die Charakterisierung der Moleküle ermöglichen, die an diesen Interaktionen beteiligt sind und würde schließlich Ziele bereitstellen, für die Therapeutika entwickelt werden könnten. Zur Identifizierung von RNA-Bindeproteinen, von RNA-Molekülen und den RNA-Bindestellen, mit denen sie interagieren, und zur Untersuchung dieser Interaktionen wurden zuvor noch keine universellen Assay-Bedingungen beschrieben.
Aufgrund der Vielzahl der RBPs und der Motive war es allgemein erforderlich, für jede RNAIRBP-Kombination individuelle Assay-Bedingungen auszuarbeiten, was zu einem langsamen Fortschritt bei der Untersuchung bekannter RBPs und ihren Interaktionen und zu verlangsamter oder vereitelter Identifizierung zusätzlicher RBPs und ihren RNA-Motiven führte. Einige RNA/RBP-Interaktionen sind einfach unentdeckt geblieben, da die richtigen Assay- Bedingungen nie ausprobiert wurden. Somit besteht ein Bedarf an universelleren Assay- Bedingungen, von denen man erwarten kann, dass sie die Mehrzahl spezifischer RNA/RBP- Interaktionen nachweisen.
Es ist daher ein Ziel der Erfindung, einen Assay zum Nachweis von Interaktionen zwischen jedem RNA-Bindeprotein und seiner zugehörigen RNA-Bindestelle bereitzustellen.
Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, einen Screening-Assay zur Identifizierung von Verbindungen bereitzustellen, die Interaktionen zwischen RNA-Molekülen und RNA-Bindeproteinen beeinträchtigen.

Zusammenfassung der Erfindung

Es wurde entdeckt, dass ein einzelner Satz von Bedingungen dazu verwendet werden kann, nahezu jede Interaktion zwischen RNA-Bindeproteinen und RNA-Molekülen nachzuweisen. Vor dieser Entdeckung dachte man, dass jede spezifische Interaktion getrennte optimierte Bedingungen erforderte, um entdeckt zu werden. Assays, die die offenbarten universellen Bedingungen verwenden, sind zur Identifizierung von RNA-Bindeproteinen nützlich, die mit spezifischen interessierenden RNA-Molekülen interagieren, zum Nachweis von RNA-Molekülen, die mit spezifischen interessierenden RNA-Bindeproteinen interagieren, zur Identifizierung von RNA-Bindeproteinen, die in bestimmten Zelltypen und unter bestimmten physiologischen Bedingungen aktiv sind, und zur Identifizierung von spezifischen Bereichen eines RNA-Moleküls, das mit RNA-Bindeproteinen interagiert. Screening-Assays, die die offenbarten universellen Bedingungen verwenden, sind zur Identifizierung von Verbindungen, die interessierende RNA/RBP-Interaktionen modulieren, nützlich.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 stellt ein digitalisiertes Bild eines Gel-Mobilitäts-Shift-Assay-Gels dar, das die relative Wanderung radioaktiver RNA-Moleküle zeigt. Vier verschiedene radioaktive RNA- Moleküle, AUUUA, Histon, doppelsträngige RNA (dsRNA) und der 5'-untranslatierte Bereich des Glucose-Transporters Typl (Glut1) wurden entweder mit SH-SY5Y oder CHL/260-Proteinextrakt inkubiert. Veränderte Mobilität der RNA-Moleküle in einem Gel zeigt sich durch langsam wandernde radioaktive Banden oder Schmier.
Fig. 2 stellt ein digitalisiertes Bild eines Gel-Mobilitäts-Shift-Assay-Gels dar, das die relative Wanderung radioaktiver RNA-Moleküle zeigt. Vier verschiedene radioaktive RNA- Moleküle, die die Ziele spezifischer RNA-Bindeprotein-Motive darstellen, wurden mit SH- SY5Y oder CHL/260-Proteinextrakt oder rekombinantem Rev-Protein inkubiert. Veränderte Mobilität der RNA-Moleküle in einem Gel zeigt sich durch langsam wandernde radioaktive Banden oder Schmier. Die RNA-Moleküle stellen Ziele für RNA-Bindeproteine dar, die doppelsträngige RNA-Bindemotive (IRE-BF), RGG-Box (APP-BF), Arg-reiche Motive (RRE- BF) und RNP-Motive (U1-BF) enthalten.
Fig. 3 stellt ein digitalisiertes Bild eines Gel-Mobilitäts-Shift-Assay-Gels dar, das die relative Wanderung radioaktiver RNA-Moleküle zeigt. Das radioaktive RNA-Molekül IRE wurde in Anwesenheit (Spuren 3-10) oder Abwesenheit (Spuren 1 und 2) von K562-Proteinextrakt inkubiert und veränderte Mobilität der RNA-Moleküle in einem Gel zeigt sich durch langsam wandernde radioaktive Banden oder Schmier. Assays in den Spuren 5-7 wurden in Anwesenheit von ansteigenden Konzentrationen (100X, 1000X bzw. 10 000X) von unmarkiertem IRE inkubiert. Assays in den Spuren 8-10 wurden in Anwesenheit ähnlicher Konzentrationen eines mutanten IRE inkubiert, das bezüglich der Bindung defekt ist.
Fig. 4 zeigt diagrammartig die Menge an radioaktiv markierter RNA (ausgedrückt in Prozent der Menge an RNA, die in einer Referenz-Bindungslösung auf einem Filter zurückgehalten wurde), die nach der Beladung verschiedener Bindungslösungen auf einem Filter zurückgehalten wurden. Jede der Bindungslösungen enthielt radioaktiv markierte IRE-RNA entweder allein oder einschließlich verschiedener anderer Bestandteile. Die ersten beiden Spuren stellen Bindungslösungen ohne RNA-Bindeprotein dar. RNA und T1 bedeutet, dass die Bindungslösung vor der Beladung auf den Filter mit RNase T1 behandelt wurde. Die verbleibenden Säulen zeigen Bindungslösungen, die RNA-Bindeprotein (K562-Extrakt) enthalten. WT bedeutet, dass die Bindungslösung die angezeigte Menge an unmarkierter Wildtyp-RNA als Kompetitor enthielt. MUT bedeutet, dass die Bindungslösung die angezeigte Menge unmarkierter mutanter RNA als Kompetitor enthielt.
Fig. 5 zeigt diagrammartig die Menge an radioaktiv markierter RNA, die auf einem Filter zurückgehalten wurde (ausgedrückt in Prozent der Menge an RNA, die in einer Referenz-Bindungslösung auf einem Filter zurückgehalten wurde), nach Beladung verschiedener Bindungslösungen. Jede der Bindungslösungen enthielt radioaktiv markierte U1-RNA, entweder allein oder einschließlich verschiedener anderer Bestandteile. Die ersten beiden Säulen stellen Bindungslösungen ohne RNA-Bindeprotein dar. Die verbleibenden Säulen stellen Bindungslösung dar, enthaltend RNA-Bindeprotein (K562-Extrakt). WT bedeutet, dass die Bindungslösung die angezeigte Menge an unmarkierter Wildtyp-RNA als Kompetitor enthielt. MUT bedeutet, dass die Bindungslösung die angezeigte Menge unmarkierter mutanter RNA als Kompetitor enthielt.
Fig. 6 zeigt diagrammartig die Menge an radioaktiv markierter RNA, die auf einem Filter zurückgehalten wurde (ausgedrückt als Prozent der Menge an RNA, die in einer Referenz- Bindungslösung auf einem Filter zurückgehalten wurde), nach Beladung mit verschiedenen Bindungslösungen. Jede der Bindungslösungen enthielt radioaktiv markierte IRE-RNA, entweder allein oder einschließlich verschiedener anderer Bestandteile. Die erste Säule stellt eine Bindungslösung ohne RNA-Bindeprotein dar. Die verbleibenden Säulen stellen Bindungslösungen dar, die RNA-Bindeprotein (K562-Extrakt) enthalten. Hämin bedeutet, dass die Bindungslösung die angezeigte Menge an Hämin als Testverbindung enthielt. Desferal und des zeigen an, dass die Bindungslösungen die angezeigten Mengen an Desferroxiamin als Testverbindung enthielten.
Fig. 7 zeigt diagrammartig die Menge an auf einem Filter zurückgehaltener radioaktiv markierter RNA (ausgedrückt als Prozent der Menge an RNA, die in einer Referenz-Bindungslösung auf einem Filter zurückgehalten wurde), nach Beladung verschiedener Bindungslösungen. Jede der Bindungslösungen enthielt radioaktiv markierte AUUUA-RNA, entweder allein oder einschließlich verschiedener anderer Bestandteile. Die erste Säule stellt eine Bindungslösung ohne RNA-Bindeprotein dar, die verbleibenden Säulen stellen Bindungslösung dar, die RNA-Bindeprotein (K562-Extrakt) enthält. Die Säulen 3-8 entsprechen Bindungslösungen, die die angezeigte Testverbindung enthalten.
Fig. 8 zeigt diagrammartig die Menge an auf einem Filter zurückgehaltener radioaktiv markierter RNA (ausgedrückt als Prozent der Menge an RNA, die in einer Referenz-Bindungslösung auf einem Filter zurückgehalten wurde), nach Beladen mit verschiedenen Bindungslösungen. Abwechselnde Säulen entsprechen Bindungslösungen, die radioaktiv markierte AUUUA-RNA oder IRE-RNA enthielten, entweder allein oder einschließlich verschiedener anderer Bestandteile. Die ersten beiden Säulen stellen Bindungslösungen ohne RNA-Bindeprotein dar. Die verbleibenden Säulen stellen Bindungslösung dar, die RNA-Eindeprotein (K562-Extrakt) enthalten. Die Säulen 5-40 entsprechen Bindungslösungen, die die angezeigte Menge der angezeigten Testverbindung enthalten.
Fig. 9A ist ein Diagramm, das die der Höhe der RNA/RBP-Interaktionen (zwischen der TNF-α 3'-untranslatierten Region und humanen Zell-RBPs) in An- oder Abwesenheit von Testverbindungen zeigt. Die Interaktion radioaktiv markierter TNF-α RNA mit humanen Zellextrakten wurde in einem Hochdurchsatz-Screening-Assay, wie in Beispiel 4 beschrieben, nachgewiesen. Die erste Säule zeigt RNA allein. Die zweite Säule zeigt RNA plus Extrakt. Die verbleibenden Säulen zeigen RNA plus Extrakt in Anwesenheit spezifischer Verbindungen.
Fig. 9B ist ein Diagramm der konzentrationsabhängigen Hemmung der TNF-α RNA/RBP- Interaktion durch die Verbindung SYM 1405. Ein Kontroll-Assay mit dem "fron response element" zeigt, dass der Effekt spezifisch für TNF-α ist.
Fig. 10 stellt ein Diagramm der Strukturen der Verbindungen SYM 1301, SYM 1405 und SYM 1710 dar.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Es werden universelle Bedingungen und Verfahren offenbart, die auf jedes RNA-Molekül und jedes RNA-Bindeprotein angewandt werden können, um Interaktionen zwischen ihnen nachzuweisen. Das grundlegende Nachweisverfahren kann angepasst werden, um Interaktionen zwischen RNA-Bindeproteinen und RNA-Molekülen im Massenansatz nachzuweisen, um Interaktionen zwischen RNA-Bindeproteinen und einem spezifischen RNA-Molekül und um Interaktionen zwischen RNA-Molekülen und einem spezifischen RNA-Bindeprotein nachzuweisen. Das Nachweisverfahren kann somit dazu verwendet werden, um z. B. alle in einer Probe, wie einer Zelle oder einem Gewebeextrakt anwesenden RNA-Bindeproteine mit einem spezifischen RNA-Molekül wie einem Transkript eines interessierenden Gens nachzuweisen. In ähnlicher Weise kann das Nachweisverfahren dazu verwendet werden, alle RNA-Moleküle, die in einer Probe, wie einer Zelle oder einem Gewebeextrakt anwesend sind, mit einem spezifischen RNA-Bindeprotein nachzuweisen.
Das Nachweisverfahren und ein Kit dafür ist als Forschungswerkzeug nützlich, sowohl zur Identifizierung von Interaktionen zwischen RNA-Molekülen und RNA-Bindeproteinen als auch zur Identifizierung von Verbindungen, die solche Interaktionen modulieren. Verbindungen, die in einem solchen Screening-Assay identifiziert werden, könnten zur Regulation der Expression interessierender RNA-Moleküle nützlich sein. Die Wichtigkeit der Interaktionen zwischen RNA-Molekülen und RNA-Bindeproteinen würde vorstehend beschrieben. Alle Anwendungen können durch Verwendung des grundlegenden Nachweisverfahrens und spezifischer, hier beschriebener Anpassungen des grundlegenden Nachweisverfahrens durchgeführt werden.
Es wurde entdeckt, dass ein einzelner Satz von Bedingungen dazu verwendet werden kann, nahezu jede Interaktion zwischen RNA-Bindeproteinen und RNA-Molekülen nachzuweisen. Diese Bedingungen ermöglichen nachweisbare Komplexe zwischen RNA-Bindeproteinen und RNA-Molekülen und es wird angenommen, dass sie physiologische Bedingungen in Zellen nachahmen, in denen solche Interaktionen normalerweise auftreten. Vor dieser Entdeckung hat man angenommen, dass jede spezifische Interaktion getrennte optimierte Bedingungen erforderte, um nachgewiesen zu werden.
Interaktionen zwischen RNA-Bindeproteinen und RNA-Molekülen, die hier als "möglich" bezeichnet werden, bezeichnen jene Interaktionen, die spezifisch sind (z. B. in vivo oder optimierte Binde-Assay-Bedingungen). Im Kontext des offenbarten universellen Verfahrens zum Nachweis von Interaktionen zwischen RNA-Bindeproteinen und RNA-Molekülen wird das Verfahren eine Mehrzahl der Interaktionen, die zwischen RNA-Bindeproteinen und RNA- Molekülen möglich sind, nachweisen. Die Bedeutung des Begriffs "spezifische Interaktion" ist im Allgemeinen so zu verstehen, dass Interaktionen auf spezifischen Charakteristika der interagierenden Moleküle basieren und nicht auf allgemeinen Charakteristika. So erkennen und binden z. B. spezifische RNA-Bindeproteine spezifisch an Stellen in RNA-Molekülen, die die Nukleotidsequenz AUUUA aufweisen. Dies ist eine spezifische Interaktion. Umgekehrt binden einige Proteine RNA-Moleküle allgemein (d. h. nicht spezifisch), basierend auf den allgemeinen chemischen Charakteristika aller RNA-Moleküle. Eine Interaktion kann allgemein durch die Bestimmung, dass die Interaktion in Anwesenheit eines nicht-spezifischen Kompetitors verhindert werden kann, als eine nicht-spezifische Interaktion identifiziert werden. Bevorzugte Assay-Bedingungen für den offenbarten universellen Assay sind jene, die den Nachweis von Interaktionen zwischen Proteinen in einem SH-SY5Y-Proteinextrakt und dem 3'-untranslatierten Bereich des Amyloid-Vorläuferproteins, vier Wiederholungen der AUUUA-Sequenz aus instabilen RNAs (Malter, Science 240: 668-670 (1989)) und Poly(A) ermöglichen, da der Nachweis solcher unterschiedlicher RNA/RBP-Interaktionen als bezeichnend dafür angesehen wird, viele RNA/RBP-Interaktionen nachweisen zu können.

I. Bestandteile

A. Bindungslösung

Interaktionen zwischen RNA-Bindeproteinen und RNA-Molekülen werden in einer Bindungslösung erleichtert. Die Bindungslösung enthält eines oder mehrere RNA-Moleküle und Pufferbestandteile. Die Pufferbestandteile schließen einen Puffer, ein einwertiges Kation, ein zweiwertiges Kation, ein Reduktionsmittel und ein Dichtemittel ein. Es ist bevorzugt, dass der Puffer Bis-Tris-Propan bei einem pH-Wert von etwa 8,5 und einer Konzentration von etwa 7,5 mM ist, wobei das einwertige Kation K&spplus; bei einer Konzentration von etwa 50 mM, das zweiwertige Kation Mg&spplus;&spplus; bei einer Konzentration von etwa 1 mM, das Reduktionsmittel Dithiothreitol bei einer Konzentration von etwa 0,2 mM und das Dichtemittel Glycerin bei einer Konzentration von etwa 10% (v/v) vorliegt.
Diese Bedingungen wurden optimiert, um universell anwendbar zu sein. Es wird am meisten bevorzugt, dass die optimalen Bedingungen verwendet werden. Es können jedoch ein oder weniger bevorzugt zwei der Pufferbestandteile in der nachstehend offenbarten Weise verändert werden. Zur Variation verschiedener Pufferbestandteile wird bevorzugt, dass (1) der Puffer HEPES oder Bis-Tris-Propan ist, jeweils bei einem pH zwischen 8 und 10 und in einer Konzentration von zwischen etwa 5 bis etwa 100 mM, (2) dass das einwertige Kation K&spplus;, Na&spplus; oder NH&sub4;&spplus; ist, jeweils in einer Konzentration von zwischen 0 und etwa 100 mM, (3) dass das zweiwertige Kation Mg&spplus;&spplus;, Ca&spplus;&spplus; oder Fe&spplus;&spplus; ist, jedes in einer Konzentration zwischen 0 und etwa 5 mM, (4) dass das Reduktionsmittel Dithiothreitol oder β-Mercaptoethanol bei einer Konzentration von zwischen 0 und etwa 1 mM ist, und dass das Dichtemittel Glycerin oder Polyethylenglykol in einer Konzentration von zwischen 0 und etwa 20% (v/v) ist.
Für die meisten RNA-Moleküle scheint das Reduktionsmittel nicht kritisch zu sein, obwohl es eine Tendenz für eine etwas bessere Bindung in Anwesenheit eines Reduktionsmittels, bevorzugt DTT, gibt. In einigen Fällen macht das Reduktionsmittel jedoch einen signifikanten Unterschied beim Nachweis von Interaktionen aus. Demgemäss ist die Verwendung eines Reduktionsmittels bevorzugt. Ein Dichtemittel scheint zum Nachweis der Interaktion zwischen RNA-Molekülen und RNA-Bindeproteinen nicht erforderlich zu sein. Wenn Interaktionen jedoch durch Gel-Mobilitäts-Shift analysiert werden, erhöht die Anwesenheit eines Dichtemittels die Qualität der Banden. Demgemäss ist die Verwendung eines Dichtemittels bevorzugt.
Die Bindungslösung kann andere Bestandteile enthalten, die bei der Bildung spezifischer Interaktionen helfen. So kann z. B. ein Kompetitor nicht-spezifischer RNA/Protein-Interaktionen zugegeben werden, um den Hintergrund nicht-spezifischer Interaktionen zu vermindern. Poly r(G), tRNA und Heparin sind bevorzugte Kompetitoren nicht-spezifischer RNA-Protein- Interaktionen.
Es ist beabsichtigt, dass ein Konzentrationsbereich, der als zwischen 0 und einer spezifischen Konzentration angegeben ist, keine Konzentration von 0 umfasst, aber die spezifische Konzentration und Konzentrationen umfasst, die etwa 10% größer als die spezifische Konzentration sind. Es ist ebenfalls beabsichtigt, dass ein Konzentrationsbereich, der angegeben ist als zwischen etwa einer ersten spezifischen Konzentration und etwa einer zweiten spezifischen Konzentration die erste spezifische Konzentration, Konzentrationen bis zu etwa 10% niedriger als die erste spezifische Konzentration, Konzentrationen zwischen den ersten und zweiten spezifischen Konzentrationen, die zweite spezifische Konzentration und Konzentrationen bis zu etwa 10% höher als die zweite spezifische Konzentration umfasst. Es ist beabsichtigt, dass ein Konzentrationsbereich, der angegeben ist als von einer ersten spezifischen Konzentration bis zu einer zweiten spezifischen Konzentration, die erste spezifische Konzentration, Konzentrationen zwischen den ersten und zweiten spezifischen Konzentrationen und die zweite spezifische Konzentration umfasst. Es ist ebenfalls beabsichtigt, dass ein Konzentrationsbereich, der als ausgehend von 0 bis zu einer spezifischen Konzentration angegeben ist, eine Konzentration von 0, Konzentrationen zwischen 0 und der spezifischen Konzentration und die spezifische Konzentration umfasst.
Wenn nicht anders angegeben, ist beabsichtigt, dass alle Konzentrationen der Pufferbestandteile die Endkonzentration dieser Bestandteile in einer vollständig gebildeten Bindungslösung sind. Der Bindepuffer kann durch jede Kombination von Bestandteilen gebildet werden, die zur beabsichtigten Endkonzentration führen. Eine Bindungslösung kann z. B. hergestellt werden, indem eine einzelne Vorratslösung von Pufferbestandteilen, getrennte Vorratslösungen von Pufferbestandteilen oder getrennte Vorratslösungen von Kombinationen einiger der Pufferbestandteile mit anderen Bestandteilen der Bindungslösung vermischt werden. Es wird ebenfalls beabsichtigt, dass, die Endkonzentration der Pufferbestandteile durch Vermischen verschiedener Lösungen erreicht werden kann, die jeweils einen Teil der Gesamtmenge eines gegebenen Bestandteils enthalten. So kann z. B. ein Teil des zweiwertigen Kations als Teil einer Vorratslösung zugegeben werden und ein Teil kann mit der RNA zugegeben werden.
Es wird bevorzugt, die Konzentrationen störender Verbindungen in Bindungslösungen auf einem Minimum zu halten. Es wird jedoch angenommen, dass Proben von RNA-Bindeproteinen und RNA-Molekülen zusätzliche Verbindungen enthalten können. Die Konzentration solcher Verbindungen in der Bindungslösung kann z. B. durch größtmögliche Verdünnung der Probe bei der Herstellung der Bindungslösung vermindert werden.

B. RNA-Bindeproteine

RNA-Bindeproteine zur Verwendung im offenbarten Verfahren können Teil eines rohen zellulären Extrakts oder Kernextrakts sein, teilweise aufgereinigt oder umfassend aufgereinigt. RNA-Bindeproteine können entweder isoliert oder in Kombination mit einem oder mehreren anderen RNA-Bindeproteinen verwendet werden. Bevorzugt werden drei oder mehr, vier oder mehr oder fünf oder mehr RNA-Bindeproteine verwendet. Wenn das Ziel darin besteht, RNA- Bindeproteine in einer Probe zu identifizieren, wird bevorzugt, dass die Probe ein ungereinigter oder teilweise aufgereinigter Extrakt ist, so dass die größte Verschiedenheit an RNA- Bindeproteinen anwesend ist. Wenn das Ziel darin besteht, RNA-Moleküle zu identifizieren oder Teile eines RNA-Moleküls, das mit einem spezifischen RNA-Bindeprotein interagiert, wird bevorzugt, dass das RNA-Bindeprotein im Wesentlichen aufgereinigt ist.
RNA-Bindeproteine können anhand bekannter Verfahren zur Herstellung von zellulären Extrakten und zur Aufreinigung von Proteinen hergestellt werden. Verfahren zur Herstellung von Extrakten, die RNA-Bindeproteine enthalten und zur Aufreinigung bekannter RNA-Bindeproteine sind z. B. in Ashley et al., Science 262: 563-566 (1993); Rouault et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5768-5772, 1989; Neupert et al., Nucleic Acids Research 18 51-55 (1990); Zhang et al., Molecular and Cellular Biology 13: 7652-7665 (1993), und in in Burd und Dreyfuss, Science 265: 615-621 (1994) zitierten Referenzen beschrieben. Einzelne RNA-Bindeproteine können auch rekombinant durch bekannte Verfahren hergestellt werden. DNA, die für RNA-Bindeproteine kodiert, kann aus bekannten Klonen durch Synthese eines DNA- Moleküls, das für ein RNA-Bindeprotein mit einer bekannten Aminosäuresequenz kodiert, oder durch Klonierung des Gens, das für das RNA-Bindeprotein kodiert, erhalten werden. Verfahren zur rekombinanten Expression von Proteinen und Verfahren zur Klonierung von Genen, die bekannte Proteine kodieren, werden z. B. von Sambrook et al., Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) beschrieben.
Der Nachweis von Interaktionen zwischen RNA-Bindeproteinen und RNA-Molekülen kann erleichtert werden, indem eine nachweisbare Markierung an das RNA-Bindeprotein angeheftet wird. Im Allgemeinen können Markierungen, von denen man weiß, dass sie für Proteine nützlich sind, dazu verwendet werden, RNA-Bindeproteine zu markieren. Bevorzugte Markierungen für RNA-Bindeproteine sind ¹²&sup5;I ³H und ³&sup5;S. Wenn das RNA-Bindeprotein rekombinant hergestellt wird, kann es durch Einbau markierter Aminosäuren markiert werden. Verfahren zur Markierung und zum Nachweis markierter Proteine sind gut bekannt und werden z. B. in Sambrook et al. und Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc., 1996) beschrieben. Der Nachweis von RNA-Bindeproteinen kann ebenfalls mit Antikörpern durchgeführt werden, die spezifisch für das RNA-Bindeprotein sind. Die Herstellung und die Verwendung von Antikörpern zu diesem Zweck ist gut bekannt und wird z. B. in Johnstone und Thorpe, Immunochemistry in Practice (Blackwell Scientific Publications, 1987) beschrieben.

C. RNA-Moleküle

RNA-Moleküle zur Verwendung im offenbarten Verfahren können Teil eines rohen zellulären Extrakts oder Kernextrakts sein, teilweise aufgereinigt oder umfassend aufgereinigt. RNA- Moleküle können ebenfalls durch in vitro Transkription oder durch direkte Synthese hergestellt werden. RNA-Moleküle können entweder isoliert oder in Kombination mit einem oder mehreren anderen RNA-Molekülen verwendet werden. Bevorzugt werden drei oder mehr, vier oder mehr oder fünf oder mehr RNA-Moleküle verwendet. Wenn das Ziel darin besteht, RNA-Moleküle in einer Probe zu identifizieren, wird bevorzugt, dass die Probe ein unaufgereinigter oder teilweise aufgereinigter Extrakt ist, so dass die größte Vielzahl an RNA-Molekülen anwesend sein wird. Wenn das Ziel darin besteht, RNA-Bindeproteine zu identifizieren, die mit spezifischen RNA-Molekülen interagieren, wird bevorzugt, dass die RNA-Moleküle im Wesentlichen aufgereinigt sind. Zu diesem Zweck ist es am meisten bevorzugt, dass das RNA-Molekül in vitro hergestellt wird.
RNA-Moleküle können mit bekannten Verfahren zur Herstellung zellulärer Extrakte und zur Aufreinigung von RNA hergestellt werden. Verfahren zur Präparation von Extrakten, die RNA-Moleküle enthalten, werden z. B. in Sambrook et al. und Ausubel et al. beschrieben. Einzelne RNA-Moleküle können ebenfalls rekombinant mit bekannten Verfahren, durch in vitro Transkription und durch direkte Synthese hergestellt werden. Zur rekombinanten und in vitro Transkription kann DNA, die für RNA-Moleküle kodiert, durch Synthese eines DNA- Moleküls, das für ein RNA-Molekül kodiert, oder durch Klonieren des Gens, das für die RNA-Moleküle kodiert, aus bekannten Klonen erhalten werden. Verfahren zur in vitro Transkription von RNA-Molekülen und Verfahren zur Klonierung von Genen, die für bekannte RNA-Moleküle kodieren, werden z. B. von Sambrook et al. beschrieben.
Der Nachweis von Wechselwirkungen zwischen RNA-Bindeproteinen und RNA-Molekülen kann erleichtert werden, indem eine nachweisbare Markierung an das RNA-Molekül angeheftet wird. Im Allgemeinen können Markierungen, von denen man weiß, dass sie nützlich für Nukleinsäuren sind, dazu verwendet werden, RNA-Moleküle zu markieren. Beispiele geeigneter Markierungen schließen radioaktive Isotope wie 33P, 3aP und 355 ein, Fluoreszenzmarkierungen wie Fluorescein (FITC), 5,6-Carboxymethylfluorescein, Texas-Rot, Nitrobenz-2- oxa-1,3-diazol-4-yl (NBD), Coumann, Dansylchlorid, Rhodamin, 4'-6-Diamidino-2-phenylinodol (DAPI) und die Cyanin-Farbstoffe Cy3, Cy3.5. Cy5, Cy5.5 und Cy7 und Biotin.
Markierte Nukleotide stellen die bevorzugte Form der Markierung dar, da sie während der Synthese direkt in die RNA-Moleküle eingebaut werden können. Beispiele von Nachweismarkierungen, die in amplifizierte RNA eingebaut werden können, schließen Nukleotid-Analoga wie BrdUrd (Hoy und Schimke, Mutation Research 290: 217-230 (1993)), BrUTP (Wansick et al., 1 Cell Biology 122: 283-293 (1993)) und Nukleotide ein, die mit Biotin modifiziert sind (Langer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 6633 (1981)) oder mit geeigneten Haptenen wie Digoxygenin (Kerkhof, Anal. Biochem. 205: 359-364 (1992)). Geeignete fluoreszenzmarkierte Nukleotide sind Fluorescein-Isothiocyanat-dUTP, Cyanin-3-dUTP und Cyanin-4-dUTP (Yu et al., Nucleic Acids Res. 22: 3226-3232 (1994)). Eine bevorzugte Nukleotid-Analogon- Markierung für RNA-Moleküle ist Biotin-14-cytidin-5'-Triphosphat. Fluorescein, Cy3 und Cy5 können zur direkten Markierung an dUTP gekoppelt werden. Cy3.5 und Cy7 sind als Avidin oder anti-Digoxygenin-Konjugate zum sekundären Nachweis von Biotin- oder Digoxygenin-markierten Sonden erhältlich.
Markierungen, die wie Biotin in RNA-Moleküle eingebaut werden, können anschließend durch Verwendung empfindlicher Verfahren, die gut bekannt sind, nachgewiesen werden. So kann z. B. Biotin durch ein Streptavidin-alkalische Phosphatase-Konjugat (Tropix, Inc.) nachgewiesen werden, welches an das Biotin gebunden wird und nachfolgend durch Chemilumineszenz geeigneter Substrate nachgewiesen wird (z. B. das chemilumineszente Substrat CSPD: Dinatrium, 3-(4-Methoxyspiro-[1,2,-dioxetan-3-4'-(5'-chloro)tricyclo [3.3.1.13,7]decan]-4-yl)- phenylphosphat; Tropix, Inc.).

II. Verfahren

Das grundlegende Verfahren zum Nachweis von Interaktionen zwischen RNA-Molekülen und RNA-Bindeproteinen beinhaltet die Herstellung einer Bindungslösung, die RNA-Moleküle und einen 1X Bindungspuffer enthält, das Erhitzen der Bindungslösung, um die RNA-Moleküle zu denaturieren, das Abkühlen der Bindungslösung auf Reaktionstemperatur, die Zugabe der RNA-Bindeproteine zur Bindungslösung und den Nachweis der Interaktionen zwischen den RNA-Molekülen und den RNA-Bindeproteinen.

A. Herstellen der Bindungslösung

Die Bindungslösung enthält ein oder mehrere RNA-Molekül(e), Pufferbestandteile und nicht- spezifische Kompetitoren. Die Pufferbestandteile schließen einen Puffer, ein einwertiges Kation, ein zweiwertiges Kation, ein Reduktionsmittel und ein Dichtemittel ein. Die Bindungslösung wird durch Kombination und/oder Vermischen der Bestandteile der Bindungslösung in einer Weise hergestellt, die in einer Bindungslösung resultiert, die die erforderliche Zusammensetzung aufweist. Der Bindungspuffer kann durch jede Kombination von Bestandteilen gebildet werden, die zur beabsichtigten Endkonzentration führt. So kann z. B. eine Bindungslösung hergestellt werden, indem eine einzige Vorratslösung von Pufferbestandteilen, getrennte Vorratslösungen von Pufferbestandteilen oder getrennte Vorratslösungen von Kombinationen einiger der Pufferbestandteile mit anderen Bestandteilen der Bindungslösung zusammen vermischt werden. Es wird ebenfalls beabsichtigt, dass die Endkonzentration der Pufferbestandteile durch Vermischen verschiedener Lösungen erreicht werden kann, die jeweils einen Teil der Gesamtmenge einer gegebenen Komponente enthalten. So kann z. B. ein Teil des zweiwertigen Kations als Teil einer Vorratslösung und ein Teil kann mit der RNA zugegeben werden. Somit ist die Art, auf der man die Endzusammensetzung der Bindungslösung erreicht, nicht kritisch. Es ist beabsichtigt, dass jede Kombination von Lösungen und Bestandteilen, die dieses Ergebnis erreicht, durch diesen Schritt umfasst ist.

B. Erhitzen und Abkühlen der Bindungslösung

Die gebildete Bindungslösung wird erhitzt und abgekühlt, um jede Struktur höherer Ordnung in den RNA-Molekülen zu denaturieren. Solche Strukturen können die RNA-Moleküle gegenüber RNA-Bindeproteinen weniger zugänglich machen. Wenn RNA-Moleküle verwendet werden, die aus natürlichen Quellen aufgereinigt werden, ist es auch möglich, dass andere Moleküle an die RNA gebunden bleiben. Der Schritt der Erhitzung kann dazu dienen, solche Moleküle freizusetzen. Der Erhitzungs- und Abkühlungsschritt beinhaltet die Behandlung der Bindungslösung mit einer Hitzequelle, bis sie eine ausreichende Temperatur erreicht, und dann das Abkühlen der Lösung auf die Reaktionstemperatur. Die Temperatur, auf die die Bindungslösung erhitzt wird, kann jede Temperatur sein, die die RNA-Moleküle, die in der Bindungslösung anwesend sind, im Wesentlichen denaturieren wird. Es ist klar, dass für verschiedene RNA-Moleküle verschiedene Temperaturen ausreichend sein werden. Beispielsweise werden kürzere RNA-Moleküle und RNA-Moleküle mit einem niedrigen GC-Gehalt im Allgemeinen bei niedrigeren Temperaturen im Wesentlichen denaturiert sein. Es wird jedoch bevorzugt, dass eine einzige Temperatur für den Erhitzungsschritt verwendet wird. In diesem Fall wird bevorzugt, dass eine Temperatur, die ausreichend ist, um im Wesentlichen RNA- Moleküle im Allgemeinen zu denaturieren, verwendet wird. Eine bevorzugte Temperatur ist 80-85ºC. Nach Abkühlenlassen der Lösung auf Reaktionstemperatur wird das RNA-Bindeprotein zur Bindungslösung vor der Inkubation bei der geeigneten Temperatur für RNA-Proteinbindung, bevorzugt 37ºC, zugegeben.

C. Nachweis von Interaktionen

Interaktionen zwischen RNA-Bindeproteinen und RNA-Molekülen können durch jedes geeignete Verfahren nachgewiesen werden. Es ist bevorzugt, dass der Nachweis die Trennung von interagierenden RNA-Molekülen und RNA-Bindeproteinen von nicht-interagierenden RNA- Molekülen involviert. Dies kann z. B. durch Auftrennen der Bestandteile in der Bindungslösung auf Basis der Größe oder physikalischer Eigenschaften durchgeführt werden. Zwei bevorzugte Verfahren zur Auftrennung und zum Nachweis von interagierenden RNA-Molekülen und RNA-Bindeproteinen sind Filterbindung und Gel-Mobilitäts-Shift.
1. Filterbindung. Die Filterbindung beinhaltet das Einfangen von interagierenden Molekülen auf einem Filter, während nicht-interagierende Moleküle durch den Filter hindurch passieren.
Dieses Verfahren ist dem Fachmann bekannt. Es werden z. B. vorbefeuchtete Nitrozellulosefilter in 1 · Bindungspuffer equilibiert. Die Bindungsreaktion wird dann durch Vakuumfiltration auf den Filter aufgebracht, um ungebundene RNA zu entfernen. Der Filter wird dann in 1X Bindungspuffer gewaschen, ein Szintillations-Cocktail wird zugegeben und die Menge an Protein-gebundener RNA wird durch Szintillationszählung bestimmt.
Bei Assays, die Filterbindung beinhalten, wird ebenfalls bevorzugt, dass ein nicht-interagierender Kontroll-Assay durchgeführt wird. Solch eine Kontrolle wird dazu verwendet, das nachweisbare Signal zu bestimmen, das in Abwesenheit spezifischer RNA/RNA-Bindeprotein-Interaktion zurückbleibt. Bevorzugt wird solch ein nicht-interagierender Kontroll-Assay durch Austausch eines mutanten RNA-Moleküls - ein Molekül, das nicht-spezifisch mit dem RNA-Bindeprotein interagiert - gegen das RNA-Molekül durchgeführt, das in entsprechenden Binde-Assays verwendet wird. Die Höhe des nachweisbaren Signals, das an den Filter in der nicht-interagierenden Kontrolle gebunden ist, zeigt den Beitrag des Hintergrunds oder des nicht-spezifischem Signals an, das in der Höhe des nachweisbaren Signals anwesend ist, das für die Bindungs-Assays gemessen wird. In dem Hochdurchsatz-Screening-Assay ist die nicht-interagierende Kontrolle ebenfalls eine Kontrolle für die Kontroll-Assays (d. h. Assays, die keine Testverbindung enthalten). Es wird erwartet, dass die Höhe an Hintergrundsignal durch Benützung einer niedrigen Konzentration von Detergens im Waschpuffer vermindert werden kann. Bevorzugte Detergenzien für diesen Zweck sind Tween 20 und Triton N-101. Für einen gegebenen Satz von Testreaktionen kann ein nicht-interagierender Kontroll-Assay dazu verwendet werden, die Wirksamkeit der Waschschritte zu bestimmen.
Es ist bevorzugt, dass die Konzentration von RNA-Bindeprotein in den offenbarten Assays wenigstens 0,1 ug/ul oder zwischen 0,1 ug/ul und 1,0 ug/ul beträgt. Für Assays mit Filterbindung ist der Filter bevorzugt entweder reine Nitrozellulose oder ein gemischter Zelluloseester (gemischtes Zelluloseacetat). Für den offenbarten Assay haben die gemischten Zelluloseester- Filter mehr Zählwerte ("counts") gebunden als reine Nitrozellulose. Für die Filter wird eine 0,2 um Porengröße (Ausschluss von 8000 Dalton Molekulargewicht) am meisten bevorzugt, obwohl MCA-Filterplatten mit einer Porengröße von 0,45 um (Ausschluss von 20 000 Dalton Molekulargewicht) ebenfalls bevorzugt werden. Der Ausschluss von niedrigerem Molekulargewicht ermöglicht den Nachweis von Binde-Interaktionen zwischen RNA und Molekülen von geringerem Molekulargewicht. Für den Hochdurchsatz-Screening-Assay wird bevorzugt, dass die Bindungsreaktionen in 96-Loch-Pohrstyrolplatten in einem Endvolumen von 10 oder 100 ul durchgeführt werden. Nach der Bindung werden die Proben auf eine 96-Loch-Millipore-Filterplatte geladen.
Für Assays mit Filterbindung wird bevorzugt, dass nach der Inkubation und vor der Beladung auf den Filter die Reaktionen in einem Endvolumen von 10 ul auf ein größeres Endvolumen gebracht werden, bevorzugt ein Endvolumen von 110 ul durch Zugabe einer Lösung, die als Verdünnungslösung bezeichnet wird. Bevorzugte Verdünnungslösungen enthalten 1X BTP Bindungspuffer mit Glycerin, 1X BTP ohne Glycerin, TE, PBS und TCA, wobei 1X BTP ohne Glycerin am meisten bevorzugt wird. Es ist am meisten bevorzugt, dass die Verdünnungslösung die gleichen Pufferbestandteile (bevorzugt in der gleichen Endkonzentration) wie in der Bindungslösung enthält, mit der Ausnahme, dass das Dichtemittel fehlt. Diese Verdünnung ermöglicht eine gleichmäßigere Beladung der Probe auf die Filterplatte. Es ist beabsichtigt, dass das bevorzugte verwendete Endvolumen sich in Abhängigkeit von dem Bereich des Filters, auf den die Assay-Lösung aufgetragen wird, unterscheiden sollte. Dies bedeutet, dass Assays, in denen größere Filterbereiche verwendet werden, bevorzugt auf ein Endvolumen von mehr als 110 ul gebracht werden und Assays, in denen kleinere Filterbereiche verwendet werden, bevorzugt auf ein Endvolumen von weniger als 110 ul gebracht werden.
Es ist bevorzugt, dass die Assay-Lösung unter Vakuum auf den Filter aufgetragen wird. Nach der Beladung werden die Filter bevorzugt zweimal gewaschen. Bevorzugte Waschpuffer (ebenfalls bezeichnet als Waschlösung) schließen 1X BTP Bindungspuffer mit Glycerin, 1X BTP ohne Glycerin, TE, PBS und TCA ein, wobei 1X BTP ohne Glycerin insbesondere bevorzugt ist. Es wird insbesondere bevorzugt, dass der Waschpuffer die gleichen Pufferbestandteile (bevorzugt in der gleichen Endkonzentration) wie die Bindungslösung aufweist, mit der Ausnahme, dass das Dichtemittel fehlt. Es ist ebenfalls bevorzugt, dass der Waschpuffer kalt ist (d. h. unter Raumtemperatur).
2. Gel-Mobilitäts-Shift. Gel-Mobilitäts-Shift beinhaltet die Auflösung interagierender und nicht-interagierender RNA-Moleküle und RNA-Bindeproteine auf einem Gel durch Elektrophorese und Sichtbarmachung der Position und der Menge an Komponenten, die in verschiedenen Ausmaßen wandern. Interagierende RNA-Moleküle und RNA-Bindeproteine tendieren dazu, in dem Gel aufgrund ihrer größeren Masse weniger als nicht-interagierende Moleküle zu wandern. Gel-Mobilitäts-Shift-Assays können wie folgt durchgeführt werden. Nach Inkubation der Bindungsreaküon wird 6X Ladepuffer (30% Glycerin, 0,25% Xylencyanol, 0,25% Bromphenolblau) zu einer Endkonzentration von 1X zugegeben. Die Reaktion wird dann in die Taschen eines Polyacrylamidgels (im Allgemeinen 4-8%) geladen, das in TBE-Puffer (90 mM Tris-Borat, 2 mM EDTA, pH 8) hergestellt ist. Die Protein-gebundene RNA wird von der ungebundenen RNA durch Anlegen einer konstanten Ladung (150-175 V) an das Gel aufgetrennt. Das Gel läuft solange, bis das Bromphenolblau das Ende des Gels erreicht hat. Das Gel wird unter Vakuum bei 80ºC getrocknet. Die ungebundene RNA und die Protein-gebundene RNA werden dann autoradiographisch sichtbar gemacht. In Fällen, in denen es wünschenswert ist, das Molekulargewicht des RNA-Proteinkomplexes zu kennen, wird die Bindungsreaktion ultraviolettem Licht unterzogen, um den Komplex kovalent querzuvernetzen. 6X Ladepuffer (3,75 M Tris, 30% βME, 13,8% SDS, 30% Glycerin, pH 6,8) wird zu der quervernetzten Reaktion in einer Endkonzentration von 1X zugegeben und das Gemisch wird auf ein SDS-Polyacrylamidgel (im Allgemeinen 8-12%) geladen. Das Gel läuft in einem Tris-Glycin-Puffer (25 mM Tris, 192 mM Glycin, 0,1% SDS) bei 30 mA, bis die Molekulargewichtsmarker in geeigneter Weise aufgetrennt sind. Das Gel wird getrocknet und der RNA-Proteinkomplex autoradiographisch sichtbar gemacht.
3. Ribonuklease-Verdau. Für einige Assays kann es wünschenswert sein, jene RNA-Moleküle oder jene Bereiche eines RNA-Moleküls, die nicht an einer Interaktion mit RNA-Bindeproteinen beteiligt sind, zu eliminieren. Wenn z. B. ein großes RNA-Molekül im Assay verwendet wird, kann die Bindung eines RNA-Bindeproteins zu einem RNA/Proteinkomplex führen, der nur geringfügig größer als das RNA-Molekül allein ist. Beim Nachweis eines solchen Komplexes durch Gel-Mobilitäts-Shift kann der entstehende Shift nicht leicht nachweisbar sein. Beim Nachweis eines solchen Komplexes durch Filterbindung kann das RNA-Molekül allein ausreichend groß sein, um auf dem Filter zurückgehalten zu werden. Diese möglichen Probleme können durch den Verdau von RNA, die an Interaktionen nicht beteiligt ist, gelindert werden. Dies kann leicht durchgeführt werden, indem die Bindungslösung einem Verdau durch Ribonuklease unterzogen wird. Nur die ungebundene oder nicht-interagierende RNA wird verdaut werden. Die RNA-Bereiche, die durch RNA- Bindeproteine gebunden sind, werden vor der Verdauung durch das Protein geschützt sein.

D. Identifizierung von RNA-Molekülen und RNA-Bindemolekülen, die mit spezifischen RNA-Bindeproteinen und RNA-Molekülen interagieren

Die Identifizierung von RNA-Molekülen, die mit einem spezifischen RNA-Bindeprotein interagieren, kann durch Herstellung einer Bindungslösung durchgeführt werden, die ein oder mehrere RNA-Moleküle umfasst, und Pufferbestandteile, die einen Puffer umfassen, ein einwertiges Kation, ein zweiwertiges Kation, ein Reduktionsmittel und ein Dichtemittel, durch Zugabe des spezifischen RNA-Bindeproteins und durch den Nachweis von Interaktionen zwischen einem oder mehreren RNA-Molekülen und dem RNA-Bindeprotein. Jene RNA-Moleküle, die interagieren, können durch spezifische Sequenzanalyse identifiziert werden. Ein Assay dieser Art kann dazu verwendet werden, alle RNA-Moleküle in einer gegebenen Probe zu identifizieren, die spezifisch für ein interessierendes RNA-Bindeprotein sind. Die Identifizierung solcher RNA-Moleküle kann zur Identifizierung von Genen führen, die für RNA- Moleküle kodieren, die durch die interessierenden RNA-Bindemoleküle reguliert werden.
In ähnlicher Weise können RNA-Bindeproteine, die mit einem spezifischen RNA-Molekül interagieren, durch Herstellung einer Bindungslösung identifiziert werden, die das interessierende RNA-Molekül und Pufferbestandteile umfasst, durch die Zugabe eines oder mehrerer RNA-Bindeproteine und durch den Nachweis von Interaktionen zwischen einem oder mehreren RNA-Bindeproteinen und dem RNA-Molekül.

E. Identifizierung von Genen, die für RNA-Moleküle kodieren, die mit BNA- Bindeproteinen interagieren

Die Gene, die für RNA-Moleküle kodieren, die mit RNA-Bindeproteinen interagieren, können durch Synthese einer markierten cDNA aus dem RNA-Molekül und durch Verwendung der cDNA zum Screening einer Bibliothek von Genen identifiziert werden, von der man annimmt, dass sie die Gene enthält, die für das RNA-Molekül kodieren. Das Gen, das für das RNA- Molekül kodiert, kann dann durch Sequenzanalyse identifiziert werden. Die Identität des Gens kann durch Bestimmung der Iniron-Exon-Struktur des Gens, durch Klonierung der Exons in einen Vektor und Transkription der RNA in vitro bestätigt werden. Die in vitro transkribierte RNA kann dann dazu verwendet werden, eine Bindungslösung herzustellen. Die Interaktionen mit den RNA-Bindeproteinen können nachgewiesen und mit den Interaktionen der ursprünglichen RNA und des RNA-Bindeproteins verglichen werden. Das Gen wird als das Gen bestätigt, das für das RNA-Molekül kodiert, wenn die Interaktionen zwischen der Test-RNA und den RNA-Bindeproteinen im Wesentlichen die gleichen sind wie jene der ursprünglichen RNA und der ursprünglichen RNA-Bindeproteine. Verfahren für alle diese Manipulationen sind gut etabliert und dem Fachmann bekannt und/oder hier beschrieben.

F. Identifizierung von Genen, die für RNA-Bindeproteine kodieren

Die Gene, die für RNA-Bindeproteine kodieren, die mit RNA-Molekülen interagieren, können durch Isolierung des Bindeproteins und durch Bestimmung eines Teils der Aminosäuresequenz identifiziert werden. Diese Sequenz kann dann dazu verwendet werden, Peptide herzustellen, die wiederum dazu verwendet werden können, Antikörper gegen das RNA-Bindeprotein herzustellen. Zusätzlich oder alternativ dazu kann die Peptidsequenz revers translatiert werden, um eine cDNA-Sonde herzustellen. Die Sonden oder Antikörper können dann dazu verwendet werden, eine cDNA-Bibliothek zu screenen (Expressionsbibliothek bei Verwendung von Antikörpern) und entstehende cDNA-Klone können dazu verwendet werden, eine genomische Bibliothek zu screenen. Das Gen, das für das RNA-Bindeprotein kodiert, kann dann durch Sequenzanalyse identifiziert werden. Die Identität des Gens kann durch Bestimmung der Intron-Exon-Struktur des Gens, durch Klonieren der Exons in einen Vektor und Durchführung von in vitro Transkription/Translation zur Expression des Proteins oder durch Expression des Proteins in vivo bestätigt werden. Das exprimierte Protein kann dann zur Bindungslösung zugegeben, die Interaktionen mit den RNA-Molekülen können nachgewiesen und mit den Interaktionen der ursprünglichen RNA-Bindeproteine und RNA-Moleküle verglichen werden. Das Gen wird als Gen bestätigt, das das RNA-Bindeprotein kodiert, wenn die Interaktionen zwischen dem Testprotein und den RNA-Molekülen und dem ursprünglichen Protein und den RNA-Molekülen im Wesentlichen die gleichen sind. Verfahren für all diese Manipulationen sind gut etabliert und dem Fachmann bekannt und/oder werden hier beschrieben.

6. Identifizierung von Bereichen in RNA-Molekülen, die mit RNA- Bindeproteinen interagieren

Bereiche in RNA-Molekülen, die mit RNA-Bindeproteinen interagieren, können durch Herstellung einer Bindungslösung identifiziert werden, umfassend (1) ein RNA-Molekül aus einer Untergruppe von RNA-Molekülen, die aus aufeinanderfolgend kleineren Fragmenten eines größeren RNA-Moleküls bestehen, von dem zuvor festgestellt wurde, dass es an RNA-Protein-Interaktion beteiligt ist, oder (2) ein RNA-Molekül, das eine oder mehrere Mutationen oder Deletionen in einem zuvor identifizierten RNA-Molekül enthält, das an der RNA-Protein-Interaktion beteiligt ist, Pufferbestandteile, umfassend einen Puffer, ein einwertiges Kation, ein zweiwertiges Kation, ein Reduktionsmittel und ein Dichtemittel und nichtspezifische Kompetitoren, die Zugabe von einem oder mehreren RNA-Bindeproteinen und der Nachweis der Interaktion zwischen dem RNA-Molekül und den RNA-Bindeproteinen. Durch Vergleich, welche RNA-Moleküle mit den Bindeproteinen interagieren mit jenen, die nicht interagieren, kann der Bereich des RNA-Moleküls, der an der Interaktion beteiligt ist, identifiziert werden. Ein Assay dieser Art kann alle Bereiche in einem RNA-Molekül identifizieren, die an einer Interaktion mit einem RNA-Bindeprotein beteiligt sind, als auch die spezifischen Nukleotide, die mit dem RNA-Bindeprotein interagieren.

H. Identifizierung von Bereichen in RNA-Bindeproteinen, die mit RNA-Molekülen interagieren

Bereiche in RNA-Bindeproteinen, die mit RNA-Molekülen interagieren, können durch Herstellung einer Bindungslösung identifiziert werden, umfassend eines oder mehrere RNA- Moleküle, Pufferbestandteile, umfassend einen Puffer, ein einwertiges Kation, ein zweiwertiges Kation, ein Reduktionsmittel und ein Dichtemittel und nicht-spezifische Kompetitoren und durch Zugabe eines oder mehrerer Fragmente eines RNA-Bindeproteins, die durch Peptidase-Verdau eines RNA-Bindeproteins oder durch Peptidsynthese erhalten wurden, und durch Nachweis der Interaktionen der RNA-Bindeproteinpeptide mit den RNA-Molekülen. Dies ist durchführbar, da der Teil eines RNA-Bindeproteins, das mit einem RNA-Molekül interagiert, allgemein eine in sich geschlossene Domäne ist. Durch den Vergleich, welche Peptide an einer Interaktion mit einem RNA-Molekül beteiligt sind und welche nicht beteiligt sind, kann der Bereich des RNA-Bindeproteins, der an der Interaktion beteiligt ist, identifiziert werden. Die Identifizierung der spezifischen Aminosäuren, die an der Interaktion des RNA-Bindeproteins mit den RNA-Molekülen beteiligt sind, kann durchgeführt werden durch Einbringung von Mutationen in die Peptidfragmente, die mit den RNA-Molekülen interagieren, und Austesten der mutierten Peptide hinsichtlich Interaktionen mit RNA-Molekülen. Die Aminosäuren, die an der Interaktion des RNA-Bindeproteins mit dem RNA-Molekül beteiligt sind, werden durch die mutierten Peptide, die nicht mit dem IRNA-Molekül interagieren, identifiziert werden.

I. Screening auf Verbindungen, die die Interaktion von RNA-Molekülen und RNA-Bindeproteinen modulieren

Die Identifizierung von Verbindungen, die die Interaktion von RNA-Molekülen und RNA- Bindeproteinen modulieren, kann durchgeführt werden durch Einschluss einer oder mehrerer Testverbindungen in der Bindungslesung, die die interessierenden RNA-Moleküle, die interessierenden RNA-Bindeproteine und Pufferbestandteile umfasst, und durch Nachweis der Interaktion zwischen den RNA-Molekülen und den RNA-Bindeproteinen. Testverbindungen, die die Interaktion zwischen den RNA-Molekülen und den RNA-Bindeproteinen modulieren oder beeinträchtigen, können durch Vergleich der Interaktionen in der Bindungslösung, die die Testverbindung nicht enthält, mit den Interaktionen in der Bindungslösung, die die Testverbindung enthält, identifiziert werden. Bindungslösungen, die eine oder mehrere Testverbindungen einschließen, werden hier als Testlösungen bezeichnet. Bindungslösungen, die keine Testverbindung einschließen, werden hier als Kontrolllösungen bezeichnet. Verbindungen, die die Interaktion modulieren, werden dann identifiziert, wenn die Interaktionen in den beiden Lösungen unterschiedlich sind. Ein Assay dieser Art kann dazu verwendet werden, Verbindungen zu identifizieren, die die Interaktion durch Bindung an die RNA-Moleküle oder durch Bindung an die RNA-Bindeproteine in einer gegebenen Probe modulieren oder beeinträchtigen. Durch Zugabe einer identifizierten Verbindung zu einer Zelle, in der ein interessierendes RNA-Molekül oder ein verwandtes RNA-Molekül exprimiert wird, kann die Funktion oder die Wirkweise des RNA-Moleküls in der Zelle aufgrund der Modulierung oder dem Effekt, den die Verbindung auf die Interaktion eines mRNA-Moleküls und eines RNA-Bindeproteins besitzt, beeinträchtigt werden. Wenn z. B. eine Interaktion zwischen einem mRNA- Molekül und einem RNA-Bindeprotein die Translation der mRNA kontrolliert, so kann eine Verbindung, die in dem offenbarten Assay als eine Verbindung identifiziert wird, die diese Interaktion beeinträchtigt, dazu verwendet werden, die Translation der mRNA über ihren Effekt auf die Interaktion zu beeinträchtigen. Identifizierte Verbindungen können dazu verwendet werden, die Funktion oder Expression eines RNA-Moleküls in einer Zelle in vivo, ex vivo oder in vitro zu beeinträchtigen. Die Identifizierung solcher Verbindungen kann auch zur Entwicklung von Therapien zur Behandlung einer Vielzahl von Krankheiten führen. Solche Verbindungen können ebenfalls als Forschungswerkzeuge zur Untersuchung der Signifikanz, der Art oder der Mechanismen der RNA-Funktion oder -Expression in einer Zelle verwendet werden.
1. Hochdurchsatz-Screening-Assay. Die offenbarten universellen Assay-Bedingungen können in einem Screening-Assay zur Identifizierung von Verbindungen verwendet werden, die eine interessierende RNA/RNA-Bindeprotein-Interaktion beeinträchtigen. Solche Screening-Assays können entworfen werden, um gleichzeitige Auswertung der Wirkung zahlreicher Testverbindungen auf die interessierende Interaktion zu ermöglichen. Zu diesem Zweck ist es bevorzugt, dass die Interaktionen durch Filterbindung nachgewiesen werden. Gleichzeitige Filterbindung-Assays werden bevorzugt durch gleichzeitige Filtration von Bindungslösungen in einer Vorrichtung durchgeführt, die getrennte Vertiefungen, Löcher, Taschen oder andere Behältnisse aufweist, die getrennte Bindungslösungen aufnehmen können. Eine bevorzugte Vorrichtung ist eine Multi-Vertiefungs-Filterbindungsvorrichtung wie die MultiScreen-Filterplatte von Millipore. Es wird ebenfalls beabsichtigt, dass multiple Multi-Vertiefungs- oder Multi-Proben-Assays gleichzeitig durchgeführt werden können.
Im Allgemeinen kann Hochdurchsatz-Screening wie folgt durchgeführt werden. Zuerst wird ein Satz einer oder mehrerer Testlösungen gebildet, wobei jede Testlösung eine oder mehrere RNA-Moleküle und Pufferbestandteile enthält. Vor Zugabe der Testverbindung wird die RNA für eine gewisse Zeit auf eine Temperatur erhitzt, die ausreicht, um die RNA-Moleküle zu denaturieren, und langsam abgekühlt. Nach Zugabe der Testverbindung werden eines oder mehrere RNA-Bindeproteine den Testlösungen zugegeben und Interaktionen zwischen RNA- Molekül(en) und RNA-Bindeprotein(en) in den Testlösungen werden nachgewiesen. Eine der Testverbindungen ist in der Testlösung enthalten. Zur Bestimmung, ob die Testverbindungen einen Effekt auf die Interaktionen zwischen den RNA-Molekülen und den RNA-Bindeproteinen besitzen, wird eine Kontrolllösung hergestellt, erhitzt und genau wie die Testlösungen abgekühlt, mit der Ausnahme, dass in der Kontrolllösung keine Testverbindung anwesend ist. Die RNA-Bindeproteine werden der Kontrolllösung zugegeben und Interaktionen zwischen den RNA-Molekülen und den RNA-Bindeproteinen in der Kontrolllösung werden nachgewiesen. Durch Vergleich der Interaktionen, die in den Testlösungen nachgewiesen werden mit jenen, die in der Kontrolllösung nachgewiesen werden, kann bestimmt werden, ob eine gegebene Testverbindung einen Effekt auf die Interaktionen besitzt. Eine Testverbindung wird als Verbindung identifiziert, die eine Wirkung auf Interaktionen zwischen den RNA-Molekülen und den RNA-Bindeproteinen aufweist, wenn die Interaktionen, die man in der Kontrolllösung nachweist und die Interaktionen, die man in der Testlösung nachweist, die die Testverbindung enthält, unterschiedlich sind.
Die Testverbindung kann der Testlösung zu fast jeder Zeit zugegeben werden, z. B. während Herstellung der Testlösung, vor der Zugabe des RNA-Bindeproteins oder zusammen mit dem RNA-Bindeprotein. Bevorzugt wird die Testverbindung entweder mit dem RNA-Molekül oder dem RNA-Bindeprotein vor deren Zugabe zur Testlösung vermischt.
Der Assay mit der Kontrolllösung kann getrennt oder zusammen mit den Assays der Testlösungen durchgeführt werden. Bei getrennter Durchführung kann der Kontrolllösungs-Assay entweder vor, nach oder gleichzeitig mit den Testlösungs-Assays durchgeführt werden. Es wird bevorzugt, dass der Kontrolllösungs-Assay zusammen und gleichzeitig mit den Testlösungs-Assays durchgeführt wird.
Wie hier verwendet, bezieht sich ein Satz von Testlösungen auf eine oder mehrere Testlösungen, die sich darin ähneln, dass sie die gleichen RNA-Bindeproteine, RNA-Moleküle und Pufferbestandteile enthalten. Die Testlösungen innerhalb eines Satzes von Testlösungen unterscheiden sich bevorzugt voneinander in der Testverbindung, die in der Testlösung anwesend ist. Es wird beabsichtigt und bevorzugt, dass eine einzelne Kontrolllösung oder eine einzelne Art von Kontrolllösung zum Vergleich von Interaktionen verwendet wird, die in einem vollständigen Satz von Testlösungen nachgewiesen werden. Zu diesem Zweck ist bevorzugt, dass die Kontrolllösung die gleichen RNA-Bindeproteine, RNA-Moleküle und Pufferbestandteile wie die Testlösungen in dem Satz enthalten. Multiple Sätze von Testlösungen und eine Kontrolllösung für jeden Satz können auch zusammen in einem Hochdurchsatz- Assay ausgewertet werden. Zu diesem Zweck ist es bevorzugt, dass sich entweder das RNA- Bindeprotein oder die RNA-Moleküle oder beide sich zwischen jedem Satz der Testlösungen unterscheiden. Bei Assays, an denen solche multiplen Sätze von Testlösungen beteiligt sind, ist es bevorzugt, dass jeder Satz von Testlösungen den gleichen Satz von Testverbindungen enthält.
Bevorzugte Beziehungen zwischen Testlösungen, Sätzen von Testlösungen und Kontrolllösungen, wie vorstehend beschrieben, können anhand der folgenden schematischen Beispiele veranschaulicht werden. In den folgenden Beispielen werden verschiedene RNA-Moleküle oder Sätze von RNA-Molekülen (eine gegebene Lösung kann ein einzelnes RNA-Molekül oder multiple RNA-Moleküle enthalten), als R1, R2, R3, usw. bezeichnet. Verschiedene RNA-Bindeproteine werden als P1, P2, P3, usw. bezeichnet. Testverbindungen werden als C1, C2, C3, usw. bezeichnet. Pufferbestandteile, als eine Gruppe von Bestandteilen in einer gegebenen Lösung, werden als B1, B2, B3, usw. bezeichnet.
Drei Sätze von Testlösungen, bezeichnet als Satz 1, Satz 2 und Satz 3 werden unter Verwendung der folgenden Bestandteile hergestellt:
Für jeden Satz wird eine unterschiedliche Kontrolllösung unter Verwendung der gleichen Bestandteile hergestellt. Somit ist jeder Satz so gestaltet, dass die Auswirkung von Testverbindungen auf eine unterschiedliche RNA/RNA-Bindeprotein-Interaktion (oder Gruppe von Interaktionen) bewertet werden können. In jeder Testlösung in jedem Satz kann wie folgt eine unterschiedliche Testverbindung aufgenommen werden:
Den Kontrolllösungen wird keine Testverbindung zugegeben. Wie aus diesem Beispiel ersichtlich, wird die gleiche Bank von 95 Testverbindungen hinsichtlich eines Effekts auf jede der drei RNA/RNA-Bindeprotein-Interaktionen getestet. Ähnliche Gruppen von Assays könnten unter Verwendung eines unterschiedlichen Satzes von Testverbindungen oder eines teilweise überlappenden Satzes von Verbindungen durchgeführt werden. Die gesamte Gruppe der vorstehend beschriebenen Assays kann gleichzeitig durchgeführt werden und ist bevorzugt automatisiert. Die Anzahl von Assays in einem Satz von Test-Assays kann erhöht werden, um so viele Testverbindungen wie gewünscht unterzubringen. In solchen Fällen ist es natürlich bevorzugt, dass der Satz von Test-Assays in überschaubare Gruppen aufgeteilt wird, basierend z. B. auf der Anzahl von Vertiefungen in einer Multi-Vertiefungs-Filtervorrichtung. Es ist beabsichtigt, dass das offenbarte Verfahren mit Geräten und Vorrichtungen durchgeführt werden kann, die dazu geeignet sind, eine große Zahl von Test-Assays aufzunehmen.
2. Bevorzugte Arten der Identifizierung von Verbindungen. Bevorzugt wird der Nachweis von Interaktionen in automatisierter Weise unter Verwendung von z. B. automatisiertem Nachweis und Vergleich der Interaktionssignale durchgeführt. Wenn die RNA-Moleküle oder die RNA-Bindeproteine mit einer nachweisbaren Gruppe markiert sind, ist es bevorzugt, dass die Interaktionen unter Verwendung automatisierter Quantifizierung der nachweisbaren Gruppe nachgewiesen werden. Zu diesem Zweck ist es bevorzugt, dass die nachweisbare Gruppe einen Bestandteil einschließt, der entweder direkt oder indirekt ein quantifizierbares Signal herstellt. Bevorzugte Bestandteile dieser Art sind radioaktive Isotope. Reagenzien und Verfahren zur Verwendung und zum Nachweis von radioaktiven Markierungen sind gut bekannt.
Gleichzeitige Gel-Shift-Assays werden bevorzugt durchgeführt, indem multiple Bindungslösungen in einem einzelnen Gel mit multiplen Spuren und in multiplen Gelen mit multiplen Spuren einer Elektrophorese unterzogen werden. Der Nachweis und der Vergleich multipler Proben kann z. B. durch automatisierten Nachweis und Lokalisierung interagierender Komplexe in den Gelspuren durchgeführt werden.
Es ist bevorzugt, dass die Testverbindungen mit entweder dem RNA-Molekül entweder vor, während oder nach der Bildung der Bindungslösung oder mit dem RNA-Bindeprotein vor der Zugabe zur Bindungslösung vermischt werden. Zu diesem Zweck ist es bevorzugt, dass die Testverbindung mit entweder dem RNA-Molekül oder dem RNA-Bindeprotein vermischt wird, abhängig davon, bei welchem dieser Bestandteile es erwünscht ist oder erwartet wird, dass die Testverbindung interagieren wird. Wenn z. B. Verbindungen erwünscht sind, die die Interaktion einer RNA und einem RNA-Bindeprotein über Interaktion mit der RNA beeinträchtigen (oder erwartet werden, in Abhängigkeit von der Art der Testverbindungen), dann sollte die Testverbindung zur RNA zugegeben werden. Wenn umgekehrt Verbindungen erwünscht sind (oder erwartet, in Abhängigkeit der Art der Testverbindungen), die die Interaktion einer RNA und einem RNA-Bindeprotein über die Interaktion mit dem RNA-Bindeprotein beeinträchtigen, dann sollte die Testverbindung zum RNA-Bindeprotein zugegeben werden. Am meisten wird bevorzugt, dass die Testverbindung zur Bindungslösung nach dem Erhitzen und Abkühlen und vor der Zugabe des RNA-Bindeproteins zugegeben wird. Es ist ebenfalls bevorzugt, dass für alle Testlösungen in einem gegebenen Satz von Testlösungen die Testverbindung auf die gleiche Weise und im gleichen Stadium für jeden der Assays zugemischt wird.
3. Identifizierte Verbindungen. Verbindungen, von denen festgestellt wurde, dass sie einen Effekt auf Interaktionen zwischen RNA-Molekülen und RNA-Bindeproteinen aufweisen, können dazu verwendet werden, solche Interaktionen in Zellen zu beeinträchtigen. Falls eine Interaktion zwischen einem RNA-Molekül und einem RNA-Bindeprotein die Funktion oder die Expression des RNA-Moleküls beeinträchtigt, erwartet man von einer Verbindung, die einen Effekt auf die Interaktion hat, dass sie einen Effekt auf die Funktion oder Expression des RNA-Moleküls hat. Somit ist beabsichtigt, dass Verbindungen, von denen festgestellt wurde, dass sie einen Effekt auf die Interaktion eines RNA-Moleküls und eines RNA-Bindeproteins aufweisen, dazu nützlich sind, die Funktion oder Expression des RNA-Moleküls in einer Zelle zu beeinträchtigen. Solche Verbindungen können auf jede Weise an eine Zelle verabreicht werden, die es ermöglicht, dass die Verbindung den erwünschten Effekt hat. Viele solcher Verabreichungsarten sind im Stand der Technik bekannt. Eine bevorzugte Form der Verabreichung für in vivo Anwendungen stellen Verbindungen dar, die eine identifizierte Verbindung und einen pharmazeutisch verträglichen Träger enthalten. Zu diesem Zweck kann das offenbarte Verfahren einen Schritt beinhalten, eine solche Zusammensetzung zu bilden. Für die in vitro und ex vivo Anwendungen kann eine identifizierte Verbindung zum Kulturmedium zugegeben werden. Die Verbindung kann auch mit jedem Verabreichungssystem oder mit jeder Zusammensetzung kombiniert werden, die den Eintritt der Verbindung in die Zelle und/oder den Transport der Verbindung zu bestimmten Zellen verstärken kann.
Geeignete pharmazeutische Träger zur Verabreichung an einen Patienten sind den Fachleuten bekannt. Zur parenteralen Verabreichung kann die Verbindung in sterilem Wasser oder Saline aufgelöst oder suspendiert werden. Zur enteralen Verabreichung kann die Verbindung in einen inerten Träger in Tabletten-, Flüssig- oder Kapselform eingebaut werden. Geeignete Träger können Stärken oder Zucker sein und können Lubrikanzien, Geschmacksstoffe, Bindemittel und andere Materialien der gleichen Art einschließen. Die Verbindung kann auch lokal an eine gewünschte Stelle durch topische Anwendung einer Lösung oder Creme verabreicht werden.
Alternativ dazu kann die Verbindung in, auf oder als Teil von Liposomen oder Mikrosphären (oder Mikropartikeln) verabreicht werden. Verfahren zur Herstellung von Liposomen und Mikrosphären zur Verabreichung an einen Patienten sind dem Fachmann bekannt. US-PS 4,789,734 beschreibt Verfahren zur Einkapselung von biologischen Materialien in Liposomen. Im Wesentlichen wird das Material in einer wässrigen Lösung aufgelöst, die geeigneten Phospholipide und Lipide werden, wenn erforderlich, mit Surfaktanzien zugegeben und das Material wird je nach Notwendigkeit dialysiert oder mit Ultraschall behandelt. Eine gute Übersicht der bekannten Verfahren stammt von G. Gregoriadis, Kapitel 14, "Liposomes", Drug Carriers in Biology and Medicine, Seiten 287-341 (Academic Press, 1979). Aus Polymeren oder Proteinen gebildete Mikrosphären sind den Fachleuten bekannt und können für die Passage durch den Gastrointestinaltrakt direkt in den Blutstrom angepasst werden. Alternativ kann die Verbindung aufgenommen und die Mikrosphären oder Bestandteile von Mikrosphären können für die langsame Freisetzung über einen Zeitraum, der von Tagen bis zu Monaten reicht, implantiert werden; vgl. z. B. US-PS 4,906,474, 4,925,673 und 3,625,214.
Die Kriterien zur Auswertung der Antwort auf therapeutische Modalitäten bei Verwendung einer identifizierten Verbindung werden durch den spezifischen Zustand vorgegeben und folgen allgemein standardmäßiger medizinischer Praxis. Im Allgemeinen kann die Auswirkung der Verabreichung einer Verbindung dadurch bewertet werden, indem wenigstens bestimmt wird, ob die RNA/RNA-Bindeprotein-Interaktion, die durch die Verbindung beeinträchtigt werden soll, tatsächlich in Zellen beeinträchtigt ist, an die die Verbindung verabreicht oder in die sie transportiert wird. Solch eine Bewertung kann ebenfalls durchgeführt werden durch die Bestimmung, ob es einen Effekt auf einen Ersatz für die Interaktion gibt, wie die Expression einer RNA, die Herstellung eines Proteins oder ein folgender physiologischer Effekt. Wo die RNA/RNA-Bindeprotein-Interaktion, die durch das Protein beeinträchtigt wird, dafür bekannt ist oder wo es vermutet wird, dass die Funktion oder Expression einer RNA beteiligt ist, die an einem Krankheitszustand beteiligt ist, kann die Effektivität der Verabreichung der Verbindung durch Messen der Veränderungen der Charakteristika des Krankheitszustands bewertet werden.

Beispiele

Beispiel 1: Entwicklung optimaler universeller Assay-Bedingungen.

Durch Verwendung von Gel-Mobilitäts-Shift zum Nachweis von Interaktionen wurden universelle Bedingungen für den Assay zum Nachweis von Interaktion zwischen RNA-Bindeproteinen und RNA-Molekülen optimiert. Der Assay wurde im Allgemeinen wie vorstehend beschrieben durchgeführt. Im Speziellen wurde eine Bindungslösung durch Vermischen einer RNA-Bindeprotein-Probe, eines RNA-Moleküls und von Pufferbestandteilen hergestellt. Die Pufferbestandteile enthielten einen Puffer, ein einwertiges Kation, ein zweiwertiges Kation, ein Reduktionsmittel und ein Dichtemittel. Die Art und Konzentration der verschiedenen Pufferbestandteile wurde variiert, um ihren Effekt auf die Bindung zu bewerten und um zu bestimmen, welche Zusammensetzung der Pufferbestandteile Interaktionen von RNA-Bindeproteinen mit einer Vielzahl von RNA-Molekülen erleichterte.
RNA-Bindeproteine: Ein Proteinextrakt aus SH-SY5Y-Zellen wurde als RNA-Bindeprotein- Probe verwendet. Es wurden auch Proteinextrakte aus zahlreichen anderen Zelllinien, einschließlich HeLa, K562 und primären Astrozyten und aus Gewebeproben, z. B. Rattengewebe, präpariert und getestet. Der SH-SY5Y-Extrakt wurde wie folgt präpariert. Eine Probe von SH- SY5Y-Zellen wurde in 10 große Kulturen von jeweils 30 ml in T150-Flaschen (9,9 · 10&sup5; Zellen/Flasche) aufgeteilt. Das Medium wurde entfernt, die Zellen wurden in 150 cc-Platten gegeben, in 1X PBS gewaschen und in PBS abgekratzt. Die Zellen wurden dann wie folgt gezählt: (73 · 10&sup4; Zellen/ml) · (42 ml) · (10 (x dil)) = insgesamt 3,1 · 10&sup8; Zellen. Nach der Zählung wurde das PBS entfernt und pro Platte wurden 400 ul Lysepuffer zugegeben. Der Lysepuffer hatte die folgende Zusammensetzung:
Die Zellen wurden dann bei -20ºC für 30 Minuten eingefroren, aufgetaut und bei 15 000 g bei 4ºC für 15 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde in 100 ul Aliquots aufgeteilt und bei -80ºC gelagert.
RNA-Moleküle: AUUUA, untranslatierter Bereich (UTR) vom Amyloid-Vorläuferprotein (APP) und Poly(A) wurden als RNA-Moleküle in verschiedenen Assays verwendet. Diese wurden ausgewählt, um die Fähigkeit des Assays zu bewerten, Interaktionen bei Verwendung unterschiedlicher RNA-Moleküle nachzuweisen. Die RNA-Moleküle wurden durch in vitro Transkription durch SP6 oder T7 RNA-Polymerase präpariert. Um den Nachweis der Interaktion zu erleichtern, wurde ³²P-UTP in die RNA-Moleküle während der Transkription eingebaut. Viele in vitro Transkriptions-Kits sind kommerziell erhältlich und für effiziente RNA- Synthese optimiert. Die RNA-Moleküle wurden wie allgemein von Sambrook et al. und Ausubel et al. beschrieben präpariert. Ein Reaktionsgemisch, enthaltend 2 ul 10X Transkriptionspuffer (400 mM Tris-HCl, pH 7,5, 60 mM MgCl&sub2;, 20 mM Spermidin, 50 mM NaCl), jeweils 1 ul ATP, CTP und GTP (10 mM), 2 ul 50 uM UTP, 2,5 ul ³²P-UTP, 2 ul lineare Transkriptionsmatrize (etwa 100 ng) und 2 ul Enzym-Mix (RNase-Inhibitor und 20 Einheiten RNA-Polymerase) wurde in einem Endvolumen von 20 ul hergestellt. Solange nichts anderes benannt wird, wurden alle Verdünnungen mit DEPC-behandeltem Wasser hergestellt. Dieses Reaktionsgemisch wurde für 2 Stunden bei 37ºC inkubiert. Dann wurde 1 ul RNase-freie DNase I zugegeben und die Reaktion wurde für 15 Minuten bei 37ºC inkubiert. Schließlich wurden 20 ul Wasser und 40 ul Phenol-Chloroform zugegeben und die Reaktion wurde extrahiert. Die nicht-eingebauten Nukleotide wurden dann durch Gelitration durch Gel-25 Spin- Säulen entfernt.
Optimierung des Puffers: Die erste Variable im Assay ist der Puffer. Tris, HEPES und Bis- Tris-Propan (BTP) wurden hinsichtlich ihrer Effizienz untersucht, Interaktionen mit den Test- RNA-Molekülen zu fördern. Für diese Assays betrug die Pufferkonzentration 7,5 mM, die Proteinkonzentration 0,2 ug/ul und die Bindungslösung enthielt 10 mM KCl, 0,2 mM DTT, 10% Glycerin und 0,2 ug/ul tRNA als Kompetitor für nicht-spezifische RNA/Protein-Interaktionen. Assays wurden ebenfalls durchgeführt, um den optimalen pH für den Puffer zu bestimmen. Die untersuchten Puffer waren HEPES bei pH 8, Bis-Tris-Propan bei pH 8 und 7,5 und Tris bei pH 8 und pH 7,4. Alle drei Puffer ermöglichten die Bindungsinteraktion für alle drei RNA-Moleküle. Während es zwischen ihnen nur geringe Unterschiede gab, führte die Verwendung von BTP in allen Fällen zu signifikanter Bindung und wurde, da es den größten Bereich von Pufferkapazität aufweist, als Puffer für die weitere Optimierung ausgewählt.
Für alle untersuchten RNA-Moleküle schien der optimale pH-Wert bei 8 oder 9 zu liegen. Für jedes RNA-Molekül wurde bei pH 10 signifikante Bindung beobachtet, eine Bedingung, bei der die Hemmung durch RNase T&sub1; offensichtlich wird. Umgekehrt scheint ein niedriger pH die Bindung zu hemmen. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengefasst:
Basierend auf diesen Ergebnissen wird der bevorzugte Assay aus RNase T&sub1;, tRNA als nicht- spezifischen Kompetitor und einem Puffer, bestehend aus BTP bei pH 8,5 zusammengesetzt sein.
Optimierung der Kationen: Die Optimierung der einwertigen und zweiwertigen Kationen stellt einen anderen Aspekt der Entwicklung eines Kits dar. Drei einwertige (K&spplus;, Na&spplus; und NH&sub4;&spplus;) und drei verschiedene zweiwertige Kationen (Mg&spplus;&spplus;, Ca&spplus;+ und Fe&spplus;&spplus;) wurden analysiert. Diese wurden in verschiedenen Konzentrationen (0, 0,1, 1, 10, 50, 100 und 250 mM) getestet. Das optimale einwertige Kation wurde dann mit den einzelnen Konzentrationen zweiwertiger Kationen und umgekehrt getestet.
Drei einwertige Kationen (K&spplus;, Na&spplus; und NH&sub4;&spplus;) wurden zuerst in Konzentrationen im Bereich von 0 bis 500 mM getestet. Anfänglich wurden Konzentrationen von 0, 0,2, 2, 12,5, 20 und 50 mM jedes Kations hinsichtlich der Auswirkungen auf die RBP/RNA-Komplexbildung für APP, AUUUA und Poly(A) getestet. Der SH-SY5Y-Proteinextrakt und ein Bindungspuffer, der aus 20 mM Bis-Tris-Propan bei pH 9,0 bestand, von dem zuvor gezeigt wurde, dass er zu optimalen Bindungsinteraktionen führt, wurden zusätzlich zum Kation und zur Sonde verwendet. Weder für Konzentrationen noch für Kationen bei 0 bis 50 mM wurden signifikante Unterschiede bemerkt. Dann wurden höhere Konzentrationen getestet.
Die Untersuchungen der Effekte zweiwertiger Kationen auf RBP/RNA-Interaktionen wurden ebenfalls begonnen. Zuerst wurde der Konzentrationseffekt von Mg&spplus;&spplus; auf die Komplexbildung zwischen APP RNA und Proteinen (SH-SY5Y) untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass bei niedrigeren Konzentrationen (≤10 mM) von Mg&spplus;&spplus; eine normale Komplexbildung beobachtet wurde. Bei höheren Konzentrationen (10 mM, 50 mM, 100 mM, 250 mM) an Mg&spplus;&spplus; wurde die Interaktion zwischen APP RNA und Proteinen in verschiedenen Ausmaßen gehemmt.
Der große Konzentrationsbereich von einwertigen Kationen, der dazu fähig ist, Interaktionen zu fördern, verglichen mit dem relativ engen Bereich von zweiwertigen Kationen, ist höchstwahrscheinlich darauf zurückzuführen, dass APP Tertiärstrukturen einnimmt, die von zweiwertigen Kationen abhängig sind. Dies würde nahe legen, dass AUUUA- und Poly(A)-Interaktionen nicht so von zweiwertigen Kationen abhängig sind, da sie wahrscheinlich lineare Strukturen darstellen.
Die Konzentrationseffekte zweiwertiger Kationen (Mg&spplus;&spplus;, Ca&spplus;+ und Fe&spplus;&spplus;) auf die Komplexbildung zwischen APP, AUUUA und Poly(A)-RNA und Proteinen (SH-SY5Y) wurden dann untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass für alle drei zweiwertigen Kationen 1 mM die optimale Konzentration zum Nachweis von Interaktionen zwischen RNAs (APP, AUUUA und Poly(A)) und Proteinen (SH-SY5Y) unter der ausgewählten Bindungsbedingung ist. Bei höherer Konzentration (10 mM, 50 mM, 100 mM, 250 mM) hemmten Mg&spplus;&spplus;, Ca&spplus;&spplus; und Fe&spplus;&spplus; die Komplexbildung in variierenden Ausmaßen. Nach einem Vergleich aller drei zweiwertigen Kationen bei der optimalen Konzentration für Bindungsinteraktionen (1 mM) wurde Mg&spplus;&spplus; für weitere Untersuchungen ausgewählt.
Die Auswirkungen individueller einwertiger Salzkonzentrationen (0, 50, 100 und 500 mM) auf die Bindung von AUUUA, APP und Poly(A)-RNA an SH-SY5Y-Protein wurden ebenfalls vervollständigt. Die verwendeten einwertigen Kationen waren K&spplus;, Na&spplus; und NH&sub4;&spplus;. RNA- Proteinkomplexe bilden sich in einer weitaus größeren Konzentration von einwertigem Salz (0 bis 100 mM) als für die zweiwertigen Kationen (0 bis 5 mM) mit der optimalen einwertigen Salzkonzentration, die als 50 mM bestimmt wurde, beobachtet wurde. Die Bindungsinteraktion mit dem Cis-Element von APP für alle drei einwertigen Kationen wurde bei 50 mM verglichen und basierend auf seiner Fähigkeit, die RBP/RNA-Interaktion zu fördern, wurde KCl ausgewählt.
Die einwertigen (K&spplus;) und zweiwertigen (Mg&spplus;&spplus;) Kationen wurden dann kombiniert, um die beste Konzentration zur Verwendung bei der Entwicklung des Nachweis-Kits zu bestimmen. Kombinationen von 10, 50 und 100 mM K&spplus; mit 1 mM Mg&spplus;&spplus; und 0,1 mM, 1 mM und 2,5 mM Mg&spplus;&spplus; mit 50 mM K&spplus; wurden analysiert. Die Ergebnisse zeigten, dass die Kombination von 50 mM K&spplus; mit 1 mM Mg&spplus;&spplus; zum Nachweis von APP RNA-Protein-Interaktionen besser als die anderen Kombinationen ist. Dieses Ergebnis wurde durch Verwendung von AUUUA RNA und Poly(A)-RNA bestätigt.
Verwendung von Reduktionsmitteln: Die Auswirkungen von Reduktionsmitteln wurden durch Vergleich der Bindungsreaktion unter den zuvor etablierten Bedingungen (0,2 mM DTT) untersucht, durch Austausch von 0,2 mM β-Mercaptoethanol gegen DTT oder in Abwesenheit eines Reduktionsmittels. In fünf der sechs untersuchten Interaktionen hatte die An- oder Abwesenheit eines Reduktionsmittels keinen Effekt auf die Bindungsinteraktion. In ähnlicher Weise wurde mit Poly(A)-RNA und Bindeprotein, das von K562-Zellen abgeleitet war, keine Wirkung eines Reduktionsmittels beobachtet. Wenn jedoch Bindeprotein aus HeLa-Zellen isoliert wurde, wurde ein reproduzierbarer Effekt mit DTT beobachtet, welches die Interaktion besser als β-Mercaptoethanol steigerte, welches umgekehrt besser als kein Reduktionsmittel war. Das Erfordernis an DTT für einige Reaktionen legt nahe, dass dessen Verwendung als Bestandteil des Puffers bevorzugt ist.
Verwendung von Dichtemitteln: Die Bindungseffizienzen sechs verschiedener RNAs wurden in Anwesenheit von 10% Glycerin, 10% Polyethylenglykol oder ohne Dichtemittel unter vorstehend beschriebenen Puffer-, Kation- und reduzierenden Bedingungen getestet. Obwohl keine quantitativen Unterschiede nachgewiesen wurden, verstärkte die Zugabe von Glycerin oder PEG die Qualität der Bande auf dem Gel-Mobilitäts-Assay. In Abwesenheit eines Dichtemittels waren die Banden deutlich diffuser. Somit wird, obwohl nicht erforderlich, die Zugabe von 10% Glycerin bevorzugt.
Basierend auf dieser Arbeit wurde bestimmt, dass die optimalen Pufferbestandteile BTP bei pH 8,5, 50 mM KCl, 1 mM MgCl&sub2;, 0,2 mM DTT und 10% Glycerin sind. Diese Bedingungen wurden für weitere validierende Assays wie nachstehend beschrieben verwendet. Eine BTP- Konzentration von 7,5 mM wurde verwendet.
Erwärmungsschritt: Die nächste Phase umfasst das Screening von 12 anderen RNA-Elementen zum Nachweis von Interaktionen unter den ausgewählten Bedingungen. Diese Assays wurden ebenfalls in Anwesenheit spezifischer und nicht-spezifischer Kompetitor-RNA durchgeführt. Die ersten beiden untersuchten Cis-Elemente waren das "fron Response Element" (IRE) und Histon-RNA. In beiden Fällen wurde Bindung nachgewiesen, aber nur sehr ineffizient. Nachdem von diesen die Bildung sekundärer Strukturen beschrieben wurde, erhitzten wir die markierte RNA auf 80ºC und kühlten die Probe auf 37ºC ab, nachdem die Bindungslösung gebildet wurde und vor Zugabe der RNA-Bindeproteine. Damit wurde beabsichtigt, jede falsche Struktur zu zerstören, die sich in der RNA gebildet hatte, und es erleichterte den Nachweis von Interaktionen stark. Unter unseren Bedingungen wurden für beide Cis-Elemente spezifische Interaktionen nachgewiesen. RNAs verschiedener Größen und Strukturen wurden unter den vorstehend genannten Bedingungen getestet. Es wurde gezeigt, dass sie Interaktionen mit Bindeproteinen bilden, übereinstimmend mit Interaktionen, die in der Literatur beschrieben wurden. Die getesteten Bindeproteine enthalten verschiedene Motive, einschließlich RGG-Boxen, KH-Domänen und Arg-reichen Proteinen.
Das bevorzugte Verfahren zum Nachweis von Interaktionen zwischen RNA-Molekülen und RNA-Bindeproteinen beinhaltet (1) die Herstellung einer Bindungslösung einschließlich von RNA-Molekülen, BTP bei pH 8,5, 50 mM KCl, 1 mM MgCl&sub2;, 0,2 mM DTT und 10% Glycerin, (2) Erhitzen der Bindungslösung zur Denaturierung der RNA-Moleküle, (3) Abkühlen der Bindungslösung, (4) Zugabe von RNA-Bindeproteinen zur Bindungslösung und (5) Nachweis der Interaktionen zwischen den RNA-Molekülen und den RNA-Bindeproteinen.

Beispiel 2: Assays mit universellen Bedingungen

Es wurden einige Assays durchgeführt, die die Nützlichkeit der in Beispiel 1 beschriebenen universellen Assay-Bedingungen zum Nachweis von Interaktionen zwischen verschiedenen RNA-Molekülen und RNA-Bindeproteinen zeigen. In ersten Assay wurden Interaktionen einiger RNA-Moleküle (radioaktiv markiert) mit verschiedenen Erkennungseigenschaften mit SH-SY5Y oder CHL/260-Proteinextrakt inkubiert. Die RNA-Moleküle wurden ausgewählt, um den Nachweis von Interaktionen in Abhängigkeit von der RNA-Sequenz (AUUUA-RNA), Sequenz- und RNA-Struktur (Histon-RNA) oder RNA-Struktur allein (doppelsträngige RNA) zu erhellen. Zusätzlich zu diesen kleinen RNA-Molekülen (weniger als 30 Nukleotide) wurde die 210 Nukleotide große 5'-untranslatierte Region des Glukose-Transporter-Typs 1 (Glut1) ebenfalls untersucht. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 dargestellt. SH-SY5Y-Proteinextrakt wurde mit AUUUA-RNA und CHL/260-Proteinextrakt wurde mit den verbleibenden RNA- Molekülen verwendet. Die multiplen, langsamer wandernden Banden in jeder der Spuren zeigen, dass die universellen Assay-Bedingungen den Nachweis von Interaktionen zwischen RNA-Molekülen und RNA-Bindeproteinen über das Spektrum von Interaktionstypen ermöglichen.
In einem anderen Assay wurden Interaktionen einiger RNA-Moleküle, die Ziele für verschiedene Bindemotive darstellen, mit SH-SY5Y oder CHL/260-Proteinextrakt oder rekombinantem Rev-Protein inkubiert. Die RNA-Moleküle wurden ausgewählt, um den Nachweis von Interaktionen zu erleuchten, an denen RNA-Bindeproteine beteiligt sind, die doppelsträngige RNA-Bindemotive enthalten (IRE-BF), RGG-Box (APP-BF), Arg-reiche Motive (RRE-BF) und RNP-Motive (U1-BF). Die Ergebnisse sind in Fig. 2 gezeigt. Im APP-BF-Assay wurde SH-SY5Y-Proteinextrakt verwendet, CHL/260-Proteinextrakt wurde mit den IRE-BF- und U1-BF-Assays verwendet und rekombinantes Rev-Protein wurde mit dem RRE-BF-Assay verwendet. Die multiplen, langsamer wandernden Banden in jeder der Spuren zeigen, dass die universellen Assay-Bedingungen den Nachweis von Interaktionen zwischen RNA-Molekülen und RNA-Bindeproteinen über das Spektrum von Interaktionsarten erlauben.
In einem anderen Assay wurde die Spezifität der nachgewiesenen Interaktion bestätigt. Radioaktiv markierte IRE-RNA wurde in An- oder Abwesenheit des K562-Proteinextrakts inkubiert. Um zu testen, ob die nachgewiesenen Interaktionen spezifisch waren oder nicht, wurde in einigen der Assays ebenfalls nicht-markiertes IRE mitaufgenommen. Diese RNA konkurriert mit der markierten IRE-RNA um die Interaktion mit RNA-Bindeproteinen. Als Kontrolle wurde unmarkierte mutante IRE (die hinsichtlich der Bindung defekt ist) in einigen Assays mitaufgenommen. Wenn die Interaktion spezifisch ist, sollte diese RNA nicht mit der markierten IRE-RNA um die RNA-Bindeproteine konkurrieren. Die Ergebnisse dieser Assays sind in Fig. 3 dargestellt. Die Spuren 1 und 2, welche keinen Proteinextrakt enthalten, zeigen wie erwartet keinen Mobilitäts-Shift. Spuren 3 und 4, die Proteinextrakt enthalten, zeigen einen deutlichen Mobilitäts-Shift. Spuren 5-7 zeigen Assays, in denen ansteigende Konzentrationen (100X, 1000X bzw. 10000X) unmarkierter IRE-RNA enthalten waren. Diese unmarkierte RNA konkurriert effektiv mit der markierten RNA um die Interaktion mit den RNA- Bindeproteinen, wie anhand der Zerstörung des Mobilitäts-Shifts in den Spuren 6 und 7 gesehen werden kann. Spuren 8-10 zeigen Assays, bei denen ansteigende Konzentrationen (100X, 1000X bzw. 10000X) mutanter IRE-RNA enthalten waren. Diese unmarkierte RNA ist unfähig, mit der markierten RNA um die Interaktion mit den RNA-Bindeproteinen zu konkurrieren, wie aus dem unveränderten Mobilitäts-Shift in den Spuren 8-10 gesehen werden kann. Dies zeigt deutlich, dass der kompetitive Effekt unmarkierter IRE-RNA, der in den Spuren 6 und 7 zu sehen ist, nicht auf nicht-spezifische Interaktionen zwischen den RNA-Molekülen und den RNA-Bindeproteinen zurückzuführen ist.
Die universellen Assay-Bedingungen werden nun auch in Hochdurchsatz-Screening-Assays zur Isolierung von Verbindungen verwendet. Solche Assays werden kombinatorische Bibliotheken hinsichtlich Verbindungen analysieren, die dazu fähig sind, die Bindungseigenschaften des RBP an die RNA zu verändern, wobei die RNA zum Ziel gesetzt wird. Die aus dem RNA- Mapping und Peptid-Mapping erhaltene Information wird in der molekularen Modulierung verwendet werden, um vernünftig Verbindungen zu entwerfen, die dazu fähig sind, die Interaktion des RNA-Bindeproteins mit dem RNA-Molekül zu modulieren.

Beispiel 3: Entwicklung eines Hochdurchsatz-Screening-Assays.

Die folgenden Assays zeigen Arten und die Effektivität des offenbarten Hochdurchsatz- Screening-Assays. Alle Bindungsreaktionen werden in 96-Loch-Polystyrol-Platten in einem Endvolumen von 10 oder 100 ul durchgeführt. Die Assays setzen sich zusammen und wurden durchgeführt wie nachstehend beschrieben. Im Speziellen wurden Assays durchgeführt durch (1) Herstellen einer Bindungslösung einschließlich RNA-Molekülen, 7,5 mM BTP bei pH 8,5, 10 mM KCl, 5 mM MgCl&sub2;, 0,2 mM DTT und 10% Glycerin, (2) Erhitzen der Bindungslösung zur Denaturierung der RNA-Moleküle, (3) Abkühlen der Bindungslösung, (4) Zugabe von RNA-Bindeproteinen zur Bindungslösung, (5) Beladen der Bindungslösung auf einen Filter und (6) Nachweis der Menge an RNA, die auf dem Filter zurückgehalten wurde. Es wird bevorzugt, dass die Proben auf einen Filter aus entweder reiner Nitrozellulose oder einem gemischten Zelluloseester (MCA) geladen werden. Es ist ebenfalls bevorzugt, dass die Filter eine Porengröße von 0,2 u aufweisen, obwohl Filter mit einer Porengröße von 0.45 u ebenfalls den RNA/RNA-Bindeprotein-Komplex binden werden. Es ist bevorzugt, dass vor der Ladung der Bindungslösung auf einen Filter das Volumen erhöht wird. Zu diesem Zweck wird bevorzugt, dass die Verdünnungslösung die gleichen Pufferbestandteile wie die Bindungslösung aufweist, ohne das Dichtemittel. Für ein 10 ul Volumen wird bevorzugt, dass das Endvolumen durch Zugabe von 1X-Bindungspuffer etwa 100 ul beträgt. Es ist ebenfalls bevorzugt, dass die Bindungslösung unter Vakuum auf den Filter aufgetragen wird. Es ist ebenfalls bevorzugt, dass der Filter vor dem Nachweis der Menge an RNA, die auf dem Filter zurückgehalten ist, zweimal gewaschen wird. Bevorzugt weist die Waschlösung die gleiche Zusammensetzung wie die Bindungslösung auf. Es können jedoch TE (pH 8,0), PBS oder TCA ebenfalls als Waschlösungen verwendet werden. In den meisten der nachstehend beschriebenen Assays waren die RNA-Moleküle mit ³²P markiert.
Vor der Beladung mit den Assay-Lösungen wurde die Nitrozellulose-Filterplatte mit BSA, PVP, PolyG, PolyI, PolyC, PolyU oder tRNA als Blockierungsagenzien vorbeschichtet. Ungeachtet dessen, ob die Vertiefung unbehandelt oder mit einem Blockierungsagens vorbeschichtet wurde, betrugen die freien RNA cpms (d. h. RNA, die in Abwesenheit von RNA- Bindeprotein auf dem Filter zurückgehalten wurde) 7-12% der Proteingebundenen cpms. Dies zeigt, dass Blockierung nicht erforderlich oder bevorzugt ist.

Optimierung der Proteinkonzentration

Ergebnisse aus Gel-Mobilitäts-Shifts zeigen, dass nicht die gesamte RNA, die zur Reaktion zugegeben wird, durch 2 ug Proteinextrakt "geshiftet" wird. Somit wurden Protein-Titrationen durchgeführt, um die Anzahl nachgewiesener Zählungen zu maximieren, so dass es zum Nachweis aktiver Verbindungen einen größeren Unterschiedsbereich geben wird. Man erwartete auch, dass dies das Verhältnis von gebundener zu freier RNA erhöhte. Die Menge an Proteinextrakt (SH-SY5Y oder K562, in Abhängigkeit von der verwendeten RNA) wurde von 1 bis 10 ug pro Reaktion in Schritten von 1 ug titriert. Die Ergebnisse waren für alle getesteten RNA/Protein-Kombinationen (APP/SH-SY5Y; IRE/K562; AUUUA/K562; nAChR/SH- SY5Y; His/K562, U1/K562; Glut-1/K562) ein konzentrationsabhängiger Anstieg in Proteingebundenen cpms bis zu etwa 5 bis 7 ug, wobei die Reaktion bei 10 ug ein Plateau erreichte und leicht abfiel. Zusammengefasst zeigen diese Ergebnisse, dass die optimale Konzentration an Proteinextrakt größer als etwa 0,5 ug/u1 ist. Die Daten sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Es wurde gefunden, dass in den meisten Fällen die halb-maximale Konzentration für Wildtyp- Bindung im Bereich von 2 bis 4 gg lag. Es ist bevorzugt, dass die Menge an im Screen verwendetem Proteinextrakt im Bereich von 2 bis 4 gg ist, um den Nachweis von Verbindungen zu erleichtern, die die RNA/RNA-Bindeprotein-Interaktion sowohl verstärken als auch hemmen. Bei Verwendung markierter mutanter RNAs erzeugten diese ebenfalls nachweisbare Zählwerte, aber die absolute Zahl von gebundenen cpms sind 5- bis 100-fach geringer als für Wildtyp-RNAs. Tabelle 1
Um die Fähigkeit des Filter-Assays zu testen, Veränderungen in der Bindungsaktivität nachzuweisen (d. h. verminderte Interaktion zwischen RNA und RNA-Bindeproteinen), wurden Kompetitions-Assays mit IRE-RNA und K562-Proteinextrakt (vgl. Fig. 4) durchgeführt. Kompetitionsexperimente wurden durch Zugabe ansteigender Konzentrationen (100 bis 10 000X) unmarkierter Wildtyp- oder mutanter IRE-RNA zur Bindungsreaktion durchgeführt. Fig. 4 veranschaulicht die Ergebnisse. Eine konzentrationsabhängige Hemmung der Bindung wurde in Assays beobachtet, in denen unmarkierte Wildtyp-RNA zugegeben wurde, wobei in Assays, in denen nicht-markierte mutante RNA zugegeben wurde, keine Kompetition beobachtet wurde.
Um den Filter-Assay ausführlicher zu testen, wurden Kompetitionen ebenfalls mit U1 und His-RNAs durchgeführt. Sowohl U1- als auch His-Wildtyp-RNA zeigten eine konzentrationsabhängige Hemmung der Bindung (vgl. Fig. 5). Die mutanten RNAs hemmten jedoch auch die Bindung in einer konzentrationsabhängigen Weise, obwohl bei einer etwa 10-fach höheren Konzentration. Fig. 5 veranschaulicht diese Ergebnisse für die Ul-Kompetition. In diesen Kompetitions-Assays wurde gezeigt, dass, anders als im IRE-Assay, die verwendete mutante RNA das RNA-Bindeprotein bindet, jedoch mit einer geringeren Affinität als die Wildtyp- RNA. Die Ergebnisse der U1- und His-Filter-Assay-Kompetitionen spiegeln die Fähigkeit des Assays wider, Niedrig-Affinitäts- als auch Hoch-Affinitäts-Bindungsinteraktionen nachzuweisen.

Modulierung der Bindungsinteraktion durch kleine Moleküle

Bindungs-Assays mit Wildtyp-IRE-RNA und K562-Proteinextrakt wurden in Anwesenheit von Quellen von Eisen oder Eisenchelat-Bildnern durchgeführt, um die Fähigkeit des Filter- Assays zu bestimmen, die Modulierung von Bindungsinteraktionen durch kleine Moleküle nachzuweisen. Ansteigende Konzentrationen der Eisenquellen Hemin (1 bis 100 uM) und FeCl&sub3; (1 uM bis 1 mM) oder des Eisenchelat-Bildners Desferroxiamin (1 uM bis 1 mM) wurden den Bindungsreaktionen zugegeben (vgl. Fig. 6). Hemin und FeCl&sub3; erzeugten eine konzentrationsabhängige Hemmung der Bindung. Desferroxiamin veränderte die Menge an gebildetem IRE/Protein-Komplex nicht, vielleicht, da in dem Zellextrakt nicht ausreichend Eisen anwesend ist, um eine bemerkbare Veränderung nach Zugabe von Desferroxiamin herzustellen. Die Reaktionen wurden mittels Gel-Shift analysiert, um die Ergebnisse des Filter-Assays sichtbar zu machen.

Exploratorischer Bibliotheks-Screen

Eine exploratorische Verbindungsbibliothek mit 96 Mitgliedern, die CNI-1493 enthielt, eine Verbindung, von der zuvor gezeigt wurde, dass sie post-transkriptional die TNF-α-Produktion hemmt, wurde generiert. Die Bibliothek wurde anfänglich bei 10 uM gegen ³²P-markierte AUUUA-RNA gescreent. Verschiedene Verfahren zur Einführung der Verbindungen in die Bindungsreaktion wurden getestet. Anfänglich wurden die Verbindungen mit der RNA und dem Protein ko-inkubiert, was zu bescheidenen Ergebnissen führte. Als nächstes versuchte man eine Prä-Inkubation entweder mit dem Proteinextrakt oder mit der RNA mit verbesserten Ergebnissen.
Für die weitere Analyse bei 100 nM, 1 uM und 10 uM wurden 17 Verbindungen ausgewählt, unter Verwendung sowohl von AUUUA- als auch IRE-RNAs, basierend auf den Ergebnissen aus vier Screening-Ansätzen (Experimente 29-31, 33). Tabelle 2 fasst die Ergebnisse dieser Verbindungen bei 10 uM zusammen. Die Ergebnisse werden auch graphisch in Fig. 7 gezeigt. Die Verbindung C1 war übereinstimmend der aktivste Inhibitor und führte zu einer nahezu 50%igen Reduktion in den Zählwerten (p = 0,001), wobei AS der am meisten aktive Verstärker war, der die Zählwerte um 38% über die Kontrollen (p< 0,001) steigerte. Die Verbindung G10, CNI-1493, erzeugte eine wesentliche Steigerung in den Zählwerten von 3 der 4 Experimente. Die Verbindungen D9 und H&sub2;, die aus dem anfänglichen Screening als Negativkontrollen ausgewählt wurden, hatten weiterhin keinen Effekt in dem dosisabhängigen Screen (Experiment 33) und wurden als Vehikelkontrolle identifiziert. Wenn die 17 Verbindungen gegen IRE-RNA gescreent wurden, sah man bei der Verbindung A5 (vgl. Fig. 8) einen differenziellen Effekt. Dieser wirksamste Verstärker der AUUUA-Bindung hatte keinen Effekt auf IRE. Tabelle 2

Analyse

Es wurden Kompetitionsuntersuchungen mit dem Filter-Assay durchgeführt, bei dem unmarkierte Wildtyp- oder mutante RNA zur Reaktion in einer 100- bis 10 000-fachen Konzentration der ³²P-RNA zugegeben wurde, um um die Proteinbindung der radioaktiv markierten RNA zu konkurrieren. Es wurde gezeigt, dass der Hochdurchsatz-Assay effektiv für diese Art der Untersuchung verwendet werden kann unter Verwendung einer Vielzahl von RNA-Molekülen, einschließlich IRE, AUUUA, APP, U1 und His. Bei Verwendung von IRE wurde eine konzentrationsabhängige Hemmung der Bindung durch unmarkierte Wildtyp-RNA gezeigt, wobei sich außer bei der höchsten Konzentration bei unmarkierter mutanter RNA kein Effekt zeigte. Diese Ergebnisse wurden durch Gel-Shift-Analyse bestätigt. Weiterhin kann der offenbarte Assay dazu verwendet werden, geringere Unterschiede in der Fähigkeit verschiedener RNA-Moleküle nachzuweisen, Proteine zu binden, wie durch die Ergebnisse der U1- und His- Experimente gezeigt. In diesem Fall hat mutante RNA eine schwache Bindungsaffinität für das RNA-Protein. Wenn unmarkierte mutante RNA der Bindungsreaktion zugegeben wird, weist man eine leichte konzentrationsabhängige Hemmung nach, wobei die maximale Hemmung von 50 bis 70% bei der 10 000-fachen ³²P-RNA-Konzentration auftritt. Auf diese Weise können die Bindungsaffinitäten verschiedener veränderter Formen der Bindungsstelle eines RNA-Bindeproteins verglichen werden.
Eine zufällige Verbindungsbibliothek mit 96 Mitgliedern wurde mit den offenbarten Hochdurchsatz-Assays gescreent. Die Verbindungen wurden anfänglich bei 10 uM gegen ³²P-markierte AUUUA-RNA gescreent. Es wurde nachgewiesen, dass eine Verbindung eine signifikante Steigerung in nachweisbaren Zählwerten erzeugte, während zwei Verbindungen eine signifikante Abnahme der Zählwerte erzeugten. 17 Verbindungen wurden zur weiteren Analyse bei 100 nM, 1 uM und 10 uM ausgesucht, unter Verwendung sowohl der AUUUA- als auch der IRE-RNA-Moleküle, um zu bestimmen, ob irgendeine Selektivität der Verbindungen nachgewiesen werden konnte. Wenn die 17 Verbindungen gegen IRE-RNA gescreent wurden, sah man einen differenziellen Effekt mit der steigernden Verbindung. Der wirksamste Verstärker der AUUUA-Bindung hatte keinen Effekt auf IRE. Gel-Shift dieser Verbindungen mit AUUUA-RNA bestätigte die Aktivität der Inhibitoren.

Beispiel 4: Screening auf Verbindungen, die die Interaktion von RNA-Molekülen und RNA-Bindeproteinen modulieren

Dieses Beispiel beschreibt die Identifizierung von Verbindungen, die die Bindungsinteraktion zwischen einer Stelle innerhalb eines RNA-Moleküls, das mit einem RBP interagiert, entweder erhöhen oder vermindern. Dieses Beispiel verwendet einen Gesamt-Proteinextrakt, der die Identifizierung von Verbindungen ermöglicht, die die Interaktionen modulieren, ohne die Notwendigkeit der Identifizierung der beteiligten spezifischen RBPs. Der 3'-untranslatierte Bereich (UTR) von TNF-α wurde in dem in Beispiel 3 beschriebenen Screening-Assay verwendet, unter Verwendung einer kombinatorischen Bibliothek von Verbindungen, die so ausgewählt wurde, dass sie viele Eigenschaften repräsentiert, von denen man annimmt, dass sie an RNA-Bindung beteiligt sind. Eine Anzahl von Verbindungen wurde aus der kombinatorischen Bibliothek identifiziert. Wie in Fig. 9A gezeigt, hatte SYM 1301 keinen Effekt auf diese Interaktion, SYM 1710 potenzierte die Bindung etwa 3-fach, während SYM 1405 die Bindung um etwa 40% hemmte. Es wurde bestimmt, dass SYM 1710 einen EC&sub5;&sub0; von 23 uM und SYM 1405 einen EC&sub5;&sub0; von etwa 2 uM auf die in vitro Bindung besitzt. Diese Verbindungen können jetzt dazu verwendet werden, fokussierte Bibliotheken herzustellen, basierend auf den Strukturen dieser Verbindungen. Solche fokussierten Bibliotheken können dann unter Verwendung des offenbarten Assays gescreent werden, um Verbindungen zu identifizieren, die effektiver oder spezifischer sind. Die Spezifität von SYM 1405 wurde demonstriert, wenn ansteigende Konzentrationen der Verbindung im Assay mit TNF-α und einer nicht verwandten RNA, dem "Iron Response Element", getestet wurden. Fig. 9B zeigt, dass SYM 1405 die Bindung von TNF-α in einer konzentrationsabhängigen Weise hemmte, während sie nur geringen Effekt auf das "fron Response Element" hatte.

Claims

1. Verfahren zum Nachweis von Interaktionen zwischen RNA-Bindeproteinen und RNA- Molekülen unter Bedingungen, die den Nachweis von Interaktionen zwischen RNA-Bindeproteinen in einem SH-SY5Y-Proteinextrakt und jedem der RNA-Moleküle Amyloid-Vorläuferprotein-untranslatierten Region, -AUUUA-Region und -Poly(A)-Region erlauben, umfassend

Herstellen einer Bindungslösung, umfassend ein oder mehrere RNA-Moleküle und Pufferbestandteile, umfassend einen Puffer, ein einwertiges Kation, ein zweiwertiges Kation, ein Reduktionsmittel und ein Dichtemittel,

Erhitzen der Bindungslösung für eine Zeit und eine Temperatur, die ausreicht, um ein oder mehrere RNA-Moleküle zu denaturieren,

Abkühlen der Bindungslösung,

Zufügen eines oder mehrerer RINA-Bindeproteine zu der Bindungslösung, und

Nachweisen von Interaktionen zwischen einem oder mehreren RNA-Bindeproteinen und dem einen oder mehreren RNA-Molekülen.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Puffer (1) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus HEPES, Tris und Bis-Tris-Propan und (2) bei einem pH-Wert zwischen etwa 8 und 10 ist, wobei das einwertige Kation ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus K&spplus;, Na&spplus; und NH&sub4;&spplus;,

wobei das zweiwertige Kation ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Mg&spplus;&spplus;, Ca&spplus;+ und Fe&spplus;&spplus;,

wobei das Reduktionsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Dithiothreitol und β-Mercaptoethanol, und

wobei das Dichtemittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Glycerin und Polyethylenglykol.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei der Puffer (1) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus HEPES, Tris und Bis-Tris-Propan, (2) bei einem pH-Wert zwischen etwa 8 und etwa 10 ist und (3) in einer Konzentration zwischen etwa 5 und etwa 100 mM vorliegt,

wobei das einwertige Kation K&spplus; ist bei einer Konzentration von etwa 50 mM,

wobei das zweiwertige Kation Mg&spplus;&spplus; ist bei einer Konzentration von etwa 1 mM,

wobei das Reduktionsmittel Dithiothreitol ist bei einer Konzentration von etwa 0,2 mM, und

wobei das Dichtemittel Glycerin ist bei einer Konzentration von etwa 10% (v/v).

4. Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei der Puffer Bis-Tris-Propan ist bei einem pH von etwa 8,5 und einer Konzentration von etwa 7,5 mM,

wobei das einwertige Kation (1) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus K&spplus;, Na&spplus; und NH&sub4;&spplus; und (2) in einer Konzentration zwischen 0 und etwa 100 mM vorliegt,

wobei das zweiwertige Kation Mg&spplus;&spplus; ist bei einer Konzentration von etwa 1 mM, wobei das Reduktionsmittel Dithiothreitol ist bei einer Konzentration von etwa 0,2 mM, und

wobei das Dichtemittel Glycerin ist bei einer Konzentration von etwa 10% (v/v).

5. Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei der Puffer Bis-Tris-Propan ist bei einem pH von etwa 8,5 und einer Konzentration von etwa 7,5 mM,

wobei das zweiwertige Kation (1) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Mg&spplus;&spplus;, Ca&spplus;+ und Fe&spplus;&spplus; und (2) in einer Konzentration von zwischen 0 und etwa 5 mM vorliegt,

wobei das Reduktionsmittel Dithiothreitol ist bei einer Konzentration von etwa 0,2 mM und

wobei das Dichtemittel Glycerin ist bei einer Konzentration von etwa 10% (v/v).

6. Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei der Puffer Bis-Tris-Propan ist bei einem pH von etwa 8,5 und einer Konzentration von etwa 7,5 mM,

wobei das Reduktionsmittel (1) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Dithiothreitol und β-Mercaptoethanol und (2) in einer Konzentration von zwischen 0 und etwa 1 mM vorliegt und

wobei das Dichtemittel Glycerin ist bei einer Konzentration von etwa 10% (v/v).

7. Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei der Puffer Bis-Tris-Propan ist bei einem pH von etwa 8,5 und einer Konzentration von etwa 7,5 mM,

wobei das Dichtemittel (1) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Glycerin und Polyethylenglykol und (2) in einer Konzentration von zwischen etwa 1 und etwa 20% (v/v) vorliegt.

8. Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei der Puffer Bis-Tris-Propan ist bei einem pH von etwa 8,5 und einer Konzentration von etwa 7,5 mM,

wobei das Dichtemittel Glycerin ist bei einer Konzentration von etwa 10% (v/v).

9. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei wenigstens eines der RNA-Bindeproteine oder wenigstens eines der RNA-Moleküle mit einer nachweisbaren Gruppe markiert ist, und wobei der Nachweis von Interaktionen zwischen einem oder mehreren RNA-Bindeproteinen und einem oder mehreren RNA-Molekülen durchgeführt wird durch die Trennung von Komplexen aus interagierenden RNA-Bindeproteinen und RNA-Molekülen von RNA-Bindeproteinen und RNA-Molekülen, die nicht an der Interaktion beteiligt sind, und Messen der markierten RNA- Bindeproteine oder markierten RNA-Moleküle, die an der Interaktion beteiligt sind.

10. Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei die Trennung von Komplexen aus interagierenden RNA-Bindeproteinen und RNA-Molekülen von RNA-Bindeproteinen und RNA-Molekülen, die nicht an der Interaktion beteiligt sind, durch Gelelektrophorese oder Filterbindung durchgeführt wird.

11. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Nachweis von Interaktionen zwischen einem oder mehreren RNA-Bindeproteinen und dem einen oder mehreren RNA-Molekülen durchgeführt wird durch Trennung der Komplexe von interagierenden RNA-Bindeproteinen und RNA-Molekülen von RNA-Bindeproteinen und RNA-Molekülen, die nicht an der Interaktion beteiligt sind, und Analysieren der RNA-Moleküle oder RNA-Bindeproteine, die an der Interaktion beteiligt sind.

12. Verfahren gemäß Anspruch 1 l, wobei die Trennung der Komplexe aus interagierenden RNA-Bindeproteinen und RNA-Molekülen von RNA-Bindeproteinen und RNA-Molekülen, die nicht an der Interaktion beteiligt sind, durch Gelelektrophorese oder Filterbindung durchgeführt wird.

13. Verfahren gemäß Anspruch 1, weiterhin umfassend den Vergleich der Interaktionen von einem oder mehreren RNA-Bindeproteinen und dem einen oder mehreren RNA-Molekü- len in Anwesenheit oder Abwesenheit von einem oder mehreren konkurrierenden RNA-Molekülen.

14. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Bindungslösung ein oder mehrere RNA- Moleküle und Pufferkomponenten umfasst und wobei ein RNA-Bindeprotein zu der Bindungslösung hinzugefügt wird.

15. Verfahren zur Identifizierung von RNA-Molekülen, die mit RNA-Bindeproteinen interagieren, umfassend den Nachweis von Interaktionen gemäß Anspruch 14 und Identifizieren von RNA-Molekülen, die mit dem RNA-Bindeprotein interagieren.

16. Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei die Identifizierung von RNA-Molekülen, die mit dem RNA-Bindeprotein interagieren, durch Nukleinsäure-Sequenzierung durchgeführt wird.

17. Verfahren zum Vergleich der Interaktionen von RNA-Bindeproteinen und RNA-Molekülen in Anwesenheit oder Abwesenheit von konkurrierenden RNA-Molekülen, umfassend die Identifizierung von RNA-Molekülen gemäß dem Verfahren nach Anspruch 15 und Vergleichen der Interaktionen von dem RNA-Bindeprotein und dem einen oder mehreren RNA- Molekülen in Anwesenheit oder Abwesenheit von einem oder mehreren konkurrierenden RNA-Molekülen.

18. Verfahren zur Identifizierung von Genen, die RNA-Moleküle kodieren, die mit RNA- Bindeproteinen interagieren, umfassend die Identifizierung von RNA-Molekülen gemäß dem Verfahren nach Anspruch 15 und Identifizieren von einem oder mehreren Genen, die eine oder mehrere RNA-Moleküle kodieren, die mit dem RNA-Bindeprotein interagieren.

19. Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei die RNA-Moleküle Teile von RNA-Molekülen sind, die durch ein Gen kodiert werden.

20. Verfahren zu Identifizierung von Regionen von RNA-Bindeproteinen, die mit RNA- Molekülen interagieren, umfassend den Nachweis von Interaktionen gemäß dem Verfahren nach Anspruch 14 und Identifizieren von Regionen des RNA-Bindeproteins, die mit einem oder mehreren RNA-Molekülen interagieren.

21. Verfahren gemäß Anspruch 20, wobei die Identifizierung von Regionen der RNA- Bindeproteine, die mit RNA-Bindeproteinen interagieren, durchgeführt wird durch den Nachweis von Interaktionen zwischen einem oder mehreren RNA-Molekülen und Teilen des RNA- Bindeproteins.

22. Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die die Interaktion von RNA- Molekülen und RNA-Bindeproteinen regulieren, umfassend

(a) Nachweis von Interaktionen gemäß dem Verfahren nach Anspruch 14,

(b) Nachweis von Interaktionen zwischen einem oder mehreren RNA-Molekülen und dem RNA-Bindeprotein in Anwesenheit einer Testverbindung durch

(i) Herstellen einer Testlösung, umfassend eine oder mehrere RNA-Moleküle und die Pufferbestandteile, wobei die Pufferbestandteile die gleichen sind wie in der Bindungslösung,

(ii) Erhitzen der Testlösung für eine Zeit und bei einer Temperatur, die ausreicht, um ein oder mehrere RNA-Moleküle zu denaturieren,

(iii) Kühlen der Testlösung,

(iv) Zufügen des RNA-Bindeproteins zu der Testlösung,

(v) Nachweis von Interaktionen zwischen einem oder mehreren RNA- Molekülen und dem RNA-Bindeprotein in der Testlösung,

wobei die Testverbindung zu der Testlösung oder zu dem RNA-Bindeprotein während oder nach einem der Schritte (i) bis (iv) zugesetzt wird, und

(c) Vergleichen der nachgewiesenen Interaktionen in der Bindungslösung mit Interaktionen, die in der Testlösung nachgewiesen wurden,

wobei die Testverbindung als eine Zusammensetzung identifiziert wird, die die Interaktion der RNA-Moleküle und des RNA-Bindeproteins reguliert, wenn die Interaktionen, die in der Bindungslösung nachgewiesen wurden und die Interaktionen, die in der Testlösung nachgewiesen wurden, sich unterscheiden.

23. Verfahren gemäß Anspruch 22, weiterhin umfassend den Nachweis von Interaktionen zwischen einem oder mehreren RNA-Molekülen und dem RNA-Bindeprotein in Anwesenheit von einer oder mehreren zusätzlichen Testverbindungen, jede in einer oder mehreren zusätzlichen Testlösungen, wobei die Testlösung und die eine oder mehreren zusätzlichen Testlösungen zusammen einen Satz von Testlösungen ergeben.

24. Verfahren gemäß Anspruch 23, wobei eine Vielzahl von Sätzen von Testlösungen und eine Kontrolllösung, die jedem Satz der Testlösungen entspricht, getestet werden.

25. Verfahren gemäß Anspruch 24, wobei jeder Satz von Testlösungen beinhaltet (a) einen anderen Satz von RNA-Molekülen, (b) ein anderes RNA-Bindeprotein oder (c) einen anderen Satz von RNA-Molekülen und ein anderes RNA-Bindeprotein als die anderen Sätze von Testlösungen.

26. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Bindungslösungen aus einem RNA-Molekül und den Pufferbestandteilen besteht.

27. Verfahren gemäß Anspruch 26, wobei das RNA-Molekül durch ein interessierendes Gen kodiert wird.

28. Verfahren zur Identifizierung von RNA-Bindeproteinen, die mit RNA-Molekülen interagieren, umfassend den Nachweis von Interaktionen gemäß dem Verfahren nach Anspruch 27 und Identifizieren der RNA-Bindeproteine, die mit dem RNA-Molekül interagieren, wobei die Identifizierung der RNA-Bindeproteine, die mit dem RNA-Molekül interagieren, durch Analysieren der RNA-Bindeproteine, die an der Interaktion beteiligt sind, erfolgt.

29. Verfahren gemäß Anspruch 28, wobei die Analyse der RNA-Bindeproteine, die an Interaktion beteiligt sind, durch Antikörpernachweis, Peptid-Mapping oder Aminosäuresequenzierung erfolgt.

30. Verfahren gemäß Anspruch 26, weiterhin umfassend den Vergleich von Interaktionen von einem oder mehreren RNA-Bindeproteinen und dem RNA-Molekül in Anwesenheit und Abwesenheit von einem oder mehreren konkurrierenden RNA-Molekülen.

31. Verfahren zur Identifizierung von Bereichen in RNA-Molekülen, die mit RNA-Bindeproteinen interagieren, umfassend den Nachweis von Interaktionen gemäß dem Verfahren nach Anspruch 26 und Identifizieren von Bereichen in RNA-Molekülen, die mit einem oder mehreren RNA-Bindeproteinen interagieren.

32. Verfahren gemäß Anspruch 31, wobei die Identifizierung von Bereichen der RNA- Moleküle, die mit den RNA-Bindeproteinen interagieren, durch Analyse der RNA-Moleküle, die an Interaktionen beteiligt sind, durchgeführt wird.

33. Verfahren gemäß Anspruch 32, wobei die Analyse der RNA-Moleküle, die an der Interaktion beteiligt sind, durch Verdauen von nicht geschützten Bereichen der RNA-Moleküle, die an Interaktionen beteiligt sind, und durch Nukleinsäuresequenzierung erfolgt.

34. Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die die Interaktion von RNA-Bindeproteinen und RNA-Molekülen regulieren, umfassend

(a) Nachweis von Interaktionen gemäß dem Verfahren nach Anspruch 26,

(b) Nachweis von Interaktionen zwischen dem RNA-Molekül und einem oder mehreren RNA-Bindeproteinen in Anwesenheit einer Testverbindung durch

(i) Herstellen einer Testlösung, umfassend das RNA-Molekül und die Pufferbestandteile, wobei die Pufferbestandteile die gleichen sind wie in der Bindungslösung,

(iii) Abkühlen der Testlösung,

(iv) Zufügen von einem oder mehreren RNA-Bindeproteinen zu der Testlösung,

(v) Nachweis von Interaktionen zwischen einem oder mehreren RNA- Bindeproteinen und dem RNA-Molekül in der Testlösung, wobei die Testverbindung zu der Testlösung oder zu dem RNA-Bindeprotein während oder nach einem der Schritte (i) bis (iv) zugefügt wird, und

(c) Vergleichen der Interaktionen, die in der Bindungslösung nachgewiesen wurden mit den Interaktionen, die in der Testlösung nachgewiesen wurden,

wobei die Testverbindung als eine Verbindung identifiziert wird, die die Interaktion von RNA-Bindeproteinen und dem RNA-Molekül reguliert, wenn die nachgewiesene Interaktion in der Bindungslösung und die Interaktionen, die in der Testlösung nachgewiesen wurde, sich unterscheiden.

35. Verfahren gemäß Anspruch 34, weiterhin umfassend den Nachweis von Interaktionen zwischen einem oder mehreren RNA-Bindeproteinen und dem RNA-Molekül in Anwesenheit von einer oder mehreren zusätzlichen Testverbindungen, jeweils in einer oder mehreren zusätzlichen Testlösungen, wobei die Testlösung und die eine oder mehreren zusätzlichen Testlösungen zusammen einen Satz von Testlösungen ergeben.

36. Verfahren gemäß Anspruch 35, wobei eine Mehrzahl von Sätzen von Testlösungen und eine Kontrolllösung, die jedem Satz der Testlösungen entspricht, getestet werden.

37. Verfahren gemäß Anspruch 36, wobei jeder Satz von Testlösungen beinhaltet (a) einen anderen Satz von RNA-Bindeproteinen, (b) ein anderes RNA-Molekül oder (c) einen anderen Satz von RNA-Bindeproteinen und ein anderes RNA-Molekül als die anderen Sätze von Testlösungen.

38. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Bindungslösung drei oder mehr RNA-Moleküle und Pufferbestandteile umfasst.

39. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei drei oder mehr RNA-Bindeproteine der Bindungslösung zugefügt werden.

40. Verfahren zum Nachweis von Interaktionen zwischen RNA-Bindeproteinen und RNA- Molekülen unter Bedingungen, die den Nachweis von Interaktionen zwischen RNA-Bindeproteinen in einem SH-SY5Y-Proteinextrakt und jedem der RNA-Moleküle Amyloid-Vorläuferprotein-untranslatierten Region, -AUUUA-Region und -Poly(A)-Region erlauben, umfassend

(a) Herstellen einer Bindungslösung, umfassend ein oder mehrere RNA-Moleküle, und Pufferbestandteile, umfassend einen Puffer, ein einwertiges Kation, ein zweiwertiges Kation, ein Reduktionsmittel und ein Dichtemittel,

(b) Erhitzen der Bindungslösungen für eine Zeit und auf eine Temperatur, die ausreicht, um ein oder mehrere RNA-Moleküle zu denaturieren,

(c) Abkühlen der Bindungslösung,

(d) Zufügen von einem oder mehreren RNA-Bindeproteinen zu der Bindungslösung und

(e) Nachweisen von Interaktionen zwischen dem einen oder mehreren RNA-Bindeproteinen und dem einen oder mehreren RNA-Molekülen,

wobei das Verfahren Interaktionen zwischen RNA-Bindeproteinen und einem RNA-Molekül nachweist, (i) wenn die RNA-Bindeproteine Proteine in einem SH-SY5Y-Proteinextrakt sind und das RNA-Molekül ein RNA-Molekül ist, das eine Amyloid-Vorläuferprotein-untranslatierte Region besitzt, (ii) wenn die RNA-Bindeproteine Proteine in einem SH-SY5Y-Proteinextrakt sind und das RNA-Molekül ein RNA-Molekül mit AUUUA ist und (iii) wenn die RNA-Bindeproteine Proteine in einem SH-SY5Y-Proteinextrakt sind und das RNA-Molekül ein RNA-Molekül mit einem Poly(A) ist.

41. Kit zum Nachweis von Interaktionen zwischen RNA-Bindeproteinen und RNA- Molekülen. umfassend

eine oder mehrere Vorratslösungen, insgesamt umfassend einen Puffer, ein einwertiges Kation, ein zweiwertiges Kation, ein Reduktionsmittel und ein Dichtemittel,

wobei die Vorratslösung Bedingungen zur Verfügung stellt, die den Nachweis von Interaktionen zwischen RNA-Bindeproteinen in einem SH-SY5Y-Proteinextrakt und jedem der RNA- Molekül-Amyloid-Vorläuferprotein-untranslatierten Region, -AUUUA-Region und -Poly(A)- Region besitzen,

wobei der Puffer (1) Bis-Tris-Propan ist und (2) bei einem pH zwischen etwa 8 und 10 ist,

wobei das einwertige Kation ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus K&spplus;, Na&spplus; und NH&sub4;&spplus;,

wobei das zweiwertige Kation ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Mg&spplus;&spplus;, Ca&spplus;&spplus; und Fe&spplus;&spplus;,

wobei das Reduktionsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Dithiothreitol und β-Mercaptoethanol und

42. Kit gemäß Anspruch 41, wobei die Vorratslösungen weiterhin umfassen ein oder mehrere RNA-Moleküle oder einen oder mehrere Vektoren, die ein oder mehrere RNA-Moleküle kodieren.

43. Kit gemäß Anspruch 41, wobei die Vorratslösungen weiterhin umfassen ein oder mehrere RNA-Bindeproteine oder eine oder mehrere Lösungen, die ein oder mehrere Bindeproteine enthalten.